CN104292318B - 一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用 - Google Patents

一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2及其编码基因和应用。
背景技术
小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件对我国小麦造成的减产约800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。
真核生物基因表达是一个被高度调控的过程，其主要涉及到三方面：转录、转录后及翻译后。基因表达调控首先就是在转录水平，主要是一些转录因子参与调节在各种内外环境刺激下特定基因RNA的合成。另外，就是在蛋白质水平的翻译后调控，如激酶磷酸化、泛素连接酶等被公认为能在时空上控制细胞内功能蛋白的产生。然而，对于介于上述两方面之间的转录后调控的认识还特别少。近几年，通过研究低等真核生物如酵母、克氏锥虫等越来越多的发现表明：转录后调控RNA的作用因子为一系列RNA结合蛋白（RNA-BindingProteins,RBPs）。
RBPs在mRNA存在的各个主要环节中都发挥着重要作用，如mRNA的剪接、RNA转运、RNA稳定性与讲解、细胞内定位、翻译调控、多腺苷化作用及序列编辑等。在细胞核内RBP结合在mRNA前体（Pre-mRNA）上调节促进内含子的剪切及拼接形成成熟的mRNA；RBP还能调节成熟mRNA从细胞核转运到细胞质；RBP能调节mRNA识别定位目标，如mRNA识别定位线粒体；RBP还参与调控mRNA的稳定性，调节mRNA的退化；在调控mRNA的翻译过程中RBP也发挥重要作用。在这些复杂过程中RNA结合蛋白通过与RNA相互作用形成核糖核蛋白复合体(Ribonucleoprotein Complex)，直接或间接地参与了这些过程。RNA结合蛋白种类很多，估计占细胞编码蛋白的6-8%，但迄今为止只有为数不多的几种RBP，如HuR、AUF1、TTP、T1A1及CUGBP2等被证实可特异参与mRNA拼接、稳定性、翻译和其他层面的基因调控。
RBP具体参与细胞内外调控信号共同作用来调节mRNA形成的各个环节是非常复杂的（如图1-2）。例如RBP家族成员之一的sam68，介导细胞外信号作用下RNA的选择性剪接，如佛波酯处理的T细胞中CD44拼接改变。SAM68的RNA结合活性通过磷酸化和调控其与其它蛋白的相互作用来调节，如佛波酯处理的T细胞刺激RAS/MAP激酶通路，激活ERK磷酸化Sam68，诱导CD44选择性剪接。Sam68除调节转录后基因表达的作用外，还与转录因子如CBP相互作用来调节基因表达。Sam68的KH结构域出现在细胞有丝分裂间期的G1向S过渡以刺激阻止有丝分裂。
RBPs基因家族在植物生长发育等多种生理活动中发挥重要的调控作用，其作用于基因表达调控过程的转录后调控，这类基因控制生成的RBPs与相关的RNA相互作用形成核糖核蛋白复合体（Ribonucleoprotein Complex，RNP Complex），从而直接或间接地参与mRNA的代谢调控[8-10]。众多的RBPs氨基酸序列有一定的同源性，目前已经发现许多RNA结合结构域（RNA-binding domain，RBD），包括RNA识别基序（RNA Recognition Motif，RRM）、KH结构域、锌指结构（Zine finger）、RGG box、DEAD/DEAH box、Pumilio/FBF(PUF)、双链RNA结构域（double-stranded RNA bindingdomain,dsRBD）、富含精氨酸基序（Arginine-richmotif）、Sm-protein模体等[11]。这些结构域各自具有特定的保守序列及不同的功能，一些RBP含有1个或者多个相同结构域拷贝，而另外一些RBP则含有2个或者更多不同的结构域。
对RBP各种模体/结构域研究得较清楚的是RRM,也称为RNP motif[12-15]。RRM基序是空间上反向平行的β折叠和а螺旋形成的三明治结构，约由90个氨基酸组成，中间有两段保守序列，定义为RNP1和RNP2。RNP1有8个保守的氨基酸残基，RNP2有6个保守的氨基酸残基，同时RNP1和RNP2位于β折叠的中间，分别为β3和β1 [16]。RRM基序中的β-折叠创造了一个平的、外露的RNA结合表面，第二个和第三个β-折叠组成了带正电荷的平台边缘[12,13]。KH结构域的交联和保守序列为RNA连接提供了一个潜在的位于两个螺旋之间环中心的表面[17]。锌指结构域中位于DNA大凹槽内的螺旋在DNA连接中起主导作用，但在RNA连接作用方面研究较少[18]。RGG box结构域在揭开RNA二级结构时起作用[4]。
富含甘氨酸RNA结合蛋白（GR-RBP）至少在氨基端含有一个典型的RRM结构域，同时在羧基端富含长度可变的甘氨酸序列。GR-RBPs是植物中丰度较高的蛋白，植物中GR-RBPs基因最早在玉米中被克隆，随后相继在拟南芥、烟草、大麦等多种植物中被克隆得到。研究表明,这种蛋白参与了植物对多种逆境条件的反应调节,如冷害、干旱、水涝、伤害、盐压、外源脱落酸(AB A)或水杨酸(SA)处理等[19,29]。在众多植物中研究较多、较深入的是拟南芥的GRBPs。遗传学和生理学方面的数据提供了清楚的证据表明GRRBPs在植物抗逆反应中起重要作用。研究表明拟南芥中的GRRBP1、GRRBP2、GRRBP3、GRRBP4、GRRBP7、GRRBP8基因表达量在低温条件下显著增加。干旱、盐分压力也会引起GRRBP1、GRRBP4和GRRBP7转录产物不同程度地增加。与低温条件下GRRBP2表达量增加相对应,拟南芥GRRBP2突变株低温条件下与野生型相比表现出发芽、幼苗生长延迟的现象；而过量表达GRRBP2植株发芽时间提早，幼苗生长更好,而且对冻害表现出更强的耐受力[25]。
