CN109486801A - 水稻高环境温度适应性响应控制基因OsTOGR2及其应用 - Google Patents

水稻高环境温度适应性响应控制基因OsTOGR2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻控制高环境温度适应性的基因OsTOGR2及其编码蛋白。OsTOGR2基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白，或编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。所述基因为与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。所述基因编码的OsTOGR2蛋白如SEQ ID No.2所示，或者为与SEQ ID No.2相比进行了少数氨基酸的缺失、增加或者替换但是同时具有相同功能的衍生蛋白。本发明还提供一种培育具有高环境温度适应性响应的水稻的方法。

Description

水稻高环境温度适应性响应控制基因OsTOGR2及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域。具体而言，本发明涉及一种控制水稻高环境温度适应性响应的基因OsTOGR2(Thermotolerant Growth Required2)，该基因的编码蛋白和功能类似物，及包含该基因的载体的宿主细胞。本发明还提供利用所述控制水稻高环境温度适应性响应的基因OsTOGR2培育能够在高环境温度下正常响应和生长的水稻品种的方法。
背景技术
由于植物不能运动，需要能准确的感应各种环境条件(包括生物环境与非生物环境)及其变化，进而做出相应的适应性响应。温度作为植物最为重要的非生物环境因素之一，在很多区域既存在昼夜变化，也存在着季节性变化，对植物的生命活动起着至关重要的作用。而植物也演化出许多感应和响应环境温度的机制，保证其能够更好的适应环境温度变化。在拟南芥中，环境温度的升高会引起植物做出一系列适应性的形态变化，包括下胚轴伸长加快，叶柄的伸长加快，叶片偏下性生长导致其向上举起，形成一种较为松散的植株结构，进而促进空气的流通，便于通过蒸腾作用降低植物温度(Quint et al.，2016)。
目前，对于植物感应环境温度变化的分子机制也做了比较深入的研究。从生物学功能的角度来说响应环境温度的分子主要包含以下几类：第一类是转录因子(比如ELF3与phyB)，环境温度的改变能直接调控其转录激活或转录抑制的活性，进而影响下游的转录组(Box et al.，2015；Legris et al.，2016；Jung et al.，2016)；第二类是质膜系统信号转导因子(比如Cold1)，环境温度的改变会影响质膜系统的流动性及位于膜上的相关蛋白的构象或功能，然后引发信号级联反应(G蛋白信号转导与作为第二信使的Ca2+)(Ma et al.，2015)；第三类是通过胞内蛋白的稳态调节，包括内质网UPR、胞质UPR反应和对26S蛋白酶体的活性的调节(Deng et al.，2011；Deng et al.，2013；Che et al.，2010；Liu et al.，2013；Li et al.，2015)。因此，植物感应和响应环境温度变化受到多重途径调控。然而目前关于水稻对环境温度适应性响应的研究知之甚少。
发明内容
因此，本发明的目的是鉴定一种水稻控制高环境温度适应性响应的关键调控因子，为培育具有优良的环境温度适应性的水稻品种提供基因资源。
本发明人在研究水稻高环境温度响应缺陷的突变体ostogr2的过程中发现，当ostogr2种植于较低环境温度(例如，12月份至次年4月份种植于海南)下时，其形态特征与野生型(中花11，WT)非常接近；而当生长于较高环境温度(例如，5-9月份种植于北京)下时，突变体生长明显矮化。在严格控制光照条件下，于人工培养箱中设置不同的温度，进一步确认了ostogr2的环境温度敏感表型。在此基础上，本发明人鉴定了水稻的高环境温度适应性响应控制基因OsTOGR2，该基因编码N-端乙酰化酶复合体NatA的辅助亚基OsNAA15。
N-端乙酰化酶复合体NatA负责对核糖体上新生的多肽进行N-端乙酰基修饰。研究表明，该修饰具有丰富的功能，并且对细胞执行正常的生命活动是必需的。N-端乙酰化能直接介导蛋白之间的互作(Caesar and Blomberg，2004)；统计分析显示蛋白靶向运输到内质网与缺乏N-端乙酰化之间显著相关(Forte et al.，2011)；N-端乙酰化参与细胞对胞内蛋白的质量控制和调节蛋白的化学计量比(Varshavsky，2011)。然而，该修饰与植物对环境温度适应性响应的关系尚未见报道。
本发明鉴定的水稻N-端乙酰化酶复合体NatA的辅助亚基OsTOGR2控制了水稻对高环境温度的适应性响应，该基因的正常表达和活性保证了水稻在高环境温度下的正常响应和生长。
在第一方面，本发明人鉴定了水稻的高环境温度适应性响应控制基因OsTOGR2，所述基因编码SEQ ID No.2所示的蛋白，或编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
