CN105111295B - 抗根腐病和纹枯病的转wmyb-r基因小麦的培育方法及其相关生物材料 - Google Patents

抗根腐病和纹枯病的转wmyb-r基因小麦的培育方法及其相关生物材料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗根腐病和纹枯病的转WMYB‑R基因小麦的培育方法及其相关生物材料。本发明所提供的培育具有抗根腐病和纹枯病的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入WMYB‑R蛋白的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性的转基因植物的步骤。将本发明的WMYB‑R基因转入植物中，可提高植物对根腐病及纹枯病的抗性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。

Description

抗根腐病和纹枯病的转WMYB-R基因小麦的培育方法及其相关 生物材料
技术领域
本发明涉及分子生物学和基因工程领域中抗根腐病和纹枯病的转WMYB-R基因小麦的培育方法及其相关生物材料。
背景技术
小麦(Triticum aestivum)是人类赖以生存的四大作物之一，世界上1/3以上的人口以小麦为主食，小麦的产量与品质直接影响着人类的生存与生活质量。随着耕作制度、肥水条件和气候条件等因素的改变，土传病害根腐病、纹枯病在我国小麦生产区呈加重发生态势,已成为制约小麦高产、稳产的重要因素之一。
由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)(有性态为禾旋孢腔菌Cochliobolussativus)等引起的小麦根腐病,发生于世界各国,在我国以北方麦区尤为严重，一般减产5％～10％，严重地块减产20％～50％。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病(wheatsharpeyespot)，是由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG4、AG5融合群引起的一种世界性小麦土传真菌病害。我国小麦纹枯病主要病原菌为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)，纹枯病一般可使小麦减产10％～30％，严重地块则使小麦减产50％以上。据全国农技推广站报道，2005-2011年我国小麦纹枯病每年发生面积约1亿亩，经济损失达数十亿元以上，已成为我国小麦主产区小麦第一大病害。因此，选育和推广抗性的小麦品种是防治小麦病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保证我国小麦高产、稳产非常重要。然而，由于小麦根腐病、纹枯病抗性均由多基因控制，缺乏理想的小麦抗病种质资源，常规育种方法在选育抗根腐病和纹枯病小麦品种方面的研究进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。植物抗性蛋白基因的分离克隆与功能分析，对阐明植物抗性机制、有效地进行分子育种研究十分必要，已成为国内外植物科学研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性，如提高小麦对根腐病和纹枯病的抗性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了植物抗病性相关蛋白。
本发明所提供的植物抗病性相关蛋白，名称为WMYB-R，为下述A1)或A2)或A3)的蛋白质：
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
A2)在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)在A1)的蛋白质的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的与植物抗病性相关的由A1)衍生的蛋白质。
其中，SEQ ID No.1由293个氨基酸残基组成。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述A3)中的WMYB-R蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述A3)中的WMYB-R蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述A3)中的WMYB-R蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.2的第67-948位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述WMYB-R蛋白相关的生物材料。
本发明所提供的与所述WMYB-R蛋白相关的生物材料，为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述WMYB-R蛋白的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官。
上述与所述WMYB-R蛋白相关的生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)-9)中任一所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.2的第67-948位所示的cDNA分子或DNA分子；
2)序列是SEQ ID No.2的第1-948位所示的cDNA分子或DNA分子；
3)序列是SEQ ID No.2的第67-1234位所示的cDNA分子或DNA分子；
4)序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
5)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
6)与2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
7)与3)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
8)与4)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
9)在严格条件下与1)-8)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子。