GR-RBPs基因家族参与植物激素、生理节奏、冷冻、机械伤害、干旱等抗逆调控[19]。早在1992年Sturm从胡萝卜中克隆分离出编码受伤口诱导富含甘氨酸蛋白的cDNA，分析证明在受到机械伤害过程中富含甘氨酸蛋白参与异质核RNA的生物合成和特定mRNA成熟反应[20]。Dunn等发现大麦中1个GR-RBP参与低温胁迫调控，还控制mRNA的稳定性；同时，通过实验证明其在体外还能磷酸化[21]。研究还发现高粱中1个编码GR-RBP的基因受到盐和ABA(Abscisic Acid，脱落酸)诱导表现出上调控[22]。Nakaminami等通过实验证明小麦中一种冷激结构域蛋白WCSP1与单链DNA/RNA结合行为的必须条件是具有富含甘氨酸区域，而富含甘氨酸与这个蛋白的热稳定性没有必然的关系[23]。Sahi等研究表明水稻幼苗中OsGR-RBP4基因能调控多种非生物胁迫，OsGR-RBP4为核蛋白，其主体主要定位在细胞质中，可能结合并稳定应力诱导的转录过程[24]。同时，Kim等研究证明水稻中OsGR-RBP1、OsGR-RBP4和OsGR-RBP6都有使冷敏感大肠杆菌突变体BX04在低温环境存活的能力；并且OsGR-RBP1、OsGR-RBP4能够保护冷敏感拟南芥AtGR-RBP7突变植株在寒冷和冰冻条件下的生长缺陷[25]。Chen等研究发现烟草中四种GR-RBPs分别命名为NtRGP-1a，NtRGP-1b，NtRGP-2，NtRGP-3，其中NtRGP-2与NtRGP-3与拟南芥中AtGR-RBP基因接近，NtRGP-1a和NtRGP-1b与禾本科中GR-RBP基因接近；同时，四种NtRGPs特别是NtRGP-1a和NtRGP-3受到水、创伤、严寒和高温等处理的强烈诱导，受PEG、干旱和水杨酸处理较弱诱导，不受ABA处理影响[26]。Kim等研究表明拟南芥AtGR-RBP7在寒冷胁迫环境中涉及mRNA从细胞核转出到细胞质；同时，AtGR-RBP7还影响拟南芥在高盐、脱水胁迫条件下的生长和抗逆性，使植株具有抗冻性，这些调控过程都是通过在保卫细胞中调节气孔开闭来完成[27]。景润春等实验发现RRM RNA结合蛋白基因家族参与了细胞核与细胞质的相互作用，同时,细胞质雄性不育性的形成与育性恢复均与细胞质内线粒体基因组变异与转录后调控有关[28]。董霞等研究表明富含甘氨酸的RNA结合蛋白GRPs基因可作为烟草水杨酸代谢途径中的一个标记基因研究其途径对逆境的应答[29]。
综上所述，GR-RBPs蛋白在调节植物的逆境反应，提高植物的抗逆性中起着至关重要的作用，对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益。因此，利用抗逆相关RBP蛋白基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2。
本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱相关蛋TaRBP2的基因。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。
本发明的另一目的提供上述植物抗旱相关蛋白TaRBP2的应用。
本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白TaRBP2，来源于小麦品种京花9，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的蛋白由232个氨基酸残基组成。自SEQ ID NO.1的氨基末端第31-73位氨基酸残基是RRM结合域，自SEQ ID NO.1的第154-185位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。
SEQ ID NO.1
为了使蛋白TaRBP2便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子TaRBP2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
根据本发明的TaRBP2编码基因具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
SEQ ID NO.2
含有TaRBP2基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有TaRBP2基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用TaRBP2构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。
本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有TaRBP2基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TaRBP2基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、小麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。
所述植物耐逆性具体可为对非生物胁迫的耐逆性，如对或盐胁迫的耐逆性。
本发明以抗旱、耐盐性较强的小麦为实验材料，得到了抗逆相关的TaRBP2蛋白及其编码基因，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强小麦抗逆性，加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
附图说明
图1 T1代TaRBP2转基因拟南芥株系的筛选。图中A:Kana平板筛选；BT1代植株电泳检测，M为DNA Marker Plus2K，0为水对照，1-8为阳性苗。
图2 T3代转TaRBP2基因拟南芥株系根长分析。图中WT:野生型拟南芥，L4-L6：转TaRBP2基因拟南芥3个独立株系。
图3转基因拟南芥耐旱性鉴定及存活率统计分析。A.转基因拟南芥在旱胁迫复水后的表型；B.转基因拟南芥存活率的统计，WT是野生型拟南芥，L1-L3为3个独立的转TaRBP2基因拟南芥株系。
