CN103320410B

CN103320410B - 一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7及其编码基因和应用

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Publication number: CN103320410B
Application number: CN201310167937.3A
Authority: CN
Inventors: 高世庆; 赵昌平; 唐益苗; 徐蓓
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2014-11-26
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: CN103320410A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7及其编码基因和应用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

Description

一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7及其编码基因和应用。

背景技术

小麦作为我国重要的粮食作物之一，在国民经济中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、盐碱等逆境胁迫条件对我国小麦造成的减产约800亿公斤，严重影响着小麦的产量和品质，制约着我国小麦粮食安全。随着现代分子生物学的发展，利用基因工程技术从分子水平上深入研究植物与非生物逆境之间的关系，揭示植物对逆境胁迫信号传导及基因表达调控分子机理，为培育作物抗逆新种质提供了理论基础。

近年来，通过蛋白激酶的结构与功能分析来鉴定、阐明各种条件下基因表达调控的机理得到了广泛关注。蔗糖非发酵相关蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的许多生理过程中起着重要的作用，例如激素信号传导、非生物胁迫和植物的生长发育等。SnRK蛋白激酶属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶超级家族，由于基因序列的相似性和基因结构的不同，被分为三个亚家族分别是：SnRK1，SnRK2和SnRK3。SnRK蛋白激酶三个亚家族都有相似的结构特点，N-端都有一段能与其他蛋白相互作用的激酶结构域，并且结构在三个家族中是高度变化的，但是与其他蛋白激酶家族相比，这个结构域域都含有一个保守的苏氨酸。

第一个SnRK2成员是从ABA处理的小麦胚胎cDNA文库中分离得到的PKABA1，PKABA1的表达除受ABA和干旱胁迫所诱导。目前已经在多种植物中分离鉴定出了SnRK2蛋白激酶家族基因，在拟南芥中有10个SnRK2家族成员，命名为AtSnRK2.1～AtSnRK2.10；在水稻种，Kobayashi等鉴定了10个SnRK2蛋白激酶家族基因，命名为OsSAPK1～OsSAPK10；在高梁中分离鉴定了10个SnRK2家族基因，命名为SbSnRK2.1～SbSnRK2.10，在玉米里基因组中鉴定出了11个SnRK2家族基因，命名为SnRK2.1～SnRK2.11。目前，在小麦中也鉴定出多个SnRK家族成员，如TaSnRK2.3、TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和TaSnRK2.8。研究表明，水稻中的OsSAPK4、小麦中的TaSnRK2.3、TaSnRK2.4、TaSnRK2.7和TaSnRK2.8基因通过构建荧光表达载体分析基因的亚细胞定位情况，都是在细胞核、细胞质和膜上均有分布。

SnRK2家族基因在功能上表现出一定的差异性，拟南芥中SnRK家族成员中有9个基因被高渗胁迫（甘露醇或NaCl）诱导，5个基因被ABA诱导，但均不受冷胁迫诱导。拟南芥SnRK2.6基因通过参与调控主要的新陈代谢过程和ABA途径来控制气孔的开度。水稻中SnRK基因，通过蛋白磷酸化分析表明所有成员都能被高渗胁迫激活，但是只有OsSAPK8、OsSAPK9和OsSAPK10这三个基因受ABA诱导表达，OsSAPK4是水稻SnRK2家族的基因，该基因的诱导表达可以提高水稻在盐胁迫下种子的萌发率和提高成熟植株的抗旱能力。小麦中得SnRK2家族基因在功能上也有一定不同，在拟南芥中过表达TaSnRK2.4基因可以明显增强植物的抗逆性；TaSnRK2.7基因功能分析显示，在糖代谢、降低渗透势、增强光系统II的活性以及促进植物生根等生理生化过程中起着重要作用；过表达TaSnRK2.8基因的拟南芥对干旱、低温、高盐等胁迫均有一定耐性。因此，利用抗旱、耐盐的燕麦克隆、分离抗逆相关SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性，对抗逆育种和农业生产会产生巨大推动作用和经济效益，具有非常重要应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7。

本发明的再一目的是提供编码上述植物抗旱、耐盐相关蛋AsSAPK7的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的转基因细胞系。

