CN105524152A - 水稻抗高温基因及其在作物抗高温育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的植物基因-水稻抗高温蛋白1基因(Rice？<u>H</u>igh？<u>T</u>emperature？<u>R</u>esistance？1,HTR1)及其编码蛋白。本发明还公开了这种抗高温蛋白基因的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中用于增强植物的高温抗性。

Description

水稻抗高温基因及其在作物抗高温育种中的应用

技术领域

本发明属于植物学领域，具体地说，本发明涉及新的水稻(Oryzasativa)的抗高温基因及其编码蛋白。本发明还公开了编码这种抗高温蛋白的基因的用途，尤其是在植物品种改良和杂交育种中用于改变植物的抗高温性。

背景技术

近些年来，全球气候发生较大变化，极端高温天气出现频率变大，造成了粮食作物的大量减产，给人们生产生活带来很大影响。

研究表明，高温将成为威胁全球粮食安全的最主要环境因子：比如，高温已经取代干旱，成为威胁欧洲小麦生产的主要因素(小麦灌浆期对高温很敏感)；水稻、玉米等主要粮食作物近30年来的生产也受高温严重影响。

在我国，高温热害已经对水稻产量造成了很大的损失，特别是在长江以南，双季早稻开花灌浆期、早熟中稻孕穗期至抽穗开花期以及长江中下游地区的早熟粳稻开花灌浆期，往往处于盛夏高温季节，高温胁迫导致水稻不能正常散粉、受精，籽粒灌浆不饱满，极大地减少了稻米产量并且降低了其品质。

从遗传上了解水稻耐高温的机理，进而应用遗传工程手段培育高温抗性好的水稻优良品种是一种从根本上应对水稻高温热害的重要措施,对促进水稻生产持续、稳步发展具有深远意义。同时，对水稻抗高温基因的挖掘及对其作用机理的研究，也会为其他农作物的抗高温育种提供基因资源和借鉴。

然而，人们对植物如何抗高温的机理还不甚了解。因此，为了有效地、针对性地改变植物品种的抗高温性，本领域迫切需要开发与抗高温性有关的蛋白及其编码基因。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的抗高温基因(即水稻抗高温蛋白1基因)及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在改变植物抗高温性等方面的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的水稻抗高温蛋白1(简称为HTR1)，该多肽源自水稻。所述水稻抗高温蛋白1为水稻26S蛋白酶体α2亚基，且所述α2亚基在对应于亚洲栽培稻的α2亚基(如SEQIDNO.:4)中第99位上的氨基酸由Arg突变为His；

或者所述水稻抗高温蛋白1为具有SEQIDNO.:2氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。

在另一优选例中，所述的水稻抗高温蛋白1来源于非洲稻(CG14)。

在另一优选例中，所述的多肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO.:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQIDNO.:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高水稻抗高温性的功能的由(a)衍生的多肽。

在另一优选例中，所述的衍生的多肽在对应于SEQIDNO.:2中第99位上的氨基酸为His。

在另一优选例中，所述的水稻抗高温蛋白1具有选自下组的一个或多个特征：

(i)高温下降解变性蛋白的活性显著高于SEQIDNO.:4所示的蛋白；

(ii)高温下蛋白自身的稳定性显著高于SEQIDNO.:4所示的蛋白。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指满足下式：

A1/A0≥2

式中，A1为水稻抗高温蛋白1高温下的降解变性蛋白的活性；

而A0为SEQIDNO.:4所示的蛋白高温下的降解变性蛋白的活性。

在另一优选例中，A1/A0≥3，或≥5。

在另一优选例中，所述的高温指出温度为35-45℃，较佳地37-42℃，更佳地为39-42℃。

在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码本发明第一方面所述的多肽；

或者，所述的多核苷酸为水稻中驱动本发明第一方面所述多肽的特异响应高温启动子序列。

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述水稻抗高温蛋白1的ORF序列操作性连接的启动子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。

在另一优选例中，所述的启动子为特异响应高温的启动子；较佳地，所述启动子的序列如SEQIDNO.:27和28中所示；更佳地，所述的多核苷酸的序列选自下组的一种:

(a)具有SEQIDNO:1中1-708位的核苷酸序列；

(b)具有SEQIDNO:1中1-705位的核苷酸序列；

(c)具有SEQIDNO:29中1-6292位的核苷酸序列；

(d)具有SEQIDNO.:27或28所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的多核苷酸为基因组序列或cDNA序列。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，该载体含有本发明第二方面中所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，该宿主细胞含有本发明的第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第三方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：植物细胞、原核细胞、酵母细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞为农作物细胞、包括禾本科植物细胞，如水稻细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种水稻抗高温蛋白1的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第四方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出水稻抗高温蛋白1。

在本发明的第六方面，提供了一种26S蛋白酶体，该26S蛋白酶体中所含的α2亚基为本发明的第一方面中所述的抗高温多肽。

在本发明的第七方面，提供了一种改良植物的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻抗高温蛋白的编码序列，所述的水稻抗高温蛋白为权利要求1中所述的抗高温多肽或SEQIDNO.:4所示的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻抗高温蛋白的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入水稻抗高温蛋白的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株；

较佳地，所述方法改良植物的抗高温性。

在另一优选例中，所述的植物包括农作物、林业植物、蔬菜、瓜果、花卉、牧草(包括草坪草)；优选地包括禾本科，豆科以及十字花科植物，更优选地包括水稻、玉米、高粱、小麦、大豆或拟南芥。

在另一优选例中，所述的植物包括：水稻、小麦、玉米、高粱、卷心菜等十字花科及其他蔬菜等。

在另一优选例中，在步骤(4)之后还包括步骤：对所述植株，测试其抗高温性能。

在另一优选例中，所述方法改良植物的抗高温性。

在本发明的第八方面，提供了一种培育植物抗高温株系的方法，该方法包括步骤：提高所述植物植株中26S蛋白酶体的表达或活性。

在另一优选例中，所述的26S蛋白酶体中的α2亚基为本发明第一方面中所述的抗高温多肽。

在另一优选例中，所述的抗高温多肽与特异响应高温的启动子操作性连接。

在另一优选例中，所述提高包括：提高26S蛋白酶体编码基因的表达水平、和/或提高26S蛋白酶体的活性。

在本发明的第九方面，提供了本发明的第一方面所述的抗高温多肽或其编码基因、或SEQIDNO.:4所示的多肽或其编码基因的用途，它被用于培育植物抗高温系、或用于制备培育植物抗高温株系的试剂或试剂盒。

