CN112029745B

CN112029745B - 植物tmk家族基因及其抗非生物胁迫功能的应用

Info

Publication number: CN112029745B
Application number: CN202010919990.4A
Authority: CN
Inventors: 徐通达; 黄荣峰; 何军
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-09-04
Filing date: 2020-09-04
Publication date: 2022-07-05
Anticipated expiration: 2040-09-04
Also published as: CN112029745A

Abstract

本发明提供植物TMK家族基因及其抗非生物胁迫功能的应用，所述TMK家族基因为拟南芥TMK1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明通过对tmk突变体在低温、高温胁迫条件下的生存率进行统计分析和功能鉴定，发现拟南芥TMK1基因可以提高植物对低温、高温胁迫的耐受，增加其在胁迫条件下的存活率。

Description

植物TMK家族基因及其抗非生物胁迫功能的应用

技术领域

本发明涉及植物TMK家族基因及其抗非生物胁迫功能的应用，属于生物技术领域。

背景技术

在植物生长发育过程中，会遭遇到各种各样非生物胁迫的威胁。温度是影响植物生长发育和地理分布最主要的限制因素。随着全球极端温度波动的加剧，温度胁迫给整个农作物生产带来严峻的挑战，常常造成大面积的农作物受灾，给农业生产带来巨大损失，严重影响了国计民生和国家粮食的安全，为此，研究植物对温度胁迫的响应机制，培育耐低温、抗高温的农作物新品种具有重要的实际意义。

随着全球人口的进一步增加、世界范围内自然灾害的加剧，使得粮食安全成为世界瞩目的问题。通过基因工程手段，充分发掘利用植物自身基因资源来改良农作物的重要农艺性状和抗逆能力，对培育高产抗逆的农作物具有重要的指导意义。

拟南芥（Arabidopsis thaliala），属十字花科，芸薹属植物；具有植株小、生长周期短、结实多、基因组小等优点，同时其形态特征分明，因此被广泛应用于植物遗传学、发育生物学的研究，是植物研究领域最耀眼的模式植物。通过对该模式植物的遗传分析、基因克隆和功能研究等可以为多种农作物的重要农艺性状、耐逆境胁迫、粮食增产和环境保护等相关研究提供重要的理论指导和研究基础。通过农杆菌介导的花浸染法，可以将重要的相关基因转导到拟南芥植株中，形成基因功能互补或基因过量表达或基因敲除的拟南芥株系，可以方便地研究该基因在逆境胁迫中的功能，并为研究植物如何响应逆境胁迫提供重要的分子机制。

发明内容

本发明的目的是提供了一种植物TMK基因在植物抗（耐）低温、高温胁迫方面的应用，拓展了植物基因TMK的功能。

为了实现本发明目的，本发明通过对tmk突变体在低温、高温胁迫条件下的生存率进行统计分析和功能鉴定，发现拟南芥TMK1基因可以提高植物对低温、高温胁迫的耐受，增加其在胁迫条件下的存活率。

本发明涉及的TMK1基因的序列为：

(1) SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

(2)由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过取代、添加或缺失一个或几个核苷酸且具有同等功能的核苷酸衍生序列；或

