CN105198976B - 一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF6及其编码基因与应用 - Google Patents

一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF6及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF6及其编码基因与应用。该蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：本发明提供的蛋白具有提高植物抗逆性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。

Description

一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF6及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与植物抗逆性相关蛋白GsERF6及其编码基因与应用。
背景技术
我国盐碱地面积多达15亿亩，东北地区达5500余万亩，仅黑龙江省就高达2800余万亩。因此，盐碱逆境是制约我国农业生产的重大问题。如果能够开发利用这些广袤的盐碱地资源，对保证我国农业持续高效发展和粮食安全，具有重大的战略意义和现实意义，可创造巨大的经济效益、社会效益和生态效益。我国的盐碱地主要是碱性土壤，面积最大、造成的危害也最为严重，包括东北、华北、西北内陆等地区，其危害是在Na+引发离子毒害的基础上，增加HCO3 -和CO3 2-导致pH值升高，引起混合毒害作用。因此，研究开发碱性土壤尤为重要。
如何提高作物耐碱性是我国乃至全世界农业生产亟待解决的重大问题。近年来，随着分子生物学的不断发展，利用日趋成熟的基因工程技术培育具有优良性状及良好耐逆功能作物新品种已成为现代作物改良的重要手段之一，作物转基因技术已然成为当今世界发达国家和发展中国家的优先发展战略和抢占的科技制高点。随着现代分子生物学、生物信息学、基因工程、基因组与蛋白组学等前沿学科的迅猛发展，为挖掘功能显著的基因和转基因分子育种提供了高效、科学的技术手段。
自1987年Paz-Aies首次从玉米中克隆转录因子cDNA基因cLC6和cLC28以来，科研工作者相继从各种高等植物中分离鉴定出一系列调控植物应答生物胁迫(如病原反应)和非生物胁迫(如干旱、盐碱、低温、激素)等相关基因表达的转录因子已达数百种。因此，挖掘抗逆转录因子，将为作物转基因育种提供功能更加显著的基因资源。东北野生大豆(Glycine soja L.)具有适应性广、抗逆性强等特点，其优质基因资源丰富，是抗逆基因克隆的理想材料。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗逆性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种蛋白质，将其命名为GsERF6蛋白。
本发明提供的GsERF6蛋白，是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
b)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的的蛋白质。
其中，SEQ ID No.2所示的氨基酸序列由278个氨基酸残基组成。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID No.1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与上述GsERF6蛋白相关的生物材料。
本发明提供的与上述GsERF6蛋白相关的生物材料为下述A1)至A20)中的任一种：
A1)编码上述GsERF6蛋白的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A13)含有A1)所述核酸分子的转基因植物组织；
A14)含有A2)所述表达盒的转基因植物组织；
A15)含有A3)所述重组载体的转基因植物组织；
A16)含有A4)所述重组载体的转基因植物组织；
A17)含有A1)所述核酸分子的转基因植物器官；
A18)含有A2)所述表达盒的转基因植物器官；
A19)含有A3)所述重组载体的转基因植物器官；
A20)含有A4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是SEQ ID No.1的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，SEQ ID No.1所示的核苷酸序列由837个核苷酸组成，编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GsERF6蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GsERF6蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GsERF6蛋白且具有上述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，A2)所述的含有编码GsERF6蛋白的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达GsERF6蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动GsERF6基因转录的启动子，还可包括终止GsERF6基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述GsERF6基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施例中，GsERF6蛋白的编码基因(即SEQ ID No.1的核苷酸)通过含有GsERF6蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6导入农杆菌LBA4404中。所述重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6为用SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA 2300载体的SmaI和XbaI酶切位点之间，保持pCAMBIA 2300的其他序列不变得到的载体，重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6表达GsERF6蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了上述GsERF6蛋白或上述GsERF6蛋白相关的生物材料的用途。
