CN110607315A - 一种抗旱相关的芝麻基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗旱相关的芝麻基因及其应用。一种抗旱相关的芝麻(Sesamum indicum L.)基因SiOSM1,核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示,或为由该序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有同等功能的核苷酸序列。通过将抗旱相关芝麻基因SiOSM1在拟南芥中的过量表达,发现此基因可显著提高植物的抗旱性,因此本发明在提高植物抗旱性上有很好的应用前景。

Description

一种抗旱相关的芝麻基因及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及一种与抗旱相关的芝麻基因SiOSM1,同时还涉及该基因在作物抗旱育种中的应用,抗旱相关芝麻基因SiOSM1在拟南芥中的过量表达表明,此基因可显著提高植物抗旱能力,应用于作物抗旱育种。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum L.)是我国五大油料作物之一,是传统特色农产品,在世界上广泛种植在80多个国家,主要分布在亚洲和非洲。我国是主要生产国和贸易国,年消费量居世界之首,但是,自给不足50%。
近年来我国芝麻生产旱害发生不断加重,造成减产严重。芝麻产业技术体系对我国主产区7省138个县次的调查结果发现,2008-2017年旱害发生县频率逐年上升,近三年高达60-75%,造成减产13-26%。黄淮和长江流域芝麻主产区,2016年7月下旬至8月中下旬正值芝麻盛花期和终花期发生持续干旱,对芝麻生长发育和产量造成严重影响,37个芝麻生产县中在盛花期和终花期分别有10个和13个县受旱灾,影响了芝麻生长发育,造成严重减产,平均减产10.92kg,平均减产率14.9%。我国西部、东北芝麻春播区和长江以南秋播区,常年遭受干旱威胁,影响产量。此外,在印度、埃塞俄比亚、尼日利亚、泰国、土耳其等非洲和南亚等大多数国家的芝麻生产地区,干旱是最大的危害因素。因此,提高芝麻抗旱能力,促进高产稳产,对促进我国芝麻生产发展、解决总量自给不足问题十分必要。芝麻抗旱性的研究比较薄弱,研究报道主要集中在干旱对芝麻植株形态、产量性状、品质性状及生理生化的影响,分子相关研究较少。发掘芝麻抗旱功能基因,是开展芝麻抗旱性分子育种,以提高芝麻抗旱能力的重要基础和可靠途径。
Osmotin是PR-5家族中一个24KD的碱性蛋白,具有β-1,3葡聚糖酶、抗真菌侵染、抗冻、抗渗透压力等多种生物学活性,参与植物系统获得抗性(SAR)和过敏反应(HR),在植物抵御生物(真菌、细菌以及病毒病)和非生物(干旱、盐碱、渍害等)胁迫中具有重要作用。由于PR-5蛋白独特的抗真菌活性,良好的稳定性,而且对人体无毒,使它成为一种潜在的绿色抑菌药剂。PR-5蛋白包含了具有多种抗逆功能的渗透调节蛋白(osmotin)和类渗透调节蛋白(osmotin-like protein,OLP)。在植物中,osmotin是一种阳离子蛋白,最初作为在高浓度NaCl环境中培养的烟草细胞中主要积累的一种蛋白而分离得到。1992-1993年美国和荷兰的科学家分别从烟草中分离克隆了osmotin基因,并进行了该基因对马铃薯和烟草的转基因研究,结果表明转osmotin基因的马铃薯植株中推迟了P.infestants侵染后症状的出现并对多种病原菌有抑制作用。Wong等(2006)、Ko等(2006)和Sharma等(2013)发现拟南芥osmotin34(ATOSM34)基因能显著提高植株的抗旱能力。本发明中提到的植物抗旱相关基因SiOSM1及其编码蛋白,与拟南芥同源基因(ATOSM34)(AT4G11650.1)同源度分别为68%和74%。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种抗旱相关的芝麻(Sesamum indicum L.)基因SiOSM1、编码蛋白及应用。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:
提供一种抗旱相关的芝麻(Sesamum indicum L.)基因SiOSM1,该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示,或为由该序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有同等功能的核苷酸序列。通过将抗旱相关芝麻基因SiOSM1在拟南芥中的过量表达,发现此基因可显著提高植物的抗旱能力,为植物抗旱育种提供基因资源。
本发明还包括提供一种芝麻SiOSM1蛋白,其具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明包括通过各种方法获得的、如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生蛋白质的基因。
本发明还包括含有SiOSM1核苷酸序列的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞如含有所述载体的转化拟南芥植株。