(3)在高严谨条件下，与SEQ ID NO.1所示序列杂交的核苷酸序列；

其高严谨条件为0.1%SDS的0.1%的SSPE或 0.1%SDS的0.1%的SSC溶液中，65℃条件下杂交，并用该溶液洗膜。

SEQ ID NO.1：

ATGAAGAAAAGAAGAACCTTTCTTCTATTTTCATTTACCTTTCTTCTTCTTCTATCTCTTTCTAAAGCTGATTCTGATGGAGATCTCTCAGCGATGTTATCACTCAAGAAAAGCTTAAACCCACCCAGTTCTTTCGGTTGGTCTGACCCTGACCCATGTAAATGGACTCACATCGTTTGTACAGGAACAAAACGTGTGACCCGGATCCAAATCGGGCATTCGGGTCTTCAAGGTACACTTTCTCCTGATCTACGTAACTTATCAGAGCTTGAAAGACTTGAGCTTCAATGGAACAACATCTCTGGTCCTGTTCCTTCTTTAAGTGGTTTAGCTTCATTACAAGTCTTGATGTTAAGTAACAACAACTTTGATTCTATCCCTAGTGATGTCTTTCAAGGTTTAACTTCGTTACAATCTGTAGAAATTGATAACAATCCTTTTAAGAGTTGGGAGATTCCAGAGAGTTTGAGAAATGCTTCTGCTCTTCAGAATTTCTCTGCTAATTCGGCTAATGTTTCCGGTTCTTTACCCGGTTTTCTCGGACCGGATGAGTTTCCCGGTTTGTCGATTTTGCATTTGGCTTTCAACAACTTAGAAGGAGAGTTGCCTATGAGTTTAGCTGGCTCTCAGGTTCAGTCATTGTGGCTCAATGGTCAGAAACTAACCGGTGATATTACTGTTCTTCAGAACATGACTGGTTTAAAAGAGGTTTGGCTTCACTCCAACAAGTTTTCGGGTCCTTTACCGGACTTTTCGGGTCTTAAGGAGCTTGAGAGCTTGAGTTTGAGAGATAACTCCTTTACAGGTCCAGTTCCTGCGTCTTTGTTAAGTCTTGAGTCACTTAAAGTTGTGAACTTGACGAATAATCATCTACAAGGACCAGTGCCTGTGTTTAAGAGCTCTGTTTCAGTTGATTTGGATAAAGATTCTAACAGCTTTTGCTTGTCTAGTCCTGGTGAGTGTGATCCTAGAGTGAAGTCTTTGCTTTTGATAGCTAGTTCATTCGATTATCCGCCCCGGCTCGCTGAGAGTTGGAAAGGAAACGATCCTTGTACTAACTGGATTGGGATAGCTTGTAGCAATGGGAACATTACTGTTATCAGTCTTGAGAAAATGGAACTAACCGGGACGATTTCTCCCGAGTTTGGAGCGATCAAGTCGCTTCAAAGAATCATTCTTGGTATCAACAATCTTACTGGTATGATTCCTCAAGAGCTTACAACGTTACCTAATCTCAAAACACTCGATGTTTCGAGTAACAAGCTTTTCGGGAAGGTCCCGGGTTTTAGAAGCAATGTTGTTGTGAATACTAATGGTAATCCTGACATTGGAAAGGATAAAAGCTCTTTGTCTTCTCCTGGTTCTTCTTCGCCTTCAGGTGGTTCGGGTTCAGGTATCAACGGTGATAAAGACCGGAGAGGAATGAAGTCTTCGACTTTTATAGGAATCATTGTTGGTTCAGTTCTTGGAGGTTTGTTATCAATCTTCTTGATTGGTTTGTTAGTTTTCTGTTGGTACAAAAAGAGGCAGAAGAGATTCTCAGGAAGTGAGAGCTCAAATGCAGTAGTGGTGCATCCGCGACATTCGGGGTCTGACAATGAGAGTGTTAAGATTACAGTTGCGGGTTCAAGCGTAAGCGTTGGAGGGATAAGTGATACTTATACGCTTCCTGGTACAAGTGAGGTTGGAGATAATATTCAAATGGTGGAAGCAGGAAACATGCTGATATCAATCCAAGTGCTTCGTTCTGTGACTAACAACTTCAGTTCAGATAACATTCTTGGATCAGGAGGTTTCGGGGTTGTGTATAAAGGCGAGTTGCACGATGGAACGAAGATTGCGGTTAAGAGAATGGAGAATGGAGTTATTGCTGGTAAAGGCTTTGCGGAGTTTAAATCAGAGATTGCGGTTTTAACAAAGGTTAGGCATCGTCATTTGGTTACGCTTCTTGGTTATTGTTTGGATGGGAATGAGAAGTTACTTGTGTATGAGTATATGCCTCAAGGGACATTGAGTAGGCATTTGTTTGAGTGGTCAGAGGAAGGACTTAAGCCTCTGTTGTGGAAACAGAGATTGACTTTAGCTTTGGATGTTGCTAGAGGTGTGGAGTATCTCCATGGATTAGCTCACCAGAGCTTTATACACAGGGATCTTAAGCCTTCTAACATTCTTCTTGGGGATGATATGAGGGCGAAAGTTGCAGACTTTGGACTCGTTCGTCTCGCTCCTGAAGGAAAAGGATCGATTGAGACTAGAATCGCTGGAACATTTGGTTACTTGGCACCCGAATACGCAGTAACGGGTCGAGTGACAACGAAGGTCGATGTATACAGCTTCGGGGTAATCCTAATGGAACTCATAACGGGAAGAAAATCTCTAGACGAATCGCAACCAGAAGAAAGCATTCACTTGGTCTCTTGGTTCAAACGGATGTACATCAACAAAGAAGCATCATTCAAGAAAGCGATCGACACGACAATAGACCTAGACGAAGAAACCTTAGCCAGCGTTCACACTGTTGCTGAACTAGCAGGCCATTGCTGTGCCCGTGAGCCTTACCAGAGACCAGACATGGGACACGCAGTCAACATTCTGTCATCACTCGTTGAGCTATGGAAACCGTCGGATCAGAATCCAGAAGACATATATGGTATCGATCTCGACATGTCTTTACCTCAAGCACTTAAGAAATGGCAAGCTTATGAAGGAAGAAGTGATCTCGAATCTTCAACTTCATCACTTTTACCTAGCTTGGACAACACGCAGATGAGTATTCCCACTAGACCTTACGGATTCGCAGAGTCATTCACTTCAGTAGATGGACGATGA。

