CN103819547A

CN103819547A - 晚疫病抗性相关蛋白及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN103819547A
Application number: CN201410049534.3A
Authority: CN
Inventors: 郑峥; 刘磊; 李君明; 张春芝; 杜永臣
Original assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-02-13
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-02-13
Also published as: CN103819547B

Abstract

本发明公开了晚疫病抗性相关蛋白及其相关生物材料与应用。本发明的晚疫病抗性相关蛋白，是如下a）或b）的蛋白质：a）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物晚疫病抗性相关的蛋白质。将本发明的晚疫病抗性相关蛋白基因导入受体番茄中得到对晚疫病抗性提高的转基因番茄，说明本发明的晚疫病抗性相关蛋白基因是与晚疫病抗性相关的基因，其编码与晚疫病抗性相关的蛋白质。

Description

晚疫病抗性相关蛋白及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及晚疫病抗性相关蛋白及其相关生物材料与应用。

背景技术

晚疫病由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起，是最具毁灭性的番茄田间病害之一。在有利病原菌生长的条件下，晚疫病可以以惊人的速度蔓延，7至10天便可杀死宿主。杀菌剂是目前控制晚疫病最常用的方法。但其花费高且对人类健康和环境安全有一定负面影响。此外，病原菌的迅速繁殖，导致一些新的生理小种对常用杀菌剂不敏感。这种病害对于生产过程中不使用任何化学农药的有机种植者来说是个大问题。因此，将野生番茄抗病基因转入栽培种，是实现防治晚疫病的有效方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物晚疫病抗性相关蛋白及其相关生物材料与应用。

本发明所提供的植物晚疫病抗性相关蛋白，名称为SP-LBR3，来源于番茄（Solanumlycopersicum）CLN2037B，是如下a）或b）的蛋白质：

a）由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物晚疫病抗性相关的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由851个氨基酸残基组成。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

与SP-LBR3相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与SP-LBR3相关的生物材料，为下述B1）至B5）中的任一种：

B1）编码SP-LBR3的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1）所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的第3575-6130位核苷酸的DNA分子(cDNA分子或基因组DNA分子)；

2）核苷酸序列是SEQ ID No.1的第12-7996位所示的DNA分子(cDNA分子或基因组DNA分子)；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

本申请使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

其中，SEQ ID No.1由8007个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第3575-6130位为SP-LBR3基因的编码序列。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65℃条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，B2）所述的含有编码SP-LBR3的核酸分子的表达盒（SP-LBR3基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达SP-LBR3的DNA，该DNA不但可包括启动SP-LBR3基因转录的启动子，还可包括终止SP-LBR3转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的植物载体构建含有所述SP-LBR3基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pBINPLUS、pAHC25、pBin438、pCAMBIA2300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

在本发明的一个实施方式中，B3）所述重组载体为SP-LBR3基因表达载体pBINPLUS-SP-LBR3，pBINPLUS-SP-LBR3是用SEQ ID No.1的第10-7998位所示的SP-LBR3基因表达盒替换pBINPLUS的SbfI和AscI识别位点间的片段得到的重组表达载体。

上述生物材料中，B4）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。B5）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。在本发明的一个实施方式中，B4）所述的重组微生物为将pBINPLUS-SP-LBR3导入根癌农杆菌菌株AGL1得到的转入pBINPLUS-SP-LBR3的重组根癌农杆菌（命名为AGL1/pBINPLUS-SP-LBR3）。

SP-LBR3或上述与SP-LBR3相关的生物材料在调控植物对晚疫病的抗性中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。在本发明的一个实施方式中，所述植物为番茄。

在本发明的一个实施方式中，所述晚疫病由致病疫霉[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]生理小种T1,2,4引起。

本发明提供了利用SP-LBR3的编码基因培育抗晚疫病转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗晚疫病转基因植物的方法，包括向受体植物中导入SP-LBR3的编码基因得到对晚疫病抗性高于所述受体植物的转基因植物的步骤。

上述方法中，其中所述SP-LBR3基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述SP-LBR3基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