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
实施例1：小麦抗旱、耐盐相关TaRBP2基因的cDNA克隆
对生长30天左右的小麦幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取小麦总RNA。应用5’RACE试剂盒（5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit）(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得TaRBP2基因的全长序列699bp。
用Trizol提取小麦幼苗的总RNA，用superscript II（invitrogen）反转录酶反转录获得到cDNA。根据TaRBP2基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：
P1：5’-ATGTCGTCGGATCCTCGGAAC-3’，
P2：5’-TTACTTGTGAAGAATACCCTTCTTTTGTG-3’。
对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.7kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pGEM-TEasy（Promega）连接，参照Cohen等的方法（Proc Natl Acad Sci，69:2110），将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的TaRBP2基因的开放阅读框(ORF)为SEQ IDNo.2的自5’末端第1至696位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示TaRBP2基因的重组载体命名为pTE-TaRBP2，其cDNA克隆结果如图1所示。
TaRBP2基因的序列在Genabnk上进行比对，证明TaRBP2基因是一个新的基因。
实施例2：用TaRBP2基因增强植物的耐旱性
1、重组表达载体的构建
1）35S-TaRBP2重组表达载体的构建
以小麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有EcoRI和HindIII接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后EcoRI和HindIII双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV35S启动子之后的EcoRI和HindIII酶切位点之间，得到重组载体p35S-TaRBP2。
引物序列如下：
TaRBP2[EcoRI]5’-CCGGAATTCATGTCGTCGGATCCTCGGAAC-3’
TaRBP2[HindIII]5’-CCCAAGCTTTTACTTGTGAAGAATACCCTTCTTTTGTG-3’
2、转基因拟南芥获得和功能鉴定
1）转基因拟南芥的获得
利用农杆菌介导法将该重组质粒转化到抽薹期的野生型拟南芥中，得到的T0代转基因拟南芥种子播到含有50mg/L Kan的MS培养基上，22℃正常培养7～10d，筛选出叶片深绿色并且长势正常的拟南芥植株（如图1）。将转化成功的拟南芥植株移栽到营养土中继续培养，收获转基因拟南芥T1代的种子，继续在含50mg/L Kan的MS培养基上筛选筛选，绿色长势正常的拟南芥移栽到营养土中，收获T2代种子，进一步抗性筛选和PCR检测，最终获得了8个不同转基因拟南芥T3代株系。
2）在PEG胁迫下转基因拟南芥萌发率统计分析
如图2A，转TaRBP2基因拟南芥和野生型拟南芥在MS培养基上培养约3周，发现培养基上拟南芥均能正常生长，其根均细长，说明TaRBP2基因的转化没有影响拟南芥的根长生长。在10%PEG的培养基上，与野生型拟南芥相比，转基因的拟南芥生根快，L4、L5和L63个株系明显比野生型的根长，转基因株系L5与L6的优势更明显；同时，还能观察到转基因拟南芥3个株系根较粗，根毛发达，根系雪白，说明这3个株系在幼苗期耐旱性较强。本研究对拟南芥根长的数值统计结果如图2B所示，在胁迫培养基上转基因拟南芥和野生型根系均不能正常生长，但转基因拟南芥明显比野生型的根长。以上实验结果表明，TaRBP2基因参与了逆境应答，提高了转化拟南芥的耐旱性。
3）转基因拟南芥苗期耐旱性鉴定
为进一步检测转基因拟南芥植株对干旱胁迫的耐性，对其在干旱胁迫下第0d、第10d、第24d和复水后第3d、7d的表型进行照相观察，干旱处理24d后，3个转基因株系中L1-L3株系莲座叶叶片颜色加深，少数野生型和转基因植株出现死亡。在干旱处理的第25d开始复水，复水后第3d和7d观察照相记录表型(如图3A)。复水后7d野生型拟南芥及3个转基因株系的存活率分别约为15%、40%、70%、30%。3个转基因株系中L3的存活率较其他株系低，但转基因拟南芥的存活率明显高于野生型拟南芥(如图3B)。综上实验结果说明，TaRBP2基因在拟南芥中过表达提高了拟南芥幼苗的抗旱能力。

Claims (7)

1.一种植物抗旱相关蛋白TaRBP2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的植物抗旱相关蛋白TaRBP2的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2或3所述的基因的重组载体。
5.包含权利要求2或3所述的基因的重组菌。
6.权利要求1所述植物抗旱相关蛋白TaRBP2在提高植物抗旱性中的应用。
7.权利要求2或3所述的基因在提高植物抗旱性中的应用。
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植物抗旱相关基因研究进展;唐益苗等;《麦类作物学报》;20091231;第29卷(第1期);166-173 *

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