所述的TMK1基因在拟南芥基因组数据库TAIR中的编号为AT1g66150，该基因来源于哥伦比亚生态型拟南芥，其核苷酸长度为2829bp，编码942个氨基酸蛋白，该蛋白编码一个类受体跨膜的蛋白激酶。该基因读码框由2个外显子和1个内含子组成，其中第2297位到第2380位碱基为内含子序列；其余为外显子序列。在其TMK1基因的CDS序列中，自5^，端的第1位-69位碱基为编码信号肽的序列；5^，端的第1443位-1509位碱基为编码跨膜序列；5^，端的第1764位-2595位碱基为编码蛋白激酶结构域序列。

由TMK1基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。在不影响其蛋白功能的前提下，本领域的技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。

SEQ ID NO.2：

MKKRRTFLLFSFTFLLLLSLSKADSDGDLSAMLSLKKSLNPPSSFGWSDPDPCKWTHIVCTGTKRVTRIQIGHSGLQGTLSPDLRNLSELERLELQWNNISGPVPSLSGLASLQVLMLSNNNFDSIPSDVFQGLTSLQSVEIDNNPFKSWEIPESLRNASALQNFSANSANVSGSLPGFLGPDEFPGLSILHLAFNNLEGELPMSLAGSQVQSLWLNGQKLTGDITVLQNMTGLKEVWLHSNKFSGPLPDFSGLKELESLSLRDNSFTGPVPASLLSLESLKVVNLTNNHLQGPVPVFKSSVSVDLDKDSNSFCLSSPGECDPRVKSLLLIASSFDYPPRLAESWKGNDPCTNWIGIACSNGNITVISLEKMELTGTISPEFGAIKSLQRIILGINNLTGMIPQELTTLPNLKTLDVSSNKLFGKVPGFRSNVVVNTNGNPDIGKDKSSLSSPGSSSPSGGSGSGINGDKDRRGMKSSTFIGIIVGSVLGGLLSIFLIGLLVFCWYKKRQKRFSGSESSNAVVVHPRHSGSDNESVKITVAGSSVSVGGISDTYTLPGTSEVGDNIQMVEAGNMLISIQVLRSVTNNFSSDNILGSGGFGVVYKGELHDGTKIAVKRMENGVIAGKGFAEFKSEIAVLTKVRHRHLVTLLGYCLDGNEKLLVYEYMPQGTLSRHLFEWSEEGLKPLLWKQRLTLALDVARGVEYLHGLAHQSFIHRDLKPSNILLGDDMRAKVADFGLVRLAPEGKGSIETRIAGTFGYLAPEYAVTGRVTTKVDVYSFGVILMELITGRKSLDESQPEESIHLVSWFKRMYINKEASFKKAIDTTIDLDEETLASVHTVAELAGHCCAREPYQRPDMGHAVNILSSLVELWKPSDQNPEDIYGIDLDMSLPQALKKWQAYEGRSDLESSTSSLLPSLDNTQMSIPTRPYGFAESFTSVDGR。

本领域的技术人员可根据不同物种密码子的偏好性，适时的选择适应特定物种的表达的密码子。

本发明还提供含有植物TMK1基因序列的克隆载体和各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞以及含有所述基因序列的转基因植株。

本发明通过在低温、高温胁迫条件下的遗传筛选，发现和野生型相比， tmk1突变体表现出较低的生存率，通过转化TMK1基因启动子驱动TMK1基因的表达载体，表型及功能验证分析表明TMK1基因可以恢复tmk1突变体对低温、高温敏感的表型缺陷，表明TMK1基因参与并调控植物对温度胁迫的耐受中。

