KR101441916B1 - 벼 Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼(Oryza sativa) Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 유전자 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것으로, 본 발명의 프로모터가 소포자 및 성숙화분 발달단계에서 발현특이성이 매우 우수하므로, 웅성 불임 식물을 생명공학적으로 육성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

벼 Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도{Microspore or pollen specific expression promoter from Oryza sativa Os8g0560700 gene and uses thereof}

본 발명은 벼 Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼(Oryza sativa) Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터, 상기 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자에 관한 것이다.

속씨식물(angiosperm)의 포자형성 세포로부터 유래하는 성숙화분(mature pollen)의 발달과정은 반수체인 배우체 세포와 포자체 조직에서 매우 복잡하고 정교한 유전자 발현 프로그램을 필요로 한다. 특히 식물체의 화분으로 대표하는 웅성 배우체의 발달과정에는 정교한 발현의 조절을 요구하는 수많은 유전자(약 20,000개 이상)들이 관여한다고 알려져 있다. 소포자(microspore) 및 화분에서 발현하는 유전자를 탐색하기 위하여 전통적으로 웅성 배우체 혹은 화분의 정상적인 생산을 할 수 없는 돌연변이체를 이용한 유전학적인 방법을 많이 사용하였으나, 현재는 마이크로어레이(microarray) 및 차세대 시퀀싱(NGS, next generation sequencing) 방법을 많이 이용하여 짧은 시간동안 대규모 분량의 데이타를 생산하고 있다.

소포자로부터 성숙화분으로의 발달과정은 웅성 배우자를 만드는 식물의 생식세대에 속하며, 비교적 짧은 주기이나 종자식물의 존재 여부에 근간이 되는 중요한 생물학적 과정이며, 이러한 발생과정에 관여하는 유전자들은 농업적 활용도(생명공학적 방법을 이용한 작물육종분야)가 매우 크다. 특히 소포자 및 화분조직에서만 특이적으로 발현하는 프로모터는 화분발달을 저해할 수 있는 외래유전자에 결합한 형질전환용 벡터를 제작함으로써 특정 유전자를 식물체의 화분조직에 국한시켜 발현시키는 형질전환체를 육성하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 방식으로 육성된 웅성 불임 개체는 벼를 비롯한 주요작물의 1대 잡종 종자를 생산하기 위한 불임친으로 직접적으로 사용될 수 있으므로, 농업적 활용도가 매우 크다.

작물의 잡종강세(heterosis) 현상은 타가수분 작물 혹은 자가수분 작물에서 유전적 배경이 상이한 계통 혹은 품종간의 교배를 통하여 획득된 F1 세대 잡종식물이 교배에 사용된 양친보다 왕성한 생육, 높은 수량성, 병충해 및 환경 스트레스에 강한 특성을 보이는 현상으로, 작물육종의 한 방법으로 널리 사용되고 있다. 또한 잡종 2세대가 되면 잡종강세 현상이 현저히 약해지므로, 현재 종자회사에서 시판하고 있는 종자들은 대부분 F1 세대 잡종 종자이다.

식물의 종자를 생산하는 생식구조는 매우 다양하고 복잡하기 때문에 잡종 종자를 생산하는 것이 용이하지 않다. 대표적인 자가수정 작물인 벼의 경우, 1대 잡종 육종기술은 수량성을 크게 증가시킬 수 있는 잠재력은 있으나 종자생산의 어려움 등 아직 육종학적으로 해결되어야 할 문제가 많이 있다. 특히 Indica x Japonica 1세대 잡종의 경우 영양생장기의 잡종강세 효과는 매우 크지만, 출수지연과 불임 등의 문제가 있어 실용화되지 못하고 있는 실정이다. 또한 현재 중국에서는 불임친, 유지친 및 회복친의 3계통법을 환경감응형 웅성 불임 계통을 이용하여 2계통법으로 전환하고 있으나, 여러 가지 문제로 인하여 오히려 3계통법으로 돌아가고 있는 실정이다.