本发明的另一目的提供上述植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7的应用。

本发明所提供的抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7，来源于燕麦，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的蛋白激酶由357个氨基酸残基组成，是SnRK类蛋白激酶。自SEQ IDNO.1的氨基末端第10-33位氨基酸残基是ATP结合域，自SEQ ID NO.1的第118-132位氨基酸残基为丝氨酸/苏氨酸结合域。

SEQ ID NO.1

1 MERYELLKDI GAGNFGVARL

21 MRNKETKELV AMKYIPRGLK

41 IDENVAREII NHRSLRHPNI

61 IRFKEVVVTP THLAICMEYA

81 AGGELFDRIC NAGRFSEDEA

101 RYFFQQLICG VSYCHFMQIC

121 HRDLKLENTL LDGSPAPRLK

141 ICDFGYSKSS LLHSKPKSTV

161 GTPAYIAPEV LSRREYDGKT

181 ADMWSCGVTL YVMLVGGYPF

201 EDPDDPKNFR KTIGRIMSIQ

221 YKIPEYVHVS QDCKNLLAAI

241 FVANPAKRIT MREIKNHPWF

261 LKNLPRELTE AAQAMYYKRD

281 NSAPTYSVQT VEEIMKIVQE

301 AQKPPPSSTP VAGFGWVEED

321 EQEDGKKPEE EPEEDDEEDE

341 YEKQLNEVRA SGEFHIS*

为了使蛋白AsSAPK7便于纯化，可在由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

根据本发明所公开的SEQ ID NO.1序列，本发明的转录因子AsSAPK7可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

根据本发明的AsSAPK7编码基因具有如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。

SEQ ID NO.2

1 ATGGAGAGGT ACGAGCTGCT CAAGGACATC GGCGCCGGCA ACTTCGGCGT CGCGCGCCTG

61 ATGCGGAACA AGGAGACCAA GGAGCTAGTC GCCATGAAGT ACATCCCACG GGGACTCAAG

121 ATTGATGAGA ATGTGGCGAG GGAGATCATA AACCACCGCT CGCTGCGGCA CCCAAACATA

181 ATCCGATTCA AGGAGGTTGT GGTCACGCCG ACGCACCTGG CGATTTGTAT GGAGTACGCC

241 GCCGGCGGCG AGCTCTTCGA CCGGATCTGC AACGCCGGGA GGTTCAGCGA GGACGAGGCC

301 AGGTACTTTT TTCAGCAGCT CATCTGCGGC GTCAGCTACT GCCACTTCAT GCAAATTTGC

361 CACCGGGACT TGAAGCTGGA GAACACACTG CTGGACGGCA GCCCGGCGCC ACGCCTCAAG

421 ATCTGCGATT TCGGTTACTC AAAGTCGTCG TTGCTGCACT CGAAGCCCAA GTCGACGGTC

481 GGCACGCCGG CGTACATCGC CCCGGAGGTG CTCTCCCGCC GGGAATACGA CGGCAAGACA

541 GCCGATATGT GGTCTTGTGG AGTGACCCTT TATGTGATGC TAGTGGGCGG CTACCCTTTT

601 GAGGATCCTG ATGACCCCAA GAATTTCAGG AAGACCATTG GGAGAATCAT GTCAATCCAA

661 TACAAAATAC CAGAGTATGT GCATGTATCC CAAGACTGCA AGAACCTCCT TGCTGCTATT

721 TTTGTTGCAA ACCCTGCAAA GAGAATAACA ATGAGGGAGA TCAAGAATCA CCCCTGGTTC

781 TTGAAGAACT TACCTAGAGA GCTAACAGAA GCTGCCCAAG CAATGTACTA CAAGAGAGAC

841 AACAGCGCCC CAACCTACTC TGTCCAAACC GTCGAGGAGA TCATGAAGAT CGTCCAGGAA

901 GCACAGAAAC CACCTCCTTC CAGCACCCCT GTGGCAGGTT TCGGTTGGGT GGAGGAGGAC

961 GAGCAGGAGG ATGGCAAGAA GCCAGAGGAA GAACCGGAGG AGGACGACGA AGAAGACGAG

1021 TATGAGAAGC AGTTGAACGA AGTCCGTGCC AGCGGTGAGT TCCACATCAG CTAG

含有AsSAPK7基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有AsSAPK7基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用AsSAPK7构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin），它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐逆植物的方法。

