CN104357465B - 植物耐低温基因AtLCBK1的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供植物耐低温基因AtLCBK1的应用，通过在植物中过表达AtLCBK1基因，可获得耐低温的转基因植物。本发明提供的AtLCBK1基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

Description

植物耐低温基因AtLCBK1的应用

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及植物耐低温基因AtLCBK1的应用。

背景技术

与动物或微生物相比，植物由于其生长的固着性，对环境的要求比较高。作为重要的环境胁迫之一，温度不仅能影响植物的生长发育，同时也是限制作物产量的因素，很多农作物的大量减产就是由于低温寒害造成的，从而给农业生产带来巨大损失，也加剧了全球的粮食危机。因此研究植物响应低温胁迫的生理生化反应及其分子生物学机制，能够为提高植物抵抗低温寒害的能力创造条件，在农业生产中具有重要的实际应用价值。

最近几十年来，由于科学技术的不断进步，各种植物基因组测序的陆续完成，大量突变体的筛选克隆，相关遗传和生化的分析，都使人们对植物冷适应的分子生物学机制有了一定程度的了解。

拟南芥属于十字花科植物，由于其形态个体小，生长周期快，基因组小，重复序列少，并且全部基因组测序已经完成，且容易被人工诱变产生大量不同基因位点遗传变异的突变植株，作为一种典型的模式植物，广泛应用于植物遗传、发育和分子生物学的研究。

发明内容

本发明的目的是提供植物耐低温基因AtLCBK1的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供的植物耐低温基因AtLCBK1的应用，其是通过在植物中过表达AtLCBK1基因，获得耐低温的转基因植物。

本发明中涉及的AtLCBK1基因的序列为：

i)Seq ID No.1所示的核苷酸序列；或

ii)Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与Seq ID No.1所示序列杂交的核苷酸序列；

所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。

AtLCBK1基因由4878个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第626位到第4545位碱基。AtLCBK1基因来源于哥伦比亚生态型的拟南芥，在拟南芥基因组数据库中编号为At5g23450。

由AtLCBK1基因编码的氨基酸序列如Seq ID No.2所示。应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如，将第189位Arg替换为Val。

应理解，考虑到密码子的简并性及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供含有植物耐低温的AtLCBK1基因序列或其片段的克隆载体或各类表达载体，含有所述载体的宿主细胞，含有所述基因序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

前述应用中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物，例如拟南芥等。将植物耐低温AtLCBK1基因在植物中过表达，包括利用任一种可以引导外源基因在植物中过表达的载体进行。

本发明还提供一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，包括以下步骤：

1)提取拟南芥总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增AtLCBK1基因，将扩增产物构建到表达载体pSuper1300上，获得的重组表达载体命名为AtLCBK1-pSuper1300；

2)用AtLCBK1-pSuper1300转化农杆菌GV3101，然后利用转化 的农杆菌侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥幼苗。

其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如Seq ID No.3和4所示。所述拟南芥优选为野生型拟南芥植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。

将本发明的AtLCBK1基因过表达后，拟南芥表现为耐低温的表型。为了便于对转基因拟南芥植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。

本发明通过对编码植物内鞘氨醇激酶的基因AtLCBK1(全称为Sphingoid Long-Chain Bases Kinase1)的研究，发现该基因的突变体具有低温敏感的相关表型，而过表达该基因的转基因植株能够产生抗低温的相关表型，本发明首次发现该基因抗低温的重要功能。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的AtLCBK1基因为培育耐低温植物新品种提供了基因资源，为研究植物应答逆境信号的机制和耐受不利环境的分子机理奠定理论基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中含有AtLCBK1基因的pSuper1300载体质粒酶切位点为SmaI和KpnI的酶切图；其中，1为Marker电泳条带；2为含有AtLCBK1基因的pSuper1300载体质粒的电泳条带。

