CN103088022A

CN103088022A - 一种植物盐诱导表达启动子

Info

Publication number: CN103088022A
Application number: CN2012105521059A
Authority: CN
Inventors: 杨剑波; 段永波; 魏鹏程; 张银萍; 李�浩; 李娟�; 李莉
Original assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Rice Research Institute of Anhui Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-12-18
Filing date: 2012-12-18
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2032-12-18
Also published as: CN103088022B

Abstract

本发明公开了一种植物盐诱导表达启动子、含有该表达启动子的植物表达载体和转化子及该启动子在植物中的盐诱导表达的应用，发明人将含有该启动子DNA序列和GUS基因的植物表达载体经农杆菌介导的遗传转化方法，获得转基因植株，经染色鉴定，GUS基因受盐诱导表达，因此推测本发明提供的启动子能够驱动外源基因在植物根中受盐诱导表达，可提高植物的抗盐的耐受力或提高植物对土壤养分的吸收，同时其在正常条件下根中集中表达的特征还可用于改造植物根系构型进而对农作物进行遗传改良。

Description

一种植物盐诱导表达启动子

技术领域

本发明主要涉及一种植物盐诱导表达启动子、含有该表达启动子的植物表达载体和转化子及该启动子在植物中的盐诱导表达的应用，属于基因工程领域。

背景技术

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度钠离子对许多植物的生长和发育造成很大的伤害。土壤盐碱化和次生盐碱化问题，已经成为世界灌溉农业可持续发展的制约因素。随着人口的增长以及水资源的匮乏，提高水资源利用效率、充分开发和利用盐碱地已成为关系国计民生的重要课题。近年来，随着对拟南芥、水稻等模式植物的深入研究和生物技术的迅速发展，已为培育高度耐盐性作物新品种提供了新思路、新材料和新方法，利用分子生物学方法和手段发现新的遗传资源是培育高度耐盐耐旱新品种的重要环节。

随着分子生物学技术以及植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术来改变一些作物的性状，提高其对外界胁迫条件的耐受性从而增加作物的产量已经成为一种重要的技术。外源基因在转基因植物中低水平表达和非特异性表达是制约植物基因工程发展的一个重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。

常见的启动子可分为组成型启动子、组织特异启动子和诱导表达启动子。不同启动子驱动基因表达的强度相差极大，并具有明显的种属特异性。在某些情况下，一种类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。在植物基因工程中大量应用组成型启动子，使用组成型启动子可以提高外源基因的表达强度，对目的基因的表达有很强的促进作用，但是随之也带来了一些问题，如组成型启动子使基因产物在宿主的整个生命周期以及所有的组织器官持续表达不仅造成了宿主体内资源的浪费，而且往往导致转基因材料的某些性状的改变，影响转基因材料的正常发育，使其出现发育迟缓，植株矮化等现象。如Nakashima等在水稻中用玉米的泛素基因启动子组成型表达OsNAC6基因，虽然具有抗旱和耐盐功能，但其造成植株生长期延长，产量降低。此外组成型表达某些基因虽然可以增加作物的抗逆性，但是对转基因作物的安全性也造成一定的影响，比如组成型表达抗虫基因可以在一定程度上防止病虫害，但其编码白也存在与果实或者种子中，给转基因材料的释放造成一定的困难。

组织特异启动子由于其表达的空间特异性，可将外源基因在转基因植物中定位表达，这不但可以降低植物负担、减轻对作物农艺性状的影响，而且还能提高外源基因产物在特定部位的浓度，增加转基因的效果。与组成型表达启动子相比，诱导型启动子驱动的外源只在特定的环境或者组织中才高强度表达，因此可以根据实验需要来控制目的基因的时空表达。Kazuo等人在水稻中过表达OsNAC6基因，利用组成型启动子导致水稻生长延迟产量降低，但是利用其本身的启动子就可以解决这个问题。Aryadee等在烟草中利用启动子Rab16A表达自身基因，发现只有在胁迫条件下该基因才能在叶中大量表达，从而提高其抗逆性，而且转基因植株与对照相比其形态发育以及产量都没有受到影响。因此，诱导型表达启动子在植物抗逆基因工程中亟待开放应用。

作为植物的地下部分，根直接与土壤接触，承担着从土壤中吸取水分和养分、运输物质和储存营养等功能，因此研究根特异性表达启动子具有重要的应用价值。如利用根特异性启动子可以改善植物根的生长，提高植物的抗旱耐盐能力，增加根的分泌物，对土壤污染进行生物修复等。同时利用根特异性启动子研究植物根的发育、根系的形态建成和根构型的重建并进行作物的遗传改良培育高产稳产的作物新品种具有重要的意义。