本发明所提供的培育耐逆植物的方法，是将上述任一种含有AsSAPK7基因的重组表达载体导入植物细胞中，得到耐逆植物。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的SnRK蛋白激酶AsSAPK7基因导入植物细胞，可获得对干旱和盐等非生物逆境胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。携带有编码基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：拟南芥、小麦、燕麦、拟南芥、水稻、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

本发明以抗旱、耐盐性较强的燕麦(Avena sativa L.)为实验材料，得到了抗逆相关的AsSAPK7蛋白及其编码基因，并将其导入拟南芥，显著提高了植物的抗旱、耐盐性。本发明的抗旱、耐盐相关蛋白及其编码基因对改良、增强拟南芥抗逆性，提高产量、加速抗逆分子育种进程，以及有效节省水资源具有十分重要的理论和实际意义。

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为T1代AsSAPK7转基因拟南芥株系的筛选。A：转基因拟南芥T1代株系的PCR筛选；B：转基因拟南芥T1代株系的PCR鉴定M：marker；1～11：A～G株系；12：阴性对照；13：水对照。

图2为转基因拟南芥在不同胁迫处理下幼苗生长情况。

图3转基因拟南芥对旱胁迫的响应。WT是野生型拟南芥，L1、L2、L4是3个独立的AsSAPK7转基因拟南芥株系。

图4转基因拟南芥对盐胁迫的响应，WT是野生型拟南芥，L1、L5、L11是3个独立的AsSAPK7转基因拟南芥株系。

图5转基因拟南芥对盐胁迫下叶绿素的相对含量。WT是野生型拟南芥，正常是没有受盐胁迫的拟南芥的相对叶绿素含量，L1、L2、L5、L11是4个独立的转基因拟南芥株系。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

实施例1：燕麦抗旱、耐盐相关AsSAPK7基因的cDNA克隆。

对生长30天左右的燕麦幼苗进行干旱处理5小时，用Trizol提取燕麦总RNA。应用5’RACE试剂盒（5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Kit）(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE试剂盒(3’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit)(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)获得AsSAPK7基因的全长序列1074bp。

用Trizol提取燕麦幼苗的总RNA，用superscript II（invitrogen）反转录酶反转录获得到cDNA。根据AsSAPK7基因编码区序列设计引物P1和P2。以反转录得到的cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增。引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-ATGGAGAGGTACGAGCTGCTCAAG-3’，

P2：5’-TCAGCTGAGCTGAAACTCACCACT-3’。

对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为1kb左右的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy（Promega）连接，参照Cohen等的方法（Proc Natl Acad Sci，69:2110），将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的氨卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到的AsSAPK7基因的开放阅读框(ORF)为SEQ ID No.2的自5’末端第1至1074位脱氧核糖核苷酸，编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质。将含序列SEQ ID No.2所示AsSAPK7基因的重组载体命名为pTE-AsSAPK7，其cDNA克隆结果如图1所示。

AsSAPK7基因的序列在Genebank上进行比对，在燕麦中未发现同源蛋白基因，证明AsSAPK7基因是一个新的基因。

实施例2：用AsSAPK7基因增强植物的抗旱、耐盐性

1、重组表达载体的构建

1）35S-AsSAPK7重组表达载体的构建

以燕麦的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用含有SmaI和SpeI接头序列的特异引物进行PCR扩增；然后SmaI和SpeI双酶切PCR产物回收，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV35S启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体p35S-AsSAPK7。

引物序列如下：

AsSAPK7[SmaI]5’-TCCCCCGGGATGGAGAGGTACGAGCTG-3’

AsSAPK7[SpeI]5’-GGACTAGTCTAGCTGATGTGGAACTCACCGCTGGC-3’