한편, 한국등록특허 제1185845호에는 '벼의 화분에서 발현하는 pLim3 프로모터, 이 프로모터를 포함하는 발현벡터, 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0527285호에는 '벼 수술 특이적 발현 시스테인 프로테아제 유전자, 상기 유전자의 수술 특이적 발현 프로모터, 상기 유전자의 발현억제를 이용한 웅성 불임 도입 벼의 생산방법'이 개시되어 있으나 본 발명의 벼 Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 벼 Os08g0560700 유전자 유래의 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터를 포함하는 재조합 식물 발현 벡터를 벼 및 애기장대에 형질전환시킨 결과, 형질전환 식물체에서 외래 유전자가 소포자 또는 화분에 특이적으로 발현되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로모터를 포함하는 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

또한, 본 발병은 상기 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및 상기 재조합된 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환 식물체의 종자를 제공한다.

본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼의 꽃가루 발달과정 동안 소포자 발달단계 및 성숙화분에서 제한적으로 발현을 유도할 수 있는 벼 유래 프로모터에 관한 것이다. 특히 본 발명의 벼 유래 프로모터는 화분 특이적으로 발현하는 벼 유전자로부터 유래한 프로모터이며, 2세포성 소포자에서 성숙화분으로 발달하는 벼 및 애기장대의 소포자 또는 화분에서만 특이적 발현을 유도하는 특성을 보인다. 따라서 본 프로모터는 단자엽 식물뿐만 아니라, 쌍자엽 식물에서도 이용 가능함을 보여주며, 또한 애기장대와 같은 십자화과 식물인 배추, 유채와 담배들에서도 활용가능성이 있다는 사실을 보여주고 있다. 본 발명의 프로모터는 소포자 및 성숙화분 발달단계에서만 특이적으로 유전자 발현을 유도할 수 있고, 꽃가루 조직 및 발달단계에서 발현 특이성이 매우 우수하므로, 웅성 불임 식물을 생명공학적으로 육성하는데 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 프로모터가 유래된 벼 Os08g0560700 유전자의 전체 염기서열(A) 및 상기 유전자로부터 유래된 소포자 또는 화분 특이적 프로모터에 GUS::GFP 유전자를 융합시킨 재조합 벡터의 구조(B)를 나타낸 도면이다. (A)의 초록색 블럭 표시가 본 발명의 벼 유래 소포자 또는 화분 특이적 프로모터 부위이다.
도 2는 벼 유래 소포자 또는 화분 특이적 프로모터에 GUS::GFP 유전자를 융합시킨 재조합 벡터를 이용하여 벼 형질전환체를 육성하고, T0 및 T1 세대의 벼 형질전환 식물체들의 약 내의 소포자 및 화분 발달단계별 GUS 유전자의 발현양상을 형광 및 광학 현미경에서 관찰한 결과이다. anther; 약, UC(Uninucleate micrpore); 1핵기 소포자, BC(Bicelluar microspore); 2핵기 소포자, TC(Tricellular microspore); 3핵기 소포자, MP(Mature pollen); 성숙화분.
도 3은 벼 유래 소포자 또는 화분 특이적 프로모터에 GUS::GFP 유전자를 융합시킨 재조합 벡터 pSK735를 이용하여 형질전환시킨 벼 형질전환체에서, 본 발명에 사용된 프로모터가 유래된 Os08g0560700 유전자의 발현양상을 벼 조직별(약, 엽, 줄기 및 뿌리조직)로 분석한 RT-PCR 결과(A) 및 T1 세대의 벼 형질전환 식물체의 잎, 줄기 및 뿌리 조직에서 GUS 유전자의 발현 양상을 분석한 결과(B)이다. MP; 소포자 및 성숙화분을 함유하는 약 조직, L1, L2 및 L3; 발아 후 2주, 3주 및 4주 생장한 잎 조직, S1, S2 및 S3; 발아 후 2주, 3주 및 4주 생장한 줄기 조직, R1, R2 및 R3; 발아 후 2주, 3주 및 4주 생장한 뿌리 조직.
도 4는 벼 Os08g0560700 유전자의 마이크로 어레이 분석 결과이다. Heatmap에서 노란색은 발현이 높은 것을 의미하고 파란색은 발현이 낮은 것을 의미한다.
도 5는 벼 유래 소포자 또는 화분 특이적 프로모터에 GUS::GFP 유전자를 융합시킨 재조합 벡터 pSK735를 이용하여 형질전환시킨 T1 세대 애기장대 형질전환체들의 꽃봉우리, 소포자 및 화분 조직에서의 GUS 유전자 발현 양상을 분석한 결과이다. (A)는 T1 세대의 화기조직에서의 GUS 유전자 발현 양상을 나타내는 결과이며, (B)는 형질전환 식물체들의 소포자 및 화분 발달단계별 GUS 유전자 발현양상을 형광 및 광학 현미경에서 관찰한 결과이고(UN, BC, TC 및 MP는 도 2에 기재된 내용과 동일함), (C)는 T2 세대의 애기장대 형질전환 식물체의 개화된 꽃(Fl), 개화 이전의 꽃봉오리(Bd), 잎(L), 줄기(S), 뿌리(R) 및 유묘(Sd) 조직에서의 GUS 유전자 발현 양상을 RT-PCR로 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터를 제공한다.