其中SEQ ID No.2所示的蛋白由909个氨基酸组成。
所述控制水稻对高环境温度适应性的基因OsTOGR2为分离的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述控制水稻对高环境温度适应性的基因OsTOGR2为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。并且，本领域技术人员应该理解，在较广的意义上，所述控制水稻对高环境温度适应性的基因OsTOGR2可以为与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上、优选99％以上的同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。
其中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列由2730个碱基组成。
在第二方面，本发明提供了由第一方面所述的控制水稻高环境温度适应性的基因OsTOGR2编码的蛋白，所述蛋白为下述(a)或(b)：
(a)SEQ ID No.2所示的蛋白；
(b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的蛋白质。
在一个优选的实施方案中，由第一方面所述的控制水稻对高环境温度适应性的基因OsTOGR2编码的蛋白是一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
在第三方面，本发明提供包含第一方面所述的控制水稻高环境温度适应性的基因OsTOGR2的重组载体。
优选地，所述重组载体包含的外源核苷酸片段编码SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。更优选地，所述重组载体包含的外源核苷酸片段如SEQ ID No.1所示。
所述重组载体中还可以包含增强子，以增加插入的核苷酸片段的表达。优选地，所述重组载体为重组表达载体。
在一个实施方案中，用于构建所述重组载体的质粒可以选自，不限于pCAMBIA1300或pTCK303。
包含所述重组载体的宿主细胞也在本发明的范围内。可以通过将所述重组载体转化或转染到细胞中而得到包含所述重组载体的宿主细胞，以进一步用于扩增表达载体、表达所述蛋白或得到转基因植株等应用。用于转化或转染的细胞可以选自，但不限于，细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，真菌细胞，例如酵母细胞或农杆菌细胞，或植物细胞，例如水稻细胞，等等。
在第四方面，本发明提供控制水稻高环境温度适应性的基因OsTOGR2在培育能够在高环境温度下正常响应和生长的水稻品种中的用途。
在第五方面，本发明提供一种培育能够在高环境温度下正常响应和生长的水稻品种的方法，所述方法包括在水稻植株中过表达控制水稻高环境温度适应性的基因OsTOGR2。基因OsTOGR2的过表达可以通过下述实现：用OsTOGR2基因或包含OsTOGR2基因的重组载体转化或转染水稻的细胞或组织，并将转化的水稻细胞或组织培育成水稻植株。
OsTOGR2基因的转化或转染可以通过农杆菌介导法进行。
本领域的研究人员应该明确，利用任何一种引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明提供的OsTOGR2基因导入植物细胞，或者对OsTOGR2基因的前导序列进行改造从而改变OsTOGR2的表达量，比如插入增强元件，可获得对高环境温度适应性响应改变的细胞系及植株。
本发明的OsTOGR2基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可以加上适当的增强启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可以对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(比如潮霉素基因)。携带有本发明OsTOGR2基因的表达载体可以通过使用农杆菌侵染转化水稻。
本发明的基因对培育具有优良高环境温度适应性响应的水稻品种提供了理论基础。当本发明的基因被用于改良水稻对高环境温度的适应性响应时，可采用以下方法：(1)将本发明的基因OsTOGR2克隆到植物转化载体中；(2)将所构建的植物转化载体转化可再生的水稻组织或器官并使本发明的基因在转化组织中表达；(3)将被转化的组织或器官培养成植株。
依据第五方面的方法，可以培育出能够在高环境温度下正常响应和生长的水稻品种。
综上所述，本发明提供以下实施方案：
1.一种分离的控制水稻对高环境温度适应性响应的基因，其中所述基因编码SEQID No.2所示的蛋白，或编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
