CN103923196B

CN103923196B - 来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN103923196B
Application number: CN201410131071.5A
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 杨坤; 荣玮; 杜丽璞; 魏学宁; 叶兴国
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2014-04-02
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2034-04-02
Also published as: CN103923196A

Abstract

本发明公开了来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用。TaPK-R1是如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质。实验证明TaPK-R1以及与TaPK-R1相关的生物材料可用于调控植物抗病性，特别是可用于调控小麦对纹枯病的抗性。

Description

来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及来源于小麦的抗病性相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，对于保障粮食安全起着举足轻重的作用。随着肥水条件的改良、种植密度增加和耕作制度的改变，小麦纹枯病已发展成我国小麦生产的主要病害，成为我国小麦高产稳产的重要限制因素。小麦纹枯病，也称为小麦尖眼斑病（wheatsharpeyespot），是由腐生营养型病原真菌禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)AG4、AG5融合群引起的一种世界性小麦土传真菌病害。我国小麦纹枯病主要病原菌为禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)。纹枯病一般可使小麦减产10%～30%，严重地块则使小麦减产50%以上。据全国农技推广站报道，2005—2011年我国小麦纹枯病每年发生面积约1亿亩，经济损失达数十亿元以上，已成为我国小麦主产区小麦第一大病害。因此，选育和推广抗纹枯病小麦新品种是防治该病害流行的最经济、安全和有效的途径，对于保证我国小麦高产、稳产非常重要。然而，由于缺乏易于利用的小麦纹枯病抗性种质资源，常规育种方法在抗纹枯病小麦品种育种方面进展缓慢。分子生物学和基因工程的发展为植物抗性育种开辟了一条新途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于小麦的抗病性(如抗纹枯病)相关蛋白TaPK-R1及其相关生物材料与应用。

本发明所提供的小麦抗病性相关蛋白，名称为TaPK-R1，来源于抗纹枯病的小麦品系CI12633，是如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病性相关的蛋白质。

序列表中的序列2由557个氨基酸残基组成。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK1 -->
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

与TaPK-R1相关的生物材料也属于本发明的保护范围。

本发明所提供的与TaPK-R1相关的生物材料，为下述B1）至B7）中的任一种：

B1）编码TaPK-R1的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系；

B6）降低TaPK-R1表达的核酸分子；

B7）含有B6）所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

上述生物材料中，B1）所述核酸分子具体可为如下1）或2）或3）或4）所示的基因：

1）其编码序列是序列表中序列1的第67-1740位核苷酸的DNA分子；

2）核苷酸序列是序列表中序列1的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码TaPK-R1的DNA分子；

4）与1）或2）限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码TaPK-R1的DNA分子。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，B6）所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第67-1740位核苷酸所示的DNA分子中任一片段反向互补的DNA分子，如与序列表中序列1的第2716-3030位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子。

其中，序列表中的序列1由2077个核苷酸组成，其编码序列是序列表中序列1的第67-1740位核苷酸，编码序列表的序列2所示的蛋白质。

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1%SDS的溶液中，在65oC条件下杂交并洗膜。

上述生物材料中，B2）所述的含有编码TaPK-R1的核酸分子的表达盒（TaPK-R1基因表达盒），是指能够在宿主细胞中表达TaPK-R1的DNA，该DNA不但可包括启动TaPK-R1基因转录的启动子，还可包括终止TaPK-R1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)PlantPhysiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBOJ.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人GenesDev.,5:141;Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)。

在本发明的实施例中，所述TaPK-R1基因表达盒中启动所述TaPK-R1基因转录的启动子为玉米Ubiquitin启动子，终止所述TaPK-R1基因转录的终止子为胭脂碱合成酶基因终止子TNos。

可用现有的植物表达载体构建含有所述TaPK-R1基因表达盒的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，B4）和B7）所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。B5）和B7）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

实验证明TaPK-R1、或上述与TaPK-R1相关的生物材料可用于调控植物抗病性。

其中，所述抗病性具体可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）引起，所述禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）具体可为禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如小麦。既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦（如小麦品种扬麦20）。

本发明提供了两种具体的利用上述与TaPK-R1相关的生物材料调控植物抗病性的方法，一种是培育抗病性转基因植物的方法，另一种是培育纹枯病抗性降低的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入TaPK-R1的编码基因（TaPK-R1基因）得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物的步骤。

