CN101280007A - 一种与植物耐冷性相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物耐冷性相关的蛋白及其编码蛋白与应用。该蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物耐冷性的由(a)衍生的蛋白质。本发明的培育耐冷植物的方法对于植物耐冷性分子机制的研究、耐冷品种的选育以及植物耐冷性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐冷性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

Description

一种与植物耐冷性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物耐冷性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

水稻是重要的粮食作物，芽期冷害是影响我国长江中下游早稻种植区和东北、西北稻区及云贵高原一季稻区水稻生产的重要因子之一。水稻芽期如遭遇冷害，将导致水稻幼苗生长迟缓、分蘖减少，严重者甚至还会出现大面积的僵苗、死苗现象，最终造成水稻产量的大幅度降低，因此迫切需要培育出芽期耐冷的水稻品种。普通野生稻是亚洲栽培稻的祖先种，野生稻在演化成栽培稻的过程中，经过自然选择和人工选择，基因多样性降低、等位基因数减少。据统计，栽培稻的等位基因数约为野生稻的60％(Sun C Q，Wang X K，Li Z C，Yoshimura A.Comparison of the geneticdiversity of common wild rice(Oryza rufipogon Griff.)and cultivated rice(O.sativa L.)using RFLP markers.Theor Appl Genet，2001，102：157-162)，从而导致当前水稻品种选育所面临的遗传瓶颈问题。因此从水稻近缘野生种的(普通野生稻Oryzarufipogon Griff.)基因组中发掘和利用在栽培稻中已丢失或削弱的优异基因，并把它们应用于水稻育种生产中具有十分重要的理论意义和实践价值，也是解决当前水稻育种难题的一条行之有效的途径。

江西东乡普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一，具有极强的耐冷性，它的地下茎能耐-12.8℃的低温并可安全越冬(Chen D Z，Xiao Y Q，Zhao SX，Xiong H J，Pi Y H，Luo L J.Studies on cold tolerance of seedling and heading stagein Dongxiang wild rice.Acta Agric Jiangxi，1996，8：1-6(in Chinese)；Chen D Z，XiaoY Q，Zhao S X，Pi Y H，Xiong H J，Luo L J.Genetic study on the cold tolerance ofDongxiang wild rice at the seedling stage.Acta Agric Jiangxi，1997，9：56-59(inChinese))，而当前栽培稻无一具此抗性，因此江西东乡普通野生稻是水稻耐冷性研究的理想材料。Liu et al.(Liu F X，Sun C Q，Tan L B，Li D J，Fu Y C，Wang XK.Identification and mapping of quantitative trait loci controlling cold-tolerance ofChinese common wild rice(O.rufipogon Griff.)at booting to flowering stages.ChineseScience Bulletin，2003，48：2068-2071)报道了3个来自江西东乡普通野生稻的数量性状位点(QTL)能提高栽培稻受体亲本(桂朝2号)孕穗开花期的耐冷性，进一步证实了从江西东乡普通野生稻中发掘耐冷基因的可行性。

我国野生稻资源丰富，从野生稻中发掘、定位和克隆耐冷相关基因不仅为培育超耐冷新品种提供新基因和新技术，而且对加强我国野生稻基因资源的保护、将资源优势变成经济优势具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物耐冷性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物耐冷性相关的蛋白名称为LTT7，来源于稻属普通野生稻(O.rufipogon Griff.)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由(a)衍生的蛋白质。

为了使(a)中的LTT7便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

              表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的LTT7可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的LTT7的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第91-369位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物耐冷性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

与植物耐冷性相关蛋白的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第91-369位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

3)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的蛋白的DNA分子。

序列表中的序列2由836个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第91-369位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的LTT7。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA gel blot实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述LTT7基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物耐冷性相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有LTT7基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物耐冷性相关蛋白编码基因LTT7的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是水稻等单子叶植物，也可以是拟南芥等双子叶植物。

使用LTT7基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在pCAMBIA1300-35S的多克隆位点间插入序列表中序列2的自5’末端的第91-369位脱氧核苷酸得到的重组质粒pCAMBIA1300-35S-LTT7；所述pCAMBIA1300-35S是用HindIII和XbaI分别双酶切载体pBI121和载体pCAMBIA1300，连接pBI121酶切得到的35S启动子和pCAMBIA1300酶切后的大片段，即得到pCAMBIA1300-35S。