图2为本发明实施例2中过表达株系OE-1和OE-2的AtLCBK1基因相对表达量柱状图。

图3为本发明实施例3中过表达株系OE-1和OE-2低温处理植株恢复情况照片。

图4为本发明实施例3中过表达株系OE-3和OE-4低温处理植株成活率统计图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中pBSK载体为常用的克隆载体，可市购；pSuper1300载体是由pCAMBIA1300改造而来，由中国农业大学生物学院巩志忠教授实验室惠赠；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株常用的克隆载体。

以下实施例中的主要试剂为：各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、Pyrobest Taq酶、KOD、购自NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程公司；TRLzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司；MS培养基、琼脂粉、琼脂糖、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、硫酸庆大霉素(Gen)、利福平(Rif)等抗生素以及DEPC、Galactose、Glucose、BSA、尼龙膜、硝酸纤维素膜、LB培养基等购自Sigma公司，硝酸纤维素膜购自Amersham、Bio-Rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。

实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。实施例1AtLCBK1基因过表达载体的构建和检测

为全面了解鞘磷脂蛋白对植物抗逆能力的影响，从拟南芥属拟南芥(Arabidopsisthaliana(L.)HEYNH.)中克隆了编编码植物内鞘氨醇激酶的基因AtLCBK1。根据编码区序列分析，设计引物将该基因的编码区扩增出来，连接到具有35S启动子的过表达载体pSuper1300上。

所用的引物为：

上游引物F：5’-ATGCAGAAGAGTGGTGTTAATCGGA-3’(Seq ID No.3)

下游引物R：5’-TGAATGTCGTCCAGGAGCGTTACCG-3’(Seq ID No.4)

将AtLCBK1基因连接到具有Super启动子的载体pSuper1300上的具体方法为：首先以cDNA为模板，利用上、下游引物将AtLCBK1扩增出来，将PCR产物与pBSK载体相连，连接产物命名为AtLCBK1-pBSK；利用SmaI和KpnI将AtLCBK1从AtLCBK1-pBSK酶切后连入pSuper1300载体，连接产物命名为AtLCBK1-pSuper1300。

将上一步所得的质粒酶切后，进行电泳检测，具体的方法为：用SmaI和KpnI酶切AtLCBK1-pSuper1300，用1％琼脂糖凝胶，120V，50mA电泳后，UVP Gel Documentation凝胶分析系统扫描成像。

图1为含有AtLCBK1基因的pSuper1300载体质粒酶切位点为SmaI和KpnI的酶切图，表明pSuper1300载体中已连入AtLCBK1基因。

实施例2AtLCBK1基因过表达植物的构建和检测

将实施例1所述含有AtLCBK1基因的pSuper1300载体转化到农杆菌GV3101菌株中，再转入野生型拟南芥植株中，得到拟南芥转基因幼苗。具体方法为：将含有目的载体的农杆菌接种于100mL LB三抗液体培养液(Kan50μg/mL，Rif50μg/mL，Gen50μg/mL)中，28℃振荡培养过夜，待OD₆₀₀值为1.0-2.0，以4000rpm，室温离心15min，收集菌体；用200mL转化液(1/2MS，5％蔗糖，40μL Silwet L-77)悬浮菌体；将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中1min，套上保鲜袋保湿并置于黑暗处使其温度较低，第二天将植物从保鲜袋中取出，放回光照培养架上正常生长至收种。

pSuper1300载体所带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选，获得的T₁代具有潮霉素素抗性的阳性苗进行单株收种，再对T₂代种子进行潮霉素抗性的测试，选择3/4具有抗性而其余1/4没有抗性的株系，说明在该株系中连有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入。将这些株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种，再进行潮霉素抗性筛选，如果没有分离，说明 该转基因株系为纯合体，该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。

本实施例中分离得到过表达株系OE-1和OE-2。采用Trizol提取正常生长条件下野生型和过表达株系OE-1和OE-2的RNA。

1)反转录合成cDNA第一链(25μl体系)