上述用于编码所述WMYB-R蛋白的核酸分子，本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述WMYB-R蛋白的核酸分子的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，与本发明分离得到的编码所述WMYB-R蛋白的核酸分子的核苷酸序列具有80％或者更高同一性且编码所述WMYB-R蛋白，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指核酸序列间的序列相似性。“同一性”包括与本发明的SEQ ID No.2的第67-948位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有80％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.2的第1-948位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有80％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.2的第67-1234位核苷酸所示的DNA分子或cDNA分子具有80％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；与本发明的SEQ ID No.2所示的DNA分子或cDNA分子具有80％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列；同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
上述80％或80％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
其中，SEQ ID No.2由1234个核苷酸组成，其编码序列是第67-948位，编码SEQIDNo.1所示的蛋白质。
上述与所述WMYB-R蛋白相关的生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达相应蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动相关基因转录的启动子，还可包括终止相关基因转录的终止子，如B2)所述的含有编码WMYB-R蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达WMYB-R蛋白的DNA。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：玉米Ubiquitin启动子、组成型启动子T7lac、花椰菜花叶病毒的组成型启动子CaMV35S、番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基(Small subunit ofribulose-1,5-bisphospate carboxylase,rbcs)基因启动子；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol.120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5,187,267)；四环素诱导型启动子(美国专利5,057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、T7终止子、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等(1985)，Nature，313:810；Rosenberg等(1987)，Gene,56:125；Guerineau等(1991)，Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)，Cell,64:671；Sanfacon等，Genes Dev.，5:141；Mogen等(1990)，Plant Cell,2:1261；Munroe等(1990)，Gene，91:151；Ballad等(1989)，Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等(1987)，NucleicAcid Res.,15:9627)。在本发明的实施例中，受体植物小麦中所述WMYB-R基因表达盒中启动所述WMYB-R基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子；终止所述WMYB-R基因转录的终止子为NOS终止子。
上述与所述WMYB-R蛋白相关的生物材料中，可用现有的植物表达载体构建含有所述WMYB-R基因的重组表达载体,所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的WMYB-R基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
B3)所述重组载体可含有SEQ ID No.2的第67-948位所示的用于编码WMYB-R蛋白的DNA序列；进一步B3)所述重组载体具体可为pA25-WMYB-R。所述pA25-WMYB-R为将pAHC25载体的SpeI和SacI/EcoICRI识别位点间的DNA序列替换为SEQ ID No.2的第67-948位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID No.1所示的WMYB-R蛋白的重组载体。
上述与所述WMYB-R蛋白相关的生物材料中，B4)所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia),欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium),产碱菌属(Alcaligenes),假单胞菌属(Pseudomonas),芽胞杆菌属(Bacillus)等。
B5)所述的转基因植物细胞系，B6)所述的转基因植物组织和B7)所述的转基因植物器官不包括植物的繁殖材料。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述1)-6)中任一种应用：
1)所述WMYB-R蛋白在调控植物抗病性中的应用；
2)所述WMYB-R蛋白在制备植物抗病性产品中的应用；
3)所述WMYB-R蛋白在培育抗病性植物中的应用；
4)所述WMYB-R蛋白相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；
5)所述WMYB-R蛋白相关的生物材料在制备植物抗病性产品中的应用；