在本发明的实施例中，所述TaPK-R1的编码基因通过含有TaPK-R1基因表达盒的TaPK-R1基因重组表达载体导入目的植物中。

上述方法中，其中所述TaPK-R1基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：

1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述TaPK-R1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

在本发明的一个实施例中，所述TaPK-R1基因重组表达载体具体为用序列表中序列1的第67-1740位核苷酸的DNA分子替换pAHC25的SpeI和SacI酶切位点间的片段得到的重组表达载体。

所述TaPK-R1基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463;GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition)。

上述方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物，如小麦。所述单子叶植物具体可为小麦（如小麦品种扬麦20）。所述抗病具体可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）引起，所述禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）具体为禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明所提供的培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括是降低目的植物中TaPK-R1编码基因（TaPK-R1基因）的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。

所述目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦（如小麦品种扬麦20）。所述抗病具体可为抗纹枯病。所述纹枯病可由禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）引起，所述禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）具体为禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301。

在本发明的一个实施例中，降低目的植物中TaPK-R1基因的表达是通过将与序列表中序列1的第1634-1936位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。

在本发明的一个实施例中，与序列表中序列1的第1634-1936位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子通过BMSV病毒的γ载体导入所述目的植物中。

所述目的植物具体可为小麦。

扩增编码TaPK-R1的核酸分子的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

将TaPK-R1基因导入小麦的转基因的分子检测与抗病性实验结果证明，TaPK-R1基因过表达的转TaPK-R1基因小麦对小麦纹枯病的抗性显著提高；而抗病小麦CI12633中所述TaPK-R1基因表达被抑制则使该植株对纹枯病抗性降低，说明TaPK-R1基因是小麦抗纹枯病反应所需的抗病基因，正向参与抗纹枯病反应。TaPK-R1基因是一种与纹枯病抗性相关的小麦抗病蛋白基因，对植物育种具有重大价值。

附图说明

图1为TaPK-R1基因在未接种禾谷丝核菌及接种禾谷丝核菌21天的抗纹枯病小麦CI12633和感纹枯病小麦温麦6号中的表达分析。mock:未接种禾谷丝核菌的小麦；21DPI:接种禾谷丝核菌21天。

图2为pAHC25-TaPK-R1表达载体的构建流程图。

图3为转TaPK-R1基因小麦T₁代部分植株的PCR检测结果。

1-15为T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1，其中，1、2、3、4、7、9、13、14为T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株；P为pAHC25-TaPK-R1;WT:未转基因扬麦20；图中箭头所示为目的片段。

图4为转TaPK-R1基因小麦叶鞘中TaPK-R1基因(a)和禾谷丝核菌的actin（Rcactin）基因(b)的表达分析。

Yang20:受体小麦扬麦20；PK13、PK35、PK37:T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株。

图5为TaPK-R1基因被沉默的转基因小麦中TaPK-R1基因的表达分析。

Mock:未接种BSMV病毒的植株，即小麦CI12633；BSMV:GFP:接种BSMV-γ的植株；BSMV:TaPK-R1-1、BSMV:TaPK-R1-2和BSMV:TaPK-R1-3均为接种BSMV-γ：antiTaPK-R1的植株。

图6为接种禾谷丝核菌40天的TaPK-R1基因被沉默的转基因小麦中禾谷丝核菌actin基因的qRT-PCR分析。

图7为接种禾谷丝核菌40天时TaPK-R1基因被沉默的转基因小麦的小麦纹枯病病症观察结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

小麦种质资源CI12633抗纹枯病，小麦品种温麦6高感纹枯病。温麦6号来自中国农业科学院种质资源库，小麦CI12633来自江苏农业科学院种质资源库。小麦品种扬麦20来自江苏里下河地区农业科学研究所，公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。

小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301（江苏省农业科学院）（冷苏凤，张爱香，李伟，陈怀谷.江苏省小麦新品种（系）对纹枯病的抗性分析.江苏农业学报，2010，26（6）：1176-1180）。公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。

单子叶植物表达载体pAHC25（ChristensenandQuail,1996;Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch，5,213–218），公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子。

BSMV-γ（BMSV病毒的γ载体）（Burch-SmithTM,AndersonJC,MartinGB,Dinesh-KumarSP.Applicationsandadvantagesofvirus-inducedgenesilencingforgenefunctionstudiesinplants.ThePlantJournal，2004,39:734-746）公众可以从中国农业科学院作物科学研究所获得，以重复本申请实验。