本发明的另一个目的是提供一种培育耐冷植物的方法。

本发明所提供的培育耐冷植物的方法，是将上述与植物耐冷性相关蛋白的编码基因LTT7导入植物中，得到耐冷性提高的植物。

所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。

所述植物具体可为水稻或拟南芥。

本发明从江西东乡普通野生稻中克隆了与植物耐冷性相关的基因LTT7，并将其转入水稻中，其T₁代转LTT7基因植株比对照株表现出较强的耐冷性。4-5℃低温处理5d，正常条件下恢复生长7d后，T₁代转基因植株生长良好，叶色浓绿，活苗率为100％，5个株系的平均株高8.5±0.40cm；而相同处理的对照植株(转pCAMBIA1300-35S的日本晴)却长势很差，株高2.9±0.53cm，明显矮于T₁代转LTT7基因植株，活苗率为50％。

本发明的培育耐冷植物的方法具有操作简单、周期短的特点，适于推广应用。该方法对于植物耐冷性分子机制的研究、耐冷品种的选育以及植物耐冷性分子育种具有重要的理论及实际意义，为提高植物的耐冷性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为以江西东乡普通野生稻、IL112和桂朝2号的基因组DNA为模板PCR扩增产物的条带

图2为以20个水稻品种的基因组DNA为模板PCR扩增产物的条带

图3A为转pCAMBIA1300-35S-LTT7的T₀代转基因植株和对照株的PCR检测结果

图3B为转pCAMBIA1300-35S-LTT7的T₁代转基因植株和对照株的芽期耐冷性鉴定结果

图3C为转pCAMBIA1300-35S-LTT7的T₂代转基因植株和对照株的芽期耐冷性鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由北京奥科生物科技有限责任公司完成。

下述水稻品种若无特殊说明，均购自国家种子资源库。

实施例1、提高水稻芽期耐冷性的基因LTT7的获得

首先将江西东乡普通野生稻与超高产水稻品种桂朝2号进行回交和自交，构建了以桂朝2号为遗传背景的高代回交群体(BC₄F₂群体)，对此群体进行芽期耐冷性鉴定，同时以丽江新团黑谷作为对照。具体的鉴定方法为：将桂朝2号、高代回交群体和丽江新团黑谷的种子分别用5％(体积百分含量)的次氯酸钠溶液浸泡20min后用清水冲洗3-4次，37℃浸种催芽1d，随后将种子置于玻璃试管中浸水的滤纸上，将试管放入光照培养室(昼温28℃，夜温25℃，每天光照、黑暗时间各为12h，相对湿度83％)，待种子发芽后芽长长至5mm左右时，每个水稻品种分别选择10个健壮一致的芽置于直径4cm、高9.5cm的玻璃试管中，将试管置于4-5℃冰箱中低温处理5d，然后将低温处理后的幼芽移至光照培养室中恢复生长7d，测定高代回交群体、桂朝2号及丽江新团黑谷的活苗率，以活苗率[活苗率＝(活苗数/供试苗数)×100％]作为芽期耐冷性的指标进行耐冷性评价，筛选出芽期强耐冷系IL112。结果表明，IL112的活苗率为100％，其芽期耐冷较强。

随后以IL112为供体，以桂朝2号为受体构建F_2:3群体，对其群体按照上述方法进行芽期耐冷性鉴定，统计各株系的活苗率。进一步的耐冷性分析表明，IL112及其后代能耐9d的4-5℃低温，具有极强的芽期耐冷性。

提取上述F_2:3群体各单株的基因组DNA，进行SSR分析，获得各株系的基因型，并利用QTXMAP17软件进行耐冷性QTL分析，结果在第1，2，5，6，7和10染色体上均检测到与芽期耐冷性相关的QTL。为了精细定位这些QTL，找到与水稻芽期耐冷性相关的基因，以IL112和桂朝2号为材料进行芯片(Affimetrix公司的水稻全基因组芯片(GeneChipRice Genome Array，货号：900599)杂交，在芯片数据分析的基础上，结合比较基因组学分析，在QTL区域内筛选在日本晴和93-11间存在基因组差异的表达差异基因作为候选目的基因。依据日本晴的基因组序列，在二者存在基因组差异的区域设计引物p12(序列3和序列4)，分别以江西东乡普通野生稻、IL112和桂朝2号的基因组DNA为模板进行PCR扩增。具体的PCR扩增反应体系为：水稻基因组DNA模板20ng，Taq Plus DNA聚合酶0.5U，2.0μl 10×PCR缓冲液(100mM Tris·Cl pH9.0，500mM KCl，15mM Mg²⁺，1％Triton X-100)，100μMdNTPs，正、反向引物各0.2μM，DEPC水补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃3min；然后94℃1min，58℃1min30sec，72℃2min，共35个循环；再72℃10min。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，具体检测结果如图1所示。其中1、2和3分别为以江西东乡野生稻、IL112和桂朝2号的基因组DNA为模板的PCR扩增产物条带，DL2000为100-2000bp的DNA分子量标准(天根生化科技有限公司，货号：Cat#HT402-01)。结果表明，在江西东乡普通野生稻和IL112中扩增到相同的条带，其大小在500-750bp左右；而桂朝2号中无扩增条带。回收扩增得到的条带并对其进行测序，测序结果表明，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，并将其命名为LTT7，其编码的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