取2μg上述RNA，加DEPC水至12μL，加入2μL(10pmol)Oligo(dT)18混匀，37℃反应5分钟，然后放在冰上3min，之后加入5×buffer5μL，2.5mmol dNTP5μL，200U/μL反转录酶H1μL。

反转录反应(cDNA第一链合成)在PCR仪上进行，使用如下程序：42℃反应60分钟；反应结束之后取出，加入10mg/ml1μLDNase，然后在37℃放置20分钟，之后65℃10min。

2)定量PCR(Real-time-PCR)：仪器ABI PRISM7500Real-time PCR System(Applied Biosystems,Foster City，CA，USA)；ABI kit-POWER SYBR GREEN PCR MASTERMIX。

检测结果见图2，由图2可以看出OE-1和OE-2中AtLCBK1基因均有较大程度上调。

在其它植物中过表达AtLCBK1基因的方法可以参考本实施例进行。

实施例3过表达AtLCBK1基因植物的耐低温能力检测

细胞膜被认为对于植物感受外界的冷响应至关重要，而脂类是细胞膜的重要组成部分。拟南芥鞘氨醇激酶参与植物体内鞘磷脂的代谢途径，它的催化产物SIP可作为一种信号分子参与植物的抗逆调控过程。因此，将鞘氨醇激酶过表达有可能增强植株对外界冷信号及其它逆境的抗性。已有的文献报道低温响应过程能够激活植物冷响应基因的表达，在胞内积累大量的渗透物质和保护蛋白，促进植物更好的适应零下低温。本实施例的冷响应条件设定为正常光照下4℃生长4天。

首先使野生型拟南芥幼苗和实施例2中获得的AtLCBK1基因过表达株系OE-1和OE-2在固体培养基上生长。幼苗生长2周后，对幼苗进行低温处理，处理时间为-1℃至-6℃梯度降温(每小时降低 1℃)，并在-6℃条件下处理1小时。处理后的幼苗转移至4℃黑暗条件放置过夜，之后将其在正常光照条件下培养3-4天，低温中受伤的组织会在培养过程中黄化枯死，而能够抵抗低温伤害的组织逐渐变绿并恢复生长，拍照并统计成活率。

AtLCBK1基因过表达株系OE-1和OE-2及对照野生型株系，在冷驯化和非冷驯化后低温处理后的照片见图3，冷驯化的恢复情况比非冷驯化要好，AtLCBK1基因过表达株系OE-1和OE-2的恢复情况比对照均要好。

对处理后的幼苗进行存活率统计，标准为生长点能够变绿并长出新叶，统计结果见图4，不经冷驯化(不经冷响应)，野生型幼苗植株在-6℃处理1小时后存活率仅为36％，而过表达植株OE-1和OE-2的存活率分别能够达到55％和52％；而在冷驯化(经冷响应，即让植株预先在正常光照下4℃生长4天，再进行低温处理)后，-8℃处理，野生型的存活率为43％，而过表达植株OE-1和OE-2的存活率分别能够达到59％和55％，抗低温能力较野生型也有显著增强。

这说明AtLCBK1基因过表达植株无论是否进行冷驯化，都较野生型的抗低温能力有明显增强。

由此可见，拟南芥鞘氨醇激酶相关基因AtLCBK1过表达后能够显著提高植物对低温的耐受能力。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.植物耐低温基因AtLCBK1的应用，其特征在于，通过在拟南芥中过表达AtLCBK1基因，获得耐低温的转基因拟南芥；

其中，AtLCBK1基因的序列为：Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

2.一种构建耐低温的转基因拟南芥的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取拟南芥总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，F和R为引物，扩增AtLCBK1基因，将扩增产物构建到表达载体pSuper1300上，获得的重组表达载体命名为AtLCBK1-pSuper1300；

2)用AtLCBK1-pSuper1300转化农杆菌GV3101，然后利用转化的农杆菌侵染拟南芥花序，获得耐低温的转基因拟南芥幼苗；

其中，步骤1)中所述引物F和R的核苷酸序列如Seq ID No.3和4所示；

所述AtLCBK1基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。