기존에 널리 사용되고 있는 꽃양배추 모자이크 바이러스 유래의 CaMV35S 프로모터가 도입된 유전자를 전 조직에서 발현시키는데 비해, 상기 본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터는 형질전환 식물체에서 도입된 유전자를 소포자 또는 화분 특이적으로 발현시킬 수 있다.

또한, 상기 프로모터 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상동체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터 서열은 서열번호 1의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발병의 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터를 포함하는 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터를 제공한다.

본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 발현 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자를 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명에 이용될 수 있는 바이너리 벡터는 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 Ti 플라스미드와 함께 존재시 식물체를 형질전환시킬 수 있는 T-DNA의 RB(right border)와 LB(left border)를 함유하는 어떤 바이너리 벡터도 될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에서 자주 사용되는 pBI101(Cat#: 6018-1, Clontech, 미국), pBIN19(Genbank 수탁번호 U09365), pBI121, pCAMBIA 벡터 등을 사용하는 것이 좋다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli) 또는 아그로박테리움 튜머파시엔스(A. tumefaciens)를 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 형질전환 식물체에서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있다.

바람직하게는 쌍자엽 식물로는 무, 배추, 유채, 가는장대, 애기장대, 개갓냉이, 겨자, 고추냉이, 갓, 들갓, 장대나무, 꽃다지, 꽃무, 논냉이, 루타바가, 갈래꽃, 콜리플라워, 브로콜리, 양배추, 컬리플라워, 케일 등의 십자화과(Brassicaceae) 식물일 수 있고, 단자엽 식물로는 억새, 갈대, 강아지풀, 기장, 귀리, 수수, 댈러스 그래스, 대나무, 돌피, 호밀, 레몬그라스, 밀, 벼, 보리, 사탕수수, 율무, 잔디, 조, 귀리 등의 화본과(Gramineae) 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대 또는 벼 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및

상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 소포자 또는 화분에 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

상기 외래 유전자는 식물체 소포자 또는 화분에서 발현을 원하는 어떤 유전자도 될 수 있으며, 본 발명의 소포자 또는 화분 특이적 발현 벡터에서 상기 프로모터의 뒤에 위치하며 필요에 따라 리포터 유전자와 융합되어 발현될 수도 있다. 상기 재조합된 소포자 및 화분 특이적 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같이 실시할 수 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따른 상기 식물체는 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 형질전환 식물체는 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터에 의해 외래 유전자를 소포자 및 화분 특이적으로 발현시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 벼 유래 화분특이적 발현 유전자의 프로모터 확보 및 염기서열 분석