本发明提供了上述GsERF6蛋白或上述GsERF6蛋白相关的生物材料在调控植物抗逆性中的应用。
本发明还提供了上述GsERF6蛋白或上述GsERF6蛋白相关的生物材料在作为转录激活因子中的应用。
本发明还提供了上述GsERF6蛋白或上述GsERF6蛋白相关的生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用。
上述应用中，所述调控植物抗逆性为提高植物抗逆性。
上述应用中，所述抗逆性为抗碱胁迫。
上述应用中，所述植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。
本发明提供的一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法包括将上述GsERF6蛋白的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物抗逆性高于所述受体植物。
上述方法中，所述GsERF6蛋白的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子。
上述方法中，所述抗逆性为抗碱胁迫。
所述抗碱胁迫具体为抗NaHCO3胁迫，体现为在NaHCO3胁迫的条件下：转基因植物的萌发率和/或存活率高于受体植物、转基因植物的根长长于受体植物、转基因植物的叶绿素含量高于受体植物和/或转基因植物的丙二醛(MDA)含量低于受体植物。
上述方法中，所述受体植物可为单子叶植物和/或双子叶植物；所述双子叶植物具体可为豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可为大豆、百脉根、苜蓿或水黄皮；所述十字花科植物可为拟南芥或油菜；所述菊科植物可为向日葵；所述拟南芥可为拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)。
在本发明的一个实施例中，GsERF6蛋白的编码基因(即SEQ ID No.1的核苷酸)通过含有GsERF6蛋白的编码基因的表达盒的重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6导入农杆菌LBA4404中。所述重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6为用SEQ ID No.1所示的DNA分子插入pCAMBIA 2300载体的SmaI和XbaI酶切位点之间，保持pCAMBIA 2300的其他序列不变得到的载体，重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6表达GsERF6蛋白。
上述方法中，所述GsERF6基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GsERF6基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述GsERF6基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
扩增编码上述GsERF6蛋白的核酸分子全长或其片段的引物对也属于本发明的保护范围。
本发明发现了一种野生大豆耐碱转录因子基因GsERF6，对其进行组织定位分析，发现其在根中的表达量明显高于其他组织。将其瞬时表达于洋葱表皮细胞，发现其主要表达在细胞核中，进一步研究发现该蛋白具有自激活活性，可能通过调控其他基因的表达水平或者转录活性使植株对碱胁迫产生抗性。本发明的实验证明，将GsERF6基因超表达于拟南芥中，可增强拟南芥在萌发期、幼苗期和成苗期对碱胁迫的耐性，说明该蛋白可以为培育具有耐碱性的转基因植物的研究奠定基础。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为野生大豆根中GsERF6基因在50mM NaHCO3(pH 8.5)处理下的表达模式。
图2为野生大豆不同组织中GsERF6基因的相对表达量。
图3为GsERF6基因在拟南芥中的组织定位分析。
图4为GsERF6基因的亚细胞定位分析。
图5为酵母细胞中GsERF6基因的转录激活活性分析。
图6为转GsERF6基因拟南芥植株分子鉴定。其中，#7、#19和#22均为T3代转GsERF6基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。
图7为转GsERF6基因拟南芥植株在6mM NaHCO3、7mM NaHCO3和8mM NaHCO3处理下的萌发期表型及萌发率的统计分析。其中，#7和#19均为T3代转GsERF6基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。
图8为转GsERF6基因拟南芥植株在6mM NaHCO3处理下的幼苗期表型。图8A为野生型及转GsERF6基因拟南芥植株在碱胁迫处理下的表型分析结果；图8B为野生型及转GsERF6基因拟南芥植株在碱胁迫处理下的根长统计结果。其中，#7和#19均为T3代转GsERF6基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。