2.根据第1项所述的基因，其为与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上、优选99％以上的同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。
3.根据第2项所述的基因，其为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
4.一种由第1项所述的基因编码的分离的控制水稻高环境温度适应性响应的蛋白，其为SEQ ID No.2所示的蛋白，或由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
5.根据第4项所述的蛋白，其为SEQ ID No.2所示的蛋白。
6.一种含有第1-3项任一项所述的基因的重组载体。
7.根据第6项所述的重组载体，所述重组载体为表达载体。
8.根据第7项所述的重组载体，所述重组载体由质粒pCAMBIA1300或pTCK303构建。
9.一种包含第1-3项任一项所述的基因或第6-7项任一项所述的重组载体的宿主细胞。
10.根据第9项所述的宿主细胞，所述宿主细胞为包含第1-3项任一项所述的基因或第6-7项任一项所述的重组载体的细菌、真菌或植物细胞，优选为包含第1-3项任一项所述的基因或第6-7项任一项所述的重组载体的大肠杆菌、农杆菌或植物细胞。
11.一种培育具有优良的高环境温度适应性响应的植物的方法，所述方法包括在植物植株中过表达第1-3项任一项所述的基因。
12.根据第11项所述的方法，所述方法包括用第1-3项任一项所述的基因或第6-7项任一项所述的重组载体转化所述植物的细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成过表达控制水稻对高环境温度适应性响应的基因的植株。
13.根据第12项所述的方法，其中所述转化通过农杆菌介导法进行。
14.根据第10-13项任一项所述的方法，其中所述植物为水稻。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1.ostogr2与WT(中花11)的表型比较。水稻材料分别于5月至9月种植于北京和于12月至次年4月种植于海南。(A)WT、ostogr2和ostogr2/+在北京的成熟期表型。(B)WT和ostogr2在海南的成熟期表型。(C)WT、ostogr2和ostogr2/+在北京的株高比较及WT和ostogr2在海南的株高比较。(D)WT、ostogr2和ostogr2/+在北京的分蘖数目比较及WT和ostogr2在海南的分蘖数目比较。标尺：10厘米；ostogr2/+表示ostogr2的杂合体。
图2.不同温度下ostogr2与WT的幼苗生长。(A-B)WT和ostogr2在25℃/20℃和35℃/30℃下的苗期表型。(C)WT和ostogr2在(A-B)中的整株幼苗表型。(D)WT和ostogr2在(A-B)中的幼苗长度比较。标尺：10厘米。
图3.ostogr2的基因定位及候选基因的确定。
图4.OsTOGR2基因的DNA序列(SEQ ID No.1)。
图5.OsTOGR2基因编码的氨基酸序列(SEQ ID No.2)。
图6.GFP基因的DNA序列(SEQ ID No.3)。
图7.OsTOGR2基因功能互补及过表达载体。(A)OsTOGR2的基因功能互补载体。(B)OsTOGR2的过表达载体。
图8.OsTOGR2基因功能互补实验验证。(A)WT、ostogr2和互补材料在35℃培养箱中的幼苗表型。(B)WT、ostogr2和互补材料在35℃培养箱中的幼苗长度比较。标尺：10厘米。
图9.OsTOGR2基因过表达水稻植株与WT比较。(A)WT、ostogr2和过表达材料在35℃培养箱中的幼苗表型。(B)WT、ostogr2和过表达材料在35℃培养箱中的幼苗长度比较。标尺：10厘米。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
以下实施例中所用的试剂或载体，除非另外指明，均可从市售渠道获得。
实施例1.水稻高环境温度适应性响应控制基因的分离与遗传分析
本发明人研究的水稻高环境温度响应缺陷的突变体ostogr2(2014年7月唐华山在北京采集得到)来自粳稻品种中花11(ZH11)的EMS诱变后代。当ostogr2种植于较低环境温度(例如，12月份至次年4月份种植于海南)下时，其形态特征与野生型(中花11，WT)非常接近；而当生长于较高环境温度(例如，5-9月份种植于北京)下时，突变体生长明显矮化。在严格控制光照条件下，于人工培养箱中设置不同的温度，进一步确认了ostogr2的环境温度敏感表型。以ostogr2为母本WT为父本进行杂交，所有F1均表现正常，在F2分离群体中，正常的和矮化单株的分离比例在统计学上符合3∶1(80∶32)。遗传分析的结果说明ostogr2受隐性单基因控制。
控制水稻高环境温度适应性响应基因OsTOGR2的图位克隆