벼의 발달하는 화분에서만 특이적으로 발현하는 유전자를 탐색하기 위하여, 벼의 약(anther) 및 소포자(microspore) 발달단계별 마이크로 어레이 데이터 분석을 통하여 벼 Os08g0560700 유전자를 선발하였다. NCBI 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)로부터 상기 유전자의 프로모터와 5'-UTR를 포함한 약 2Kbp의 염기서열을 확보하였으며, 프로모터 단편 263bp를 증폭하기 위하여 프라이머 Os08g0560700P-F(5'-AAAAAGGGGATCGAGAGGAAGAGGAAG-3'; 서열번호 2)와 Os08g0560700P-R(5'-ATGGATGATCAGCTTGATGATAGATAGATATAGATG-3'; 서열번호 3)을 제작하였고(도 1A의 청색 표시), 상기의 프라이머에 각각 AttB1 및 AttB2와 상보적인 염기서열(5'-AAAAAGCAGGCT-3'; 서열번호 4, 5'-AGAAAGCTGGGT-3'; 서열번호 5)의 어뎁터를 부착하였다. 벼 품종 동진의 발아 3주 경과한 유묘기의 잎 조직으로부터 CTAB 방법(Ronald PC and Chen DH, 1999, Plant Mol. Biol. Reporter 17:53-57)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 프로모터 단편의 증폭을 위한 PCR 반응은 2단계로 진행하였으며, 1차 반응은 94℃ 5분간 반응 후, 94℃ 30초, 58℃ 30초 및 72℃ 2분의 반응을 10회 수행하고, 마지막으로 72℃ 5분간 반응하였다. 2차 반응은 1차 반응 산물의 10㎕를 이용하였으며, 어닐링(annealing) 온도를 55℃로 조정하였으며, 20회 반응을 수행하였다. 그 외에는 1차 반응조건과 동일하였으며, 전체 양을 50㎕로 조정하였다. PCR 반응 산물은 전기영동 후 1%의 아가로스 겔로부터 추출하여 벡터 제작에 사용하였다.

실시예 2. 벼 유래 화분특이적 발현 유전자의 프로모터를 이용한 식물 발현 벡터 제조

벼 화분 특이적 발현을 검정하기 위하여 상기 263bp의 프로모터 단편을 이용하여 게이트웨이 클로닝 방법(Invitrogen, 미국)을 통하여 다음과 같은 방법으로 263bp 프로모터::GUS-GFP 표식유전자 융합벡터를 제작하였다. 상기 증폭된 프로모터 부위는 1차적으로 pGEM-T Easy 벡터(Promega, 미국)에 클로닝 한 후, BR clonase 반응을 위한 2개의 재조합 부위(AttB1와 AttB2)를 함유하는 게이트웨이 pDONR201 엔트리 클로닝 벡터(Invitrogen)로 2차 클로닝하였다. 263bp 프로모터 부위를 가지는 pDONR201 플라스미드 DNA를 추출한 후, 프로모터 지역 및 pDONR201 벡터 지역의 염기서열에 상보적인 프라이머를 이용하여 염기서열을 분석하였으며, BIOEDIT 프로그램을 이용하여 검정한 결과, 염기서열상의 이상이 없음을 확인하였다(도 1A). 이후 LR 재조합 반응을 통하여, 263bp의 프로모터 부위는 destination 벡터인 pKGWFS7로 최종적으로 클로닝 하였으며, pSK735로 명명하였다(도 1B). pKGWFS7는 프로모터 부위가 결실된 GFP-GUS 융합 표식유전자를 함유하고 있으며, 또한 LR반응을 위한 재조합 부위인 AttB1와 AttB2를 가지고 있다. 최종적으로 완성된 식물발현용 벡터 pSK735는 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens) 균주인 LBA4404로 동결 해동(Freeze-thaw) 방법(An G, 1987, Methods in Enzymology, 153:292-293)을 이용하여 형질전환되었으며, 조직배양 방법을 이용한 벼의 형질전환에 사용되었다.

실시예 3. 제조된 식물 발현 벡터 pSK735 를 이용한 벼와 애기장대 식물체의 형질전환

상기와 같이 제조된 식물발현 벡터 pSK735를 함유하는 아그로박테리움 균주를 3일 동안 28℃에서 진탕 배양한 후, 벼 형질전환에 사용하였다. 2006년 보고된 Toki 등의 벼 형질전환 방법(Toki et al, 2006, Plant J. 47:969-976)을 사용하였으며, 32℃에서 5일 동안 연속 광조건에서 기내배양된 일본형 벼 품종 동진 종자를 취하여 형질전환 하였다. 애기장대를 형질전환하기 위하여 개화기의 생태형 콜롬비아 타입을 이용하여 꽃대 침지법(Clough SJ and Bent AF, 1998, Plant J. 16:735-743)에 의해 수행하였다.