实施例1、小麦抗性蛋白TaPK-R1及其编码基因的克隆

本发明的发明人通过基因芯片对抗纹枯病小麦CI12633与感纹枯病小麦温麦6应答纹枯病菌、抗纹枯病小麦山红麦与感纹枯病小麦温麦6应答纹枯病菌的2套基因差异表达数据进行分析，结合抗性程度与表达量关联分析，从CI12633中分离克隆出小麦抗纹枯病的蛋白激酶基因-TaPK-R1基因。具体克隆方法如下：

提取小麦CI12633叶鞘的总RNA，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，以

TaPK-R1-OF1：5'-GCATCGGGTTCTACGGAG-3'和TaPK-R1-OR1：

5'-GAGACTGTCAAACCAACATACG-3'为引物，进行第一轮PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后94℃45秒，60℃40秒，72℃2.5分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；以稀释50倍的第一轮PCR扩增产物作为模板，利用TaPK-R1-OF2：

5'-CGGCTGCTGGATTGGT-3'和TaPK-R1-OR2：5'-CGGCGAACCAAACAGG-3'为引物，进行第二轮PCR扩增，扩增程序为：先94℃预变性3分钟；然后94℃45秒，55℃40秒，72℃2.5分钟，共35个循环；72℃延伸10分钟；第二轮PCR反应结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的PCR条带。将该第二轮PCR产物连接到pMD18-T载体上并测序。测序结果表明，该PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列1的第1-1947位氨基酸所示，其编码序列是序列表中序列1的第67-1740位核苷酸；编码序列2所示的蛋白质TaPK-R1。

为了获得TaPK-R1基因全长的cDNA序列，设计3’RACE引物（Ta-PK-R1-3’-F1:5’-TAATGTTGAGCAGAGACTTGG-3’和Ta-PK-R1-3’-F2:

5’-ATGAAGTTGCCGGGATTGC-3’），通过2轮PCR扩增，从抗病小麦CI12633cDNA中扩增到3’序列,即序列1所示的自5’末端第1544-2077核苷酸。

2、TaPK-R1基因受纹枯病菌诱导的表达分析

为了研究TaPK-R1基因表达量与小麦纹枯病抗性是否相关，利用Q-RT-PCR分析TaPK-R1基因在经禾谷丝核菌诱导前后的抗纹枯病和感纹枯病小麦中的表达情况。

用小麦纹枯病致病菌-禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301菌丝牙签、麦粒接种于小麦CI12633及感纹枯病小麦温麦6号分蘖期幼苗的叶鞘与茎间；以未接种小麦叶鞘作为对照（0h），于接种21天后取小麦叶鞘与茎，液氮速冻后储存于－80℃超低温冰箱备用。

分别提取各小麦茎的总RNA(每个样品约5μg总RNA)，根据Invitrogen公司第一链cDNA合成试剂盒的程序，反转录成cDNA。利用组成性表达的actin基因作为内参，将样品cDNA浓度均一化。然后用TaPK-R1基因的特异引物进行实时定量RT-PCR分析，用2^-△△CT法（LivakKJ,SchmittgenTD.2001.Analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativePCRandthe2^-△△CTmethod.Methods.25:402-408）分析TaPK-R1基因在小麦纹枯病菌处理下的表达情况，每组样品重复3次。

内参基因actin的引物对：

F：5’-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3’；R：5’-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3’。

TaPK-R1基因的特异引物对：TaPK-R1-Q-F：5’-ATGAAGTTGCCGGGATTGC-3’和TaPK-R1-Q-R，5’-CGGCGAACCAAACAGG-3’

对接种禾谷丝核菌前后的CI12633和温麦6号的TaPK-R1基因表达量分析结果表明，该基因在抗纹枯病小麦CI12633中受禾谷丝核菌诱导表达，在感纹枯病小麦温麦6号中受禾谷丝核菌下调表达。在接种禾谷丝核菌21天时，TaPK-R1基因在抗纹枯病小麦CI12633中的表达量明显高于其在感纹枯病小麦温麦6号中的表达量（图1）。

实施例2、抗纹枯病转基因小麦的获得和抗病性鉴定

一、重组表达载体的构建

将TaPK-R1基因完整的ORF序列构建到单子叶植物高效表达载体pAHC25上，具体步骤如下：

1、线性化质粒的制备：用SpeI和SacI酶切pAHC25载体质粒，1%琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收线性化pAHC25载体构架。