图9为转GsERF6基因拟南芥植株在100mM NaHCO3处理下的成苗期表型分析、叶绿素含量及丙二醛含量测定结果。图9A为转GsERF6基因拟南芥植株在100mM NaHCO3处理下的成苗期表型分析结果；图9B为转GsERF6基因拟南芥植株在100mM NaHCO3处理下的叶绿素含量测定结果；图9C为转GsERF6基因拟南芥植株在100mM NaHCO3处理下的丙二醛含量测定结果。其中，#7和#19均为T3代转GsERF6基因拟南芥，WT为野生型拟南芥。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的野生大豆G07256在文献“Mingzhe Sun,Xiaoli Sun,Yang Zhao,Hua Cai,Chaoyue Zhao,Wei Ji,Huizi DuanMu,Yang Yu,Yanming Zhu.Ectopicexpression of GsPPCK3and SCMRP in Medicago sativa enhances plant alkalinestress tolerance and methionine content.PLOS ONE 2014,9(2):e89578”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pCAMBIA2300载体在文献“Ailin Liu,Yang Yu,Xiangbo Duan,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Yanming Zhu.GsSKP21,a Glycine soja S-phase kinase-associated protein,mediates the regulation of plant alkaline tolerance andABA sensitivity.Plant Mol Biol(2015)87:111–124”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的农杆菌LBA4404在文献“Ailin Liu,Yang Yu,Xiangbo Duan,Xiaoli Sun,Huizi Duanmu,Yanming Zhu.GsSKP21,a Glycine soja S-phase kinase-associated protein,mediates the regulation of plant alkaline tolerance andABA sensitivity.Plant Mol Biol(2015)87:111–124”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH109在“孙晓丽；段小红；才华；李勇；柏锡；纪巍；季佐军；朱延明。利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质。中国生物化学与分子生物学报，2010，26(11)1050-1058”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pGBKT7载体在文献“Xiao Luo,Na Cui,Yanming Zhu,Lei Cao,Hong Zhai,Hua Cai,Wei Ji,Xuedong Wang,Dan Zhu,Yong Li,Xi Bai Over-expressionof GsZFP1,an ABA-responsive C2H2-type zinc finger protein lacking a QALGGHmotif,reduces ABA sensitivity and decreases stomata size.Journal of PlantPhysiology 169(12)；1192-1202”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pBSK-35S-eGFP载体在文献“Xiaoli Sun,Wei Ji,XiaodongDing,Xi Bai,Hua Cai,Shanshan Yang,Xue Qian,Mingzhe Sun,Yanming Zhu.GsVAMP72,anovel Glycine soja R-SNARE protein,is involved in regulating plant salttolerance and ABA sensitivity.Plant Cell Tiss Organ Cult 2013,113:199–215”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的pCAMBIA3301载体在文献“Xiaoli Sun,Feifei Wang,Hua Cai,Chaoyue Zhao,Wei Ji,Yanming Zhu.Functional characterization of an Arabidopsisprolyl aminopeptidase AtPAP1 in response to salt and drought stresses.PlantCell Tiss Organ Cult(2013)114:325–338”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的大肠杆菌感受态Trans5αChemically Competent cell是全式金公司公司的产品。
下述实施例中的转录因子pGBKT7-AtDREB1A在文献“Luo X,Cui N,Zhu Y,etal.Over-expression of GsZFP1,an ABA-responsive C2H2-type zinc finger proteinlacking a QALGGH motif,reduces ABA sensitivity and decreases stomata size[J].Journal of plant physiology,2012,169(12):1192-1202.”中公开过，公众可以从东北农业大学获得。