2、转基因拟南芥获得和功能鉴定

1）转基因拟南芥的获得

将上述构建的重组表达载体p35S-AsSAPK7分别用冻融法转化根癌农杆菌EHA105，再用p35S-AsSAPK7的根癌农杆菌EHA105转化拟南芥，用含100mg/L卡那霉素的MS培养基进行筛选，得到阳性转基因植株。将筛选得到的阳性转基因植株用PCR做进一步鉴定筛选，PCR所用的一对引物为P3和P4。

P3（上游引物）:5’-ATGGAGAGGTACGAGCTGCTCAAG-3’，

P4（下游引物）:5’-TCAGCTGAGCTGAAACTCACCACT-3’。

对35S::AsSAPK7转基因拟南芥进行PCR鉴定，阳性转基因植株经PCR扩增可获得1Kb左右条带，结果获得转35S::AsSAPK7拟南芥40株（图1）。

同时将pBI121空载体导入拟南芥，方法同上，作为对照，获得21个株系的转空载体拟南芥（筛选获得的转基因拟南芥用T₃代表示）。

2）在ABA及PEG胁迫下转基因拟南芥根长统计分析

如图2，转AsSAPK7基因拟南芥和野生型拟南芥在MS培养基上均能正常生长，在50μM ABA培养基上，L7和L11这两个株系的拟南芥的根长较野生型拟南芥的短，在10%PEG的培养基上，转基因株系L7、L11的根长略长于同组的野生型拟南芥根长，且叶片较大，须根较多，另3个株系表型不是很明显。说明AsSAPK7基因提高了植物的抗旱性，并且可能参与了ABA信号通路。

3）转基因拟南芥苗期耐旱性鉴定

为进一步检测转基因拟南芥植株对干旱胁迫的耐性，对其在干旱胁迫下第0d、第25d和复水后第5d的表型进行照相观察，干旱处理25d后，转基因株系L1和L2这两个株系莲座叶叶片颜色加深，成深红色，少数野生型和转基因植株出现死亡。然后在第26d开始复水，复水后第5d观察照相发现，野生型拟南芥存活率是80%，转基因株系L1的存活率是80%，L2株系的存活率是93.3%，L4转基因株系存活率较低，是61.5%，说明该株系抗旱性不显著，恢复正常的植株都能够正常的抽薹结实。3个株系中2个株系的存活率是大于等于野生型拟南芥的存活率的，表明转AsSAPK7基因的拟南芥植株抗旱性较强（图3）。

4）转基因拟南芥植株成熟期耐盐性鉴定

为鉴定转基因植株的耐盐性，对长势相似的野生型拟南芥植株和转AsSAPK7基因的拟南芥植株进行耐盐性分析，每隔一周浇灌250mM NaCl溶液1升，定期进行观察并照相。通过拟南芥表型分析表明，在盐处理第10d左右，野生型和转基因拟南芥均出现叶片成暗绿色的现象，但是转基因株系L11叶片大部分仍然表型为原来的绿色，盐处理第25d，野生型植株叶片普遍发黄，但是转基因L7和L9这两株系的叶片多为暗红色和暗绿色，盐胁迫25d观察法相转基因拟南芥叶片发黄情况并不像野生型拟南芥那样严重，而且L11株系植株多为绿色，并对以上耐盐株系进行叶绿素相对含量测定，统计图L15，转基因L1、L5和L7这三个株系的叶绿素相对含量普遍高于野生型拟南芥，L5株系中有一株植株的叶绿素含量与没有受到盐胁迫的叶绿色相对含量差不多，说明AsSAPK7基因明显提高了植物的耐盐性（图4，5）。

Claims

1.一种植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7，其特征在于，编码权利要求1所述的植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7。

3.如权利要求2所述的植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7的重组载体。

5.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7的重组载体p35S-AsSAPK7，其中，以限制性内切酶SmaI和SpeI双酶切权利要求2所述植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7，将酶切产物正向插入载体pBI121的CaMV35S启动子之后的SmaI和SpeI酶切位点之间，得到重组载体p35S-AsSAPK7。

6.包含权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7的转基因细胞系。

7.权利要求1所述植物抗旱、耐盐相关蛋白AsSAPK7用于提高植物抗旱、耐盐性的应用。

8.权利要求2或3所述植物抗旱、耐盐相关基因AsSAPK7用于提高植物抗旱、耐盐性的应用。