2、含酶切位点的目标基因TaPK-R1的获得：根据TaPK-R1基因的ORF序列设计一对引物TaPK-R1-P25-F：5'-GAACTAGTATGGATTCCGCGAGAAGT-3'和TaPK-R1-P25-R：5'-GCGAGCTCCTATTTACGTCGAGGTTG-3'，提取小麦CI12633叶鞘的总RNA，将提取的RNA样品反转录合成第一链cDNA，作为基因克隆的模板，通过PrimeSTARHSDNAPolymerase高保真酶扩增基因的ORF片段，并在ORF的5’端和3’端分别添加SpeI和SacI限制性内切酶的酶切位点，扩增片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测并进行回收纯化。回收的PCR产物与克隆载体pMD18-T载体连接、转化到Top10感受态细胞中并测序，选取测序正确的阳性单克隆并提取pMD-18T-PK-R1质粒。用限制性内切酶SpeI和SacI双酶切pMD-18T-PK-R1，获得两侧带酶切位点的目标基因TaPK-R1的ORF序列。

3、目标基因TaPK-R1与线性化载体连接：配制如下反应体系（10μl）：

连接反应于16℃恒温过夜选取序列正确的单克隆，提取pAHC25载体质粒用于后续实验。

4、将连接产物热激转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，37℃培养8h后挑取单克隆，通过菌落PCR筛选阳性克隆，并进一步测序验证。测序结果表明，用序列表中序列1的第67-1740位核苷酸的DNA分子替换pAHC25的SpeI和SacI酶切位点间的GUS基因片段得到的重组表达载体命名为pAHC25-TaPK-R1。

重组质粒pAHC25-TaPK-R1的结构：骨架载体为pAHC25，在SpeI和SacI酶切位点之间插入了序列表中序列1的第67位至第1740核苷酸所示的TaPK-R1基因；TaPK-R1基因受玉米Ubiquitin启动子控制；质粒还具有1个受Ubiquitin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦（Bialaphos）筛选转化再生植株提供抗性标记。

二、转基因植物的获得

1、将2000块扬麦20的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pAHC25-TaPK-R1轰击到愈伤组织。

2、将被基因枪轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。

3、然后将愈伤组织转移到SD2培养基（MS培养基的无机盐成分中添加VB₁1mg/L，天冬门酰胺150mg/L,2,4-D2mg/L)上，恢复培养2周（26℃，暗培养）。

4、将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中（1/2MS培养基+萘乙酸1mg/L+激动素1mg/L+双丙氨膦2-5mg/L），24-26℃光照培养14d；将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中（1/2MS培养基+双丙氨膦2-3mg/L），24-26℃光照培养；获得了235株再生植株。

5、将再生植株转移到壮苗培养基(1/2MS培养基+0.5mg/L萘乙酸)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆,在移栽到温室3周以后，得到14株T₀代的转pAHC25-TaPK-R1的植株，以下将转pAHC25-TaPK-R1的植株称为扬麦20/pAHC25-TaPK-R1。

6、分子鉴定

在4叶期，每株扬麦20/pAHC25-TaPK-R1取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，利用TaPK-R1基因特异的一段序列作为上游引物(TaPK-R1-1584F:5’-ATGAAGTTGCCGGGATTGC-3’)和载体Tnos序列特异的一段序列作为下游引物（tNOS-R:5'-ATGTATAATTGCGGGACTCTAAT-3'，进行PCR扩增，以重组表达质粒pAHC25-TaPK-R1为阳性对照，扬麦20的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为386bp（序列3）。

其中，PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

先94℃5min；然后8个如下循环：94℃30s，63℃→55℃30s，72℃30s)，每个循环退火温度降低1℃；再35个如下循环：94℃30s，55℃30s，72℃30s；再72℃10min；4℃保存。

PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外拍照，记录结果。

结果表明14株T₀代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1中，有4株PCR阳性植株（即PCR产物有386bp片段的扬麦20/pAHC25-TaPK-R1植株）。

7、T₁代单株及其分子鉴定

将步骤6的3株PCR阳性植株自交后得到46株T₁代单株。将46株T₁代单株进行分子鉴定，方法同步骤6，共检测出T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株27株，这27株PCR阳性转基因植株的PCR产物中均有约386bp的片段，该27株T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株的编号分别为表2的13-1至13-12，35-1至35-4,37-1至37-10；部分单株PCR检测结果见图3。以重组表达质粒pAHC25-TaPK-R1为阳性对照，扬麦20的基因组DNA为阴性对照，预期扩增产物片段为386bp。