下述实施例中的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)在文献“Luo X,Sun X,LiuB,et al.Ectopic expression of a WRKY homolog from Glycine soja altersflowering time in Arabidopsis[J].PloS one,2013,8(8):e73295.”中公开过，，公众可以从东北农业大学获得。
实施例1、大豆转录因子GsERF6基因的克隆
1、植物材料的处理
挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H2SO4中处理10min以去除泥膜，倒净浓H2SO4，用无菌水冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3天催芽，待芽长到约1～2cm时，将其转移到盛有霍格兰培养液的钵中，用太空棉固定，使芽浸入培养液中，并将其放置于人工气候箱中培养。待幼苗长至3周龄，取其根部3cm放入EP管中，置于-80℃保存。
2、RNA提取
采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)提取上述3周龄野生大豆幼苗的根的总RNA。
3、cDNA的获得
以上述总RNA为模板，反转录得到cDNA。
4、PCR扩增
以上述cDNA为模板，采用Primer-KS和Primer-KAS引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。引物序列如下：
Primer-KS：5’-GATGGCTAACGCTGCTGAAGT-3’(序列3)；
Primer-KAS：5’-TTCGTCAAATGTACAATGTACTCATC-3’(序列4)。
PCR扩增体系(50μl)：cDNA 4μl，10×PS buffer(Mg2+)10μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Primer-F 1μl，Primer-R 1μl，Prime Star DNA Polymerase(TaKaRa)0.5μl，ddH2O29.5μl。
PCR扩增条件：98℃8min；98℃10s，60℃10s，72℃1min10s，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。
将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量略小于1Kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)回收PCR扩增产物；将其与pEASY-BluntSimple载体(TRANSGEN BIOTECH)连接，得到重组质粒，将其命名为pEASY-Blunt Simple-GsERF6，并将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后送交测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为925bp的扩增产物，其中包含完整的长837bp的ORF，将其命名为GsERF6基因，其编码基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，GsERF6基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
实施例2、大豆转录因子GsERF6基因的表达特性分析
一、野生大豆根中GsERF6基因在碱胁迫处理下的表达模式分析
1、植物材料的处理
挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H2SO4中处理10min以去除泥膜，倒净浓H2SO4，用无菌水冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3天催芽，待芽长到约1～2cm时，移出，用霍格兰液体培养基进行水培。待野生大豆幼苗长至3周龄，在50mM NaHCO3(pH 8.5)条件下对野生大豆幼苗进行碱胁迫处理，分别在处理0h、1h、3h、6h、9h、12h、24h各个时间点选取3株长势相同的野生大豆幼苗，剪取其根尖3cm作为待测组织样品，迅速放于液氮中冷冻，然后置于-80℃保存。
2、总RNA的提取和cDNA的获得
采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)分别提取上述步骤1获得的不同时间处理后的待测组织样品的总RNA；以获得总RNA为模板，反转录获得cDNA。
3、Real-time PCR
以上述cDNA为模板，采用Primer-qS和Primer-qAS引物，通过Real-time PCR对GsERF6基因进行表达量检测。引物序列如下所示：
Primer-qS：5’-CCATCGTAGCACGAGGGTTG-3’；
Primer-qAS：5’-GAAACTTCAGCAGCGTTAGCC-3’。
Real-time PCR反应的条件：95℃2min→[95℃15s→60℃30s]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。
Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以野生大豆GsGAPDH基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT处理-ΔCT对照)＝2-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]。内参基因引物序列如下所示：
GsGAPDH S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；
GsGAPDH AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。
结果如图1所示：50mM NaHCO3处理下GsERF6表达呈现先下调后上调再下降趋于平稳的趋势，在根中胁迫处理6h时达到最高值，说明GsERF6基因的表达受碱胁迫的诱导。
二、野生大豆不同组织中GsERF6基因的相对表达量
