CN103421814B

CN103421814B - Dwa1基因控制水稻抗旱性及叶表皮蜡质合成中的应用

Info

Publication number: CN103421814B
Application number: CN201310311195.7A
Authority: CN
Inventors: 熊立仲; 朱晓义
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2013-07-23
Publication date: 2015-01-28
Anticipated expiration: 2033-07-23
Also published as: CN103421814A

Abstract

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种控制水稻抗旱性和干旱逆境下叶表皮蜡质合成的关键基因DWA1在水稻遗传改良中的应用。所述DWA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所述，共编码2391个氨基酸。本发明采用突变体正向遗传学筛选方法，分离鉴定了一个干旱敏感突变体材料dwa1。在此突变体背景下导入DWA1基因极大地恢复和提高了水稻转基因植株的抗旱能力，并通过超量表达DWA1基因，可以提高转基因水稻中与抗旱性相关的蜡质合成能力，证实了该基因的功能及应用价值。

Description

DWA1基因控制水稻抗旱性及叶表皮蜡质合成中的应用

技术领域

本发明属于水稻基因工程技术领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种控制水稻抗旱性和干旱逆境下叶表皮蜡质合成的关键基因DWA1在水稻遗传改良中的应用。本发明采用突变体正向遗传学筛选方法，分离鉴定了一个干旱敏感突变体材料dwa1。在此突变体背景下导入DWA1基因极大地恢复和提高了水稻转基因植株的抗旱能力，并通过超量表达DWA1基因，可以提高转基因水稻中与抗旱性相关的蜡质合成能力，证实了该基因的功能及应用价值。

背景技术

植物的生长发育会受到诸多极端环境因素的不利影响，尤其干旱缺水会导致农作物的大规模减产，严重影响了我国乃至全世界的农业生产和发展。为了抵抗或适应这些不利环境因素，植物体建立了多种反应机制。在这些机制中，作为陆地植物地上部分最外部的疏水层，表皮蜡质提供了必需的保护以限制植物体在季节性干旱和缺水环境下的非气孔性水分流失。同时，表皮蜡质层在其他非生物和生物环境胁迫下对植株起到必需的保护作用(Jenks等，Leaf Epicuticular Waxes of the Eceriferum Mutants in Arabidopsis.Plant Physiol.1995.108(1)：369-377；Xia等，Cloning and Characterization of CER2，an Arabidopsis Gene That Affects Cuticular Wax Accumulation.Plant Cell.1996.8(8)：1291-1304)。

植物表皮蜡质成分复杂，主要由超长链脂肪酸和其衍生物组成，这些衍生物包括脂肪烷，脂肪醇，脂肪醛，脂肪酮和脂肪酯类等(Post-Beittenmiller，BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY OF WAX PRODUCTION IN PLANTS.Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol.1996.47(1)：405-430；Samuels等，Sealing Plant Surfaces：Cuticular Wax Formation by Epidermal Cells.Annu Rev Plant Biol.2008.59(1)：683-707)。干旱胁迫能诱导植物体加强表皮蜡质合成并对其组成成分有重要影响(Shepherd和Wynne Griffiths，The effects of stress on plant cuticular waxes.New Phytol.2006.171(3)：469-499；Kosma等，The Impact of Water Deficiency on Leaf Cuticle Lipids of Arabidopsis.Plant Physiol.2009.151(4)：1918-1929)。迄今为止，仅有少量的蜡质合成相关基因被报道涉及植物的干旱适应性状。对苜蓿WXP1和拟南芥CER1基因进行超量表达能够增强转基因植株的蜡质合成和干旱适应能力，并减少植株失水和表皮通透性(Zhang等，Overexpression of WXP1，a putative Medicago truncatula AP2domain-containing transcription factor gene，increases cuticular wax accumulation and enhances drought tolerance in transgenic alfalfa(Medicago sativa).Plant J.2005.42(5)：689-707；Bourdenx 等，Overexpression of Arabidopsis ECERIFERUM1Promotes Wax Very-Long-Chain Alkane Biosynthesis and Influences Plant Response to Biotic and Abiotic Stresses.Plant Physiol.2011.156(1)：29-45)。超表达拟南芥基因SHN1/WIN1也提高了植株的蜡质积累和抗旱能力，但却增加了表皮通透性和失水速率(Aharoni等，The SHINE Clade of AP2Domain Transcription Factors Activates Wax Biosynthesis，Alters Cuticle Properties，and Confers Drought Tolerance when Overexpressed in Arabidopsis.Plant Cell.2004.16(9)：2463-2480；)。调节此基因的水稻同源基因OsWR1的表达量也能改变转基因植株的蜡质合成和干旱适应能力(Wang等，An ethylene response factor OsWR1responsive to drought stress transcriptionally activates wax synthesis related genes and increases wax production in rice.Plant Mol Biol.2011.78(3)：275-288)。然而，总体而言，干旱胁迫条件下植物表皮蜡质的合成及其调控过程并不为人所知。仅有最近的一个报道显示拟南芥MYB96基因能直接调控一些蜡质合成基因并可能参与干旱诱导的表皮蜡质合成过程(Seo等，The MYB96Transcription Factor Regulates Cuticular Wax Biosynthesis under Drought Conditiohs in Arabidopsis.Plant Cell.2011.23(3)：1138-1152)。