为了克隆OsTOGR2，将ostogr2与中花11(Oryza sativa L.japonica，购自中国农科院作物所)进行杂交获得F1，利用F1的自交后代构建F2分离群体，对其中1000株隐性个体(高环境温度下极度生长缺陷的个体)进行取样作为定位群体。首先利用有多态性的分子标记对取样群体进行检测，找到与目标性状连锁的分子标记。为了获取与突变基因连锁更加紧密的分子标记，利用Gramene(http：//www.gramene.org/)数据库公布的籼稻品种9311与粳稻品种日本晴的序列进行比对，然后利用Primer3(http：//primer3.ut.ee/)开发新的STS与SNP标记，并继续进行多态性检测和取样群体及交换单株的检测。对最后的定位区间分段扩增并测序确认突变基因及位点。根据Rice Genome Annotation Project网站的注释信息，候选突变基因包含26个外显子，25个内含子，CDS区域全长为2730bp，共编码909个氨基酸。在ostogr2中，CDS第86位A突变为G导致第29位Leu突变为Pro。
OsTOGR2基因的功能验证
利用pCAMBIA1300质粒(购自CAMBIA公司)构建互补载体(图7，构建方法见实施例2)，利用农杆菌侵染的方法进行转基因实验，来验证图位克隆的结果。结果表明本发明鉴定到了能使ostogr2突变体恢复正常功能的蛋白，证明本发明正确克隆了OsTOGR2基因。氨基酸序列分析表明OsTOGR2包含TPR结构域与NARP1结构域，该基因在N-端乙酰化酶复合体NatA中作为支架蛋白发挥作用，将乙酰化酶OsNAA10锚定到核糖体上，同时指导OsNAA10对核糖体上新合成的多肽进行特异性的N端乙酰化修饰。
本发明通过图位克隆的方法克隆了水稻控制高环境温度适应性响应的基因OsTOGR2。对该基因的相关研究，为水稻的分子设计育种和培育具有优良环境温度适应性响应的水稻新品种提供了理论基础。
实施例2.OsTOGR2的互补载体构建和水稻转化
从BAC质粒OsJNBb54E06(由中国科学院上海生命科学研究院韩斌研究院馈赠，源自International Rice Genome Sequencing Project)上将OsTOGR2的完整基因用DNA聚合酶进行PCR扩增，然后酶切连接到pCAMBIA1300质粒(购自CAMBIA公司)的多克隆位点处。
将上述构建好的互补载体转化到E.coli DH5α感受态细胞中，利用卡那霉素筛选阳性克隆。提取质粒并进行测序鉴定，得到克隆载体中OsTOGR2序列完全无误的阳性克隆，然后将该阳性克隆的质粒电转化EHA105农杆菌感受态细胞(由本实验室按常规方法制备，参照《植物基因工程》，王关林、方宏筠，科学出版社，2004年第2版)。接下来将转化成功的克隆利用农杆菌侵染的方法以ostogr2为受体进行转基因操作。
转基因操作方法如下：
(1)对转基因受体水稻品种利用脱米机去壳，挑选饱满有光泽且无褶皱的米粒，用70％乙醇浸泡10分钟，然后用30％NaClO(原液有效氯10％，加0.1％的Tween20)浸泡15分钟，然后弃液体，并用移液器吸干净残液。如果是ostogr2的种子，由于更容易染菌，因此30％NaClO的处理时间延长至25分钟。
(2)利用无菌水于超净工作台中对消毒过的种子清洗3遍。如果是ostogr2的种子，清洗10遍。
(3)再次用30％NaClO(原液有效氯10％，不加Tween20)浸泡15分钟，然后弃掉液体，并用移液器吸干净残液。如果是ostogr2的种子，此步30％NaClO的处理时间延长至25分钟。
(4)利用无菌水于超净工作台中对消毒过的种子清洗3遍。如果是ostogr2的种子，清洗10遍。
(5)清洗过的种子用灭过菌的镊子夹到滤纸上吸干表面水分，然后接种到N6D培养基上(N6D大量，50ml/L；N6D微量，5ml/L；MS有机，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；2，4-D，2mg/L；CH，0.3g/L；L-脯氨酸，2.878g/L；蔗糖，30g/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)，于32℃持续光照条件下培养一周到两周，期间及时的清理染菌的种子防止菌的传播扩散。
(6)将携带目标载体的EHA105农杆菌菌株在带有相应抗性的YEB固体培养基(牛肉膏，5g/L；酵母抽提物，1g/L；胰蛋白胨，5g/L；蔗糖，5g/L；MgSO4·7H2O，0.5g/L；琼脂糖，15g/L)上于28℃避光培养3天。然后挑选单菌落于5mL带有相应抗性的YEB液体培养基中，28℃和220rpm条件下培养约24小时。按1∶100的比例将农杆菌菌液接种于50mL AAM培养基中(AAM大量，50ml/L；AAM微量，5ml/L；AAM有机，5ml/L；AAM氨基酸，100ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；蔗糖，68.5g/L；葡萄糖，36g/L；CH，0.5g/L；乙酰丁香酮(Acetosyringone)，20mg/L；pH 5.2)，过夜培养，直至OD600为0.1。