1、植物材料的处理
挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H2SO4中处理10min以去除泥膜，倒净浓H2SO4，用无菌水冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3天催芽，待芽长到约1～2cm时，将其转移到盛有30％草炭土、70％普通土的育苗盆中，将其放置于人工气候箱中培养。待幼苗长至3周龄，取野生大豆不同组织(包括幼叶、老叶、茎、花、种荚、下胚轴、根)，迅速放入液氮中冷冻，置于-80℃保存待用。
2、总RNA的提取和cDNA的获得
采用RNAprep pure试剂盒(TRANSGEN BIOTECH)分别提取上述野生大豆不同组织(包括幼叶、老叶、茎、花、种荚、下胚轴、根)的总RNA；以总RNA为模板，反转录获得cDNA。
3、Real-time PCR
以上述cDNA为模板，采用Primer-qS和Primer-qAS引物，通过Real-time PCR对GsERF6基因进行表达量检测。引物序列如下所示：
Primer-qS：5’-CCATCGTAGCACGAGGGTTG-3’；
Primer-qAS：5’-GAAACTTCAGCAGCGTTAGCC-3’。
Real-time PCR反应的条件：95℃2min→[95℃15s→60℃30s]×40→95℃1min→55℃1min→95℃30s。
Real-time PCR采用比较CT法(ΔΔCT)计算基因表达量，以野生大豆GsGAPDH基因为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和3次技术重复，数据取3次生物学重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT处理-ΔCT对照)＝2-[(CT处理目的基因-CT处理内参基因)-(CT对照目的基因-CT对照内参基因)]。内参基因引物序列如下所示：
GsGAPDH S：5'-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3'；
GsGAPDH AS：5'-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3'。
结果如图2所示：GsERF6基因在野生大豆各个组织中均有表达且在下胚轴及根中表达量相对较高，表明GsERF6基因可能参与野生大豆整个生长发育过程，尤其是根的生长发育或根部的营养物质及离子吸收转运过程。
三、GUS染色法分析GsERF6基因在拟南芥中的组织表达部位
1、植物材料的处理
挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H2SO4中处理10min以去除泥膜，倒净浓H2SO4，用无菌水冲洗3～4遍后放置于湿润的滤纸上，25℃暗培养3天催芽，待芽长到约1～2cm时，将其转移到盛有霍格兰培养液的钵中，用太空棉固定，使芽浸入培养液中，并将其放置于人工气候箱中培养。待幼苗长至3周龄，取其根部3cm放入EP管中，置于-80℃保存。
2、基因组DNA的提取
按照TRANSGEN公司EASYPure Plant Genomic DNA kit试剂盒说明书步骤提取上述野生大豆根部的基因组DNA。
3、GsERF6基因启动子的获得
以上述野生大豆根部的基因组DNA为模板，采用GsERF6-pS和GsERF6-pAS引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsERF6-pro(含有GsERF6基因的启动子序列)。
GsERF6-pS：5'-TATGATCCACCCATGATCTTCC-3'；
GsERF6-pAS：5'-CGACTTTCAACCCTCGTGCTAC-3'。
PCR扩增体系(50μl)：DNA 4μl，10×PS buffer(Mg2+)10μl，dNTP Mixture(2.5mM)4μl，Primer-F 1μl，Primer-R 1μl，Prime Star DNA Polymerase(TaKaRa)0.5μl，ddH2O29.5μl。
PCR扩增条件：98℃8min；98℃10s，60℃10s，72℃2min15s，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。
PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为2.3Kb的条带，用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TRANSGEN)回收该片段。将该回收片段(PCR扩增产物)与pEASY-BluntSimple(TIANGEN)连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pEASY-BluntSimple载体上的卡那霉素抗性标记筛选阳性克隆并送交公司测序。
测序结果表明：PCR扩增得到大小为2300bp的扩增产物，将其命名为GsERF6-pro基因，其核苷酸序列如序列表中序列5所示。
4、重组载体pCAMBIA3301-GsERF6Promoter:GUS的获得
在pCAMBIA3301载体的EcoRI和BglII酶切位点之间插入序列5所示的GsERF6-pro基因，得到重组载体pCAMBIA3301-GsERF6Promoter:GUS。并对其进行测序验证。
测序结果表明：重组载体pCAMBIA3301-GsERF6Promoter:GUS为将pCAMBIA3301载体的EcoRI和BglII酶切位点间的DNA序列替换为序列表中序列5所示的GsERF6-pro基因，并保持pCAMBIA3301载体的其他序列不变得到的载体。
5、转基因拟南芥的获得
将上述重组载体pCAMBIA3301-GsERF6Promoter:GUS转化至农杆菌LBA4404中，通过花序浸润法侵染拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)，最终获得转GsERF6启动子基因的拟南芥株系。