为了验证基因LTT7与水稻芽期耐冷性是否相关，以p12为引物，对F_2:3群体进行了基因型检测，结合前面进行的表型鉴定结果，用T-Test方法分析基因型与芽期耐冷性的关系，结果表明，p12扩增产物单独渗入时即与芽期耐冷性存在显著相关性(P＜0.01)，可使群体活苗率增加14％。

为了进一步验证基因LTT7与水稻芽期耐冷性的相关性，按照上述方法对125个水稻品种和地方种进行了芽期耐冷性鉴定，并从中随机选取20个水稻品种(10个耐冷品种，10个耐冷性差品种，具体品种见表3)分别提取其基因组DNA，以p12为引物，进行PCR扩增，以检测其基因型，同时以IL112和桂朝2号作为对照。具体检测如图2所示。其中，泳道1为以IL112的基因组DNA为模板的PCR扩增产物条带；泳道2-11为以10个耐冷水稻品种的基因组DNA为模板的PCR扩增产物条带；泳道12为以桂朝2号的基因组DNA为模板的PCR扩增产物条带；泳道13-22为以10个耐冷性差的水稻品种的基因组DNA为模板的PCR扩增产物条带；DL2000为100-2000bp的DNA分子量标准(天根生化科技有限公司，货号：Cat#HT402-01)。结果表明，在10个耐冷水稻品种中，均扩增出与IL112相同的条带，且条带大小在500-750bp之间；在10个耐冷性差的水稻品种中，8个品种均未扩增出任何条带，仅有2个品种能扩增出与IL112相同的条带，且条带大小在500-750bp之间。

同时对以上20个水稻品种、IL112和桂朝2号的芽期耐冷性进行表型鉴定，结果如表4所示。

表4水稻的芽期耐冷性鉴定结果

                                                        

水稻品种                                活苗率

                                                        

IL112                                   100％

746                                     100％

云峰7号                            100％

香粳糯                             100％

晚88-1                             100％

尚洲10                             100％

密阳111                            100％

合系35                             100％

REIMEL                             100％

IR66746-76-3-2                     100％

9505-138                           100％

桂朝2号                            0％

03A-11                             0％

03A-9                              0％

中优13                             0％

37760                              0％

水源349                            0％

水源332                            0％

水源287                            0％

VISTA                              0％

TP34                               0％

SR64446-1                          0％

                                                    

实验设三次重复，表4中的数据为三次重复的平均值。用T-Test方法分析基因型与芽期耐冷性的关系，相关性分析结果如表5所示。结果表明，基因LTT7与水稻芽期耐冷性存在极显著相关性(P＜0.01)。

表5.p12与水稻耐冷性的相关性分析

分子标记	R Square	Significance F	Ratio1	Ratio2
					p12的PCR产物	0.7143	2.0283E-07**	100％	20％

Ratio1为有分子标记渗入的耐冷水稻品种数目/10；Ratio2为有分子标记渗入的不耐冷水稻品种数目/10；**：p＜0.01。

以上结果表明，基因LTT7是与水稻芽期耐冷性相关的基因，而且此基因是一功能未知的基因。

实施例2、LTT7转基因水稻的获得及其耐冷性鉴定

一、LTT7植物表达载体的构建

根据日本晴的LOC_Os07g22494的全长cDNA序列设计引物，并在引物两端分别引入限制性内切酶KpnI和SacI识别位点及保护碱基，引物序列如下：CDS-PF：5’-CGGGGTACCCCGAGCTCGAGCAATGGTGAAGT-3’(序列5)(带下划线碱基为限制性内切酶KpnI识别位点及保护碱基)；CDS-PR：5’-CGAGCTCGCCAAAACGAATGTACACACAGC-3’(序列6)(带下划线碱基为限制性内切酶SacI识别位点及保护碱基)。