6)所述WMYB-R蛋白相关的生物材料在培育抗病性植物中的应用。
上述应用中，所述抗病性植物可为转基因植物。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物抗病剂。
本发明所提供的植物抗病剂，含有所述WMYB-R蛋白。
上述植物抗病剂中，所述植物抗病剂可以以所述WMYB-R蛋白作为活性成分，还可以将所述WMYB-R蛋白和其它抗病性物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育具有抗病性的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育具有抗病性的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述WMYB-R蛋白的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性的转基因植物的步骤。
上述方法中，所述WMYB-R蛋白的编码基因为如下1)-9)中任一所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.2的第67-948位所示的cDNA分子或DNA分子；
2)序列是SEQ ID No.2的第1-948位所示的cDNA分子或DNA分子；
3)序列是SEQ ID No.2的第67-1234位所示的cDNA分子或DNA分子；
4)序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
5)与1)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
6)与2)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
7)与3)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
8)与4)限定的核苷酸序列具有80％或80％以上同一性，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子；
9)在严格条件下与1)-8)中任一所述限定的核苷酸序列杂交，且编码所述WMYB-R蛋白的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述WMYB-R蛋白的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体小麦中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达，例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述WMYB-R蛋白编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始，例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率，例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
上述方法中，所述WMYB-R基因通过含有WMYB-R基因表达盒的重组表达载体
(WMYB-R基因表达载体)导入所述受体植物中，所述WMYB-R基因表达盒中，启动WMYB-R基因转录的启动子是玉米Ubiquitin启动子。
所述WMYB-R基因表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
所述方法还包括从导入SEQ ID No.2的第67-948位所示的WMYB-R蛋白的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因小麦的步骤。
上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
上述应用、上述植物抗病剂或上述方法中，所述植物、所述转基因植物或所述受体植物可为单子叶植物；进一步的，所述单子叶植物具体可为小麦、大麦、玉米或水稻；所述小麦具体可为扬麦16。
上述应用、上述植物抗病剂或上述方法中，所述抗病具体可为抗根腐病和/或抗纹枯病；所述根腐病可由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)或禾旋孢腔菌(Cochlio-bolus sativus)引起，具体可由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起；所述纹枯病可由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起，所述禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)具体可为禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301。
实验证明，将本发明的WMYB-R基因转入扬麦16中获得的转基因小麦扬麦16/pA25-WMYB-R与扬麦16相比，对小麦纹枯病和小麦根腐病均具有很高的抗性，表现出显著差异(P<0.01)，说明WMYB-R基因超量表达显著增强了转WMYB-R基因小麦对纹枯病和根腐病的抗性。其中，转基因植株T1代扬麦16/pA25-WMYB-R的根腐病病级为1-2级，平均病情指数为33.40-37.20，抗病效果达到36.52％-43.00％；转空载体植株扬麦16/pAHC25的病级大部分达到3-4级，平均病情指数为56.00；扬麦16的病级大部分达到3-4级，平均病情指数为58.60。转基因植株T1代扬麦16/pA25-WMYB-R的纹枯病病级为1.06-1.50，病情指数分别为21.20-30.00，抗病效果达到53.13％-66.88％；转空载体植株扬麦16/pAHC25的平均病级为3.00，平均病情指数为60.00；扬麦16出现典型的纹枯病病症，病级为3.20，病情指数为64。将本发明的WMYB-R基因转入植物中，可提高植物的抗性，从而降低农药的使用量，以减少环境污染，具有重要的理论及实际意义，在植物的遗传改良中将发挥重要作用。
附图说明
图1为利用QRT-PCR分析小麦WMYB-R基因受小麦根腐病致病菌诱导后的表达模式图；横坐标为自小麦根腐病致病菌接种开始计时的时间；纵坐标为相对于对照组WMYB-R基因的相对表达量。
图2为转WMYB-R基因小麦TO代(a)、T1代(b)植株的PCR检测结果。其中，P代表重组载体pA25-WMYB-R；WT代表扬麦16；WMYB-R-5、WMYB-R-8、WMYB-R-10、WMYB-R-15、WMYB-R-17、WMYB-R-19和WMYB-R-22代表PCR阳性转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R的不同株系。