6、碱胁迫(10mM NaHCO3)处理
对六叶期的转基因拟南芥幼苗进行碱胁迫(10mM NaHCO3)处理，分别在0h，6h和9h时间点取转基因拟南芥幼苗，并用含X-Gluc的染色液对其染色。
结果如图3所示：在没有碱处理的条件下，Gus在整棵植株如根、茎、叶中均有表达但是在根尖的分生组织中无表达，Gus在根、茎、叶中主要存在于这些组织的维管系统中，由此推论GUS不在根尖中表达的原因可能是由于根尖属于分生组织，还没有分化形成维管系统，GUS只存在于根的维管系统中(图3A)；当受到碱胁迫处理后GUS染色明显加强，说明GsERF6启动子受到碱胁迫诱导，使报告基因GUS的表达量增加(图3B、图3C)，与野生大豆中GsERF6基因受碱胁迫诱导上调表达结果一致。
实施例3、基因枪轰击介导的GsERF6基因瞬时表达与目的蛋白的亚细胞定位分析
1、亚细胞定位载体的构建
以野生大豆总cDNA为模板，采用GsERF6-YS和GsERF6-YAS引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物即GsERF6基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列，其左侧为保护碱基)：
GsERF6-YS：5'-CCGCTCGAGATGGCTAACGCTGCTGAAGTTTCA-3'；
GsERF6-YAS：5'-GCTCTAGACACAGCCACGAGCGGTGAAAAT-3'。
PCR扩增体系：20μL 5×PrimeSTARTM HS PCR缓冲液，8μL dNTP mix(A、G、T、C、各2.5mM)，2μL上下游引物(10μM)，1μL稀释100倍(含目的基因的质粒)的通用模板，1μL高保真酶[PrimeSTAR DNA Polymerase(TaKaRa)]，无菌ddH2O补足体积(总体积100μL)。
PCR反应条件：98℃8min；98℃10s，62℃10s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。
用XhoI和XbaI限制性内切酶对上述PCR扩增产物和pBSK-35S-eGFP载体进行双酶切，连接，得到含GsERF6基因的亚细胞定位载体。对含GsERF6基因的亚细胞定位载体进行测序验证表明：含GsERF6基因的亚细胞定位载体为将pBSK-35S-eGFP载体的XhoI和XbaI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF6基因，保持pBSK-35S-eGFP载体的其他序列不变得到的载体。
2、基因枪轰击介导的GsERF6基因瞬时表达
采用基因枪法将上述含GsERF6基因的亚细胞定位载体轰击洋葱表皮细胞(具体方法参见美国Bio-Rad伯乐Helios基因枪系统说明书)，以pBSK-35S-eGFP空载体为阳性对照，剪取轰击过含GsERF6基因的亚细胞定位载体和空载体的洋葱表皮细胞，装片，利用激光共聚焦显微镜下观察。
结果图4所示：GFP阳性对照在细胞内的整个区域都有表达，整个细胞均能够检测到绿色荧光信号，而GsERF6主要定位在细胞核中。
实施例4、野生大豆转录因子GsERF6基因的转录激活活性分析
1、GsERF6基因的获得
以野生大豆总cDNA为模板，采用GsERF6-ZS和GsERF6-ZAS引物进行PCR扩增，得到837bp的PCR扩增产物，即为GsERF6基因，引物序列如下所示(下划线标注引入的酶切位点序列)：
GsERF6-ZS：5'-CATACCATGGCTAACGCTGCTGAAGTTTC-3'；
GsERF6-ZAS：5'-AAAACTGCAGTCACACAGCCACGAGCGGT-3'。
2、pGBKT7-GsERF6的获得
用限制性内切酶NdeⅠ和Pst I分别对pGBKT7载体和上述PCR扩增产物进行双酶切，连接，得到pGBKT7-GsERF6重组载体，对pGBKT7-GsERF6重组载体进行测序验证。
测序结果表明：pGBKT7-GsERF6重组载体为将pGBKT7载体的NdeⅠ和Pst I酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF6基因，保持pGBKT7载体的其他序列不变得到的载体，表达GsERF6蛋白。
3、重组菌的获得
将pGBKT7-GsERF6重组载体转化酵母菌AH109，得到含质粒pGBKT7-GsERF6的酵母菌AH109，酵母感受态细胞的制备(LiAc法)及小量LiAc/PEG法转化酵母感受态细胞的具体步骤参见《分子克隆实验指南》第三版及Clontech Yeast Protocols Handbook。
4、β-半乳糖苷酶活性检测
(1)将含质粒pGBKT7-GsERF6的酵母菌AH109用接种环接种在SD/-Trp固体培养基上划线，以转录因子pGBKT7-AtDREB1A为阳性对照，以pGBKT7空载体为阴性对照，30℃培养3天后，将菌体影印到滤纸上，进行β-半乳糖苷酶活性检测。
GsERF6蛋白转录激活活性分析结果如图5B所示：由图可见，阴性对照不能使底物变蓝，阳性对照和含pGBKT7-GsERF6的基因酵母菌AH109都能使底物变蓝，说明报告基因β-半乳糖苷酶表达，GsERF6基因所表达蛋白具有自激活功能。
(2)将含质粒pGBKT7-GsERF6的酵母菌AH109用接种环接种在SD/-Trp/-His固体培养基上，以转录因子pGBKT7-AtDREB1A为阳性对照，以pGBKT7空载体为阴性对照，30℃培养3天。
结果如图5C所示：阴性对照不能在双缺的培养基上生长，阳性对照和含pGBKT7-GsERF6的基因酵母菌AH109都能在双缺的培养基上生长，说明报告基因His表达，GsERF6基因所表达蛋白具有自激活功能。
以上两个结果均表明GsERF6基因所表达蛋白具有转录激活活性，为转录激活子。此结果与已有文献报道其家族中其他成员具备转录激活活性一致。
实施例5、转GsERF6拟南芥植株的获得及在其碱胁迫下的表型分析
一、转GsERF6拟南芥植株的获得
1、GsERF6基因的获得