本发明将SiOSM1基因构建到表达载体pCAMBIA1301S(pCAMBIA1301S是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改建的,携带具有组成型和超量表达特征的花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子的遗传转化载体)。通过农杆菌介导的转化方法,将pCAMBIA1301S携带的SiOSM1基因转入拟南芥,获得拟南芥转化植株。实验结果表明,SiOSM1具有提高植物抗旱性的作用。
本发明还提供上述SiOSM1基因、载体或宿主细胞在提高植物抗旱性中的应用。
本发明所述的一种抗旱相关的芝麻基因SiOSM1
获得方法,包括如下步骤:
(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据抗旱相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果,采取逐级取样策略,选取了400份抗旱性不同的芝麻材料进行重测序分析;
(2)利用Illumina Hiseq2500测序平台,用2×76双末端测序法对400份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序,获得了2.6倍覆盖的基因组序列;
(3)结合种质资源抗旱群体中的抗旱相关性状数据、基因型数据和群体结构,采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析,在P=10-5.77水平检测到1个位于1号连锁群上6832575的位置与干旱胁迫下的芝麻存活株率显著关联的标记位点,解释11.8%的表型变异;
(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)比对和基因注释分析,发现距离显著关联标记位点37025bp的位置存在SIN_1017838基因,该基因的拟南芥同源基因为ATOSM34,是一种渗透调节基因,与植物逆境胁迫调节有关,因此,推测该基因可能与芝麻抗旱相关,命名为SiOSM1;
(5)根据SiOSM1基因的CDS序列,利用Primer5.0设计可以扩增其完整CDS序列的引物,引物序列(包含修饰碱基)及名称如下:
SiOSM1-F:5’-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGCCTTCGCCAAAAACCT-3’
SiOSM1-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCTCATGGGCAGAACACGACC-3’;(6)取初花期抗旱品种晋芝2号干旱胁迫7天后的根系,提取根系总RNA,逆转录生成cDNA,以反转后的cDNA为模板,利用步骤(5)中的引物SiOSM1-F/R进行RT-PCR扩增,将扩增得到的片段进行测序,获得提高芝麻抗旱能力的SiOSM1基因序列,如SEQ ID NO.1所示;
克隆本发明中所述的抗旱相关的基因SiOSM1的方法是本领域中所常用的方法。提取植物根系RNA是常用的分子生物学技术,提取mRNA的方法也有多种成熟的技术,试剂盒(EASY spin Plus Plant RNA kit)可从商业途径获得(购于Aidlab BiotechnologiesCo.,Ltd)。构建本发明中所述的载体和将载体转入植株所用到的酶切、连接、花序侵染等方法也是本领域中常用技术。其中所涉及的质粒(pCAMBIA1301),转染用媒体(根癌农杆菌LBA4404和所用试剂成分如蔗糖、Kan、潮霉素等)可从商业途径获得。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明是国内外首次报道抗旱相关芝麻基因SiOSM1序列。通过抗旱相关芝麻基因SiOSM1在拟南芥中的过量表达实验表明:芝麻SiOSM1基因均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了表达,与受体对照(非转基因植株)相比均有很大程度的提高;拟南芥植株抗旱能力有显著提高。由此利用SiOSM1的过量表达可提高植物的抗旱能力以便用于油料作物抗旱品种的选育,提高作物抗旱性,保证作物高产稳产,在提高植物抗旱性上有很好的应用前景。
附图说明
图1为含SiOSM1基因的植物表达载体pCAMBIA1301S-SiOSM1的构建;
图2为转SiOSM1基因拟南芥T1代阳性植株的筛选结果示意图;
图3为转SiOSM1基因拟南芥T1代的PCR鉴定结果示意图(M:Marker;1-22:转基因T1代植株;WT:野生型拟南芥);
图4为转SiOSM1基因拟南芥T2代阳性植株的筛选结果示意图;
图5为转SiOSM1基因拟南芥T2代的PCR鉴定结果示意图(M:Marker;1-22:转基因T2代植株;WT:野生型拟南芥);
图6为转SiOSM1基因拟南芥T2代植株定量表达验证结果图;
图7为土壤干燥法测定转SiOSM1基因拟南芥T2代植物的抗旱性。
具体实施方式
通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989),或Draper等人(Blackwell科学出版社,1988)所述的条件,或按照所用试剂制造厂商所建议的条件。
实施例1:抗旱相关芝麻基因SiOSM1的获得
本发明所述的一种抗旱相关芝麻基因SiOSM1获得方法,包括如下步骤:
(1)从国家芝麻中期库保存的7910份国内外资源中根据抗旱相关性状的表型、地理来源和遗传多样性检测结果,采取逐级取样策略,选取了抗旱性不同的400份芝麻材料进行重测序分析;
(2)利用Illumina Hiseq2500测序平台,用2×76双末端测序法对400份芝麻材料进行低覆盖度的全基因组重测序,获得了2.6倍覆盖的基因组序列;
(3)结合种质资源抗旱群体中的抗旱相关性状数据、基因型数据和群体结构,采用EMMAX软件包和Peal程序对芝麻相关性状进行全基因组关联分析,在P=10-5.77水平检测到1个位于1号连锁群上6832575的位置与干旱胁迫下的芝麻存活株率显著关联的标记位点,解释11.8%的表型变异;
(4)通过芝麻参考基因组(http://ocri-genomics.org/Sinbase/index.html)比对和基因注释分析,发现距离显著关联标记位点37025bp的位置存在SIN_1017838基因,该基因的拟南芥同源基因为ATOSM34,是一种渗透调节基因,与植物逆境胁迫调节有关,因此,推测该基因可能与芝麻抗旱相关,命名为SiOSM1;
(5)根据SiOSM1基因的CDS序列,利用Primer5.0设计可以扩增其完整CDS序列的引物,引物序列(包含修饰碱基)及名称如下:
SiOSM1-F:5’-GCTTTCGCGAGCTCGGTACCATGGCCTTCGCCAAAAACCT-3’,如SEQ ID NO.3所示;
SiOSM1-R:5’-CGACTCTAGAGGATCCTCATGGGCAGAACACGACC-3’,如SEQ ID NO.4所示;
(6)取初花期抗旱品种晋芝2号干旱胁迫7天后的根系,提取根系总RNA,逆转录生成cDNA,以反转后的cDNA为模板,利用步骤(5)中的引物SiOSM1-F/R进行RT-PCR扩增,将扩增得到的片段进行测序,获得提高芝麻抗旱能力的SiOSM1基因序列,如SEQ ID NO.1所示。利用SiOSM1基因序列,根据mRNA转录翻译原则及氨基酸比对获得提高芝麻抗旱能力的SiOSM1基因的蛋白序列,如SEQ ID NO.2所示。
实施例2:一种提高植物抗旱性的芝麻基因SiOSM1在植物抗旱育种中的应用
1)将实施例1克隆得到的抗旱相关的芝麻基因SiOSM1利用同源重组的方法与pCAMBIA1301S质粒连接构建植物表达载体,命名为pCAMBIA1301S-SiOSM1(图1);pCAMBIA1301S质粒的获得方法:pCAMBIA1301S是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改建而得:通过酶切连接的方法把花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子序列整合到pCAMBIA1301的基础质粒序列上,并通过对重组质粒的双向测序以及表达验证。
2)将步骤1)中制备的载体pCAMBIA1301S-SiOSM1转入根癌农杆菌LBA4404(上海唯地生物技术有限公司),再导入拟南芥植株中;
3)筛选T1代阳性植株。
种植拟南芥T0代所收获的种子,将T0代种子消毒,接种含潮霉素的MS筛选培养基上筛选阳性植株(图2),获得2个阳性株系。筛选出的阳性植株的叶片DNA提取后,利用PCR方法鉴定SiOSM1基因,进行转基因植株的目的基因的分子验证(图3),最终确认基因已经转入T1代阳性植株。
4)转基因植株T2代阳性检测
将T1代阳性植株进行单株收种获得T1代种子,继续进行潮霉素筛选获得T2代阳性植株(图4),获得的阳性植株移栽生长,提取叶片基因组DNA进行PCR分子鉴定(图5),确定T2代阳性植株。
5)转基因植株T2代阳性植株定量表达验证
生长时期的幼嫩叶片,各自cDNA为模板,以拟南芥β-actin为内参(aF:5’-CCCGCTATGTATGTCGCCA-3’;aR:5’-AACCCTCGTAGATTGGCACAG-3’),进行qRT-PCR表达验证。结果表明以未转基因的野生型拟南芥为对照,芝麻SiOSM1基因在2个拟南芥转基因株系(OSM1-1和OSM2-2)的叶片中表达量显著提高,而在未转基因对照拟南芥的叶片中,没有检测到芝麻SiOSM1基因的表达(图6)。表明芝麻SiOSM1基因均转化并插入到了相应拟南芥基因组中并得到了表达。
6)T2代阳性拟南芥植物抗旱性测定
待T2代转基因植物生长至3对叶时期,分别对拟南芥转基因植株和未转基因野生型拟南芥植株进行干旱胁迫处理20天。结果表明与野生型拟南芥对照相比,本研究所获得的转SiOSM1基因拟南芥株系抗旱能力明显高于野生型拟南芥对照(图7),表明芝麻SiOSM1基因的过量表达可以提高植物的抗旱能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种抗旱相关的芝麻基因及其应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 681
<212> DNA
<213> Sesamum indicum
<400> 1
atggccttcg ccaaaaacct cacttttgtt gcttgtattc tgacaatcgc attcttcact 60
ttcacccatg ctgccacttt cgacatcacg aaccgatgta gctaccctgt ctgggctgct 120
gcttcgcctg gtggaggcag aaggctcgac cagggccagt cttggcagat caatgtcgca 180
