CN103421813A - Sn1基因在控制水稻抗高温性和抗旱性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高高温和干旱耐受能力的水稻SN1基因在水稻抗高温性和抗旱性遗传改良中的应用。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列长度为1305bp，从92-1535位是它的编码区，编码434个氨基酸。该基因的蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明采用候选基因筛选的方法，克隆到控制水稻抗高温和抗旱的基因SN1，超量表达SN1基因，能够提高转基因水稻抗高温和抗干旱的能力，而SN1的RNAi抑制表达植株表现出对高温和甘露醇敏感，证实了该基因的功能及应用途径。

Description

SN1基因在控制水稻抗高温性和抗旱性中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高高温和干旱耐受能力的水稻SN1基因在水稻抗高温性和抗旱性遗传改良中的应用。本发明采用候选基因筛选的方法，克隆到控制水稻抗高温和抗旱的基因SN1，超量表达SN1基因，能够提高转基因水稻抗高温和抗干旱的能力，而SN1的RNAi抑制表达植株表现出对高温和甘露醇敏感，证实了该基因的功能及应用途径。

背景技术

植物在生长发育过程中常常会受到干旱、高盐、极端温度等多种不利环境条件的影响，这些不利因素在很大程度上限制着农作物的产量和分布，成为了许多地区农业发展的重大障碍。近年来，随着全球经济现代化高度发展，气候剧变、环境污染、土地沙漠化等问题日益突出，尽快培育出抗逆作物品种来缓解经济增长、人口膨胀造成的资源需求增加和环境可持续发展之间的尖锐矛盾已经成为农业科学技术研究攻关的重要方向。由于生长过程中的不可移动性，植物势必需要在物竞天择、适者生存的长期自然驯化过程中建立起一套防御逆境胁迫的自我保护机制。植物体感知和捕捉外界环境刺激信号并通过一系列途径将这些信号传递到细胞内，引起植物体在基因表达、生理生化、物质代谢乃至植株形态水平发生多重变化，使植物免受或减轻逆境胁迫带来的伤害。逆境信号介导植物体内包括参与信号转导的基因、调控基因以及一些功能基因在内的大量抗逆基因的表达（Valliyodan B,Nguyen H T.Understanding regulatory networks andengineering for enhanced drought tolerance in plants.Curr Opin Plant Biol,2006,9:189-195），从而使植物实现对外界刺激做出响应（Xiong等,Cell signaling during cold,drought and salt stress.Plant Cell,2002,14(suppl),S165–S183）。

对于高等植物来说，转录水平的调控在植物逆境应答调控网络中的地位至关重要，也是目前研究得较为清楚的一种调控方式，转录因子在转录调控中的作用不可或缺。研究表明，转录因子对顺式作用元件的调控作用以及转录因子与其它蛋白之间的相互作用共同参与到了植物复杂而细致的调控网络中（Yamaguchi-Shinozaki K,Shinozaki K.Transcriptional regulatory networks in cellular responses and toleranceto dehydration and cold stresses.Annu Rev Plant Biol,2006,57:781-803）。利用单个功能基因来对改良作物的抗逆性难以获得令人满意的效果。近年来，越来越多的研究发现：一些逆境相关的转录因子可以调控多个逆境相关基因的表达，利用转录因子进行植物抗逆性改良，可能获得更为理想的综合效果。NAC（NAM,ATAF,and CUC）家族是植物所特有的一个转录因子大家族，该家族成员最重要的特点就是含有由约150个高度保守的氨基酸残基组成的NAC结构域，该区域可以结合DNA和其它蛋白，一般位于NAC蛋白的N端。诸多研究表明：NAC类转录因子中有相当一部分成员参与了植株对环境的胁迫应答反应，并在植物响应逆境胁迫的过程中调控着大量逆境相关基因的表达。随着基因工程技术的不断发展，将某些逆境相关的NAC转录因子应用于水稻抗逆改良育种已经取得了一些进展。超量表达水稻SNAC1的转基因植株在营养生长时期对干旱和高盐胁迫的抗性得到了显著提高。在正常条件下，利用SNAC1培育的转基因水稻的产量和其它农艺性状并没有受到影响，而在成株期大田干旱条件下则能将结实率提高30%左右（Hu等,Overexpressing a NAM,ATAF,and CUC(NAC)transcription factor enhances drought resistance and salttolerance in rice.Proc Natl Acad Sci U S A,2006,103:12987-12992）。在组成型表达的启动子GOS2和根部特异表达的启动子RCc3的驱动下，超量表达OsNAC10显著增强了营养生长期水稻对干旱、高盐和低温的抗性。RCc3:OsNAC10植株比GOS2:OsNAC10植株和非转基因植株具有更为发达的根系，因此其在生殖生长期水稻的抗旱能力显著增强，从而在大田干旱条件下获得了更高的产量（Jeong等,Root-specific expressionof OsNAC10improves drought tolerance and grain yield in rice under field drought conditions.Plant Physiol,2010,153:185-197）。