在本发明的第十方面，提供了与上述的水稻抗高温蛋白1特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的约15-1500个核苷酸，它们可用作引物或探针(见实施例2，3)。

在本发明的第十一方面，提供了抗本发明蛋白的抗体以及一种检测样品中是否存在水稻抗高温蛋白1的方法，它包括：将样品与水稻抗高温蛋白1的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻抗高温蛋白1。

在本发明的第十二方面，提供了一种特异响应高温的启动子序列及其应用，其中所述的启动子是水稻中驱动本发明所述多肽(HTR1)的特异响应高温启动子，较佳地所述启动子序列具有SEQIDNO.:27或28所示的核苷酸序列。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了水稻HTR1基因的结构。296位(A到G)的碱基突变导致了氨基酸替换(从WYJ^Arg变为CG14^His)，改变了HTR1的蛋白功能活性，代表一种强抗热的单倍体型。而第222位(C到T)SNP虽然没有造成编码蛋白序列的变化，但是该SNP代表了一种HTR1的单倍体型。也就是说，该SNP可以用于鉴定不同水稻品种中HTR1的单倍体型。

图2显示了非洲稻抗高温基因HTR1^CG14的NIL(CG14)比对照(NIL(WYJ))(携带亚洲稻HTR1^WYJ基因位点)表现出明显增强的高温抗性。

其中，2A显示，NIL(CG14)在苗期和成株期都表现出来更强的高温抗性。

2B显示，在正常生长条件下，NIL(CG14)的产量和对照NIL(WYJ)没有区别。

2C显示,扬花期高温逆境下，NIL(CG14)的产量明显高于对照(单株产量比对照增加约5倍)。

2D,灌浆结实期高温逆境下，NIL(CG14)的产量也要明显高于对照。CK,正常生长条件；HT，高温处理。

图3显示了HTR1的高温响应机制。

其中，3A显示,HTR1在各组织中遍在表达并且受高温诱导表达；HTR1^CG14的表达量在高温诱导前后都比HTR1^WYJ高。其中C茎,I节,L叶片,P穗,R根,SH叶鞘,SD幼苗,UBI根茎结合部。

3B显示,高温处理会使泛素化的变性蛋白积累，但是NIL(CG14)中积累的泛素化蛋白不论是种类还是水平都明显低于对照的NIL(WYJ)。CK,高温处理前；HT，高温处理30小时后。

3C显示，HTR1^CG14的启动子受到高温的明显诱导。高温处理能明显增强该启动子驱动的GUS基因的表达。

图4显示了HTR1^CG14过表达能显著增强水稻的高温抗性。

其中，4A显示,HTR1^CG14和HTR1^WYJ过表达都能增强水稻的高温抗性，但是前者的高温抗性更强；将NIL(CG14)中的HTR1^CG14下调表达(Knockdown)会使水稻变得高温敏感。上面两行是相应水稻株系在高温处理前后的生长状态，下面一行则是相应株系中HTR1的表达情况(Knockdown株系为real-timePCR数据，而过表达株系为western-blot检测外源蛋白的表达)。

4B显示,HTR1^CG14过表达的转基因水稻在正常生长条件下的产量与对照没有差异。其中，CK，转基因阴性对照；HB-7，HTR1^CG14过表达的阳性转基因株系。

4C显示,HTR1^CG14过表达的转基因水稻在扬花期处于高温逆境时产量比对照高(单株产量比对照增加约12倍)。

4D显示,HTR1^CG14过表达的转基因水稻在灌浆结实期处于高温逆境时有比对照更高的产量。其中，CK，转基因阴性对照；HB-7，HTR1^CG14过表达的阳性转基因株系。

图5显示了HTR1^CG14过表达的转基因拟南芥和高羊茅表现出明显增强的高温抗性。

其中，A-C显示,HTR1^CG14过表达的转基因拟南芥的基础高温抗性显著增强。

D-F显示,HTR1^CG14过表达也能显著增强拟南芥的适应性高温抗性。其中，vector，转质粒对照；B-3、B-4和B-5，HTR1^CG14过表达的阳性转基因株系。

G-H显示,HTR1^CG14过表达能显著增强高羊茅的高温抗性。其中，F-6，转基因阴性对照；F-1、F-3和F-5，HTR1^CG14过表达的阳性转基因株系。

(注：A和D示意了两种不同的高温处理方式，分别检测拟南芥的基础高温抗性和适应性高温抗性；B和E显示了转基因过表达HTR1^CG14的株系及其对照在高温处理后的表型；C图是B和E两图中拟南芥株系的排布情况；F是对B和E两图中拟南芥株系的外源HTR1^CG14的蛋白水平检测结果。G显示了转基因过表达HTR1^CG14的高羊茅株系及其对照在高温处理后的表型；H为G图中相应株系的外源HTR1^CG14的蛋白水平检测结果。)

图6显示了26S蛋白酶体降解通路参与植物高温响应。

其中，A-C显示,26S蛋白酶体相关亚基的拟南芥突变体表现出基础高温抗性的缺失。

D-F显示,26S蛋白酶体相关亚基的拟南芥突变体的适应性高温抗性也降低。

G和H显示,高温逆境下用MG132处理(从左向右依次为0μM,50μM,100μM)来阻断26S蛋白酶体降解通路会使水稻的高温抗性降低。

图7显示了HTR1基因在真核生物中高度保守。图7A中的拉丁文与图7B中的中文为相互对应翻译。

图8显示了HTR1基因不同单倍体型的分布和功能分化。

其中，A显示,HTR1ORF区第296位(A到G)的碱基突变导致了氨基酸替换(从WYJ^Arg变为CG14^His)，改变了HTR1的蛋白功能活性，代表一种非洲稻中特有的强抗热的单倍体型，造成了非洲稻有更强的高温抗性。