以实施例1中的步骤4得到的pEASY-Blunt Simple-GsERF6为模板，采用引物Primer-ES和Primer-EAS进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即GsERF6基因。引物序列如下：
Primer-ES：5’-TGACCCGGGATGGCTAACGCTGCTG-3’；
Primer-EAS：5’-TGCTCTAGATCACACAGCCACGAGCGGT-3’。
PCR扩增体系(10μl)：模板1μl，buffer 1μl，dNTP Mixture(2.5mM)0.4μl，Primer-UA0.5μl，Primer-UAS 0.5μl，PfuCx DNA Polymerase(TaKaRa)0.2μl，ddH2O 6.4μl。
PCR扩增条件：95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃终止反应。
2、植物表达载体的获得
用限制性内切酶SmaI和XbaI对pCAMBIA 2300载体和上述PCR扩增产物进行酶切，连接，得到重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6。并对其进行测序验证。
测序结果表明：重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6为将pCAMBIA 2300载体的SmaI和XbaI酶切位点之间的DNA片段替换为序列表中序列1所示的GsERF6基因，并保持pCAMBIA2300载体的其他序列不变得到的载体。GsERF6基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
3、转化
采用冻融法，将重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6转化至根癌农杆菌LBA4404中，经PCR鉴定得到阳性转化子(含有序列表中序列1所示的GsERF6基因的转化子)，用于侵染拟南芥植株。
4、转GsERF6拟南芥的获得
将含有重组载体pCAMBIA 2300-GsERF6的农杆菌通过Floral-dip法侵染野生型拟南芥(哥伦比亚生态型col-0)，将侵染过的拟南芥进行培养，得到T0代转GsERF6拟南芥种子。将T0代转GsERF6拟南芥种子表面消毒后，播种于含25mg/L固杀草(glufosinate-ammonium，Sigma，45520)的1/2MS培养基上筛选，得到T1代转GsERF6拟南芥幼苗。如此重复，直至得到T3代转GsERF6拟南芥纯合体株系。
提取T3代转GsERF6拟南芥幼苗的基因组RNA，进行RT-PCR鉴定。具体步骤如下：
提取上述T3代转GsERF6拟南芥植株的总RNA，反转录得到cDNA；以cDNA为模板，分别采用Primer-qS和Primer-qAS引物对、Actin2S和Actin2AS引物对，通过RT-PCR对GsERF6基因进行表达量检测，得到PCR扩增产物。引物序列如下所示：
Primer-qS：5’-CCATCGTAGCACGAGGGTTG-3’；
Primer-qAS：5’-GAAACTTCAGCAGCGTTAGCC-3’；
Actin2S：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；
Actin2AS：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。
PCR扩增体系：5μL 2×Easy Taq DNA Polymerase，0.8μL上下游引物(10μM)，1μL稀释100倍的cDNA，无菌ddH2O补足体积(总体积10μL)。
PCR扩增条件：
GsERF6：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×30→72℃10min→4℃终止反应；
Actin 2：94℃10min→[94℃30s→60℃30s→72℃90s]×28→72℃10min→4℃终止反应。
将PCR扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测结果如图6所示：野生型拟南芥植株的RT-PCR无扩增产物，而T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7、T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#22都可以扩增出目的条带，表明外源基因GsERF6基因不但已顺利整合到拟南芥的基因组上，而且能够在转基因拟南芥中正常转录表达。选取T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19用于下一步的表型分析。
三、转GsERF6拟南芥植株在碱胁迫下的表型分析
1、转GsERF6拟南芥在碱处理下的萌发期表型及萌发率
选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)、T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19的种子，用5％次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，一部分种子播种于正常培养基，观察表型并统计萌发率；一部分种子分别播种于含有6mM、7mM和8mM NaHCO3的1/2MS固体培养基上，每天观察表型并统计萌发率。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系90株。
结果如图7所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，control)，T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19与野生型拟南芥种子的萌发状态无显著差异，说明导入的GsERF6基因并未对拟南芥萌发期的生长、发育造成影响；在6mMNaHCO3、7mM NaHCO3和8mM NaHCO3胁迫下，T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19与野生型拟南芥的萌发都受到抑制，但T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19的生长受抑制的程度明显比野生型小，且T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19的萌发率明显高于野生型植株。