本发明还提供了一种构建回补拟南芥tmk1突变体对低温、高温胁迫敏感的方法，其步骤如下：

（1）提取拟南芥基因组DNA，并以DNA为模板，通过引物F和R，扩增TMK1基因及其上游3000bp的启动子序列，将扩增产物构建到表达载体pCAMBIA1300，获得重组表达载体，命名为pTMK1:TMK1。

（2）将构建好的重组载体pTMK1:TMK1转化农杆菌GV3101，然后利用拟南芥花序侵染法转化tmk1纯合突变体，通过筛选纯合转基因植株即获得低温、高温敏感性恢复的转基因植株。

其中步骤（1）中的所用的引物序列F和R核苷酸序列如SEQ IDNO.3-4 所示。为了便于对转基因材料进行鉴定和筛选，可对所使用的表达载体添加合适的选择标签或抗生素标记物等。

本发明通过对编码植物类受体跨膜激酶的基因TMK1的研究，发现其突变体tmk1和野生型相比，在低温胁迫和高温胁迫下具有超敏感的表型，其存活率显著低于野生型植株，通过构建tmk1突变体的回补植株，在低温和高温条件下的表型分析显示TMK1基因可以恢复tmk1突变体对低温、高温敏感的表型缺陷。本发明通过对TMK1基因的功能分析，确立了TMK1基因在植物抗低温、高温胁迫中的作用，为培育抗低温、耐高温的植物新品种提供了新的实践基础。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的TMK1基因在植物响应温度胁迫中扮演重要角色，其为培育新的抗低温和耐高温的植物新品种提供了新的基因资源，在农业生产上具有重要的应用价值；也为研究植物响应逆境胁迫信号的分子机制提供新的研究素材。

附图说明

图1为实施例1中，tmks突变体在低温胁迫处理下的表型分析。

图2为实施例1中，tmks突变体在低温胁迫处理下的成活率统计图。

图3为实施例2中，tmks突变体在高温胁迫处理下的表型分析。

图4为实施例2中，tmks突变体在高温胁迫处理下的成活率统计图。

图5为实施例3中，PCR克隆TMK1基因组DNA（包括其上游3000bp的启动子序列）的电泳条带图；其中1为Marker的电泳条带，2为目的基因的电泳条带。

图6为实施例4中，tmk1突变体转基因互补株系的蛋白表达量图。

图7为实施例5中，tmk1突变体的回补株系在低温胁迫处理下的表型分析。

图8为实施例5中，tmk1突变体的回补株系在低温胁迫处理下的成活率统计图。

图9为实施例5中，tmk1突变体的回补株系在高温胁迫处理下的表型分析。

图10为实施例5中，tmk1突变体的回补株系在高温胁迫处理下的成活率统计图。

具体实施方式

一下用本发明的实施例来进一步的说明本发明的实质内容，但并不以此限制本发明。

实施例1 低温胁迫处理下tmks突变体的耐低温表型分析

将野生型拟南芥和tmks (tmk1(SALK_016360), tmk2(SAIL_1242_H07), tmk3(SALK_129759)，tmk4(GABI_348E01))突变体的种子分别用75%的乙醇浸泡灭菌10min，消毒后的种子于4℃冰箱春化2天，点播于含0.8%琼脂糖的1/2MS（Murashige and Skoog）固体培养基中，置于22℃光照培养箱中萌发培养7天，然后将其移到低温培养箱中进行低温处理。其处理程序如下：4℃ 处理2小时，进行程序降温（1℃/h）至-8℃处理1小时，然后进行程序升温（1℃/h）至4℃处理4小时；以上处理植株22℃黑暗过夜后，将其移到22℃光照培养箱中培养3-5天，统计植株存活数量，计算其存活率。

结果表明（图1和图2），低温处理后，tmk1突变体更多的出现白化死亡，其存活率显著低于野生型植株，表现出对低温胁迫的敏感表型。

实施例2 tmks突变体耐热性的表型分析

将野生型拟南芥和tmks（tmk1,tmk2,tmk3,tmk4）突变体的种子分别用75%的乙醇浸泡灭菌10min，消毒后的种子于4℃冰箱春化2天，点播于含0.8%琼脂糖的1/2MS（Murashige and Skoog）固体培养基中，置于22℃光照培养箱中萌发培养7天，然后将其移到高温环境中进行热激处理，热激条件为：38℃，2小时；45℃，2小时，22℃光照培养箱中培养3-5天，拍照并统计植株存活数量，计算其存活率。