图3为T1代扬麦16/pA25-WMYB-R植株中WMYB-R基因的相对表达量。其中，Y16代表扬麦16；WMYB-R-5、WMYB-R-8、WMYB-R-10、WMYB-R-15、WMYB-R-17、WMYB-R-19和WMYB-R-22代表PCR阳性转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R的不同株系。
图4为抗根腐病阳性转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R和扬麦16的表型比较。其中，Y16代表扬麦16；WMYB-R-19代表T1代阳性转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R中的WMYB-R-19株系。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的小麦种质资源CI 12633抗纹枯病/根腐病，小麦品种扬麦16中感根腐病和纹枯病，小麦品种温麦6感根腐病；小麦CI 12633为江苏省农业种质资源保护与利用平台的产品；小麦品种扬麦16为江苏里下河地区农业科学研究所的产品；温麦6为中国农业科学院国家农作物种质资源保存中心的产品。
下述实施例中的小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)(NaDong,Xin Liu,Yan Lu,Li-pu DU，Hui-jun XU，Zhiyong Xin，Zengyan Zhang*(通讯作者)，2010，Overexpression of TaPIEP1,a pathogen-induced ERF of wheat,confershost-enhanced resistance to fungal pathogen Bipolaris sorokiniana，Functionaland Integrative Genomics，10：215-226)，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301(冷苏凤，张爱香，李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种(系)对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报，2010，26(6)：1176-1180；Chen Liang,Zhang Zengyan(Correspondance),Liang Hongxia,Liu Hongxia,Du Lipu,Xu Huijun,Xin Zhiyong.2008.Overexpression of TiERF1enhancesresistance to sharp eyespot in transgenic wheat.Journal of ExperimentalBotany.59:4195-4204)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的pMD18-T为宝生物工程(大连)有限公司产品。
下述实施例中的单子叶植物表达载体pAHC25(Christensen and Quail,1996；Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research，5,213–218)，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子。
本申请的发明人利用小麦基因芯片对抗病小麦CI12633与感病小麦温麦6应答纹枯病致病菌的基因差异表达数据进行分析，结合抗性表达关联分析，从小麦CI12633中鉴定出小麦抗纹枯病和根腐病重要基因，命名为WMYB-R基因。下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
实施例1、小麦抗性相关蛋白WMYB-R编码基因WMYB-R基因的克隆
利用小麦基因芯片对抗病小麦CI12633与感病小麦温麦6应答纹枯病致病菌的基因差异表达数据进行分析，结合抗性表达量间关联分析，鉴定出小麦CI12633中高表达的小麦抗纹枯病和根腐病重要基因，命名为WMYB-R基因。
取用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301接种的小麦CI12633幼苗的叶片，液氮处理，按照Invitrogen TRIZOL Reagent总RNA提取试剂说明书的方法提取叶片的总RNA。根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板。为了获得WMYB-R基因全长的cDNA序列，设计2轮扩增引物(WMYB-R-QC-12F1:5'-ATCGCCATTATCTCAATCCG-3'；WMYB-R-QC-F：5'-TGCCTAGCTCGTGGGAGTAG-3'；AuAP:5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3')，通过2轮PCR扩增，从抗病小麦CI12633cDNA中扩增到3’序列,即SEQ ID No.2所示的自5’末端第1-1234位所示的核苷酸序列。第一轮PCR扩增体系为：2×GC BufferⅠ10μL,cDNA 2.5μL(50ng),2.5mM dNTPs1.5μL,10μmol/L WMYB-R-QC-12F10.5μL,10μmol/L AuAp 0.2μL,5U/μL TaKaRa LA Taq0.2μL，ddH2O补至20μL；PCR扩增程序为：先94℃预变性8分钟；然后94℃变性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环；再72℃延伸8分钟。第二轮PCR扩增体系为：2×GC BufferⅠ10μL,一轮产物50倍稀释液2.5μL,2.5mM dNTPs 1.5μl,10μmol/L WMYB-R-QC-F 0.5μL,10μmol/L AuAp 0.2μL,5U/μL TaKaRa LA Taq 0.2μL，ddH2O补至20μL；PCR扩增程序为：先94℃预变性8分钟；然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环；再72℃延伸8分钟。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增得到一条的片段，将该PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明,该PCR扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID No.2(第1-1234位核苷酸)所示，其编码序列是SEQ ID No.2的第67-948位核苷酸；编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。