B显示,HTR1在亚洲稻中不同单倍体型的分布与其生长环境温度紧密相关(纬度越低，气候温度越高)。

C-E显示，亚洲稻的高温抗性和HTR1基因的表达量明显相关。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从水稻中，利用图位克隆技术成功筛选到一个新的抗高温蛋白(HTR1，HighTemperatureResistance1)，并对其功能进行了研究，显示该基因能增强水稻的抗高温性，因此在农作物抗逆性育种中具有应用前景。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人利用非洲栽培稻品种CG14和粳稻品种武运粳构建的染色体片段替换系(CSSL)及其衍生群体，精细定位了一个控制水稻高温抗性的主效数量性状遗传位点(QTL)：HTR1(HighTemperatureResistance1)。试验表明，本发明的抗高温基因编码的蛋白为26S蛋白酶体的α2亚基。与野生型序列相比，本发明抗高温蛋白在蛋白水平上具有一个氨基酸的变化，即第99位的Arg突变为His。功能分析显示这个氨基酸的突变导致了非耐高温水稻(如武运粳)中的HTR1降解变性蛋白的活性低于本发明的HTR1。表达分析结果表明，本发明的抗高温基因在水稻的各种组织中均有表达，并且其表达明显受到高温诱导。遗传转化实验证实，过量表达HTR1能显著地增强水稻的高温耐受性。在拟南芥和高羊茅中转入HTR1以后，阳性株系表现出明显增强的高温耐受性。这表明HTR1可以应用到包括水稻在内的大量农作物的抗高温育种中。

术语

在本发明中，术语“水稻抗高温蛋白1”、“HTR1蛋白”、“HTR1多肽”“本发明的抗高温多肽”、“本发明多肽”、“HTR1^CG14蛋白”等可互换使用，都指具有非洲稻抗高温蛋白1氨基酸序列(SEQIDNO:2)的蛋白或多肽，或其衍生的具有相同抗高温性能的衍生多肽或活性片段。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的水稻抗高温蛋白1或多肽”是指水稻抗高温蛋白1基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻抗高温蛋白1。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明多肽

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括水稻抗高温蛋白1的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然水稻抗高温蛋白1相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“水稻抗高温蛋白1”指具有水稻抗高温蛋白1活性的SEQIDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与水稻抗高温蛋白1相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻抗高温蛋白1的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与水稻抗高温蛋白1的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗水稻抗高温蛋白1的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含水稻抗高温蛋白1或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了水稻抗高温蛋白1的可溶性片段。通常，该片段具有水稻抗高温蛋白1序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供水稻抗高温蛋白1或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻抗高温蛋白1的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“水稻抗高温蛋白1保守性变异多肽”指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

优选地，本发明多肽(包括保守性变异多肽、或衍生多肽)保留了在对应于SEQIDNO.:4中第99位由Arg突变为His。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

多核苷酸

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，但与SEQIDNO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码水稻抗高温蛋白1的多聚核苷酸。

特异响应高温的启动子

本发明还提供了用于在高温下特异性驱动HTR1的启动子(特异响应高温)的序列及其在各种作物抗高温育种中的应用。一种代表性的启动子序列如SEQIDNO.:27和28所示。应理解，术语“本发明的特异响应高温的启动子”还不仅包括如SEQIDNO.:27和28所示的全长启动子序列，还包括衍生自所述序列(SEQIDNO.:27或28)且具有相同或相当的特异响应高温功能的活性片段或核心片段(包括含核苷酸变异的启动子片段)。

利用所述特异响应高温的启动子，可以制备在响应高温特异诱导外源基因表达的转基因植物(如小麦、玉米、高梁等粮食作物，蔬菜瓜果花卉牧草)。

此外，基于本发明的所述特异响应高温的启动子，还可获得其在其他植物(包括其它农作物)中的同源基因启动子的DNA碱基序列。

重组技术和植物改良

本发明的水稻抗高温蛋白1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或水稻抗高温蛋白1编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻抗高温蛋白1。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码水稻抗高温蛋白1的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，水稻抗高温蛋白1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含水稻抗高温蛋白1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗高温性改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的水稻抗高温蛋白1有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗水稻抗高温蛋白1功能的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组水稻抗高温蛋白1筛选多肽库可用于寻找有价值的能刺激水稻抗高温蛋白1功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对水稻抗高温蛋白1DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的水稻抗高温蛋白1基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的各类抗体可以利用水稻抗高温蛋白1基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与水稻抗高温蛋白1基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗水稻抗高温蛋白1的抗体可用于检测样品中的水稻抗高温蛋白1。

本发明还涉及定量和定位检测水稻抗高温蛋白1水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的水稻抗高温蛋白1水平，可用于解释水稻抗高温蛋白1在抗高温性。

一种检测样品中是否存在水稻抗高温蛋白1的方法是利用水稻抗高温蛋白1的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与水稻抗高温蛋白1特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻抗高温蛋白1。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用水稻抗高温蛋白1特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测水稻抗高温蛋白1的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQIDNO:2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从水稻中分离出的，其序列如SEQIDNO:1所示，它包含的多核苷酸序列全长为708个碱基，其开放读框位于1-705位，编码全长为235个氨基酸的水稻抗高温蛋白1(SEQIDNO:2)。

此外，本发明还提供了源自HTR1基因的分子标记H1、H6和H9(SEQIDNO.a-f)以及HTR1ORF区第222位(C到T)和第296位(A到G)SNP以及图8B中三个可以鉴定HTR1单倍体型的SNP在分子标记，这些分子标记可用于辅助选育抗热(抗高温)水稻新品种。

本发明的主要优点包括：

(a)水稻抗高温蛋白1具有明确改善植物抗高温性的功能，为改变植物的抗高温性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。

(b)通过导入HTR1基因，可改变现有优良农作物品种的抗高温性，获得高抗高温性的小麦、水稻等农作物或其他品种如林草、果树、花木等，解决农林业生产中存在的实际问题。

(c)本发明的抗高温蛋白在水稻适应环境气温变化的过程中发挥重要作用，对不同地区间的引种有重要的实践意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecularBiology-ALaboratoryMannual,MelodyS.Clark编,Springer-verlagBerlinHeidelberg,1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

材料

CG14获自国际水稻所种质库。

武运粳获自中国国家水稻种质资源库。

实施例1

材料的培养及处理

将待鉴定水稻株系的种子数出相应的粒数。在浸种前，先将种子在42℃烘箱放置2个星期，以打破休眠，然后，在室温用水浸泡种子2天，每天换水以免种子霉烂。第3天放于37℃的温箱中催芽。3天后，每个重复挑选16粒发芽良好的种子，播种在已经剪掉管底的96孔板中，加满自来水，覆盖保鲜膜，放入光照培养箱30℃培养。1天后，将培养条件调至白天28℃，13小时，黑夜24℃，11小时。放入光照培养箱2天后，揭去保鲜膜，把水换成1/2×的水稻培养液，第4天换1×的，以后每隔一天换一次培养液。当水稻苗长到2叶1心(即第一、二片叶已完全展开，第三片新叶刚刚冒出，大约12天左右)时，进行高温处理。处理时，白天45℃，13小时，黑夜45℃，11小时，共处理一定时间以后，换新鲜的营养液，放回正常条件恢复生长一周左右。观察和统计各个株系的存活情况。