实验结果表明（图3和图4）经热激处理后，tmk1突变体大量死亡，其存活率显著低于野生型植株，表现出对高温胁迫的敏感表型。

实施例3 pTMK1:TMK1载体的构建

为了进一步验证tmk1突变体对低温、高温胁迫的敏感表型，我们从野生型拟南芥基因组中克隆了TMK1基因（SEQ ID NO.1所示）包括其上游3000bp的启动子序列（见图5）；并将所扩增基因序列连接到表达载体pCAMBIA1300上，获得重组表达载体，命名为pTMK1:TMK1，并进行测序作最后的检测验证。

其所用引物序列为：

上游引物F：5-CTTATTTTTTGCTTTTTGATTGTTT-3 （Seq ID NO.3），

下游引物R：5-TCGTCCATCTACTGAAGTGAATG-3 （Seq ID NO.4）。

实施例4 转基因植株的构建和检测

将实施例3中的pTMK1:TMK1载体转化到农杆菌GV3101中，再通过拟南芥花浸染法转化tmk1突变体，通过抗性筛选得到tmk1突变体的回补株系。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于80mL的LB液体培养基中(50ug/mL Kan，50ug/mL Rif )，28℃振荡培养过夜，待其OD₆₀₀为1.6左右时，以5000rpm 离心10min；去上清，加30mL 5%蔗糖悬浮菌体，并加入10uL Silwet 混匀，获得转化液。将拟南芥的花苞浸泡在转化液中1min，取出并套上黑色保鲜袋置于黑暗处12小时；第二天将保鲜袋取下，将植株放回光照培养箱下正常生长至收种。

pCAMBIA1300载体带有潮霉素抗性，可对转基因植株进行潮霉素抗性筛选，直到该转基因植株含有单拷贝的目的基因插入。该纯合单拷贝基因插入的转基因植株可进行后续的低温、高温胁迫的逆境实验处理。

获得的转基因植株命名为#11-9。采用蛋白质免疫印迹法检测转基因株系。其步骤如下：

1. 植物总蛋白提取

将培养皿上生长1周左右的植株幼苗，取10株幼苗于EP管中，迅速冻存于液氮中。在液氮中将植株材料研磨成粉末状，加入蛋白提取液于4℃静置30分钟；12000rpm 离心20min。

2. 蛋白质免疫印迹法检测转基因植株中目的蛋白的表达

取上述野生型、转基因植株离心后的蛋白提取液分别加入2×SDS蛋白上样缓

冲液，于95℃金属浴中煮沸5min；取上述蛋白样品20uL于80V电压跑胶30min；后换成120V电压至跑胶结束；用25V恒压转膜30min。最后用商品化GFP抗体检测转基因株系中目的基因的表达量。蛋白质免疫印迹结束后用丽春红染色转有目的蛋白的PVDF膜，作为蛋白内参。

检测结果（图6），可以看出在转基因植株中有目的基因的表达。

实施例5 tmk1突变体回补植株抗低温和耐高温的表型分析

首先将野生型植株、tmk1突变体以及实施例中的转基因回补植株#11-9（TMK1- GFP/tmk1）在培养皿中生长7天左右，待其真叶长出，然后将其移到低温或高温培养箱中进行低温或高温胁迫处理。对于低温处理，处理程序如下：4℃处理2小时，进行程序降温（1℃/h）至-8℃处理1小时，然后进行程序升温（1℃/h）至4℃处理4小时；以上处理植株22℃黑暗过夜后，将其移到22℃光照培养箱中培养3-5天，统计植株存活数量，计算其存活率。对于高温处理，其条件为：38℃，2小时；45℃，2小时，22℃光照培养箱中培养3-5天，拍照并统计植株存活数量，计算其存活率。

结果显示(图7-10)，在低温胁迫处理条件下，TMK1基因可以回补tmk1突变体对低温敏感的缺陷表型；同时在高温胁迫处理条件下，TMK1基因可以回补tmk1突变体对高温响应的发育缺陷。由此可见，tmk1突变体对低温、高温响应的缺陷是由TMK1基因造成的；TMK1基因在植物响应低温、高温胁迫中的起到重要作用。