水稻是最重要的粮食作物之一和作物研究的模式植物。而水资源的日益缺乏和难以预测的干旱气候发生使得干旱成为限制水稻生长和稳定产量的最主要因素。因此培育抗旱水稻品种也成为众多育种项目的最主要目标之一(Zhang，Strategies for developing Green Super Rice.Proc Natl Acad Sci USA.2007.104(42)：16402-16409)。在此研究中，我们从水稻中分离得到一个先前在植物中未经报道的编码超大蛋白的基因DWA1，此基因特异控制了干旱条件下植株表皮蜡质合成，并鉴定了它在提高水稻抗旱性方面所发挥的关键功能，此发现对于加深水稻干旱适应机制的了解和培育抗旱水稻新品种将具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的涉及一个编码超大蛋白的基因DWA1在调控水稻抗旱性和增强植株表皮蜡质合成能力改良中的应用。本发明分离和应用一种包含DWA1基因的DNA片段，该片段赋予水稻在干旱条件下抗旱性和表皮蜡质合成的能力增强。其中，本发明分离和克隆的DWA1基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其核苷酸序列长度为7176bp，它对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，蛋白为2391个氨基酸。

携带有本发明DWA1基因的表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，pp.411-463；Geiserson and Corey，1998，Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

可使用本发明的DWA1基因的表达载体转化宿主包括水稻在内的多种植物，用来培育抗旱植物品种。

本发明克隆的DWA1基因是受干旱诱导表达的，因此可将本发明的基因与任何感兴趣的干旱诱导启动子结合后连入合适的表达载体，并转化植物宿主，在干旱条件下可诱导基因表达，提高植物抗旱性。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明分离克隆的包含有DWA1基因的cDNA序列，序列长度为7324bp；该序列的135～7310bp处是该基因的编码区，长度为7176bp。

序列表SEQ ID NO：2是DWA1基因编码的蛋白质序列，共计编码2391个氨基酸。

图1：是干旱敏感共分离的DWA1基因T-DNA插入突变体dwa1的分离和鉴定。图1中：A为DWA1基因结构和dwa1突变体共分离检测图。B为DWA1在WT(野生型)和dwa1中的表达量。P，穗；L，叶片。C为dwa1苗期干旱胁迫敏感表型。D为dwa1苗期干旱胁迫后与WT对比的存活率。E为dwa1与WT的失水速率比较。F为扫描电镜观察的dwa1干旱胁迫后严重的表皮蜡质缺陷。

图2：是DWA1-FC功能互补植株恢复抗旱表型。图2中：A为DWA1-FC功能互补载体构建示意图。B为DWA1-FC植株恢复抗旱表型和干旱胁迫下的存活率。C为扫描电镜观察的DWA1-FC干旱胁迫下的表皮蜡质得到恢复。图中显示的是用粳稻DWA1基因序列互补转化的结果，用籼稻DWA1基因序列互补转化的结果与此完全一样故未显示。

图3：是DWA1基因在多种逆境和植物激素处理下的表达情况。各处理样品分别为：干旱(drought)处理0h，0.5h，1h，4h，8h，12h和24h；低温(cold)处理0h，0.5h，1h，4h，8h，12h和24h；ABA即脱落酸(100μM)处理0h，0.25h，0.5h，1h，4h，8h，12h和24h；JA即茉莉酸(100μM)处理0h，0.5h，1h，3h，6h，和12h。