作为一种重要的粮食作物，水稻（Oryza sativa）品质的改良和产量的提高一直是水稻分子育种改良科研工作者们努力的目标。在自然环境条件日趋恶劣的今天，培育抗逆水稻新品种意义重大。本发明涉及的SN1基因是水稻NAC家族的成员之一。通过候选基因筛选和鉴定，证实了超量表达SN1基因提高了转基因水稻对高温和干旱的抗性，而抑制表达SN1的转基因植株表现为对高温和甘露醇模拟的干旱胁迫敏感性增强，说明SN1基因参与了水稻对高温和干旱胁迫的应答过程。因此，分离水稻SN1基因，并鉴定其在提高水稻抗逆性方面的生物学功能，对于培育抗逆水稻新品种将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的涉及一个NAC家族基因SN1在控制水稻高温和干旱抗性改良中的应用。根据逆境芯片表达谱挑选受逆境诱导的候选基因，因为其属于NAC转录因子家族，申请人将该基因命名为SN1。本发明分离和应用一种包含SN1基因的DNA片段，该片段赋予水稻在高温条件下抗高温性增强和在干旱条件下抗旱性增强的能力。其中，所述的含有SN1基因编码区的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列长度为1305bp,它对应的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其氨基酸序列为434个。

携带有本发明SN1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞（Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

可使用包括本发明的SN1基因的表达载体转化宿主（包括水稻在内的多种植物），培育抗高温和抗旱植物品种。

本发明基因是受高温和干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的高温或干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在高温和干旱条件下可诱导表达基因，提高植物对高温和干旱的抗性。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆的包含有SN1基因编码区的核苷酸序列，序列长度为1305bp，从92-1535位是它的编码区，编码434个氨基酸。

序列表SEQ ID NO:2是SN1基因的蛋白质的序列。

图1：SN1超表达载体构建示意图及转化植株的表达量检测。图中：A为SN1超表达载体构建示意图。B为SN1超表达植株中SN1基因的表达情况。中花11（ZH11）为野生型对照。

图2：SN1超表达植株苗期高温胁迫下的表型及相关生理指标测定。图中：A为SN1超表达植株苗期高温胁迫下的表型。SN1-OE-5，-41为2个独立超量表达转基因家系，中花11（ZH11）为野生型家系。B为水稻SN1超表达植株苗期高温胁迫后存活率的统计结果。SN1-OE-5，-41为2个独立超量表达转基因家系，中花11（ZH11）为野生型家系。

图3：SN1超表达植株苗期干旱胁迫下的表型及相关生理指标测定。图中：A，SN1-OE植株苗期干旱表型。4叶期水稻植株自然断水胁迫10d后，复水生长7d。B，干旱胁迫后SN1-OE转基因植株与ZH11的存活率统计。3次重复。“*”表示t测验的P值小于0.05，差异显著；“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。C，SN1-OE转基因植株和ZH11离体叶片失水速率。3次重复。“*”表示t测验的P值小于0.05，差异显著；“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。D，SN1-OE植株成株期抗旱表型。E，SN1-OE和ZH11植株成株期干旱胁迫下的相对结实率。“*”表示t测验的P值小于0.05，差异显著。

图4：SN1抑制表达载体构建示意图及转化植株的表达量检测。图中：A为SN1抑制表达载体构建示意图。B为SN1抑制表达植株中SN1基因的表达情况。中花11（ZH11）为野生型对照。

图5：SN1抑制表达植株苗期高温胁迫下的表型和SN1抑制表达植株苗期高温胁迫后存活率的统计。图中：A为水稻SN1抑制表达植株苗期高温胁迫下的表型。SN1-RNAi-10，-24为2个独立抑制表达转基因家系，中花11（ZH11）为野生型家系。B为水稻SN1抑制表达植株苗期高温胁迫后存活率的统计结果。SN1-RNAi-10，-24为2个独立抑制表达转基因家系，中花11（ZH11）为野生型家系。