上述方法中，SP-LBR3的编码基因可为1）-4）中任一种：

1）其编码序列是SEQ ID No.1的第3575-6130位核苷酸的DNA分子；

2）核苷酸序列是SEQ ID No.1的第12-7996位所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码SP-LBR3的cDNA分子或基因组DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码SP-LBR3的cDNA分子或基因组DNA分子。

在本发明的一个实施方式中，所述蛋白质的编码基因通过pBINPLUS-SP-LBR3导入受体植物中，所述pBINPLUS-SP-LBR3是用SEQ ID No.1的第10-7998位所示的DNA分子替换pBINPLUS的SbfI和AscI识别位点间的片段得到的重组表达载体。

所述SP-LBR3基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物或双子叶植物。在本发明的一个实施方式中，所述受体植物为番茄。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本申请的实验证明，将SP-LBR3基因导入受体番茄中得到对晚疫病抗性提高的转基因番茄，说明SP-LBR3基因是与晚疫病抗性相关的基因，其编码与晚疫病抗性相关的蛋白质。

附图说明

图1为转SP-LBR3基因植株中SP-LBR3基因的表达量。

图2为接种后第7天的番茄叶片照片。

图2中a是来自3株未转化的番茄Solanum lycopersicum cv.Moneymaker的叶片，每个植株一个叶片；b是来自T10株系3株扦插株的叶片，每个植株一个叶片；c是来自T03株系3株扦插株的叶片，每个植株一个叶片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的番茄Solanum lycopersicum cv.Moneymaker在TomatoGenetics Resource Center（TGRC）的Accession Number是LA2706，公众可从TGRC获得该生物材料。

下述实施例中的番茄（Solanum lycopersicum）CLN2037B（AVRDC Report1999）在Asian Vegetable Research and Development Center（AVRDC）的Accession Number是CLN2037B，公众可从AVRDC获得该生物材料。

下述实施例中的pBINPLUS（FRED A.van ENGELEN,et，al.pBINPLUS:an improvedplant transformation vector based on pBIN19.Transgenic Research4,288-290(1995)）公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的根癌农杆菌菌株AGL1（Lazo GR,Stein PA,Ludwig RA:A DNAtransformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.NatureBiotechnology1991,9(10):963-967）公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的致病疫霉[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]生理小种T1,2,4(.中国18省市番茄晚疫病菌生理小种的鉴定.园艺学报2004,31(6):758～761)公众可从中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、SP-LBR3基因的克隆及其功能验证

1、SP-LBR3基因的克隆

以番茄（Solanum lycopersicum）CLN2037B的基因组DNA为模板，用引物SP-LBR3EF3（5'-taacctgcaggTTCAAACCATCTTCATAGAGGC-3'）和SP-LBR3ER3（5'-attggcgcgccTGGGGCTTAGAAAAAGGTTG-3'）通过使用Phusion高保真DNA聚合酶(Thermo Fisher,Waltham,MA,USA)PCR扩增SP-LBR3基因上游4kb、SP-LBR3基因和SP-LBR3基因下游2kb的片段，将该片段称为SP-LBR3基因表达盒PCR产物。将SP-LBR3基因表达盒PCR产物克隆到pCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)得到含有SP-LBR3基因表达盒PCR产物的重组载体pCR-SP-LBR3。测序结果表明SP-LBR3基因表达盒PCR产物的DNA序列如SEQ ID No.1，SEQ ID No.1由8007个核苷酸组成，SEQ ID No.1的第3575-6130位为SP-LBR3基因的编码序列。SP-LBR3基因编码SEQ ID No.2的蛋白质SP-LBR3。

2、通过转基因研究SP-LBR3基因的功能

2.1转SP-LBR3基因番茄的获得

用SbfI和AscI分别酶切步骤1的pCR-SP-LBR3和pBINPLUS，回收酶切得到的SP-LBR3基因表达盒和pBINPLUS的大片段，进行连接，得到SP-LBR3基因表达载体pBINPLUS-SP-LBR3。测序结果表明SP-LBR3基因表达载体pBINPLUS-SP-LBR3是用SEQID No.1的第10-7998位所示的SP-LBR3基因表达盒替换pBINPLUS的SbfI和AscI识别位点间的片段得到的重组表达载体。