실시예 4. 형질전환된 벼 식물체의 GUS 유전자 발현 분석

식물발현 벡터 pSK735를 이용하여 20개체 이상의 T0 세대 벼 형질전환체들을 획득하였으며, 삽입한 T-DNA 일부를 증폭하는 프라이머를 이용한 PCR 증폭실험결과, 모든 형질전환체들의 게놈 상에 1 카피 이상의 T-DNA가 삽입되었음을 확인하였다. 각 T0 세대 형질전환 식물체의 조직을 염색하기 위하여, 식물체의 각 조직을 1mM X-glu(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-glucuronide), 100mM 소듐 포스페이트(pH 7.0), 10mM EDTA, 0.5mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 0.5mM 포타슘 페로시아나이드(potassium ferrocyanide) 및 0.1% Triton X-100을 함유하는 용액에서 37℃에서 12시간 동안 반응시킨 다음, 100% 에탄올을 사용하여 클로로필을 제거하였다. GUS 표식유전자 분석결과, T0 세대 형질전환체의 소포자 및 성숙화분 조직에서만 강한 GUS 발현이 관찰되었다(도 2). GUS 표식유전자의 발현은 영양세포와 생식세포가 분열하는 2세포성 단계에서 시작하여, 생식세포가 분열하는 3세포성 단계와 1개의 영양세포 및 2개의 정세포로 구성되는 성숙화분단계까지 표식유전자의 활성이 점차적으로 증가하는 양상을 보였다(도 2). 벼의 조직별(약, 엽, 줄기 및 뿌리조직) RNA를 추출하여, 본 발명에 사용된 프로모터가 유래된 벼 Os08g0560700 유전자의 발현양상을 조사하였다. 벼 Os08g0560700 유전자의 단백질 번역부분 염기서열을 이용하여 RT-PCR 분석을 위한 프라이머 2종, Os08g0560700-F 프라이머(5'-CAACGGGGACGGCAAGATATCGCTG-3'; 서열번호 6)와 Os08g0560700-R 프라이머(5'-CAGAAGACCTTGGCGACGTCCTTCATG-3'; 서열번호 7)를 제작하여 분석을 수행하였다(유전자 내의 프라이머 위치는 도 1A의 붉은 색 표시). 분석결과 발달중인 소포자를 포함하는 약 조직에서만 특이적으로 Os08g0560700 유전자가 발현되고, 2주, 3주 및 4주 생장한 엽, 줄기 및 뿌리조직에서는 발현이 확인되지 않았다(도 3A). 또한 엽, 줄기 및 뿌리조직을 채취하여 GUS 표식유전자의 발현을 분석한 결과, GUS 표식유전자가 상기의 조직에서는 발현되지 않음을 확인하였다(도 3B). 그러므로 식물발현 벡터 pSK735에 사용된 프로모터는 벼의 2세포성 소포자에서 성숙화분으로 발달하는 벼 소포자 및 화분에서만 특이적 발현을 유도함을 알 수 있었다.

이러한 발현 특성은 화분특이적 프로모터 선발에 사용된 벼 마이크로 어레이 자료와 유사함을 확인할 수 있었다(도 4). 분석된 마이크로 어레이 자료는 인디카와 자포니카 두 품종에서 발달과정에 있는 수술과 화분 어레이 결과를 포함한다. 인디카 품종의 경우 16개의 수술 어레이와 6개의 화분 어레이가 사용되었고, 자포니카 품종의 경우에는 27개의 수술 어레이와 15개의 화분 어레이가 사용되었다. 이상의 결과를 통해서, 본 발명에 사용한 벼 Os08g0560700 유전자가 벼의 두 품종에서 공통적으로 소포자에서 성숙화분으로 발달하는 벼 소포자 및 화분에서만 특이적으로 발현됨을 확인하였다.