最后，以上列举的仅仅是本发明其中的几个具体实施例。在本发明基础之上，可以对之进行修改或改进，这对于本领域的技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 植物TMK家族基因及其抗非生物胁迫功能的应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2829

<212> DNA

<213> TMK1 基因的碱基序列

<400> 1

atgaagaaaa gaagaacctt tcttctattt tcatttacct ttcttcttct tctatctctt 60

tctaaagctg attctgatgg agatctctca gcgatgttat cactcaagaa aagcttaaac 120

ccacccagtt ctttcggttg gtctgaccct gacccatgta aatggactca catcgtttgt 180

acaggaacaa aacgtgtgac ccggatccaa atcgggcatt cgggtcttca aggtacactt 240

tctcctgatc tacgtaactt atcagagctt gaaagacttg agcttcaatg gaacaacatc 300

tctggtcctg ttccttcttt aagtggttta gcttcattac aagtcttgat gttaagtaac 360

aacaactttg attctatccc tagtgatgtc tttcaaggtt taacttcgtt acaatctgta 420

gaaattgata acaatccttt taagagttgg gagattccag agagtttgag aaatgcttct 480

gctcttcaga atttctctgc taattcggct aatgtttccg gttctttacc cggttttctc 540

ggaccggatg agtttcccgg tttgtcgatt ttgcatttgg ctttcaacaa cttagaagga 600

gagttgccta tgagtttagc tggctctcag gttcagtcat tgtggctcaa tggtcagaaa 660

ctaaccggtg atattactgt tcttcagaac atgactggtt taaaagaggt ttggcttcac 720

tccaacaagt tttcgggtcc tttaccggac ttttcgggtc ttaaggagct tgagagcttg 780

agtttgagag ataactcctt tacaggtcca gttcctgcgt ctttgttaag tcttgagtca 840

cttaaagttg tgaacttgac gaataatcat ctacaaggac cagtgcctgt gtttaagagc 900

tctgtttcag ttgatttgga taaagattct aacagctttt gcttgtctag tcctggtgag 960

tgtgatccta gagtgaagtc tttgcttttg atagctagtt cattcgatta tccgccccgg 1020

ctcgctgaga gttggaaagg aaacgatcct tgtactaact ggattgggat agcttgtagc 1080

aatgggaaca ttactgttat cagtcttgag aaaatggaac taaccgggac gatttctccc 1140

gagtttggag cgatcaagtc gcttcaaaga atcattcttg gtatcaacaa tcttactggt 1200

atgattcctc aagagcttac aacgttacct aatctcaaaa cactcgatgt ttcgagtaac 1260

aagcttttcg ggaaggtccc gggttttaga agcaatgttg ttgtgaatac taatggtaat 1320

cctgacattg gaaaggataa aagctctttg tcttctcctg gttcttcttc gccttcaggt 1380

ggttcgggtt caggtatcaa cggtgataaa gaccggagag gaatgaagtc ttcgactttt 1440

ataggaatca ttgttggttc agttcttgga ggtttgttat caatcttctt gattggtttg 1500

ttagttttct gttggtacaa aaagaggcag aagagattct caggaagtga gagctcaaat 1560

gcagtagtgg tgcatccgcg acattcgggg tctgacaatg agagtgttaa gattacagtt 1620

gcgggttcaa gcgtaagcgt tggagggata agtgatactt atacgcttcc tggtacaagt 1680

gaggttggag ataatattca aatggtggaa gcaggaaaca tgctgatatc aatccaagtg 1740

cttcgttctg tgactaacaa cttcagttca gataacattc ttggatcagg aggtttcggg 1800

gttgtgtata aaggcgagtt gcacgatgga acgaagattg cggttaagag aatggagaat 1860

ggagttattg ctggtaaagg ctttgcggag tttaaatcag agattgcggt tttaacaaag 1920

gttaggcatc gtcatttggt tacgcttctt ggttattgtt tggatgggaa tgagaagtta 1980

cttgtgtatg agtatatgcc tcaagggaca ttgagtaggc atttgtttga gtggtcagag 2040

gaaggactta agcctctgtt gtggaaacag agattgactt tagctttgga tgttgctaga 2100

ggtgtggagt atctccatgg attagctcac cagagcttta tacacaggga tcttaagcct 2160

tctaacattc ttcttgggga tgatatgagg gcgaaagttg cagactttgg actcgttcgt 2220