实施例2、WMYB-R基因受小麦根腐病致病菌的诱导表达分析
用小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)菌丝块摩擦接种小麦扬麦16幼苗的叶片，并将平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)菌丝块放于小麦扬麦16第一与第二基叶鞘部，分别于接种12h、24h、48h、72h、96h后取小麦扬麦16叶片，以未接种平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)的扬麦16叶片作为对照(0h)，液氮速冻后储存于-80℃超低温冰箱备用。
分别提取各个处理时间点的扬麦16的叶片总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，分别反转录成cDNA。利用小麦组成性表达基因的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用WMYB-R基因的特异引物进行实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)分析，用2-△△CT法(Livak KJ,Schmittgen TD.2001.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2-△△CT method.Methods.25:402-408)分析WMYB-R基因在小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)处理下的表达情况，每组样品重复3次。
内参基因actin的引物对：
actin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；
actin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。
WMYB-R基因的特异引物对：
WMYB-R-QF:5’-TCCGAGAATCTGGGCTACG-3’
WMYB-R-QR:5’-CGAGGAGGCTCTGTTCTTGG-3’
结果见图1，相对表达量为各个处理组的扬麦16中WMYB-R基因的表达量与对照组(0h)未受小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)侵染的扬麦16中WMYB-R基因的表达量的比值。WMYB-R基因的转录表达受小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)的诱导。对照组(0h)未受小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)处理的材料，WMYB-R基因的表达量最低；受小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)侵染12小时后扬麦16中WMYB-R基因表达量显著增加，侵染48小时时扬麦16中WMYB-R基因的表达量达到高峰，是对照组的8倍左右；侵染48小时后扬麦16中WMYB-R基因的表达量下降，但仍然高于对照组的WMYB-R基因表达量。结果表明WMYB-R基因可能参与寄主对小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)的防御反应。
实施例3、抗根腐病和纹枯病转基因小麦的获得和抗病性鉴定
一、重组表达载体的构建
1、用小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)接种小麦CI12633叶片，48小时后提取小麦CI12633叶片的RNA，反转录为cDNA；以cDNA为模板，用如下WMYB-R-TF和WMYB-R-TR组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(携带SpeI位点的WMYB-R基因)。
WMYB-R-TF:5’-ATACTAGTATGGGACGTCCGTCGTCC-3’(下划线标注为SpeI酶识别位点)；
WMYB-R-TR:5’-TCAGAAGTATGGTTCCAATT-3’。
PCR反应程序：先94℃预变性3min；然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，15个循环；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，20个循环；最后72℃延伸10min补平末端，16℃保存。
2、回收步骤1获得的PCR扩增产物。
3、用限制性内切酶SpeI酶切步骤2获得的回收产物，回收约880bp片段。
4、用限制性内切酶SpeI和EcoICRI酶切单子叶植物表达载体pAHC25，回收载体骨架。
5、将步骤3回收的880bp片段和步骤4回收的载体骨架进行连接，得到连接产物。
6、将步骤5获得的连接产物进行测序，测序结果表明载体骨架为单子叶植物表达载体pAHC25的一部分，在SpeI和EcoICRI识别位点之间插入了SEQ ID No.2的第67-948位所示的WMYB-R蛋白的编码基因，将该重组载体命名为pA25-WMYB-R。
重组载体pA25-WMYB-R为将pAHC25载体的SpeI和EcoICRI识别位点(识别序列)间的DNA序列替换为SEQ ID No.2的第67-948位所示的DNA序列，保持pAHC25的其它DNA序列不变，得到表达SEQ ID No.1所示的WMYB-R蛋白的重组载体。pA25-WMYB-R中WMYB-R蛋白的编码基因受Ubiquitin启动子控制，还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性标记。
二、转基因小麦的获得
1、将1200块扬麦16的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组载体pA25-WMYB-R轰击扬麦16的幼胚愈伤组织，将被基因枪轰击后的扬麦16的幼胚愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h，得到处理后的愈伤组织。