(7)将诱导的状态良好的水稻愈伤浸泡于农杆菌菌液中1分钟，然后用镊子取出置于无菌滤纸上吸取多余菌液。
(8)在N6-As培养基上(N6D大量，50ml/L；N6D微量，5ml/L；MS有机，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；2，4-D，2mg/L；CH，0.3g/L；蔗糖，30g/L；葡萄糖，10g/L；Phytagel，3g/L；乙酰丁香酮，20mg/L；pH 5.2)预先垫一张浸湿AAM培养基的滤纸，然后将愈伤转移到滤纸上摆好。
(9)将培养皿用封口膜封好，置于25℃暗培养3天。
(10)将共培养后的愈伤用无菌水冲洗1遍，然后用含500mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗5遍，接下来在含500mg/L羧苄青霉素的无菌水中浸泡20分钟，然后弃去液体，接下来在含500mg/L羧苄青霉素的无菌水中再次浸泡20分钟。
(11)将愈伤取出置于滤纸上吸干水分，然后将其在含50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉素的N6D培养基(N6DS)上摆整齐，置于32℃全光照条件下筛选两周。愈伤筛选步骤重复一次，即第一次筛选结束后将长势良好的愈伤转移到新的N6DS筛选培养基上再培养两周。
(12)将生长旺盛的分化愈伤(很明显的会长出大量新的颗粒愈伤)转移到含50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄青霉素的RE再生培养基(MS大量，50ml/L；MS微量，5ml/L；Fe-EDTA，5ml/L；RE有机，5ml/L；蔗糖，30g/L；Sorbitol，30g/L；CH，2g/L；萘乙酸(NAA)，0.02mg/L；Kinetin，2mg/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)上，置于32℃全光照条件下培养，每两周更换一次培养基。在RE再生培养基上生长3-4周后会发现部分愈伤变绿并分化出幼苗。
(13)用镊子将分化出的幼苗小心转移到不加抗生素的1/2MS培养基(MS大量，25ml/L；MS微量，2.5ml/L；Fe-EDTA，2.5ml/L；Phytagel，3g/L；pH 5.8)上，待长至10cm后去除培养基并浸泡于无菌水中3天，然后移栽至大田。
表1农杆菌侵染法转化水稻相关的培养基
实施例3.OsTOGR2互补转基因植株的表型分析
为检验转基因对水稻响应高环境温度的影响，将实施例2转基因实验得到的阳性植株与同时期WT和ostogr2幼苗进行温度处理，于培养箱中35℃-12小时光照，35℃-12小时黑暗。培养2周后的植株形态如图8所示，表明转基因植株生长速度得到了恢复(图8)。
这一结果说明了图位克隆的结果无误，OsTOGR2是控制水稻对高环境温度响应的关键基因。
实施例4.OsTOGR2过表达载体构建和水稻转化
从WT中克隆OsTOGR2的cDNA，然后与GFP(SEQ ID No.3)依次酶切连接到pTCK303(购自Biovector公司)的多克隆位点处，pTCK303在多克隆位点处带有Ubiquitin基因的启动子，可驱动OsTOGR2与GFP的融合蛋白的过表达。
将上述构建好的过表达载体转化到E.coli DH5α感受态细胞中，利用卡那霉素筛选阳性克隆。提取质粒并进行测序鉴定，得到克隆载体中OsTOGR2的cDNA与GFP序列(SEQ IDNo.3，图6)完全无误的阳性克隆，然后将该阳性克隆的质粒电转化EHA105感受态细胞。接下来将转化成功的克隆利用农杆菌侵染的方法以ostogr2为受体进行转基因操作。转基因操作方法如实施例2所述。
实施例5.OsTOGR2过表达转基因植株的表型分析
为检验OsTOGR2过表达对水稻响应高环境温度的影响，将实施例4转基因实验得到的阳性植株与同时期WT和ostogr2幼苗进行温度处理，于培养箱中35℃-12小时光照，35℃-12小时黑暗。培养2周后的植株形态如图9所示，转基因植株生长速度要快于WT。
这一结果说明OsTOGR2在控制水稻对高环境温度响应的过程中起着正向的作用。
水稻是我国最为重要的粮食作物之一，其正常的对环境温度的适应性响应是正常生长发育和成熟的基础。本发明克隆了控制水稻对高环境温度适应性的关键因子，为通过水稻基因工程和分子育种改良水稻对环境温度的适应性提供了重要的指导。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
参考文献：
Box，M.S.，Huang，B.E.，Domijan，M.，Jaeger，K.E.，Khattak，A.K.，Yoo，S.J.，Sedivy，E.L.，Jones，D.M.，Heam，T.J.，Webb-Alex A.R.，et al.(2015).ELF3 controlsthermoresponsive growth in Arabidopsis.Curr.Biol.25，194-199.