图4：是DWA1超表达显著增强转基因植株表皮蜡质合成。图4中：A为DWA1超表达载体构建示意图。B为DWA1超表达植株(1-26)中DWA1基因的表达情况。水稻品种中花11(ZH11)为野生型家系(即非转基因)。C为DWA1超表达家系(U7，U10和U16)中的超长链脂肪酸蜡质成分合成增强。U4作为转基因阴性家系对照。3次重复。“*”表示t测验的P值小于0.05，差异显著；“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。

图5：是pCAMBIA1301载体的质粒图谱。该载体上携带的信息含义部是本领域技术人员知晓的信息。

图6：是以pCAMBIA1301载体为骨架改造的pU1301(NPTII)-DWA1功能互补载体DWA1-FC的质粒图谱。该载体上携带的信息含义部是本领域技术人员知晓的信息。

图7：是以pCAMBIA1301载体为骨架改造的DWA1-pU1301超表达载体的质粒图谱。该载体上携带的信息含义都是本领域技术人员知晓的信息。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有DWA1基因完整编码区段的DNA片段，以及验证DWA1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1

1、检测水稻内源DWA1基因的表达水平

申请人选用粳稻品种“中花11号”(或称ZH11，中国农业科学院作物科学研究所培育的一个公开推广应用的水稻品种)作为表达谱分析的材料。生长至4叶期的水稻中花11幼苗进行各种逆境处理。干旱处理是不浇水让其自然干燥，0h，0.5h，1h，4h，8h，12h和24h后取样；低温胁迫试验是将中花11(ZH11)幼苗放入4℃人工气候室(人工气候室为水稻科研的常用设备，没有特殊要求，按照常规的光照、温度及相对湿度管理)，0h，0.5h，1h，4h，8h，12h和24h后取样。脱落酸(ABA)处理是100μM的脱落酸(ABA)溶液均匀喷洒水稻中花11(ZH11)植株表面后并加到水稻中花11(ZH11)幼苗根部，于0h，0.25h，0.5h，1h，4h，8h，12h和24h后取样。茉莉酸(JA)处理是100μM的茉莉酸溶液均匀喷洒水稻中花11(ZH11)植株表面后并加到水稻中花11(ZH11)幼苗根部，0h，0.5h，1h，3h，6h，和12h后取样。总RNA的提取采用TRIZOL试剂(购自Invitrogen公司)提取，提取方法按照上述TRIZOL试剂的说明书进行操作)，利用反转录酶SSIII(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂的说明书操作)，反应条件为：65℃5min，50℃120min，70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用设计的引物对DWA1基因进行特异的PCR扩增。同时利用引物(OsprofilinlF：5’-TGTGGTTTATGTTTGGCATCGTG-3’和Osprofilin1R：5’-ATCTTCATAAAGCAGAACCCACA-3’)对水稻Osprofilin1基因(LOC_Os06g05880)做特异扩增(扩增产物长76bp)，以作为内对照进行定量分析。反应条件为：95℃30sec；95℃5sec，60℃34sec，50个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析(按常规方法)。结果表明，DWA1基因(其核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示)在干旱，低温，ABA和JA处理后表达量上升(见图3)。

2、DWA1基因功能互补载体和超量表达载体的构建与遗传转化

为了分析DWA1基因的功能，申请人将其在突变体和野生型水稻中分别进行互补和超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。

超量表达载体构建方法如下：首先通过查找水稻基因组注释网站RGAP(http：//rice.plantbiology.msu.edu/)DWA1基因注释号：LOC_Os04g39780，以此为参考设计引物。以反转录获得的cDNA为模板，用引物DWA1F(5’-CGGATATCGGAATGCAAGTCAACATGCATGCCTA-3’，序列特异引物外加接头EcoRV平端酶切位点)和DWA1R(5’-CGGATATCCGTCATCGTCCTGCTTACATGCTGTG-3’，序列特异引物外加接头EcoRV平端酶切位点)，扩增出包含DWA1基因完整编码区的cDNA片断，扩增产物就是本发明SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。PCR反应条件为：95℃预变性2min；98℃15sec，68℃7.5min，32个循环；68℃延伸15min。将扩增获得的PCR产物用EcoRV酶切，回收外源片段；同时，用SmaI平端酶切携带ubiquitin启动子的遗传转化载体pU1301(pU1301是在国际上常用的植物遗传转化载体pCAMBIA1301(见图5)基础上改建的，携带具有组成型和超量表达特征的玉米ubiquitin启动子的农杆菌介导的遗传转化载体，分别为NPT和HPT抗生素抗性，其图谱见图6和图7)，酶切完毕，用氯仿：异戊醇(体积比24∶1)抽提，纯化酶切产物。用包含DWA1基因的酶切片段和酶切的pU1301载体做平端连接反应，其后转化大肠杆菌DH10β(该大肠杆菌DH10β菌株购自Invitrogen公司)。通过酶切筛选阳性克隆，将获得的重组质粒载体分别命名为DWA1-FC(功能互补，即pU1301(NPTII)-DWA1)和DWA1-pU1301(超表达)。