目前已知的根特异性表达启动子不多。在植物内源的根特异性启动子开发应用之前，使用农杆菌Ri质粒中的一个根特异的基序rolD。最近几年人们也寻找到一些根特异性启动子，如利用拟南芥的黑芥子酶基因启动子 PYK10调控CKX3基因，使该基因在根中表达，促进根的加快生长，提高了作物抗旱和吸收矿物质的能力；用根特异表达启动子Rcc3驱动OsNAC10，发现特异性表达该基因后，植株根的直径变粗，并能在干旱胁迫下增加植物产量。

综上所述，在植物中，合理使用根胁迫诱导特异性启动子能明显改善植物性状，但应用于水稻等禾谷类作物基因工程遗传载体构建中能够选用的植物内源根特异性启动子依然较少，因此发展更多的水稻等禾谷类作物的根特异性启动子对基础研究和生产应用都具有重要意义。而关于水稻基因pOsRAV69启动子在盐胁迫条件下，调控外源基因根特异性表达及应用目前还未见相关报道。

发明内容

本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，提供一种一种植物盐诱导表达启动子、含有该表达启动子的植物表达载体和转化子及该启动子在植物中的盐诱导表达的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种植物盐诱导表达启动子，正常生长条件下主要在根中表达，而盐胁迫诱导表达主要发生在叶片中，其所述植物盐诱导表达启动子的核苷酸序列为下述之一：

具有序列表1所述的核苷酸序列且和所述核苷酸至少有80%同源性；

具有在所述序列表1所示的核苷酸序列中添加或取代或插入或缺失一个或一个以上的核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物，具有相同功能的核苷酸序列。

所述的植物盐诱导表达启动子为pOsRAV69。

包含所述核苷酸序列的盐诱导特异性表达启动子与载体结合，构成重组载体。

一种植物表达载体，含有所述的植物盐诱导表达启动子pOsRAV69。

所述植物表达载体是pCAMBIA1381- pOsRAV69。

一种转化子，包含所述的植物的盐诱导表达启动子pOsRAV69或者所述的植物表达载体pCAMBIA1381- pOsRAV69及宿主。

所述的转化子为细胞系，愈伤组织或转基因植株。

所述宿主为根癌农杆菌。

一种包含所述启动子在植物中的盐诱导表达的应用，所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞、植物组织或植物器官中，并培育成植株，目标基因包括植物耐盐性和其他抗逆基因，以及植物营养吸收相关的基因。

所述的植物为水稻。

所述的序列表1为：

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本发明的优点是：

本发明所述的启动子序列可与植物双元表达载体连接，用于取代组成型启动子。并可以与所需的靶标基因链接，构建重组植物表达载体，经转化后可驱动靶标基因在根器官中的特异表达，提高外源基因在植物根中的表达量，增加转基因的效果，减轻外源基因由于过量表达而对作物性状的影响。

本发明的技术效果表明,所克隆的水稻启动子pOsRAV69能够调控基因在根中集中表达,在实际应用中具有一定的价值。通过该启动子对农作物品种进行基因改造，如通过该启动子调控目标基因在根中特异表达，可对土壤污染进行生物修复，或提供植物的抗盐耐受力，或提高植物对土壤养分的高效吸收，或增强土壤病原微生物的抵抗力等，同时还可以改造植物根系的构型对农作物进行遗传改良。因此，该启动子在转基因作物开发中，可应用于改善作物农业性状和提高作物产量的品种培育研究，由于其在根器官特异性表达的特征，用其代替35S等组成型启动子，可培育出理想的生物安全性高的转基因植物品种。

附图说明

图1A：pCAMBIA1381示意图；

图1B：利用pOsRAV69启动子驱动GUS表达的载体pCAMBIA1381- OsRAV69示意图。

图2：利用pOsRAV69启动子驱动Gus基因表达情况的分析。

图2A、启动子表达载体转基因幼苗染色结果；

图2B、pOsRAV69-1381转基因水稻茎和叶片盐诱导染色结果。

具体实施方式

实施例1

含有酶切位点的pOsRAV69启动子的获得

步骤1、引物的设计

根据NCBI中提供的水稻品种日本晴（Oryza sativa L cv. Nipponbare）全基因组序列，依据水稻OsRAV69基因的上游2073bp序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，在本实施例中以水稻双元表达载体pCAMBIA1381（来自于CAMBIA，公开使用载体，安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存）为例，靶标基因为Gus基因，具体设计的引物为：正向引物5’端带BamHI酶切位点（GGATC），反向引物5’端带Hind III酶切位点酶切位点（AAGCTT），引物序列如下：

正向引物：5’-CGGGGCAGGATTACAAGATAG-3’

反向引物：5’-ATCTCGGCACCAAGAAAGCTC-3’

由深圳华大基因公司合成。

步骤2、启动子pOsRAV69的获得

以水稻品种日本晴DNA为模板，利用正向引物、正向引物扩增启动子pOsRAV69，按常规PCR体系，扩增程序采用如下：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s, 72℃延伸2min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。