水稻(NIL(CG14)和NIL(WYJ)、转基因株系及其对照)扬花期和灌浆期的高温处理是在微型气候室中进行的。将大田生长到孕穗期或者扬花期的水稻植株移栽到气候室中，在28℃的培养条件下适应生长3-5天，然后进行白天38℃、夜间35℃的高温处理。其中扬花期处理5天，灌浆期则处理12天。处理后恢复到28℃的培养条件直到种子成熟，进行最终产量性状的考察。

结果表明，携带非洲稻HTR1^CG14基因位点的NIL(CG14)无论是在苗期还是在成熟期(扬花期和灌浆期)均比对照NIL(WYJ)(携带亚洲稻HTR1^WYJ基因位点)表现十分明显的高温耐受性(图2)；HTR1^CG14的转基因水稻株系也在各个时期都具有更强的抗热性(抗高温)(图4)。

拟南芥植株在MS平板培养基上生长，16/8-h(22℃/18℃)的昼夜交替。生长到11天的幼苗进行高温处理(基础性高温抗性和适应性高温抗性采用不同的处理方式，图5，图6)，然后恢复培养1周左右，考察表型。

发现HTR1^CG14过量表达的转基因植株明显更抗高温(图5)，而26S蛋白酶体中除了α2亚基之外的其他亚基的突变体则表现出高温敏感表型(图6)，即26S蛋白酶体的其他亚基突变后植物的高温抗性明显减弱。

高羊茅种植在人工土壤中，条件为16/8-h(18℃)的昼夜交替。选取生长状态一致的转基因植株及其相应对照进行高温处理，42℃处理48小时后恢复培养两周，观察发现HTR1^CG14过量表达的转基因植株比对照的抗热能力明显增强(图5)。

实施例2

HTR1的发现、定位克隆以及NIL的选育。

在本实施例中，以CG-14为供体亲本而武运粳为轮回亲本，构建了一套染色体片段替换系(CSSLs)，并对它们进行了高温筛选。

经过多次重复试验和反复验证，重复多次鉴定出1个稳定表现出高温耐受性的株系，它在45℃处理52小时后比轮回亲本表现出明显更强的高温耐受性。

为了对目标基因进行遗传定位，用该替换系与武运粳回交，进而再自交，产生F₂群体。用分离的F₂群体完成了连锁分析和初定位。用扩大的F₂群体和进一步回交的群体进行了精细定位和NIL(近等基因系)的选育。参考目标区域PAC克隆的序列信息，通过分段克隆、测序了一些非洲稻的基因组序列，进而开发出一些在两个亲本间有明显多态的分子标记。其中以下三个分子标记被用来进行最终的精细定位和分子标记辅助选育NIL：

Marker-H1的5'端寡核苷酸引物序列为：

5'-TGGGTTTTGAGGACTTCC-3'(SEQIDNO：5)；

3'端引物序列为：

5'-CATTGGGACATATGTAGC-3'(SEQIDNO：6)。

Marker-H6的5'端寡核苷酸引物序列为：

5'-CTGGATACACAGTTGTCC-3'(SEQIDNO：7)；

3'端引物序列为：

5'-AATCGATCGATTGTCCCG-3'(SEQIDNO：8)。

Marker-H9的5'端寡核苷酸引物序列为：

5'-CGACGACAAGTACGATCG-3'(SEQIDNO：9)；

3'端引物序列为：

5'-TGATCTCTCGATCCACAC-3'(SEQIDNO.:10)。

利用这些分子标记，在筛选了6000多株F₂个体后，一共得到接近1000株在替换区段发生交换的个体。将一部分关键交换个体自交，以产生各种基因型的纯合体，对这些纯合体进行高温耐受性的反复鉴定。最后用在目标位置发生交换的关键植株的种子(BC₄F₃)，以及和这些株系背景相同的BC₄F₃的A、B对照，进行表型鉴定。

结合这些表型鉴定结果，对目标QTL进行了高精度连锁分析，最终将HTR1定位在了12.69kb的区域内，该区域内包含两个候选基因。

根据进一步的实验结果，确定了其中的一个编码26S蛋白酶体的α2亚基的候选基因为HTR1基因。

根据RAP-DB和MSU等水稻基因注释数据库的信息和相关文献，本发明人克隆了HTR1候选基因的基因组序列和cDNA序列并对两个亲本的序列进行了比较(图1)。

结果表明，抗高温的非洲栽培稻CG14中的HTR1^CG14与武运粳的等位HTR1^WYJ之间在ORF区存在3个碱基突变，其中两个为同义突变(第222位和第543位)，而第296位(A到G)的碱基突变导致了氨基酸替换(从WYJ^Arg变为CG14^His)，从而影响了HTR1的蛋白功能活性，而使水稻有了不同的高温抗性。

HTR1基因的cDNA序列如SEQIDNO.:1所示，编码长度为235个氨基酸的蛋白(SEQIDNO.:2)。HTR1的基因组全长6292bp(SEQIDNO:29)，含有11个外显子。

此外，CG14的相应基因组序列如SEQIDNO.:29所示，其中第1-1909位为启动子序列，第1910-1912位为起始密码子ATG，共有11个外显子，分别为1910-1947位、2038-2117位、3252-3318位、3405-3446位、4105-4184位、4346-4411位、4705-4773位、4935-5022位、5244-5305位、5385-5452位、和5855-5902位。其中，在第5个外显子上发生的一个碱基替换(4173位:G突变为A)，使对应于亚洲栽培稻的氨基酸序列(如SEQIDNO.:4)中第99位上的氨基酸由Arg突变为非洲稻CG14中的His(具体序列如SEQIDNO.:2所示)，即Arg99→His99(CG14中His的密码子对应于4172-4174位的CAT)。