将pBINPLUS-SP-LBR3通过电激法导入根癌农杆菌菌株AGL1得到转入pBINPLUS-SP-LBR3的重组根癌农杆菌命名为AGL1/pBINPLUS-SP-LBR3。

将AGL1/pBINPLUS-SP-LBR3按照Huibers等方法转化番茄Solanumlycopersicum cv.Moneymaker，番茄种子先用75%的乙醇浸泡5min，然后用20%的次氯酸钠消毒10-15min，期间不断摇动，随后用无菌水冲洗3遍，接种于MS0（Murashige&Skoog，1962）播种培养基上。置于培养间发芽7-10d，待子叶完全展开，切取子叶作为外植体。子叶在预培养基MS1上预培养2-3d。在子叶外植体预培养期间，将-80℃保存的AGL1/pBINPLUS-SP-LBR3在冰上融化后，置于含有100mg l^–1卡那霉素和50mg l^–1利福平的LB培养基中，250rpm，28℃培养至OD₆₀₀=0.6-0.8。将培养好的AGL1/pBINPLUS-SP-LBR3菌液离心，用含100μM的AS液体培养基悬浮稀释至OD₆₀₀=0.1-0.2，用于侵染外植体。菌液侵染外植体10-15min后，用灭菌的滤纸将子叶周围的菌液吸干置于共培养基MS2中黑暗培养2天。共培养后将外植体移至含有抗生素的选择培养基MS3中，7-10d后可看到叶盘切口形成愈伤组织。长出愈伤组织后每隔10-15d换一次选择培养基，4-6周后，愈伤组织长出明显的芽。将1.5-2.0cm长的芽及时切下放入生根培养基MS4中进行生根培养，3-4周后长成茎根正常的转基因植株，获得24株卡那霉素阳性T₀代植株。培养间的温度为25±2℃，湿度为60-65%，光照条件为16h：8h光照/黑暗。上述转化中所用的培养基具体如表2所示。

表2、番茄转化中各培养基的组成

培养基成分	MS0	MS1	MS2	MS3	MS4
						MS（g/L）	2.2	4.4	4.4	4.4	4.4
T-ZT(mg/L)	-	1.0	1.0	2.0	-
						IBA(mg/L)	-	-	-	-	0.5
卡那霉素(mg/L)	-	-	-	50	30
						羧苄青霉素(mg/L)	-	-	-	300	200
琼脂(g/L)	6.4	6.4	6.4	6.4	6.4
						蔗糖(g/L)	30	25	25	25	25

将获得的24株卡那霉素阳性T₀代植株移栽温室。

2.2转SP-LBR3基因番茄的鉴定

分别以2.1的24株卡那霉素阳性T₀代植株的基因组DNA为模板，利用引物M67-3F（5'-TTCGAATCCTTGTGGTAT-3'，位于pBINPLUS-SP-LBR3的SP-LBR3基因表达盒）和PBP-R2（5'-AGGGAAGAAAGCGAAAGGAG-3'，位于pBINPLUS-SP-LBR3的T-DNA区域内）进行PCR扩增筛选。结果表明有14株卡那霉素阳性T₀代植株均得到2440bp的PCR产物，该14株卡那霉素阳性T₀代植株为PCR阳性植株，其编号分别为T10、T09、T15、T08、T23、T11、T21、T01、T02、T14、T04、T20、T12、T03。