실시예 5. 형질전환된 애기장대 식물체의 GUS 유전자 발현 분석

식물발현 벡터 pSK735를 이용하여 20개체 이상의 T1 세대 애기장대 형질전환체들을 획득하였으며, 삽입한 T-DNA 일부를 증폭하는 프라이머를 이용한 PCR 증폭실험결과, 모든 형질전환체들의 게놈 상에 1 카피 이상의 T-DNA가 삽입되었음을 확인하였다. 각 T1 세대 형질전환 식물체의 조직을 상기 벼 형질전환체의 염색방법과 동일한 방법으로 염색 후, GUS 표식유전자의 발현양상을 각 조직별 및 발달단계별로 조사하였다. 어린 영(glume)부터 개화상태의 꽃 전부를 포함하는 꽃봉오리를 채취하여 GUS 유전자의 발현을 분석한 결과, 소포자 및 화분을 함유하는 약 조직에서만 특이적으로 GUS효소의 활성이 관찰되었다(도 5A). 소포자 발달단계별 GUS 표식유전자의 발현양상을 조사하기 위하여 크기별로 채취한 약을 절개하여 방출된 소포자들을 DAPI 염색하여 1세포성, 2세포성 및 3세포성 소포자 및 성숙화분으로 분류하였다. 애기장대 형질전환체는 2세포성 단계에서 GUS유전자가 발현하기 시작하여 3세포성 단계에서 GUS 효소활성이 증가하여, 성숙화분단계에서는 최고 수준을 나타내는 양상을 보였으며, 이는 벼 형질전환체에서 조사된 결과와 동일하였다(도 5B). 애기장대의 조직별(개화꽃, 개화이전의 꽃봉오리, 잎, 줄기, 뿌리 및 유묘조직) RNA를 추출하여, 애기장대에 도입된 GUS 유전자의 발현을 조사하였다. GUS 유전자 염기서열을 이용하여 RT-PCR 분석을 위한 프라이머 2종, GUS-F 프라이머(5'-CGTCCTGTAGAAACCCCAACCC-3'; 서열번호 8)와 GUS-R 프라이머(5'-GCATTACGCTGCGATGGATTCCG-3'; 서열번호 9)를 제작하여 분석을 수행하였다. 분석결과 성숙화분이 포함된 개화 꽃과 개화이전의 꽃봉오리 조직에서 GUS 유전자가 강하게 발현되었으며, 이외의 조직에서는 발현되지 않음을 확인하였다(도 5C). 이의 결과를 통해 식물발현 벡터 pSK735에 사용된 프로모터는 2세포성 소포자단계에서 성숙화분으로 발달하는 애기장대 소포자 및 화분에서만 특이적으로 발현을 유도하는 것을 확인하였다.

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Microspore or pollen specific expression promoter from Oryza sativa Os8g0560700 gene and uses thereof <130> PN13162 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 263 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 aaaaagggga tcgagaggaa gaggaagctt tgtgagtttg ggcctttatt tggtggaggc 60 ccattgattc ctacgtgggc tgggccgaac acggtccagg tagttggtcc acattccagg 120 ttgaacgatt ccagcggcgg cggcgagtgg tggcgcgcga tcatctccca ctcccaccgt 180 tgttcctcct caacacgcgc cactcctcac attcatttcc acctgctcat ctatatctat 240 ctatcatcaa gctgatcatc cat 263 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 aaaaagggga tcgagaggaa gaggaag 27 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 atggatgatc agcttgatga tagatagata tagatg 36 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aaaaagcagg ct 12 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 agaaagctgg gt 12 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caacggggac ggcaagatat cgctg 25 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cagaagacct tggcgacgtc cttcatg 27 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgtcctgtag aaaccccaac cc 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gcattacgct gcgatggatt ccg 23

Claims (8)

1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 벼(Oryza sativa) Os08g0560700 유전자 유래 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터.
2. 제1항의 소포자 또는 화분 특이적 발현 프로모터를 포함하는 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터.
3. 제2항의 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터로 형질전환된 식물체.
4. 제2항의 소포자 또는 화분 특이적 식물 발현 벡터에 외래 유전자를 재조합하는 단계; 및
   상기 재조합 식물 발현 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 포함하는 외래 유전자가 소포자 또는 화분에 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 식물체는 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 단자엽 식물은 화본과(Gramineae)식물이며, 상기 쌍자엽 식물은 십자화과(Brassicaceae)식물인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제4항의 방법에 의해 제조된 외래 유전자가 소포자 또는 화분 특이적으로 발현되는 형질전환 식물체.
8. 제7항의 형질전환 식물체의 종자.

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