图6：SN1抑制表达植株苗期甘露醇处理下的表型和SN1抑制表达植株苗期甘露醇胁迫下株高的统计。图中：A为水稻SN1抑制表达植株苗期甘露醇处理胁迫下的表型。B为水稻SN1抑制表达植株苗期甘露醇胁迫下株高的统计结果。

图7：pCAMBIA1301载体的质粒图谱。

图8：pU1301载体及SN1超表达载体的质粒图谱。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有SN1基因完整编码区段的DNA片段，以及验证SN1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

1、SN1基因超量表达载体的构建和遗传转化

为了分析SN1基因的功能，申请人将其在水稻中超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。

超量表达载体构建方法如下：首先通过查找在水稻基因组注释网站RGAP（http://rice.plantbiology.msu.edu/）SN1基因注释号：LOC_Os01g09550，预测为一个NAC家族基因（该基因的完整核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示，其编码区核苷酸长度为1305bp，核苷酸序列对应的氨基酸序列为434个），以此为参考设计引物。从水稻品种IRAT109中，用引物SN1FLF（5'-TTggtaccCTCGTCCTCTTTGCTCT-3'，序列特异引物外加接头KpnI位点）和SN1FLR（5'-TTggatccCTTCTCCCAACCGTAGT-3'，序列特异引物外加接头BamHI位点），扩增出包含SN1基因完整编码区的cDNA片段，本扩增产物对应本发明SEQ ID NO：所示序列的1-1535bp。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体（购自Promega公司），筛选阳性克隆并测序。挑选测序验证无误的包含全长基因的阳性克隆进行后续实验，该克隆命名为pGEM-SN1。阳性克隆pGEM-SN1质粒用KpnI和BamHI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带Ubiquitin启动子的遗传转化载体pU1301（pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301（图7）基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米Ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体，图谱见图8)，酶切完毕，用氯仿：异戊醇（24:1）抽提，纯化酶切产物。用包含SN1基因的酶切片段和酶切的pCAMBIA1301U载体做连接反应，其后转化大肠杆菌Top10（该大肠杆菌Top10菌株购自Invitrogen公司）。通过酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒载体被命名为SN1-OE-pU1301（载体上的SN1基因序列对应SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的1-1535bp，见图1A）。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法（其具体步骤如下所述）将上述超表达载体SN1-OE-pU1301转入到水稻品种“中花11”（中国农业科学院作物科学研究所提供的一个公开使用的水稻品种）中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻（中花11）遗传转化方法（体系）在Hiei等人报道的方法（Hiei等,Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA,Plant J,1994,6:271-282）基础上改良进行。

本实施例的具体遗传转化步骤如下：

（1）电转化：将最终超表达目标载体SN1-OE-pU1301（质粒图谱见图8），用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。

（2）愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子中花11（或称为ZH11，二者为同一个品种，来自中国农业科学院作物科学研究所）去壳，然后依次用70%的乙醇处理1分钟，0.15%氯化汞（HgCl2）种子表面消毒15分钟；用灭菌水洗种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上（成分见后）；将接种后的愈伤组织诱导培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

（3）愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基（成分见后）上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

（4）预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基（成分见后）上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

（5）农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上（成分见后）预培养农杆菌EHA105（来源于CAMBIA，商用菌株，携带有本发明的超表达载体SN1-OE-pU1301）两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基（成分见后）里，28℃摇床上培养2-3小时。

（6）农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD6000.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基（成分见后）上培养3天，培养温度19-20℃。

（7）愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素（CN）的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基（成分见后）上选择2-3次，每次2周（第一次筛选羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次以后为250ppm，潮霉素浓度250ppm）。

（8）分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基（成分见后）上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上（成分见后），光照下培养，温度26℃。

（9）生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

（10）移栽：洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

培养基组分及其配方：

（1）试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA（6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤）；CN（Carbenicillin，羧苄青霉素）；KT（Kinetin，激动素）；NAA（Napthalene acetic acid，萘乙酸）；IAA（Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸）；2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸）；AS（Acetosringone，乙酰丁香酮）；CH（Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白）；HN（Hygromycin B，潮霉素）；DMSO（Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜）；N6max（N6大量成分溶液）；N6mix（N6微量成分溶液）；MSmax（MS大量成分溶液）；MSmix（MS微量成分溶液）。

（2）主要溶液配方：

1）N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液（10X）]的配制：

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2）N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液（100X）]的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