ctcgctcctg aaggaaaagg atcgattgag actagaatcg ctggaacatt tggttacttg 2280

gcacccgaat acgcagtaac gggtcgagtg acaacgaagg tcgatgtata cagcttcggg 2340

gtaatcctaa tggaactcat aacgggaaga aaatctctag acgaatcgca accagaagaa 2400

agcattcact tggtctcttg gttcaaacgg atgtacatca acaaagaagc atcattcaag 2460

aaagcgatcg acacgacaat agacctagac gaagaaacct tagccagcgt tcacactgtt 2520

gctgaactag caggccattg ctgtgcccgt gagccttacc agagaccaga catgggacac 2580

gcagtcaaca ttctgtcatc actcgttgag ctatggaaac cgtcggatca gaatccagaa 2640

gacatatatg gtatcgatct cgacatgtct ttacctcaag cacttaagaa atggcaagct 2700

tatgaaggaa gaagtgatct cgaatcttca acttcatcac ttttacctag cttggacaac 2760

acgcagatga gtattcccac tagaccttac ggattcgcag agtcattcac ttcagtagat 2820

ggacgatga 2829

<210> 2

<211> 942

<212> PRT

<213> TMK1 基因的蛋白氨基酸序列

<400> 2

Met Lys Lys Arg Arg Thr Phe Leu Leu Phe Ser Phe Thr Phe Leu Leu

1 5 10 15

Leu Leu Ser Leu Ser Lys Ala Asp Ser Asp Gly Asp Leu Ser Ala Met

20 25 30

Leu Ser Leu Lys Lys Ser Leu Asn Pro Pro Ser Ser Phe Gly Trp Ser

35 40 45

Asp Pro Asp Pro Cys Lys Trp Thr His Ile Val Cys Thr Gly Thr Lys

50 55 60

Arg Val Thr Arg Ile Gln Ile Gly His Ser Gly Leu Gln Gly Thr Leu

65 70 75 80

Ser Pro Asp Leu Arg Asn Leu Ser Glu Leu Glu Arg Leu Glu Leu Gln

85 90 95

Trp Asn Asn Ile Ser Gly Pro Val Pro Ser Leu Ser Gly Leu Ala Ser

100 105 110

Leu Gln Val Leu Met Leu Ser Asn Asn Asn Phe Asp Ser Ile Pro Ser

115 120 125

Asp Val Phe Gln Gly Leu Thr Ser Leu Gln Ser Val Glu Ile Asp Asn

130 135 140

Asn Pro Phe Lys Ser Trp Glu Ile Pro Glu Ser Leu Arg Asn Ala Ser

145 150 155 160

Ala Leu Gln Asn Phe Ser Ala Asn Ser Ala Asn Val Ser Gly Ser Leu

165 170 175

Pro Gly Phe Leu Gly Pro Asp Glu Phe Pro Gly Leu Ser Ile Leu His

180 185 190

Leu Ala Phe Asn Asn Leu Glu Gly Glu Leu Pro Met Ser Leu Ala Gly

195 200 205

Ser Gln Val Gln Ser Leu Trp Leu Asn Gly Gln Lys Leu Thr Gly Asp

210 215 220

Ile Thr Val Leu Gln Asn Met Thr Gly Leu Lys Glu Val Trp Leu His

225 230 235 240

Ser Asn Lys Phe Ser Gly Pro Leu Pro Asp Phe Ser Gly Leu Lys Glu

245 250 255

Leu Glu Ser Leu Ser Leu Arg Asp Asn Ser Phe Thr Gly Pro Val Pro

260 265 270

Ala Ser Leu Leu Ser Leu Glu Ser Leu Lys Val Val Asn Leu Thr Asn

275 280 285

Asn His Leu Gln Gly Pro Val Pro Val Phe Lys Ser Ser Val Ser Val

290 295 300

Asp Leu Asp Lys Asp Ser Asn Ser Phe Cys Leu Ser Ser Pro Gly Glu

305 310 315 320

Cys Asp Pro Arg Val Lys Ser Leu Leu Leu Ile Ala Ser Ser Phe Asp

325 330 335

Tyr Pro Pro Arg Leu Ala Glu Ser Trp Lys Gly Asn Asp Pro Cys Thr

340 345 350

Asn Trp Ile Gly Ile Ala Cys Ser Asn Gly Asn Ile Thr Val Ile Ser

355 360 365

Leu Glu Lys Met Glu Leu Thr Gly Thr Ile Ser Pro Glu Phe Gly Ala

370 375 380

Ile Lys Ser Leu Gln Arg Ile Ile Leu Gly Ile Asn Asn Leu Thr Gly

385 390 395 400

Met Ile Pro Gln Glu Leu Thr Thr Leu Pro Asn Leu Lys Thr Leu Asp