相应地，亚洲栽培稻(WJY)的相应基因组序列如SEQIDNO.:30所示。

实施例3

HTR1水稻转基因实验：

本实施例中用根癌农杆菌EHA105介导的水稻幼胚转化法进行水稻的遗传转化实验。具体如下：

3.1.HTR1基因过量表达的转基因质粒构建：

过量表达HTR1用的是pHB载体，该载体来源于植物表达载体pCAMBIA3301(购自CAMBIA公司,Canberra,Australia)，含有一个细菌复制起点(ori)、卡那霉素抗性基因(Kanr)、潮霉素抗性基因(Hygr)、除草剂抗性基因(Bar)、两个串联的CaMV35S启动子、NOS基因的终止信号序列以及后两者之间的限制性内切酶克隆位点(MCS)。将目标基因的编码序列克隆到CaMV35S启动子之后，能够在其强驱动下获得很高的表达。

HTR1编码序列的克隆首先以CG14和武运粳的RNA为模板，合成第一条链cDNA，用该DNA序列的5'和3'端的PCR寡核苷酸为引物(SEQIDNO：11和12)，用高保真Taq酶Kod进行扩增，获得包含全长ORF的1,023bp的cDNA扩增产物。并将该产物加A克隆到pTA2载体(购自TOYOBO),并对多个重组子进行测序，以验证序列的正确性。该重组的过渡质粒载体称为HTR1-CG14-PTA2和HTR1-WYJ-PTA2。

5'端寡核苷酸引物序列为：

5'-AAGCAATCGTAGTTAGCAGA-3'(SEQIDNO.:11)；

3'端引物序列为：

5'-TTTGGCAAGAAGTAAAACAG-3'(SEQIDNO.:12)。

以上述过渡载体为模板，用含有酶切位点的5'和3'端的PCR寡核苷酸为引物(SEQIDNO.:13和14)克隆HTR1的全长ORF，将PCR产物以及pHB载体用SacⅠ和XbaⅠ双酶切后再将粘性末端连接，连接物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有Kan(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用SacⅠ和XbaⅠ酶解挑选出有约780bp片段插入的克隆，并用M13通用引物测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建HTR1^CG14-pHB和HTR1^WYJ-pHB质粒。

5'端寡核苷酸引物序列为：

5'-CGAGCTCATGGGCGACAGCCAGTACTCCTTCTCCC-3'(SEQIDNO.:13)；

3'端引物序列为：

5'-GCTCTAGACTATTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAGTCCGCTGAGCCTCCTCCTTCCACCTCTTCCAAGAAATCCTTG-3'(SEQIDNO.:14)。

其中SEQIDNO.:14在HTR1的蛋白序列后映入了一个FLAG标签。

3.2.HTR1-knockdown表达质粒构建：

HTR1的knockdown是通过人工microRNA的方法实现的。首先用三对5'和3'端的PCR寡核苷酸引物(SEQIDNO.:15和16；17和18；19和20)来扩增水稻的基因组DNA，获得三段长度分别为111bp,87bp和112bp的产物，然后再用SEQIDNO.:15和20为引物，以上述三段PCR产物的混合物为模板做一次巢式PCR，得到一个262bp的片段，将该片段和p1301SN载体用BamHI和KpnI双酶切，然后进行粘性末端的连接，连接物转化大肠杆菌菌株DH5α，在含有Kan(50μg/ml)的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，用BamHI和KpnI酶解挑选出有约262bp片段插入的克隆，并测序检验核苷酸序列是否正确。这样成功构建HTR1^CG14-knockdown质粒。

构建所用引物为：

5'-CGGGGTACCCAGCAGCAGCCACAGCAAA-3'(SEQIDNO.:15)；

5'-AGTGAGACAAATTATTCCACCTGCAGGAGATTCAGTTTGA-3'(SEQIDNO.:16)。

5'-TGCAGGTGGAATAATTTGTCTCACTGCTGCTGCTACAGCC-3'(SEQIDNO.:17)；

5'-CTCAGGTCGAAAAATTTGTCTCATTCCTGCTGCTAGGCTG-3'(SEQIDNO.:18)。

5'-AATGAGACAAATTTTTCGACCTGAGAGAGGCAAAAGTGAA-3'(SEQIDNO.:19)；

5'-CGCGGATCCGCTGCTGATGCTGATGCCAT-3'(SEQIDNO.:20)。

3.3.EHA105介导的水稻转化：

将上述构建好的重组质粒通过冻融法导入常规的农杆菌菌株EHA105。每200μlEHA105感受态细胞加0.5-1μg(约10μl)质粒DNA混匀，依次于冰上、液氮和37℃水浴中各放置5分钟；用新鲜的YEB液体培养基稀释至1ml，于28℃振摇培养2-4小时；取200μl涂布于含抗生素Kan(50μg/ml)的YEB平板上，28℃培养2-3天。长出的菌落在含抗生素的YEB平板上划单菌，连续划3次。参考Hiei等(1994)的方法，从YEB平板上挑取农杆菌单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振摇培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振摇培养至OD600为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4℃离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻武运粳的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的中花11未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中(与水1:3混合，加2-3滴吐温20)消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和摄子挑出幼胚并接种于N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮作为农杆菌Vir基因活化物，使用浓度为100μmol/L。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入选择培养基N6D2S1(Hyg25mg/l)进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到N6D2S2(Hyg50mg/l)选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS0H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室盆土栽培。获得的再生植株移栽成活后提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。用转基因T2代观察水稻高温抗性表型。

3.4.转基因植物表达水平的检测：

为了验证转基因结果，使用Real-timePCR来精确定量各个转基因系中的HTR1表达情况。取幼苗期的叶片，提取RNA后反转录成cDNA，使用TaKaRa公司的SYBRGREEN试剂盒来检测HTR1在mRNA水平上的表达水准，检测引物如下：

5'端引物序列为：

5'-CAATCTGGTGGTGTAAGACC-3'(SEQIDNO.:21)；

3'端引物序列为：

5'-TCCAGGAGAAGTATGACC-3'(SEQIDNO.:22)。

该实验中使用Actin作为内参引物，引物序列如下：

5'端引物序列为：

5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3'(SEQIDNO.:23)；

3'端引物序列为：

5'-GTACCCTCATCAGGCATCTG-3'(SEQIDNO.:24)。

结果分析时使用相对定量分析法，将各个转基因系列的空载体(vector)的HTR1表达量作为1，其他各株系的表达量均已相对与空载体的表达量的倍数来表示。

其中HTR1过表达的植株还抽提植物总蛋白，经SDS-PAGE分离后，用anti-FLAG的抗体进行westernblot来检测外源基因在蛋白水平的积累。

结果见4A显示,HTR1^CG14和HTR1^WYJ过表达都能增强水稻的高温抗性，但是前者的高温抗性更强；将NIL(CG14)中的HTR1^CG14下调表达(Knockdown)会使水稻变得高温敏感。上面两行是相应水稻株系在高温处理前后的生长状态，下面一行则是相应株系中HTR1的表达情况(Knockdown株系为real-timeRCR数据，而过表达株系为west-blot检测外源蛋白的表达)。