2、将处理后的愈伤组织转移到SD2培养基(MS培养基的无机盐成分中添加VB11mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D 2mg/L)上，恢复培养2周(26℃，暗培养)，得到恢复培养后的愈伤组织。
3、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d，得到愈伤组织分化小苗；将愈伤组织分化小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L)，24-26℃光照培养，获得了28株再生植株。
4、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，24-26℃光照培养，得到转化苗；将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆,再移栽到温室3周以后，得到28株成活的T0代植株，以下将转pA25-WMYB-R的植株称为扬麦16/pA25-WMYB-R。
5、分子鉴定
在4叶期，每株扬麦16/pA25-WMYB-R植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用WMYB-R基因ORF序列特异的一段序列作为上游引物(WMYB-R-ZJF)，WMYB-R基因一特异的一段序列作为下游引物(WMYB-R-ZJR)进行PCR扩增。以重组载体pA25-WMYB-R为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为281bp。
WMYB-R-ZJF：5’-TTTTGATTTCAACTTGGAATTGG-3’；
WMYB-R-ZJR：5’-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3’。
PCR扩增体系(25μL)：2×Taq MasterMix 12.5μL，WMYB-R-ZJF(10μM)1μL，WMYB-R-ZJR(10μM)1μL，模板DNA 100ng，补ddH2O至25μL。
PCR扩增程序：94℃预变性8min；94℃变性30s，50.5℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；72℃延伸8min，16℃保存。
将获得的PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。结果表明，在获得的28株T0代扬麦16/pA25-WMYB-R植株中，共获得7株PCR阳性植株(即PCR产物有281bp片段的扬麦16/pA25-WMYB-R植株)，分别命名为WMYB-R-5、WMYB-R-8、WMYB-R-10、WMYB-R-15、WMYB-R-17、WMYB-R-19和WMYB-R-22(图2中a)。
6、T1代单株及其分子鉴定
1)PCR检测
步骤5获得的7株PCR阳性植株分别自交后得到T1代单株，将T1代单株进行分子鉴定，方法同步骤5，以重组载体pA25-WMYB-R为阳性对照，扬麦16的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为281bp。结果表明7个PCR阳性株系的T1代扬麦16/pA25-WMYB-R PCR阳性转基因植株均检测到WMYB-R基因，部分植株PCR检测结果见图2中b。
2)转基因小麦的实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)
利用QRT-PCR分析步骤1)的7个PCR阳性株系中WMYB-R基因的表达量，以扬麦16作为对照，每组样品重复3次。使用的引物对为WMYB-R-QF/R,actin作为内参基因。
内参基因actin的引物对：
actin-F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；
actin-R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。
WMYB-R基因的特异引物对：
WMYB-R-QF:5’-TCCGAGAATCTGGGCTACG-3’
WMYB-R-QR:5’-CGAGGAGGCTCTGTTCTTGG-3’。
结果如图3所示，相对表达量为各株系中WMYB-R基因的表达量与对照(扬麦16)中WMYB-R基因的表达量的比值，7个PCR阳性株系植株WMYB-R基因的表达量明显高于扬麦16，表达量是扬麦16的5-7倍，但转基因各株系间表达量也有所差异，WMYB-R基因在WMYB-R-8株系中表达量最高，约为扬麦16的7倍。
三、转空载体小麦的获得
用载体pAHC25代替重组载体pA25-WMYB-R，其它同步骤二，得到转空载体植株，命名为扬麦16/pAHC25，作为转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R的对照。
四、转基因小麦的根腐病抗性与纹枯病抗性鉴定
1、转基因小麦的根腐病抗性鉴定
1)小麦根腐病致病菌菌丝培养
制备麦粒蛭石培养基(熟麦粒：砂＝1：1，加适量水，混匀)，灭菌后，接种小麦根腐病致病菌-平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。
2)根腐病抗性鉴定
用于鉴定的实验材料为步骤二获得的25株T1代扬麦16/pA25-WMYB-R植株(来源于WMYB-R-10株系、WMYB-R-19株系和WMYB-R-22株系)、30株步骤三获得的T1代转空载体植株扬麦16/pAHC25和26株扬麦16(转基因受体，简称Y16)。
在小麦拔节期，将一粒布满平脐蠕孢菌的麦粒嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态；接种后喷水保湿5-7天，50天后进行根腐病病情调查并拍照。
按照0-4级标准划分小麦根腐病的病级(IT)：
0级(IT 0)：全株无病；
1级(IT 1)：叶鞘有少量病斑，M1<1/4；M1＝叶鞘上的病斑面积/叶鞘的表面积；
2级(IT 2)：病菌侵入茎秆，1/4≦M2<1/2；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积；
3级(IT 3)：病菌侵入茎秆，1/2≦M2<3/4；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积；
4级(IT 4)：病菌侵入茎秆，M2≧3/4，茎秆已软腐；M2＝茎杆上的病斑面积/茎秆的表面积。
病情指数PI(％)＝(0×X0+1×X1+2×X2+3×X3+4×X4)/[(X0+X1+X2+X3+X4)]×4}×100；