回收PCR扩增的目的片段，目的片段长度2073bp,并连接到PGEM-T-Easy载体(购自Promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，按照热激法转化大肠杆菌XL-Blue感受态细胞后，经菌落PCR筛选获得阳性克隆后，挑取单克隆摇菌液提质粒，用BamHI 和HindIII 进行双酶切验证。经过鉴定的阳性克隆送交Invitrogen公司测序。验证正确的克隆即为所要获得的启动子pOsRAV69，其核酸序列如序列图1所示。

实施例2

植物表达载体的构建和农杆菌的转化

将实施例1获得的TA克隆中提取质粒，用BamHI 和HindIII双酶切，回收启动子pOsRAV69片段。同时BamHI 和HindIII线性化处理回收pCAMBIA1381，将上述的两个片段用T4 ligase （购于TaKaRa公司）进行连接，得到启动子pOsRAV69与Gus基因融合的植物表达载体pCAMBIA1381- pOsRAV69（图1），利用冻融法将表达载体转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存），提取阳性质粒，用BamHI 和HindIII进行酶切验证。

对照：转CaMV35S：gus作为正对照，同时以Tnos：gus作为负对照。利用冻融法将表达载体pCAMBIA1381转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，操作步骤及验证同pCAMBIA1381- pOsRAV69的转化方法。

实施例3

利用启动子pOsRAV69驱动Gus报告基因在水稻中表达

步骤1：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70%酒精浸泡种子1 min，倒掉酒精。用含有1滴Tween 20的50%次氯酸钠 (原液有效氯浓度大于4%) 溶液浸泡种子40 min（150 r/min）。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃暗培养11d后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5d后用于农杆菌转化。农杆菌介导的遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan（Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacteriummediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice (Oryza sativa L.)[J]. Plant Cell Report，2012.DOI 10.1007/s00299-012-1275-3.）等的方法。

共获得48株 pOsRAV69-1381植株，32 株35S- 1381植株和28 株Tnos-1381植株。

步骤2、GUS组织化学染色

参照Jefferson (Jefferson RA et al. GUS fusion：β-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.，1987，6:3901-3907 )等的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24 h。脱色时在37℃条件下用95%乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

通过GUS组织染色，检测启动子pOsRAV69在水稻转基因植株中对GUS的启动活性。结果显示，正对照CaMV35S：gus转基因植株的根、茎、叶各组织均有明显染色；而负对照Tnos：：gus转基因水稻植株各组织中，均未检测到Gus基因的活性；pOsRAV69：：gus转基因水稻植株的根经GUS染色后呈现蓝色，且染色与正对照CaMV35S：gus的转基因植株的根部位染色程度相当，而在地上部分组织染色微弱（图2A）。结果说明，启动子pOsRAV69能够驱动Gus基因在水稻根中特异性高水平的表达。

在盐诱导条件下，pOsRAV69：：gus转基因水稻植株茎和叶片中（图2B）,GUS染色活性显著增强，该结果表明启动子pOsRAV69受盐诱导表达。

Claims

1.一种植物盐诱导表达启动子，其特征在于正常生长条件下主要在根中表达，而盐胁迫诱导表达主要发生在叶片中，其所述植物盐诱导表达启动子的核苷酸序列为下述之一：

2.根据权利要求1所述的一种植物盐诱导表达启动子，所述的植物盐诱导表达启动子为pOsRAV69。

3.根据权利要求1所述的一种植物盐诱导表达启动子，其特征在于，包含所述核苷酸序列的根的盐诱导特异性表达启动子与载体结合，构成重组载体。

4.一种植物表达载体，其特征是含有权利要求1和2所述的植物盐诱导表达启动子pOsRAV69。

5.根据权利要求4所述的植物表达载体，所述植物表达载体是pCAMBIA1381- pOsRAV69。

6.一种转化子，其特征是包含权利要求1和2所述的植物的盐诱导表达启动子pOsRAV69或者权利要求4和5所述的植物表达载体pCAMBIA1381- pOsRAV69及宿主。

7.根据权利要求6所述的转化子，所述的转化子为细胞系，愈伤组织或转基因植株。

8.根据权利要求6所述的转化子，所述宿主为根癌农杆菌。

9.一种包含权利要求1-8中所述启动子在植物中的盐诱导表达的应用，其特征在于所述启动子与目标基因融合，转化到植物细胞、植物组织或植物器官中，并培育成植株，目标基因包括植物耐盐性和其他抗逆基因，以及植物营养吸收相关的基因。

10.根据权利要求9所述的应用，所述的植物为水稻。

11.根据权利要求1所述的所述的一种植物盐诱导表达启动子，所述的序列表1为：