取上述14株PCR阳性植株和番茄CLN2037B（Solanum lycopersicum）按照如下方法进行实时定量PCR检测SP-LBR3基因的表达情况：

使用RNeasy植物小样提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取各个植株总RNA。用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)合成cDNA。cDNA稀释10倍后根据生产商提供的方法用Bio-Rad公司CFX96TM热循环仪进行实时定量PCR（RT-PCR）。用引物R2eF1（5'-TTCTTCTTACTGCAGTCGTCAA-3'）和R2eR1（5'-TCCAACTTCCTTTGCCTTTG-3'）检测植株的SP-LBR3基因的表达量。番茄EF1α用正向（5'-ATTGGAAACGGATATGCTCCA-3'）和反向引物（5'-TCCTTACCTGAACGCCTGTCA-3'）扩增的内部参考。基于2^-ΔΔCT法(Livak and Schmittgen2001)，计算基因表达水平。实验重复三次，以番茄（Solanum lycopersicum）CLN2037B中的SP-LBR3基因的表达量为1，计算上述14株PCR阳性植株的SP-LBR3基因的表达量。各个植株的SP-LBR3基因表达量如图1所示。

2.3转SP-LBR3基因番茄对晚疫病抗性鉴定

将2.2获得的编号分别为T10、T09、T15、T08、T23、T11、T21、T01、T02、T14、T04、T20、T12和T03的14株PCR阳性植株分别进行扦插繁殖，每个株系得到3株扦插株。

参照Chen等（CHIEN-HUA CHEN,etal.Phenotypic and Genotypic Changes in thePhytophthora infestans Population in Taiwan–1991to2006.J.Phytopathol157:248–255(2009)）和Brouwer等（Douglas J.Brouwer,Elizabeth S.Jones,andDina A.St.Clair.QTL analysis of quantitative resistance to Phytophthorainfestans(late blight)in tomato and comparisons with potato.Genome47:475–492(2004)）方法进行致病疫霉[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]生理小种T1,2,4活体接种鉴定番茄（Solanum lycopersicum）CLN2037B、Solanumlycopersicum cv.Moneymaker、编号分别为T10、T09、T15、T08、T23、T11、T21、T01、T02、T14、T04、T20、T12和T03的株系对晚疫病抗性，实验重复三次，每次具体实验方法如下：将5片叶完全展开的植株移到接种室内适应1-2天，接种室温度调至20℃，每天12h光照12h黑暗。接种之前，给植株浇足水分，保证接种室的高湿环境。采用喷雾法进行接种，致病疫霉[Phytophthora infestans（Mont.）de Bary]生理小种T1,2,4菌液浓度为1000孢子囊/mL。接种时喷雾一定要均匀，保证各层叶片都能接上，喷菌液直至植株滴水为止。接种后24h内，保证室温20±2℃，黑暗，100%相对湿度，之后室温不变，将湿度控制在60%-95%之间，光照12h。接种后第7天调查每一植株叶面积被害率（病斑面积占叶面积的百分数），进而鉴定每一植株的病害严重度，即单株病害等级。

单株病害等级：根据叶片发病情况，病情分为0-6级。0级：无病症；1级：叶部病斑细小，叶面积被害率≤5%；2级：叶部形成限制性病斑，5%＜叶面积被害率≤15%；3级：叶部有病斑，茎部无病斑，15%＜叶面积被害率≤30%；4级：茎部病斑少量，30%＜叶面积被害率≤60%；5级：茎部病斑扩展型，60%＜叶面积被害率≤90%；6级：茎部严重受害，叶面积被害率＞90%，甚至植株死亡。其中，0-4级为对晚疫病具有抗性，5-6级为对晚疫病敏感。

结果如表3所示，表明T10、T09、T15、T08、T23、T11、T21、T01、T02、T14、T04、T20、T12、T03这14个株系中，T10、T09、T15、T08、T23、T11、T21、T01和T04这9个株系的病害等级均小于4，对晚疫病具有抗性，其余四株系的病害等级均大于5，对晚疫病敏感。番茄（Solanum lycopersicum）CLN2037B的病害等级为1，对晚疫病具有抗性；Solanum lycopersicum cv.Moneymaker的病害等级为6，对晚疫病敏感。可见，将本发明的SP-LBR3基因转入对晚疫病敏感的受体番茄（Solanumlycopersicum cv.Moneymaker）中，可获得对晚疫病抗性提高的转基因番茄，说明SP-LBR3基因是与晚疫病抗性相关的基因，其编码与晚疫病抗性相关的蛋白质。

表3、各植株对晚疫病的病害等级及抗性