实施例4

在拟南芥和高羊茅中过表达HTR1^CG14实验：

拟南芥的转化通过根癌农杆菌GV3101介导的浸花法来实现。将HTR1^CG14-pHB通过通过冻融法导入农杆菌菌株GV3101，涂于选择平板(Rif100μg/mL+Gm50μg/mL+Kan50μg/mL)，28℃培养2至3天。挑去阳性克隆划线来选取单克隆，然后抽提质粒反转回DH5α，摇菌培养后抽提质粒酶切验证。正确的阳性农杆菌克隆用于转化，将含有转基因载体的农杆菌于30℃培养过夜，至OD600≈2.0，4,500rpm离心10min，菌体沉淀悬浮于新鲜配制的转化液中，至终浓度OD600≈0.8。

转化用生长一个月左右，生长状况良好的植株(转化前可以提前一个星期将植物去顶，这样可以使植物产生较多的花苞，提高转化效率)。转化时将拟南芥地上部分浸泡于菌液中5-15s，确保全部花苞都被浸没。用吸水纸吸去多余的液体，将植物平放于一个密封小盒内以保持湿度，避光过夜。第二天将植物取出，竖直，转移到正常条件下生长。T0代种子铺于含100g/mLKan或50g/mLHyg的筛选培养基上。4℃春化48h，移到人工气候室24h连续光照条件下生长一周。将抗性小苗移到土中继续生长。在T2代植物中挑选抗性比为3:1的单插入独立株系。T4代植物在检测过表达量后，用于高温抗性表型分析。

高羊茅的遗传转化与水稻一样，也是通过农杆菌EHA105来介导，侵染叶片诱导产生的愈伤组织。阳性植株也在检测过表达量后用于高温抗性的表型分析。

对HTR1^CG14在拟南芥和高羊茅的过量表达转基因阳性株系进行高温胁迫鉴定。

结果表明，转基因阳性植物比对照具有明显增强的高温抗性(图5)。因此可见，HTR1^CG14在除水稻外的其他作物(如十字花科蔬菜以及其他受高温影响的蔬菜瓜果花卉，禾本科的粮食作物以及牧草、草坪等)的抗高温分子育种上也有广泛的应用前景。

实施例5

泛素化蛋白组分析：

以NIL(WYJ)和NIL(CG14)的处理前和高温(45℃)处理30小时后的幼苗地上部为材料，先抽提植物总蛋白，然后酶解，用anti-kGG的抗体来富集被泛素化修饰的蛋白酶解后的肽段，再将这些肽段进行label-free法的质谱鉴定。实验共分为四组，每组样品做三次实验重复，共12份数据。四组样品间以双因子方差分析来筛选差异基因，选取双因子(基因型和高温处理)方差分析的差异p值达到显著水平(p<0.05)的泛素化修饰蛋白点进行研究。

1)取样。以NIL(CG14)和NIL(WYJ)为材料，在实验室水培12天后，分别在处理前和高温(45℃)30小时后取NIL(CG14)和NIL(WYJ)各20株幼苗的地上部，迅速液氮冻存。

2)蛋白质的裂解和定量。取4个样本各1g左右用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25mlTCA/丙酮(1：9)，-20℃沉淀过夜。离心10000rpm，45分钟，去除上清。加入25ml丙酮洗涤沉淀，离心10000rpm，45分钟，去除上清，重复三次。空气干燥沉淀。按10：1加入SDTbuffer(4％SDS,150mMTrisHClpH8.0)，Votex混匀，沸水浴5min。超声破碎(80w，超声10s，间歇15s，共10次)沸水浴5min，离心取上清。BCA法定量。

3)蛋白质SDS-PAGE试验。四份样品各取20μg，进行SDS-PAGE试验。

4)蛋白质的FASP酶解及肽段检测、脱盐。4样品各取6mg蛋白，分别加入DTT至终浓度为100mM，沸水浴5min，冷却至室温。按400μg/管分别将样品分为15管平行进行酶解(样品D按300μg/管分别将样品分为20管)。向所有样品管中加入200μLUAbuffer离心14000g15min，弃滤液。加入100μLIAA(50mMIAAinUA)，600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g10min。加入100μLUAbuffer，离心14000g10min重复2次。加入100μL25mM碳酸氢铵溶液，离心14000g10min重复2次。加入40μLTrypsinbuffer(2μgTrypsinin25mM碳酸氢铵溶液)，600rpm振荡1min，37℃16-18h。换新收集管，离心14000g10min，按样品分别合并滤液，OD280肽段定量。每份样品分别取2.5μL肽段用LTQVELOS质谱仪(ThermoFinnigan,SanJose,CA)进行质谱检测及查库分析。检测后的肽段应用Sep-PakC18ClassicCartridge进行除盐。取100μL除盐后的肽段溶液单独冻干、复溶，进行质谱检测与查库分析，其余肽段冻干备用。

5)泛素化肽段的富集。用CST公司的PTMScanUbiquitinRemnantMotif(K-ε-GG)Kit对酶解后的肽段进行富集。主要步骤为：用1xIAPbuffer溶解肽段，离心去杂质，将上清转入经过PBS洗过的beads中4℃孵育2小时；然后用1xIAPbuffer洗两次，用ddH2O洗三次，最后用0.15％的TFA洗脱两次。将两次洗脱产物溶液用0.22μm滤膜过滤，冻干备用。

6)酶解产物的LCMS/MS分析。每份样品各加入24μL0.1％FA溶液复溶，取复溶后的肽段溶液进行LCMSMS分析，每个样品重复进样三次，每次进样6μL。采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为2％)，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱ThermoEASYcolumnSC200150μm*100mm(RP-C₁₈)以100％的A液平衡。样品由自动进样器上样到ThermoEASYcolumnSC001traps150μm*20mm(RP-C₁₈)(Thermo)，再经色谱柱分离，流速为400nl/min。相关液相梯度如下：0分钟---100分钟，B液线性梯度从0％到45％；100分钟---108分钟，B液线性梯度从45％到100％；108分钟----120分钟，B液维持在100％。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪(ThermoFinnigan)进行质谱分析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(fullscan)后采集20个碎片图谱(MS²scan，HCD)。MS¹在M/Z200时分辨率为70,000，MS²在M/Z200时分辨率为17,500。