利用TRIZOL试剂提取江西东乡普通野生稻经4℃低温处理12h的芽期总RNA，以此RNA为模板，使用SuperScriptII反转录酶(Invitrogen，Cat no.18064-014)进行反转录得到cDNA，以此cDNA为模板，在引物CDS-PF和CDS-PR的引导下，RT-PCR扩增水稻LTT7基因的编码序列。反应结束后，对扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化836bp的DNA片段进行测序，测序结果表明，扩增得到的DNA片段含有序列表中序列2所示的脱氧核苷酸序列。

用HindIII和XbaI分别双酶切载体pBI121(购自Promega公司)和载体pCAMBIA1300(购自澳大利亚CAMBIA公司)，连接pBI121酶切得到的35S启动子和pCAMBIA1300酶切后的大片段，即得到植物表达载体pCAMBIA1300-35S。

将上述836bp的DNA片段克隆入植物表达载体pCAMBIA1300-35S多克隆位点的KpnI和SacI酶切位点之间，得到含有水稻LTT7基因的重组表达载体，命名为pCAMBIA1300-35S-LTT7。

二、转化水稻

将步骤一构建的重组表达载体pCAMBIA1300-35S-LTT7和pCAMBIA1300-35S分别用基因枪法转化日本晴的成熟胚愈伤组织，用含50mg/L潮霉素的NB培养基进行2轮筛选，每轮筛选20-30天，筛选得到的愈伤组织经预分化、分化得到转基因的水稻植株，用T₀代表示；T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株用T₁代表示；T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株用T₂代表示。

三、转基因水稻的PCR鉴定

培育5株转pCAMBIA1300-35S-LTT7的T₀代水稻转基因植株，分别提取上述T₀代转基因水稻的基因组DNA，并以此为模板，在引物1(序列7)和引物2(序列8)的引导下，进行PCR扩增。同时以未转基因的日本晴作为对照。PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃30sec，58℃45sec，72℃1min，共35个循环；再72℃10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。具体检测结果如图3A所示。其中，CK为未转基因的日本晴的PCR扩增结果，OE1、OE2、OE3、OE4及OE5为转pCAMBIA1300-35S-LTT7的T₀代转基因植株的PCR扩增结果，DL2000为100-2000bp的DNA分子量标准(天根生化科技有限公司，货号：Cat#HT402-01)。结果表明，转入重组表达载体pCAMBIA1300-35S-LTT7的T₀代转基因植株均扩增出大小约为1Kb的条带，而对照未转基因的日本晴植株中却无条带。

按照实施例1所述的芽期耐冷性鉴定方法对上述PCR鉴定结果为阳性的T₁代和T₂代转基因植株进行耐冷性鉴定，同时以转pCAMBIA1300-35S的T₁代和T₂代转基因日本晴植株、IL112和冷敏感品种GC2作为对照。每个株系10株。具体检测结果如图3B和图3C所示。图3B中，CK为正常条件下生长的T₁代转pCAMBIA1300-35S植株(Control)和T₁代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株(OE1、OE2、OE3、OE4和OE5)；5d为经4-5℃低温处理5d，正常条件下恢复生长7d后的T₁代转pCAMBIA1300-35S植株(Control)和T₁代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株(OE1、OE2、OE3、OE4和OE5)。图3C中，CK为正常条件下生长的T₂代转pCAMBIA1300-35S植株(Control)、T₂代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株(L34、L31和L16)、IL112和冷敏感品种GC2；5d、7d和9d分别为经4-5℃低温处理5d、7d和9d，正常条件下恢复生长7d后的T₂代转pCAMBIA1300-35S植株(Control)、T₂代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株(L34、L31和L16)、IL112和冷敏感品种GC2。

结果表明，T₁代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株比对照株日本晴表现出较强的耐冷性。4-5℃低温处理5d，正常条件下恢复生长7d后，T₁代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株生长良好，叶色浓绿，活苗率为100％，5个株系的平均株高8.5±0.40cm；而相同处理的对照植株(转pCAMBIA1300-35S的日本晴)却长势很差，株高2.9±0.53cm，明显矮于T₁代转LTT7基因植株，活苗率为50％。