通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法(其具体步骤如下所述)将上述改造载体DWA1-FC(功能互补，即pU1301(NPTII)DWA1，如图6所示)和DWA1-pU1301(超表达，如图7所示)分别转入到dwa1突变体(即本实验所筛选分离的突变体，原始来源于水稻T-DNA插入突变体库，下载地址见：http：//rmd.ncpgr.cn/，材料原始流水编号为03Z11EL39)和水稻品种“中花11”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗、移栽，得到转基因植株。上述农杆菌介导的水稻遗传转化方法(体系)在Hiei等人报道的方法(Hiei等，Efficient transformation of rice，Oryza sativa L.，mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994.6：271-282)基础上改良进行。

本实施例的具体遗传转化步骤如下：

(1)电转化：将目标载体DWA1-FC和DWA1-pU1301(质粒图谱见图7)，用1800v电压，电转化入农杆菌EHA105菌株，涂到带有对应抗性选择的常用的LA培养基上，筛选出阳性克隆，用于下述转化愈伤。

(2)愈伤组织诱导：将成熟的水稻种子dwa1和中花11去壳，然后依次用75％的乙醇处理3分钟，0.15％氯化汞(HgCl₂)种子表面消毒15分钟；用灭菌水沈种子4-5次；将该消过毒的种子放在诱导培养基上(成分见后)；将接种后的愈伤组织诱导培养基(成分见后)置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

(3)愈伤继代：挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度25±1℃。

(4)预培养：挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基(成分见后)上黑暗下培养2周，培养温度25±1℃。

(5)农杆菌培养：在带有对应抗性选择的LA培养基上(成分见后)预培养农杆菌EHA105(来源于澳大利亚CAMBIA实验室商用菌株，携带有本发明的载体DWA1-FC和DWA1-pU1301)两天，培养温度28℃；将所述的农杆菌转移至悬浮培养基(成分见后)里，于28℃摇床上培养2-3小时。

(6)农杆菌侵染：将预培养的愈伤转移至灭菌好的瓶子内；调节农杆菌的悬浮液至OD₆₀₀0.8-1.0；将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基(成分见后)上培养3天，培养温度19-20℃。

(7)愈伤洗涤和选择培养：灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400ppm羧苄青霉素(CN)的灭菌水中30分钟；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基(成分见后)上选择2-3次，每次2周(第一次筛选用的羧苄青霉素浓度为400ppm，第二次及以后为250ppm，潮霉素浓度为250ppm)。

(8)分化：将抗性愈伤转移至预分化培养基(成分见后)上黑暗处培养5-7周；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上(成分见后)，光照(按照水稻组织培养苗的常规光照条件，没有特殊要求)下培养，温度26℃。

(9)生根：剪掉分化时产生的根；然后将其转移至生根培养基中光照(按照水稻组织培养苗的常规光照条件，没有特殊要求)下培养2-3周，温度26℃。

(10)移栽：沈掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室，同时在最初的几天保持水分湿润。

培养基组分及其配方：(1)试剂和溶液缩写：本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthalene acetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量成分溶液)；N6mix(N6微量成分溶液)；MSmax(MS大量成分溶液)；MSmix(MS微量成分溶液)。(2)主要溶液配方：

1)N6培养基大量元素母液[10倍浓缩液(10X)]的配制：

逐一溶解，然后室温下定容至1000ml。

2)N6培养基微量元素母液[100倍浓缩液(100X)]的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

3)铁盐(Fe₂EDTA)贮存液(100X)的配制

准备800ml双蒸水并加热至70℃，加入乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)3.73克，充分溶解后在70℃水浴中保持2小时，定容至1000ml，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(100X)配制

加水定容至1000ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(10X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

6)MS培养基微量元素母液(100X)的配制

室温下溶解并定容至1000ml。

7)2，4-D贮存液，6-BA贮存液，萘乙酸(NAA)贮存液，吲哚乙酸(IAA)贮存液：1均为mg/ml。

8)葡萄糖贮存液：0.5g/ml。

9)AS贮存液的配制：秤取AS0.392g，DMSO10ml。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)愈伤组织诱导培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(25ml/瓶)，封口灭菌。