7)Maxquant的非标记分析。12个LCMS/MS原始文件导入Maxquant软件(版本号1.3.0.5)进行查库，进行LFQ和iBAQ非标定量分析。Maxquant所得的查库文件使用Perseus软件进行分析。

试验结果表明，高温处理会造成水稻细胞内大量的蛋白变性并被泛素化修饰。而在高温胁迫下，NIL(CG14)则比对照NIL(WYJ)积累的泛素化蛋白明显减少(图3B)，表明HTR1^CG14清除变性蛋白的效率更高，减少了高温诱导产生的大量变性蛋白对细胞的伤害，而增强了水稻的抗热性。

实施例6

水稻抗高温蛋白1的制备

在该实施例中，以实施例3的HTR1-CG14-PTA2为模板，基于SEQIDNO:1起始密码子以及终止密码子附近设计引物(SEQIDNO.:25和26),用高保真Taq酶pfuTaq(购自STRATAGENE公司,LaJolla,CA)进行扩增，获得扩增产物HTR1-CG14-BS。

其中，5'寡核苷酸引物序列为：

5'-CGGGATCCATGGGCGACAGCCAGTACTCCTTCTCCC-3'(SEQIDNO.:25)；

3'端引物序列为：

5'-GCGTCGACTTATTCCACCTCTTCCAAGAAATCCTTG-3'(SEQIDNO.:26)

将扩增产物以普通Taq酶加A重组进pTA2载体(购自TOYOBO，Japan.)。重组子酶切鉴定后测序。以BamHI和SalI消化重组有HTR1-CG14-BS的pTA2，回收纯化目的片段；T4连接酶连进同样以BamHI和SalI消化的pET32a(+)(购自Novagen公司,Madison,WI,USA.)。以BamHI和SalI酶切鉴定重组子。鉴定正确的进行测序，验证读码框以及序列的正确性。将重组有HTR1的原核表达载体pET32a(+)转化入大肠杆菌DH5α，IPTG诱导原核表达，然后His-tag柱纯化蛋白。

结果获得了纯化的带有标签的HTR1蛋白，酶解去除标签后用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定蛋白质分子量约为26Kda。

结果与讨论

1.在高温下筛选由非洲栽培稻品种CG14作为供体亲本，粳稻品种武运粳作为受体亲本构建的染色体片段替换系(CSSL)，经过多次验证获得一个表现明显抗高温的替换系，该替换系包含来自CG14的HTR1位点(HTR1^CG14)。在此基础上，经过与轮回亲本武运粳(WYJ)的回交和分子标记辅助选育(MAS)的手段，成功培育了含有HTR1^CG14的近等基因系NIL(CG14)，同时也获得了对照株系NIL(WYJ)。NIL(CG14)在正常生长条件下的生长发育与对照NIL(WYJ)没有差异,最终产量也与对照一致(图2A,B)，但是不管是在苗期还是成株期都比对照更抗高温(图2A)。尤其是在对高温很敏感的扬花期和灌浆结实期进行高温处理时，NIL(CG14)的产量比对照显著地提高(图2C,D)。这些数据表明这个抗高温基因位点在水稻的抗高温分子育种中有很好的应用价值。

2.通过图位克隆方法克隆出了HTR1基因。生物信息学分析表明，HTR1编码一个26S蛋白酶体的α2亚基。通过高保真PCR克隆出了HTR1的基因组序列和cDNA序列序列(图1)。序列分析表明，HTR1的基因组长度约为6292bp(SEQIDNO.:29)和6,289bp(SEQIDNO.:30)，其中启动子区约为2Kb(SEQIDNO.:27,28)。比较两个亲本之间的启动子发现，相较于WYJ，CG14在这2kb的序列中，存在9个单核苷酸差异(SNP)和一个包含3个碱基的缺失(deletion)。启动子的这种差异使来源于CG14的HTR1^CG14在表达水平上能更有效地响应高温，即其启动子更有效地响应高温(图3A和3C)。其中，启动子驱动自身基因受到高温诱导表达的实验见图3A,而驱动GUS基因的高温诱导表达见图3C。

3.对比cDNA和基因组序列发现，HTR1基因含有11个外显子和10个内含子，其中全长ORF(openreading-frame)长度为708bp，编码235个氨基酸(图1)。对比来源于不同亲本的序列发现，抗高温的非洲栽培稻CG14中的HTR1^CG14相较于来源于武运粳的等位HTR1^WYJ在ORF区存在3个碱基突变，其中两个为同义突变(第222位和第543位的C到T的变异)，而另外一个即第296位(A到G)的碱基突变导致了氨基酸替换(从WYJ^Arg变为CG14^His)，从而影响了HTR1的蛋白功能活性，而使水稻有了不同的高温抗性(图1、2、4A)。其中第222位(C到T)SNP虽然没有造成编码蛋白序列的变化，但是我们发现该SNP代表了一种HTR1的单倍体型。也就是说，该SNP可以用于鉴定不同水稻品种中HTR1的单倍体型。

4.通过对HTR1表达模式的研究发现，HTR1在水稻的各个组织中普遍性地表达，并且其表达明显受到高温诱导(图3A、C)，这表明该基因在水稻高温响应中发挥重要作用。对比不同来源的HTR1的表达模式发现，来源于CG14的HTR1^CG14的表达量在各个组织中都比HTR1^WYJ高大约1倍。而且，HTR1^CG14受到高温诱导的更明显，在高温处理的过程中一直都比HTR1^WYJ的表达量明显更高(图3A)，这说明HTR1^CG14在表达水平上能更有效地响应高温，即其启动子更有效地响应高温。

5.对NIL(CG14)及其对照在高温处理时细胞内积累的泛素化蛋白的系统研究表明，高温能够造成细胞内大量的蛋白变性并进而被泛素化修饰。而在高温胁迫下，NIL(CG14)则比NIL(WYJ)积累的泛素化蛋白明显减少(图3B)，表明HTR1^CG14清除变性蛋白的效率更高，减少高温诱导产生的大量变性蛋白对细胞的伤害，能更好地维持逆境下的蛋白动态平衡，从而增强水稻的抗热性。这是一种新的植物响应高温的机制。以前认为高温诱导产生的热激蛋白介导的对变性蛋白的复性是植物响应高温的最主要方式。而我们发现在高温胁迫比较剧烈的情况下，细胞内产生大量有毒变性蛋白，会使植物死亡。这时，通过蛋白泛素降解途径快速有效清除这些毒性蛋白，进入循环再利用，进而保护细胞的活性，是一种更为重要的抗热新机制。