式中，X0、X1、X2、X3、X4分别表示根腐病0级、1级、2级、3级、4级的茎秆数。
结果见表1，从病情调查结果得知，转基因植株T1代扬麦16/pA25-WMYB-R的根腐病抗性提高显著，病级为1-2级，平均病情指数为33.40-37.20，抗病效果达到36.52％-43.00％；转空载体植株扬麦16/pAHC25的病级大部分达到3-4级，平均病情指数为56.00；扬麦16的病级大部分达到3-4级，平均病情指数为58.60。一株抗根腐病阳性转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R的株系WMYB-R-19和一株扬麦16植株的照片见图4，结果表明，WMYB-R基因超量表达显著增强了转WMYB-R基因小麦对根腐病的抗性。
表1、转基因小麦植株与对照小麦植株的根腐病病情调查结果
注:**分别表示转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R与扬麦16有极显著差异(P<0.01水平)。
2、转基因小麦的纹枯病抗性鉴定
1)小麦纹枯病菌丝培养
将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。
制备麦粒蛭石培养基(熟麦粒：砂＝1：1，加适量水，混匀)，灭菌后，接种禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。
2)纹枯病抗性鉴定
用于鉴定的实验材料为步骤二的4个T1代扬麦16/pA25-WMYB-R株系(每个株系各10株，分别为WMYB-R-5株系、WMYB-R-8株系、WMYB-R-15株系和WMYB-R-17株系)、步骤三获得的转空载体植株扬麦16/pAHC25及野生型扬麦16。在小麦拔节期，接种小麦纹枯病致病菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)R0301菌丝：将两根布满小麦禾谷丝核菌R0301的牙签嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态，接种后喷水保湿5-7天；于小麦蜡熟期、收获时调查纹枯病病情。
纹枯病病情分级标准，按照下述文献(李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.4:31-33)中的方法进行：
0级(IT 0)：全株无病；
1级(IT 1)：第1、2叶鞘发病，但茎秆无病；
2级(IT 2)：第1、2叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于1/3；
3级(IT 3)：第3、4叶鞘发病，或病斑绕茎秆1/3-2/3；
4级(IT 4)：第5、6叶鞘发病，或病斑绕茎秆2/3-1周；
5级(IT 5)：出现枯、白穗或整株枯死。
结果表明，接种小麦纹枯病致病菌40天，WMYB-R-5植株、WMYB-R-8植株、WMYB-R-15植株和WMYB-R-17植株的平均病级分别为1.40、1.06、1.27和1.50，纹枯病病情指数分别为28.00、21.20、25.33和30.00，抗病效果达到53.13％-66.88％；扬麦16的基本茎和叶鞘出现典型的纹枯病症，平均病级为3.20，纹枯病病情指数为64.00；转空载体植株扬麦16/pAHC25的平均病级为3.00，平均病情指数为60.00；WMYB-R-5植株、WMYB-R-8植株、WMYB-R-15植株和WMYB-R-17植株均与扬麦16达极显著差异(P<0.01)(表2)，结果表明，WMYB-R基因的过表达显著增强了转基因小麦对纹枯病的抗性。
表2、转基因小麦植株与对照小麦植株的纹枯病病情调查结果
注:**分别表示转基因植株扬麦16/pA25-WMYB-R与扬麦16有极显著差异(P<0.01水平)。

Claims (4)

1.下述1)-6)中任一种应用：
1)蛋白质在调控植物抗病性中的应用；
2)所述蛋白质在制备植物抗病性产品中的应用；
3)所述蛋白质在培育抗病性植物中的应用；
4)所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；
5)所述蛋白质相关的生物材料在制备植物抗病性产品中的应用；
6)所述蛋白质相关的生物材料在培育抗病性植物中的应用；
所述1)-6)中，所述蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
所述4)-6)中，所述蛋白质相关的生物材料为下述B1)-B7)中至少一种：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
所述植物为小麦；
所述抗病为抗根腐病和/或抗纹枯病；
所述根腐病是由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起的；所述纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。
2.植物抗病剂，其特征在于：所述植物抗病剂含有权利要求1所述的蛋白质；
所述植物为小麦；
所述抗病为抗根腐病和/或抗纹枯病；
所述根腐病是由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起的；所述纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。
3.一种培育具有抗病性的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性的转基因植物的步骤；
所述植物为小麦；
所述抗病为抗根腐病和/或抗纹枯病；
所述根腐病是由平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)引起的；所述纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)引起的。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因为如下1)-4)中任一所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.2的第67-948位所示的cDNA分子或DNA分子；
2)序列是SEQ ID No.2的第1-948位所示的cDNA分子或DNA分子；
3)序列是SEQ ID No.2的第67-1234位所示的cDNA分子或DNA分子；
4)序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
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