2、转GsERF6拟南芥在碱处理下的幼苗期表型及根长
选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)、T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19种子，用5％次氯酸钠消毒液消毒10min后，于4℃春化3d，播种于1/2MS固体培养基上。1周后，挑选长势一致的转GsERF6拟南芥和野生型拟南芥幼苗水平摆放于6mM NaHCO3胁迫培养基的平皿中，竖直生长，观察各处理组和非处理组的拟南芥长势和根长，所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系15株。
结果如图8所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，control)，T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和#19与野生型拟南芥的生长发育并没有显著差异，表明导入的GsERF6基因并未在幼苗期对拟南芥的生长、发育造成影响；在NaHCO3胁迫处理条件下，转GsERF6拟南芥与野生型拟南芥的生长都受到了抑制，但在6mM NaHCO3处理下，野生型生长抑制更明显，转GsERF6拟南芥的根长显著长于野生型。因此超量表达GsERF6基因提高了拟南芥在幼苗期对碱胁迫的耐性。
3、转GsERF6拟南芥在100mM NaHCO3处理下的成苗期表型及叶绿素和丙二醛含量的测定
选取饱满的野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)、T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7、和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系19#种子，4℃春化3d后，播种于营养钵中(营养土，君子兰土，蛭石按1：1：1混合)，置于温室中培养(22℃，光照16h/d)。3周后，对于碱处理的苗每2～3d浇灌一次100mM NaHCO3溶液。15d后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势，并测定处理组和非处理组叶绿素含量及丙二醛含量(检测方法参见文献“植物生理实验/郝再彬等主编哈尔滨工业大学出版社，2004.9”)。所有实验技术重复和生物学重复各3次。每次实验每个株系40株。
100mM NaHCO3处理下转GsERF6拟南芥与野生型拟南芥的长势情况如图9A所示：在正常条件下(即无任何胁迫未处理，处理前)，T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#7和T3代转GsERF6拟南芥纯合株系#19与野生型拟南芥的成苗生长发育情况并没有显著差异，表明导入的GsERF6基因并未在成苗期对拟南芥的生长、发育造成影响；对于浇灌100mM NaHCO3溶液的成苗，野生型大部分叶片发黄、萎蔫、卷曲最终死亡，但转GsERF6拟南芥叶片发生轻度萎蔫，基本都完全存活并开始生殖生长，且转GsERF6拟南芥的存活率明显高于野生型。
100mM NaHCO3处理下转GsERF6拟南芥与野生型拟南芥的叶绿素含量及丙二醛含量测定结果如图9B和图9C所示：由图9B可见在浇灌100mM NaHCO3溶液情况下，野生型叶片失绿程度要大于转基因拟南芥，通过测定叶绿素含量可知，在胁迫处理下野生型与转基因植株叶绿素含量都有所下降，但野生型的降低幅度明显比转基因株系要大，说明野生型植株的光合系统受到的伤害程度更大；丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物之一，其含量可以反映植物遭受伤害的程度，如图9C所示，碱胁迫处理后，野生型与转基因植株的MDA含量均有所上升，说明所有植株均受到不同程度碱胁迫的伤害，但是与野生型相比，转GsERF6的拟南芥MDA含量上升的幅度显著低于野生型，说明其膜脂氧化程度较低，受到胁迫的伤害较轻。成苗期碱胁迫实验说明GsERF6基因可以正向调节拟南芥的耐碱性。

Claims (7)

1.一种蛋白质或其相关生物材料在调控植物抗逆性中的应用；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述抗逆性为抗碱胁迫。
2.一种蛋白质或其相关生物材料在培育抗逆性转基因植物中的应用；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述抗逆性为抗碱胁迫。
3.权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述相关生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：
A1)编码所述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为SEQ ID No.1的DNA分子。
5.一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法，包括将一种蛋白质的编码基因导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的抗逆性高于所述受体植物；
所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述抗逆性为抗碱胁迫。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。
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