三、转空载体植物的获得

用载体pAHC25代替重组质粒pAHC25-TaPK-R1转化扬麦20，其它同步骤二，得到转空载体植株，命名为扬麦20/pAHC25，作为扬麦20/pAHC25-TaPK-R1的对照。

四、转基因植物纹枯病抗性鉴定及TaPK-R1基因的转录水平

1、小麦纹枯病菌丝培养

将牙签段竖立塞满小烧杯，配制MS液体培养基，倒入装牙签段的小烧杯中，灭菌后将保存的禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301菌丝块接种到烧杯中，25℃恒温培养至菌丝密集地布满牙签。

制备麦粒蛭石培养基（熟麦粒：砂＝1：1，加适量水，混匀），灭菌后，接种禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301，25℃恒温培养至菌丝密集地布满麦粒。

2、纹枯病抗性鉴定

用于鉴定的实验材料为步骤二的27株T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株、步骤三的10株转空载体植株扬麦20/pAHC25和20株野生型植株扬麦20。

在小麦拔节期，将两根布满小麦禾谷丝核菌R0301的牙签嵌入到小麦基部第1-2叶鞘之间，接种时尽量保持叶鞘的自然抱茎状态，接种后喷水保湿5-7天；于小麦蜡熟期、收获时调查纹枯病病情。

纹枯病病情分级标准，按照李斯深等方法进行（李斯深,李安飞,李宪彬等.1997,小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源.(4):31-33）：

0级(IT0)：全株无病；

1级(IT1)：第1、2叶鞘发病，但茎秆无病；

2级(IT2)：第1、2叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于1/3；

3级(IT3)：第3、4叶鞘发病，或病斑绕茎秆1/3-2/3；

4级(IT4)：第5、6叶鞘发病，或病斑绕茎秆2/3-1周；

5级(IT5)：出现枯、白穗或整株枯死。

T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株对纹枯病抗性显著提高，结果见表2。27株T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株的纹枯病平均病级为1.51，病情指数为30.25，而野生型扬麦20植株的纹枯病平均病级分别为2.32，病情指数分别为46.49，说明转TaPK-R1基因可增强植株对纹枯病抗性。表2中，株系编号为13-1～37-11的27个植株为T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1PCR阳性转基因植株；株系编号为扬麦20的21个植株为扬麦20野生型植株（受体植株），株系编号为转空载体-扬麦20的10个植株为扬麦20/pAHC25，TaPK-R1平均表示27个植株为T₁代扬麦20/pAHC25-TaPK-R1转基因PCR阳性植株的平均值。

表2转TaPK-R1基因小麦T₁代植株、扬麦20和转空载体扬麦20的纹枯病病情调查结果

3、转基因小麦中TaPK-R1基因与纹枯菌actin基因的转录表达分析

转基因植株及受体扬麦20植株接种纹枯菌14天后，提取其接种纹枯菌部位叶鞘RNA，反转录合成cDNA，利用引物TaPK-R1-Q-F：5’-ATGAAGTTGCCGGGATTGC-3’和TaPK-R1-Q-R，5’-CGGCGAACCAAACAGG-3’，荧光定量RT-PCR分析TaPK-R1基因的转录水平；利用引物RCactin-F/RCactin-R荧光定量RT-PCR分析侵入叶鞘中纹枯菌actin基因的相对表达量，以此反映侵入小麦植株中纹枯菌的生物量。结果如图4a和图4b所示，转基因小麦植株中TaPK-R1基因的转录水平高于未转基因小麦受体扬麦20；转基因小麦植株中纹枯菌actin基因的相对表达量显著低于未转基因小麦受体扬麦20，即侵入转基因植株中纹枯菌的数量少于侵入未转基因小麦受体扬麦20中的纹枯菌数量。上述结果说明，TaPK-R1基因的高表达显著提高了转TaPK-R1基因小麦植株对纹枯菌的抗性。

纹枯菌actin基因转录分析引物对：

RCactin-F:5’-gcatccacgagaccacttac-3’

RCactin-R:5’-gcgtcccgctgctcaagat-3’

实施例3、培育纹枯病性降低的基因沉默小麦

一、采用病毒介导的基因沉默技术沉默小麦CI12633中的TaPK-R1基因

1、将序列表中序列1的第1634-1936位核苷酸所示的DNA片段的两末端分别带有NheI识别序列。NheI酶切后，将序列表中序列1的第1634-1936位核苷酸所示的DNA片段（303bp）以反向插入法插入到NheI酶线性化后的BSMV-γ（BMSV病毒的γ载体）上，使与序列表中序列1的第1634-1936位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子（名称为antiTaPK-R1，核苷酸序列为序列3）被γ载体的T7启动子驱动，得到重组载体BSMV-γ：antiTaPK-R1。