405 410 415

Val Ser Ser Asn Lys Leu Phe Gly Lys Val Pro Gly Phe Arg Ser Asn

420 425 430

Val Val Val Asn Thr Asn Gly Asn Pro Asp Ile Gly Lys Asp Lys Ser

435 440 445

Ser Leu Ser Ser Pro Gly Ser Ser Ser Pro Ser Gly Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Ile Asn Gly Asp Lys Asp Arg Arg Gly Met Lys Ser Ser Thr Phe

465 470 475 480

Ile Gly Ile Ile Val Gly Ser Val Leu Gly Gly Leu Leu Ser Ile Phe

485 490 495

Leu Ile Gly Leu Leu Val Phe Cys Trp Tyr Lys Lys Arg Gln Lys Arg

500 505 510

Phe Ser Gly Ser Glu Ser Ser Asn Ala Val Val Val His Pro Arg His

515 520 525

Ser Gly Ser Asp Asn Glu Ser Val Lys Ile Thr Val Ala Gly Ser Ser

530 535 540

Val Ser Val Gly Gly Ile Ser Asp Thr Tyr Thr Leu Pro Gly Thr Ser

545 550 555 560

Glu Val Gly Asp Asn Ile Gln Met Val Glu Ala Gly Asn Met Leu Ile

565 570 575

Ser Ile Gln Val Leu Arg Ser Val Thr Asn Asn Phe Ser Ser Asp Asn

580 585 590

Ile Leu Gly Ser Gly Gly Phe Gly Val Val Tyr Lys Gly Glu Leu His

595 600 605

Asp Gly Thr Lys Ile Ala Val Lys Arg Met Glu Asn Gly Val Ile Ala

610 615 620

Gly Lys Gly Phe Ala Glu Phe Lys Ser Glu Ile Ala Val Leu Thr Lys

625 630 635 640

Val Arg His Arg His Leu Val Thr Leu Leu Gly Tyr Cys Leu Asp Gly

645 650 655

Asn Glu Lys Leu Leu Val Tyr Glu Tyr Met Pro Gln Gly Thr Leu Ser

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Arg His Leu Phe Glu Trp Ser Glu Glu Gly Leu Lys Pro Leu Leu Trp

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Lys Gln Arg Leu Thr Leu Ala Leu Asp Val Ala Arg Gly Val Glu Tyr

690 695 700

Leu His Gly Leu Ala His Gln Ser Phe Ile His Arg Asp Leu Lys Pro

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Ser Asn Ile Leu Leu Gly Asp Asp Met Arg Ala Lys Val Ala Asp Phe

725 730 735

Gly Leu Val Arg Leu Ala Pro Glu Gly Lys Gly Ser Ile Glu Thr Arg

740 745 750

Ile Ala Gly Thr Phe Gly Tyr Leu Ala Pro Glu Tyr Ala Val Thr Gly

755 760 765

Arg Val Thr Thr Lys Val Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Ile Leu Met

770 775 780

Glu Leu Ile Thr Gly Arg Lys Ser Leu Asp Glu Ser Gln Pro Glu Glu

785 790 795 800

Ser Ile His Leu Val Ser Trp Phe Lys Arg Met Tyr Ile Asn Lys Glu

805 810 815

Ala Ser Phe Lys Lys Ala Ile Asp Thr Thr Ile Asp Leu Asp Glu Glu

820 825 830

Thr Leu Ala Ser Val His Thr Val Ala Glu Leu Ala Gly His Cys Cys

835 840 845

Ala Arg Glu Pro Tyr Gln Arg Pro Asp Met Gly His Ala Val Asn Ile

850 855 860

Leu Ser Ser Leu Val Glu Leu Trp Lys Pro Ser Asp Gln Asn Pro Glu

865 870 875 880

Asp Ile Tyr Gly Ile Asp Leu Asp Met Ser Leu Pro Gln Ala Leu Lys

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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Claims

1.过量表达TMK家族基因在拟南芥抗非生物胁迫功能中的应用，所述TMK家族基因为拟南芥TMK1基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述非生物胁迫为低温、高温胁迫。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将拟南芥TMK1基因利用表达载体转化到拟南芥中获得抗低温、高温胁迫的功能。