3）铁盐（Fe2EDTA）贮存液（100X）的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠（Na₂EDTA·2H₂O）3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4）维生素贮存液（100X）配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5）MS培养基大量元素母液(10X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

6）MS培养基微量元素母液(100X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

7）2,4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸（NAA）贮存液，吲哚乙酸（IAA）贮存液：均为1mg/ml。

8）葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9）AS贮存液的配制：秤取AS0.392g，DMSO10ml。

（3）用于水稻遗传转化的培养基配方

1）愈伤组织诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶（25ml/瓶），封口灭菌。

2）继代培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶（25ml/瓶），封口灭菌。

3）预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

4）共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中（25ml/每皿）。

5）悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6）选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppmCN，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

7）预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中（25ml/皿）。

8）分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶（50ml/瓶），封口灭菌。

9）生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中（25ml/管），封口灭菌。

2、SN1超量表达转基因家系高温和干旱胁迫表型鉴定

本发明采用荧光检测实时定量的方法对部分转基因水稻植株中SN1基因的表达进行检测，RNA的提取，反转录和荧光实时定量PCR的具体步骤同实施例1（图1B为表达量检测结果），结果显示，成功获得了SN1基因的表达量相对于野生型显著提高的转基因植株。

本实施例选取了转SN1基因（序列见序列表SEQ NO：1）的超量表达的2个T₁家系（编号为SN1-OE-5，-41）进行了苗期高温和干旱胁迫实验。具体步骤如下：将超量表达转基因家系（SN1-OE-5，-41）种子去壳消毒（浓度为70%酒精处理1min，0.15%氯化汞处理10min，无菌水清洗数次），在含有50mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，中花11（ZH11）家系晚一天播于不含潮霉素的MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到小圆桶中，每桶种转基因植株和野生型对照各18株，置正常条件下生长至4叶期进行高温和干旱胁迫。

将生长正常的4叶期的植株移至42℃植物生长箱进行高温胁迫处理1-2天，然后恢复至正常条件生长一周，拍照并调查植株的存活率。结果显示，在高温胁迫处理过程中，超量表达植株长势和持绿程度明显优于对照（图2A）。恢复7天后统计植株存活率，结果表明，对照植株仅有约20%恢复，而超量表达植株约有40%得到了恢复，显著高于对照（图2B）。与野生型对照相比，超表达植株对高温胁迫表现出更强的抗性。该试验设置3次重复，结果一致。说明超表达SN1基因的确提高转基因植株抗高温的能力。

将生长正常的4叶期的植株自然断水处理10天左右进行干旱胁迫，视情况进行复水，结果显示超量表达家系长势明显优于对照（图3A）。复水7天后统计植株存活率，如图3B所示，对照植株仅有25%恢复，而超量表达植株约有40%得到了恢复，显著高于对照。上述结果表明超量表达SN1的转基因植株在苗期对高温和干旱胁迫的抗性显著增强。鉴于SN1超量表达转基因植株的抗旱表型，对超量表达植株和对照植株离体叶片的失水速率进行测定。对正常生长的4叶期超量表达植株和对照植株进行取样，尽量取相同部位的叶片，置于温度和湿度较为稳定的环境中使其缓慢失水，跟踪记录离体叶片的鲜重并计算失水速率，操作详见材料与方法。结果显示，SN1超量表达植株散失水分的速度显著慢于对照（图3C）。将SN1超量表达植株和对照植株种植于带有可移动遮雨大棚的大田进行成株期干旱胁迫表型鉴定，SN1超量表达植株比对照更晚萎蔫（图3D）。在大田严重干旱胁迫条件下，SN1超量表达植株的生物学产量和相对结实率显著高于对照（图3E），这些结果表明超量表达SN1的转基因植株在成株期对干旱胁迫的抗性也有一定程度的增强。