Caesar，R.，and Blomberg，A.(2004).The stress-induced Tfs1p requiresNaB-mediated acetylation to inhibit carboxypeptidase Y and to regulate theprotein kinase A pathway.J.Biol.Chem.279，38532-38543.
Che，P.，Bussell，J.D.，Zhou，W.X.，Estavillo，G.M.，Pogson，B.J.，and Smith，S.M.(2010).Signaling from the endoplasmic reticulum activates brassinosteroidsignaling and promotes acclimation to stress in Arabidopsis.Sci.Signal.3，ra69.
Deng，Y.，Humbert，S.，Liu，J.X.，Srivastava，R.，Rothstein，S.J.，and Howell，S.H.(2011).Heat induces the splicing by IRE1 of a mRNA encoding atranscription factor involved in the unfolded protein response in Arabidopsis.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108，7247-7252.
Deng，Y.，Srivastava，R.，and Howell，S.H.(2013).Endoplasmic reticulum(ER)stress reponse and its physiological roles in plants，Int.J.Mol.Sci.14，8188-8212.
Forte，G.M.，Pool，M.R.，and Stirling，C.J.(2011).N-terminal acetylationinhibits protein targeting to the endoplasmic reticulum.PLoS Biol.9，e1001073.
International Rice Genome Sequencing Project(2005).The map-basedsequence of the rice genome.Nature 436，793-800.
Jung，J.H.，Domijan，M.，Klose，C.，Biswas，S.，Ezer，D.，Gao，M.，Khattak，A.K.，Box，M.S.，Charoensawan，V，Cortijo，S.，et al.(2016).Phytochromes function asthermosensors in Arabidopsis.Science 354，886-889.
Legris，M.，Klose，C.，Burgie，E.S.，Costigliolo，C.，Neme，M.，Hiltbrunner，A.，Wigge，P.A.，Schafer，E.，Vierstra，R.D.，and Casal，J.J.(2016).Phytochrome Bintegrates light and temperature signals in Arabidopsis.Science 354，897-900.
Liu，J.，Sun，N.，Liu，M.，Liu，J.，Du，B.，Wang，X.，and Qi，X.(2013).Anautoregulatory loop controlling Arabidopsis HsfA2 expression：role of heatshock-induced alternative splicing.Plant Physiol.162，512-521.
Li，X.M.，Chao，D.Y.，Wu，Y.，Huang，X.，Chen，K.，Cui，L.G.，Su，L.，Ye，W.W.，Chen，H.，and Chen，H.C.(2015).Natural alleles of a proteasome α2 subunit genecontribute to thermotolerance and adaptation of African rice.Nat.genet.47，827-833.
Ma，Y.，Dai，X.，Xu，Y.，Luo，W.，Zheng，X.，Zeng，D.，Pan，Y.，Lin，X.，Liu，H.，andZhang，D.(2015).COLD1 confers chilling tolerance in rice.Cell 160，1209-1221.
Quint，M.，Delker，C.，Franklin，K.A.，Wigge，P.A.，Halliday，K.J.，and Van-Zanten，M.(2016).Molecular and genetic control of plantthermomorphogenesis.Nat.Plants 2，15190.
Varshavsky，A.(2011).The N-end rule pathway and regulation byproteolysis.Protein Sci.20，1298-1345.