6.将HTR1^CG14和HTR1^WYJ在轮回亲本武运粳中过量表达都能增强其高温抗性，其中HTR1^CG14过表达植物的高温抗性更强(图4A)。将NIL(CG14)中的HTR1表达量下调(knock-down)会使水稻的高温抗性显著降低(图4A)，这些转基因实验结果验证了该基因确实是调控水稻高温耐受性的功能基因。过量表达HTR1^CG14的转基因水稻在正常生长条件下的生长发育和产量都与转基因阴性对照没有区别(图4A，B)。但是，在高温逆境下，过量表达HTR1^CG14的转基因水稻不仅苗期的存活力显著增强(图4A)；特别是在扬花期和灌浆结实期遭遇高温时，其产量显著高于对照(图4C，D)。这表明HTR1^CG14基因是一个很好的改良作物高温抗性的基因资源，可以通过遗传工程来增强作物的高温抗性，保障全球气候恶化下的粮食安全。

7.将HTR1^CG14在拟南芥(Arabidopsisthaliana)和高羊茅(FestucaarundinaceaScherb)过量表达可以明显增强转基因阳性植物的高温抗性(图5)。过表达HTR1^CG14的拟南芥不管是基础高温抗性还是适应性高温抗性都显著性地增强(图5A-F)。这些结果表明，HTR1^CG14在除水稻外的其他作物(如十字花科蔬菜以及其他受高温影响的蔬菜瓜果花卉，禾本科的粮食作物以及牧草、草坪等等)的抗高温育种上也有很好的应用前景。

8.通过拟南芥其他一些26S蛋白酶体亚基的突变体的研究发现，26S蛋白酶体的亚基发生突变以后，植物会表现出高温敏感的表型(图6A-F)。这进一步表明了26S蛋白酶体介导的泛素化降解通路在植物高温响应过程中的重要作用。通过用26S蛋白酶体降解活性抑制剂MG132对高温处理过程中水稻进行处理发现，在高温响应过程中阻断26S蛋白酶体降解通路会使植物表现出高温敏感的表型(图6G,H)。即通过用26S蛋白酶体降解活性的抑制剂来抑制26S蛋白酶体的降解活性后，植物的高温抗性明显减弱。

9.HTR1在真核生物中非常保守(图7)。在水稻中还有一个高度同源的基因PAB2，而在其他单子叶植物中(包括玉米、高粱、二穗短柄草以及小麦的祖先种属等)，同源蛋白的相似度为99％-100％；在所有的高等植物中，同源蛋白的相似度也基本在95％以上(仅拟南芥为94％)；在藻类和真菌中均有该蛋白的同源蛋白的存在，而且序列保守；即使在动物中也存在其同源蛋白，而且在脊椎动物中的同源蛋白与HTR1的蛋白相似度也达到80％以上(图7)。这种高度保守性以及在拟南芥和高羊茅中的过量表达能增强其高温抗性的实验结果表明，HTR1在其他作物中也有增加高温抗性的功能。

10.HTR1在水稻不同单倍体型的分布与相应品种的生长环境温度明显相关(图8A,B)。HTR1^CG14代表一种特异存在于非洲稻中的单倍体型，这种单倍体型能显著增强水稻的高温抗性(图8A)。在亚洲稻范围内，也存在HTR1的不同单倍体型，其中三个SNP可以代表其单倍体型的基因型(图8B)。不同单倍体型水稻品种的高温抗性与HTR1的表达量成明显相关性(图8C-E)。这表明，不仅过表达HTR1能增强水稻的高温抗性，不同品种中HTR1的单倍体型差异也会造成高温抗性的差异，这为水稻的引种提供了很好的依据。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种分离的抗高温多肽，即水稻抗高温蛋白1，其特征在于，所述水稻抗高温蛋白1为水稻26S蛋白酶体α2亚基，且所述α2亚基在对应于亚洲栽培稻的α2亚基(如SEQIDNO.:4)中第99位上的氨基酸由Arg突变为His；

或者所述水稻抗高温蛋白1为具有SEQIDNO.:2氨基酸序列的多肽、其活性片段、或其保守性变异多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)具有SEQIDNO.:2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQIDNO.:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高水稻抗高温性的功能的由(a)衍生的多肽；

较佳地，所述的水稻抗高温蛋白1具有选自下组的一个或多个特征：

(i)高温下降解变性蛋白的活性显著高于SEQIDNO.:4所示的蛋白；

(ii)高温下蛋白自身的稳定性显著高于SEQIDNO.:4所示的蛋白。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽；

或者，所述的多核苷酸为水稻中驱动权利要求1所述多肽的特异响应高温启动子序列；

更佳地，该多核苷酸的序列选自下组的一种:

(a)具有SEQIDNO:1中1-708位的核苷酸序列；

(b)具有SEQIDNO:1中1-705位的核苷酸序列；

(c)具有SEQIDNO:29中1-6292位的核苷酸序列；

(d)具有SEQIDNO.:27或28所示的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种水稻抗高温蛋白1的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出水稻抗高温蛋白1。

7.一种26S蛋白酶体，其特征在于，所述的26S蛋白酶体中所含的α2亚基为权利要求1中所述的抗高温多肽。

8.一种改良植物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻抗高温蛋白的编码序列，所述的水稻抗高温蛋白为权利要求1中所述的抗高温多肽或SEQIDNO.:4所示的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻抗高温蛋白的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入水稻抗高温蛋白的DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株；

较佳地，所述方法改良植物的抗高温性。

9.一种培育植物抗高温株系的方法，其特征在于，包括步骤：提高所述植物植株中26S蛋白酶体的表达或活性。

10.一种权利要求1所述的抗高温多肽或其编码基因、或SEQIDNO.:4所示的多肽或其编码基因的用途，其特征在于，用于培育植物抗高温系、或用于制备培育植物抗高温株系的试剂或试剂盒。

11.一种特异响应高温的启动子序列，其特征在于，所述启动子序列具有SEQIDNO.:27或28所示的核苷酸序列。