2、于两叶一心期，用重组载体BSMV-γ：antiTaPK-R1转染抗小麦纹枯病材料——小麦CI12633的第二片叶，具体步骤如下：

（1）采用摩擦法接种BSMV-γ：antiTaPK-R1（或BSMV-γ）到第二片叶完全伸展的抗病材料CI12633的第二片叶上。接种时，用未接种手固定小麦幼苗的基部，接种手的拇指和食指压住叶片，沿着叶片伸展的方向，从叶底部连续摩擦到叶尖，一、二两片叶子同时接种。

（2）接种完成后，向小麦幼苗喷施DEPC水，保鲜膜覆盖保湿24h，之后移去保鲜膜，每隔1-2h喷施一次DEPC水。

（3）接种第14天取第四片叶片，提取RNA，采用Q-RT-PCR检测TaPK-R1基因沉默情况（PKR1-QF：5’-ATGAAGTTGCCGGGATTGC-3’和PKR1-QR，5’-CGGCGAACCAAACAGG-3’）。

结果如图5所示：导入BSMV-γ：antiTaPK-R1的CI12633植株中TaPK-R1基因被沉默，得到TaPK-R1基因沉默的CI12633（命名为BSMV-γ：antiTaPK-R1-CI12633）；而导入BSMV-γ的CI12633（命名为BMSV-γ-CI12633，作为对照）与野生型小麦CI12633中TaPK-R1基因的表达量没有显著变化。

二、被沉默植株的抗病性鉴定

步骤一的小麦转染BSMV14天后，采用牙签接种法对其接种禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301，将长满禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301菌丝的牙签嵌入到基部第1-2叶鞘之间，菌麦粒置于植株的茎基部，用湿润的脱脂棉将其轻轻包围，保湿3天。禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301接种40天后，提取发病部位茎秆的RNA，进行定量和半定量RT-PCR分析，检测纹枯菌Actin基因的相对表达量。Q-RT-PCR所用的引物为：RCactin-F:5’-gcatccacgagaccacttac-3’；RCactin-R:5’-gcgtcccgctgctcaagat-3’。结果显示，BSMV-γ：antiTaPK-R1-CI12633植株中禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301Actin基因的相对表达量显著高于BMSV-γ-CI12633中的表达量（图6），即TaPK-R1基因表达沉默后的BSMV-γ：antiTaPK-R1-CI12633植株中，禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301的积累量显著高于TaPK-R1基因正常表达的对照（BMSV-γ-CI12633）植株和野生型小麦CI12633植株中禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301的积累量。

禾谷丝核菌（Rhizoctoniacerealis）R0301接种40天后，进行抗病性鉴定。结果如图7所示，TaPK-R1基因表达沉默后的BSMV-γ：antiTaPK-R1-CI12633植株倒数第三叶茎部位纹枯病病斑明显大于对照（BMSV-γ-CI12633）植株和野生型小麦CI12633植株的病斑，表明TaPK-R1基因沉默降低了CI12633对纹枯病菌的防御能力，上述结果说明TaPK-R1是CI12633抗纹枯病反应所需的基因。

Claims

1.序列表中序列2所示的蛋白质的相关生物材料在提高植物抗纹枯病性能中的应用；所述相关生物材料为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系。

2.根据权利要求1所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码序列是序列表中序列1的第67-1740位核苷酸的DNA分子。

3.序列表中序列2所示的蛋白质的相关生物材料在降低植物抗纹枯病性能中的应用；所述相关生物材料为下述B6)或B7)：

B6)降低所述蛋白质表达的核酸分子；

B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

4.一种培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入蛋白质的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物的步骤；所述抗病性为抗纹枯病；所述蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述受体植物为小麦。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的编码序列是序列表中序列1的第67-1740核苷酸。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述纹枯病由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。

8.培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括是降低目的植物中蛋白质的编码基因的表达，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物；所述抗病性为抗纹枯病；所述蛋白质的氨基酸序列为序列表中序列2。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述目的植物为小麦。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达是通过将与序列表中序列1的第1634-1936位核苷酸所示的DNA片段反向互补的DNA分子导入所述目的植物实现的。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述纹枯病由禾谷丝核菌(Rhizoctoniacerealis)引起。