Claims (10)

1.一种分离的控制水稻高环境温度适应性响应的基因，其中所述基因编码SEQ IDNo.2所示的蛋白，或编码由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同功能的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
2.根据权利要求1所述的基因，其为与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90％以上、优选99％以上的同源性，且编码具有相同功能的蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
4.一种由权利要求1所述的基因编码的分离的控制水稻高环境温度适应性响应的蛋白，其为SEQ ID No.2所示的蛋白，或由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过少数几个氨基酸的插入、缺失或替换且与SEQ ID No.2所示的蛋白具有相同活性的由SEQ ID No.2衍生的蛋白。
5.一种含有权利要求1-3中任一项所述的基因的重组载体。
6.一种包含权利要求1-3中任一项所述的基因或权利要求5所述的重组载体的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为包含权利要求1-3中任一项所述的基因或权利要求5所述的重组载体的细菌或真菌细胞，优选为包含权利要求1-3中任一项所述的基因或权利要求5所述的重组载体的大肠杆菌或农杆菌细胞。
8.一种培育具有优良的高环境温度适应性响应的水稻方法，其中所述方法包括在水稻中过表达权利要求1-3中任一项所述的基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述方法包括用权利要求1-3中任一项所述的基因或权利要求5所述的重组载体转化水稻细胞或组织，并将转化的细胞或组织培育成过表达控制水稻高环境温度适应性响应的基因的植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述转化通过农杆菌介导法进行。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410603A (zh) * 2020-10-14 2022-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻高环境温度适应性响应控制基因togr3及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638658A (zh) * 2008-07-29 2010-02-03 四川贝安迪生物基因工程有限公司 提高植物和微生物耐热性的基因、多肽及其应用
CN102134271A (zh) * 2010-01-26 2011-07-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻热胁迫转录因子在培育晚熟品种中的应用
CN102134570A (zh) * 2010-01-26 2011-07-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻热胁迫转录因子在培育耐储存种子中的应用
CN102168097A (zh) * 2010-01-28 2011-08-31 四川贝安迪生物基因工程有限公司 编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因及其用途
CN102911945A (zh) * 2011-08-05 2013-02-06 中国科学院上海生命科学研究院 一种植物抗高温基因及其应用
CN103898078A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻耐热基因tog1及其应用
CN105524152A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 中国科学院上海生命科学研究院 水稻抗高温基因及其在作物抗高温育种中的应用
KR20180085414A (ko) * 2017-01-18 2018-07-27 전남대학교산학협력단 신규한 세로토닌 n-아세틸전이효소2 유전자 및 이의 발현억제에 의한 형질전환 식물체

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638658A (zh) * 2008-07-29 2010-02-03 四川贝安迪生物基因工程有限公司 提高植物和微生物耐热性的基因、多肽及其应用
CN102134271A (zh) * 2010-01-26 2011-07-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻热胁迫转录因子在培育晚熟品种中的应用
CN102134570A (zh) * 2010-01-26 2011-07-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻热胁迫转录因子在培育耐储存种子中的应用
CN102168097A (zh) * 2010-01-28 2011-08-31 四川贝安迪生物基因工程有限公司 编码提高植物和微生物耐热性的蛋白质的基因及其用途
CN102911945A (zh) * 2011-08-05 2013-02-06 中国科学院上海生命科学研究院 一种植物抗高温基因及其应用
CN103898078A (zh) * 2012-12-26 2014-07-02 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻耐热基因tog1及其应用
CN105524152A (zh) * 2014-09-30 2016-04-27 中国科学院上海生命科学研究院 水稻抗高温基因及其在作物抗高温育种中的应用
KR20180085414A (ko) * 2017-01-18 2018-07-27 전남대학교산학협력단 신규한 세로토닌 n-아세틸전이효소2 유전자 및 이의 발현억제에 의한 형질전환 식물체

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "PREDICTED: Oryza sativa Japonica Group N-terminal acetyltransferase A complex auxiliary subunit NAA15 (LOC4326606), transcript variant X1, mRNA NCBI Reference Sequence: XM_015765436.2", 《GENBANK》 *
SYLVIA VARLAND ET AL.: "Investigating the functionality of a ribosome-binding mutant of NAA15 using Saccharomyces cerevisiae", 《VARLAND AND ARNESEN BMC RES NOTES》 *
王胜昌 等: "水稻抗非生物逆境功能基因的发掘", 《生命科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114410603A (zh) * 2020-10-14 2022-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻高环境温度适应性响应控制基因togr3及其应用
CN114410603B (zh) * 2020-10-14 2023-11-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 水稻高环境温度适应性响应控制基因togr3及其应用

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