ccaggcactg tccaggcccg gatttggggc aggactaatt gcaatttcga tggcaatggt 240
cgaggccaat gtgagacggg tgactgtaac ggggtcttgg aatgccaggg ctacggtcgg 300
gcccctaaca ccctagccga attcgccctg aaccagccca acaacttaga ctttgtcgac 360
atctcccttg tcgatgggtt caatattcca atggaattca gcccgacaac tgacgtgtgc 420
cgcaacctga ggtgcacagc cccgatcaac gagcagtgtc ccaatgagct tcgagcccca 480
ggaggatgta acaatccatg cactgttttc ggaactaatg agtactgttg tactgacggg 540
cctggaagct gcgggccaac aaattattcg aggtttttca aggagaggtg ccctgacgcc 600
tatagctatc ctcaggatga tccaacaagt cttttcactt gccctgctgg taccaattac 660
agggtcgtgt tctgcccatg a 681
<210>2
<211>226
<212>PRT
<213>芝麻(Sesamumindicum L.)
<400> 2
Met Ala Phe Ala Lys Asn Leu Thr Phe Val Ala Cys Ile Leu Thr Ile
1 5 10 15
Ala Phe Phe Thr Phe Thr His Ala Ala Thr Phe Asp Ile Thr Asn Arg
20 25 30
Cys Ser Tyr Pro Val Trp Ala Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly Arg Arg
35 40 45
Leu Asp Gln Gly Gln Ser Trp Gln Ile Asn Val Ala Pro Gly Thr Val
50 55 60
Gln Ala Arg Ile Trp Gly Arg Thr Asn Cys Asn Phe Asp Gly Asn Gly
65 70 75 80
Arg Gly Gln Cys Glu Thr Gly Asp Cys Asn Gly Val Leu Glu Cys Gln
85 90 95
Gly Tyr Gly Arg Ala Pro Asn Thr Leu Ala Glu Phe Ala Leu Asn Gln
100 105 110
Pro Asn Asn Leu Asp Phe Val Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn
115 120 125
Ile Pro Met Glu Phe Ser Pro Thr Thr Asp Val Cys Arg Asn Leu Arg
130 135 140
Cys Thr Ala Pro Ile Asn Glu Gln Cys Pro Asn Glu Leu Arg Ala Pro
145 150 155 160
Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys Thr Val Phe Gly Thr Asn Glu Tyr Cys
165 170 175
Cys Thr Asp Gly Pro Gly Ser Cys Gly Pro Thr Asn Tyr Ser Arg Phe
180 185 190
Phe Lys Glu Arg Cys Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gln Asp Asp Pro
195 200 205
Thr Ser Leu Phe Thr Cys Pro Ala Gly Thr Asn Tyr Arg Val Val Phe
210 215 220
Cys Pro
225

Claims (7)

1.一种抗旱相关的芝麻(Sesamum indicum L.)基因SiOSM1,其特征在于:该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示,或为由该序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而产生的具有同等功能的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的芝麻(Sesamum indicum L.)基因SiOSM1编码的芝麻SiOSM1蛋白,其特征在于:具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述的芝麻基因SiOSM1核苷酸序列的克隆载体或各类表达载体。
4.含有权利要求3所述载体的宿主细胞。
5.权利要求1所述的芝麻(Sesamum indicum L.)基因SiOSM1在提高植物抗旱性的应用。
6.权利要求3所述的载体在提高植物抗旱性中的应用。
7.权利要求4所述的宿主细胞在提高植物抗旱性中的应用。
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