3、SN1基因抑制表达载体的构建和遗传转化

为了更全面地分析SN1基因的功能，申请人也将其在水稻中进行了抑制表达，从抑制表达转基因植株的表型进一步研究该基因的功能。

双链RNAi抑制载体构建方法如下：参考SN1基因对应的KOME全长cDNA克隆（注释号：AK106152）信息设计特异性引物。以KOME全长cDNA克隆（注释号：AK106152）质粒为模板，用引物SN1RNAiF（5'-TCGactagtggtaccTGCCAGCAATCCTTCT-3'，序列特异引物外加接头SpeI位点和KpnI位点）和SN1RNAiR（5'-TTAgagctcggatccCCCAACCGTAGTACATACA-3'，序列特异引物外加接头SacI位点和BamHI位点），扩增出包含SN1基因cDNA编码区靠近3'端的部分序列和3'-UTR区域的部分序列，扩增产物对应本发明SEQ ID NO：所示的序列的1194-1530bp。反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，32个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体（购自Promega公司），筛选阳性克隆并测序。挑选测序验证无误的克隆进行后续实验，该克隆命名为pGEM-SN1i。阳性克隆pGEM-SN1i质粒用KpnI和BamHI双酶切，回收外源片段；同时，用同样的方法酶切携带CaMV35S启动子的遗传转化载体pDS1301（pDS1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301基础上改建的，携带具有组成型和双链RNAi抑制表达特征的农杆菌介导的遗传转化载体），酶切完毕，用氯仿：异戊醇（体积比24:1）抽提，纯化酶切产物。将上述包含SN1基因3'端特异片段的酶切产物和KpnI和BamHI双酶切的pDS1301载体通过T4DNA连接酶进行连接反应后转化大肠杆菌Top10（该大肠杆菌Top10菌株购自Invitrogen公司）。通过KpnI和BamHI双酶切筛选阳性克隆，获得的重组质粒含有第一链SN1基因片段。将这一步得到的阳性克隆进一步用SpeI和SacI双酶切后纯化回收带有第一链目的基因片段的pDS1301中间载体带，将pGEM-SN1i阳性克隆质粒用SpeI和SacI双酶切，回收外源片段，将外源片段与中间载体进行连接反应使SN1基因第二链连接到pDS1301终载体上。将连接产物电转大肠杆菌Top10，通过SpeI和SacI双酶切筛选含有第二链的阳性克隆，获得最终的抑制表达载体，该载体被命名为SN1-RNAi-pDS1301（载体上的SN1基因序列对应SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的1194-1530bp，见图4A）。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法（其具体步骤如下所述）将上述抑制表达载体SN1-RNAi-pDS1301转入到水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻（中花11）遗传转化方法（体系）与实施例2相同。

4、SN1抑制表达转基因家系高温胁迫和甘露醇处理表型鉴定

本发明采用荧光检测实时定量的方法对部分转基因水稻植株中SN1基因的表达进行检测，RNA的提取，反转录和荧光实时定量PCR的具体步骤同实施例2（图4B为表达量检测结果），结果显示，成功获得了SN1基因的表达量相对于野生型显著降低的转基因植株。

本实施例选取了SN1基因抑制表达的2个转基因T₁家系（编号为SN1-RNAi-10，-24）进行了苗期高温和甘露醇胁迫实验。高温胁迫具体步骤如下：将抑制表达转基因家系（SN1-RNAi-10，-24）种子去壳消毒（浓度为70%酒精处理1min，0.15%氯化汞处理10min，无菌水清洗数次），在含有50mg/L潮霉素的MS培养基上发芽，中花11（ZH11）家系晚一天播于不含潮霉素的MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到到小圆桶中，每桶种转基因植株和野生型对照各18株，置正常条件下生长。将生长正常的4叶期的植株移至42℃植物生长箱进行高温胁迫处理1-2天，然后恢复至正常条件生长一周，拍照并调查植株的存活率。结果显示抑制表达植株在高温胁迫条件下较ZH11对照先萎蔫失绿（图5A），恢复后的存活率也明显低于对照（图5B），表明抑制表达SN1的转基因植株在苗期对高温胁迫的敏感性增强。该试验设置3次重复，结果一致，说明抑制表达SN1基因使转基因植株对高温的敏感性增强。

甘露醇胁迫具体步骤如下：将转基因家系和对照种子分别在含有50mg/L潮霉素（选择阳性植株）的MS培养基和普通的MS培养基上发芽。挑选刚发芽的长势一致的转基因和对照小苗分别转移至含有120mmol/L甘露醇的MS培养基上生长。生长7d后，在含有甘露醇的培养基上生长的SN1抑制表达植株长势明显弱于对照植株（图6A），株高显著低于对照（图6B）。上述结果表明，抑制表达SN1的转基因植株对甘露醇模拟的干旱胁迫的敏感性增强

Claims (2)

1.SN1基因在控制水稻抗高温性和抗旱性中的应用，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.SN1基因在控制水稻抗高温性和抗旱性中的应用，其特征在于：所述基因的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

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