2)继代培养基

3)预培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlAS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口灭菌。使用前加热溶解培养基并加入5ml葡萄糖贮存液和250μlAS贮存液，分装倒入培养皿中(25ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100ml，调节pH值到5.4，分装到两个100ml的三角瓶中，封口灭菌。使用前加入1ml葡萄糖贮存液和100μlAS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250ml，调节pH值到6.0，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和400ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，封口灭菌。使用前溶解培养基，加入250μl HN和200ppm CN，分装倒入培养皿中(25ml/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并定容至1000ml，分装到50ml三角瓶(50ml/瓶)，封口灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并定容至1000ml，分装到生根管中(25ml/管)，封口灭菌。

3、DWA1功能互补转基因家系DWA1-FC干旱胁迫表型鉴定

将经过G418筛选的DWA1-FC阳性转基因家系和dwa1突变体家系发芽后移栽到小圆桶中。试验用的土壤为中国南方常规的水稻土与粗沙按体积比为2∶3混合而成，每圆桶等量均匀沙土加等体积水，水自行渗漏确保土壤的紧实度一致。对健康生长的4叶期的植株进行断水干旱胁迫6-10天(具体根据天气情况而定)，然后复水恢复7天，拍照并调查植株的存活率。结果显示DWA1-FC互补家系较突变体家系对干旱明显增强抗性(见图2中B)。复水后，对照家系存活率低于10％，而DWA1-FC互补转基因家系仍有90％以上的存活率(见图2中B)。该试验设3次生物学重复，结果一敏。说明DWA1基因的确具有增强转基因植株苗期抗干旱胁迫的能力。

4、DWA1超量表达转基因家系增强蜡质合成鉴定

本发明采用荧光实时定量的方法对转基因水稻植株中DWA1基因的表达进行检测，RNA的提取，反转录和荧光实时定量PCR的具体步骤同实施例1(图4中B为表达量检测结果)，结果显示，获得了DWA1基因的表达量相对于野生型显著提高的转基因植株。

本实施例选取了转DWA1基因(序列见序列表SEQ NO：1)的超量表达的3个家系(编号为U7，U10和U16)和阴性家系U4作为对照进行了实验。具体步骤如下：将超量表达转基因家系种子去壳消毒(用浓度为75％的酒精处理3min，再用0.15％氯化汞处理15min，无菌水清洗4次)，在含有50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上发芽；将U4对照家系的种子晚半天播于不含潮霉素的1/2MS培养基上，2-3天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到沙土中继续生长。对健康生长的4叶期的植株进行叶片取样，正己烷(色谱纯)抽提叶片表皮蜡质，加入十九烷酸作为内标。加入BSTFA(购自Sigma公司)对抽提样品进行衍生化，100℃，30min。应用GC/MS(GCMS-QP2010Plus；Shimadzu)方法对衍生化后的蜡质样品进行组分分析，单一蜡质组分对应内标进行面积积分定量。结果显示，DWA1超表达显著增强了转基因植株中超长链脂肪酸组分(C20：0，C22：0，C24：0和C28：0)的合成(图4中C)。综上结果表明，DWA1基因超表达能显著增强与植株抗旱性紧密相关的表皮蜡质的合成。

5、dwa1突变体和DWA1-FC互补植株干旱胁迫后叶片表皮扫描电镜观察

对小红盆沙土中健康生长的4叶期的dwa1突变体，DWA1-FC互补和对照家系进行断水干旱胁迫，待叶片全卷后分别剪取约0.5cm宽叶片，用2.5％的戊二醛进行固定。叶片样品经脱水干燥和金颗粒喷涂后，进入扫描电镜(型号JEOLJSM-6390LV SEM)观察。观察结果显示，dwa1突变体干旱胁迫下表皮蜡质出现严重的缺陷，而DWA1-FC互补植株明显恢复了干旱下表皮蜡质的合成。这说明DWA1基因控制了干旱胁迫下的表皮蜡质合成，从而控制了植株的抗旱能力。

Claims

1.DWA1基因在控制水稻抗旱性及叶表皮蜡质合成中的应用，其特征在于：所述DWA1基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO：1中第135-7310位的碱基序列。

2.DWA1基因在控制水稻抗旱性及叶表皮蜡质合成中的应用，其特征在于：所述基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示。