4-5℃低温处理5d，正常条件下恢复生长7d后，T₂代转pCAMBIA1300-35S-LTT7植株生长良好，叶色浓绿；平均活苗率为100％，株高8.3±0.50cm；而对照植株日本晴却长势很差，叶片发黄；活苗率为50％；桂朝2号(冷敏感品种GC2)已全部死亡。当低温处理时间延长至7d和9d后，对照植株日本晴也已全部死亡，而T₂代转基因植株仍有部分植株生长正常，低温处理7d和9d后的平均株高分别为5.56±0.74cm和2.4±0.14cm，表现出较强的抗冷性，能耐9d的4-5℃低温。

                           序列表

<160>8

<210>1

<211>92

<212>PRO

<213>普通野生稻(O.rufipogon Griff.)

<400>1

Met Asp Pro Leu Pro Leu Ala Arg Arg Ser Asn Gly Ala Thr Arg Leu

1               5                   10                  15

Pro Ala Met Ser Pro Gly Ala Ser Arg Ser Ser Ala Thr Ser Pro Met

            20                  25                  30

Ala Ala Ala Pro Val Arg Arg Trp Pro Gly Ala Ala Leu Pro Ser Ser

        35                  40                  45

Ser Leu His Trp Leu Val Lys Lys Leu Gly Glu Glu Gly Pro Gly Gln

    50                  55                  60

Asp Leu His Ala Ser Cys Leu Ser Met Lys Ile Gly Ala Met Phe Gln

65                  70                  75                  80

Glu Val Ile Pro Lys Leu Gln Cys Leu Phe Gln Tyr

                85                  90

<210>2

<211>836

<212>DNA

<213>普通野生稻(O.rufipogon Griff.)

<400>2

ccccttctct tccctctccg tggcggcatg gcggcgtgcc ccctcctccc gctgctccag     60

ctctagccct ccctccacaa catcctggac atggatcctc tacctttggc tcgccggagc    120

aatggggcca ccagactgcc agcgatgagt ccgggggcat ccagatccag cgccacctca    180

cccatggcag ctgctccggt gcgacgatgg ccaggggccg cgctgccctc ctcatccctc    240

cactggttag tgaagaagtt gggtgaagaa ggacccgggc aagacttaca tgctagctgc    300

ctctccatga agattggagc catgttccaa gaggtcattc caaaattgca atgtctgttc    360

cagtactgaa ccaatccagc tcggctccat ttcaagccat cataggcatc acctcaaaga    420

cattctaccc actgcaaagc cagggagcca tttctttctc tcaagttggc atgcgttcct    480

ttttcttagt taaatcataa attaacaggc ccaacttaat tatcatggaa taagccacag    540

caattttacc cacctaaggt cactctgtgc attcatttca ggacaatgac aagcattggg    600

atagacaagg cagtagattc tcaatcaatt ggtgctgtct agtaggtgaa gagtgacacc    660

gaagcaggat ttgcaagtca actggctcat cttcatatta tttgaggtgt tgtcggactg    720

cctgcaatgc cattcgtcaa ctcttttctc gtttccctac ctccttggtt atctaacctt    780

aagaagtaat attcaaattt catctcagtt gtagatgtct atgagattgg cattgc        836

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

actccacagc caggcaaag                                                  19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ttacatcgtg aaacggatgg                                                 20

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cggggtaccc cgagctcgag caatggtgaa gt                                   32

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgagctcgcc aaaacgaatg tacacacagc                                      30

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tacttctaca cagccatc                                                   18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgtctgtcga gaagtttc                                                   18

Claims (10)

1、一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐冷性相关的由(a)衍生的蛋白质。

2、权利要求1所述蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′端第91-369位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中序列2；

3)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA序列杂交且编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列的DNA分子。

4、含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体。

5、根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体的出发载体为pCAMBIA1300-35S；

所述pCAMBIA1300-35S是用HindIII和XbaI分别双酶切载体pBI121和载体pCAMBIA1300，连接pBI121酶切得到的35S启动子和pCAMBIA1300酶切后的大片段，即得到pCAMBIA1300-35S。

6、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求2或3所述基因的重组菌。

8、扩增权利要求2或3所述基因的全长或任一片段的引物对。

9、一种培育耐冷植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入宿主植物中，得到耐冷性提高的植物。

10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述宿主植物为单子叶植物，优选为水稻。

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