CN102168083A - 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种培育蜡质减少的转基因植物的方法。该培育蜡质减少的转基因植物的方法，包括如下步骤：使出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到蜡质减少的转基因植物。本发明基因影响叶片蜡质形成，是一个控制叶片蜡质形成的基因，具体是对叶片蜡质形成起正调控作用。本发明基因对了解水稻叶片蜡质形成的机制具有重要的应用价值，可以探索将其用于水稻育种，通过基因工程手段改良水稻叶表皮性状从而提高抗旱能力。此外，本发明的基因和蛋白控制表皮蜡质的含量，表皮蜡质的含量会影响水稻叶片GUS染色的效果，降低表皮蜡质的含量可以增强水稻叶片GUS染色的效果，因此可利用该基因来培育检测外源基因在叶片表达情况的转基因实验材料。

Description

一种培育蜡质减少的转基因植物的方法
技术领域
本发明涉及一种培育蜡质减少的转基因植物的方法。
背景技术
植物表皮蜡质是覆盖在植物表面最外层，不溶解于水而溶解于有机溶剂(氯仿等)的一类混合物的总称，它们是由表皮细胞所合成和分泌，一般认为表皮蜡质具有阻止植物组织内水分的非气孔性散失、维持植物表面清洁与植物表面防水、防止植物被有害光线损伤、保护植物避免被病菌侵害和防止某些昆虫的蚕食等功能。此外，表皮蜡质的含量通常会影响表皮结构的变化，而表皮结构的变化通常会影响表皮对水分子的吸附和渗透，例如，表皮蜡质的含量会影响水稻叶片GUS染色的效果，疏水性的表皮蜡质含量越高，GUS染色液就越难被叶表皮吸附和渗透，水稻叶片GUS染色的效果就越差，导致只有叶片的切口边缘很小一部分区域能被染色，其他大部分区域很难被染色。而蜡质含量越少，就越有利于GUS染色液的吸附和渗透，GUS染色的效果就越好。
同时对一些作物的研究结果表明，作物表皮蜡质与作物水分利用效率、产量、收获指数和角质蒸腾等都有较好的相关性，有蜡质表型的材料其抗旱节水性和产量都要高于无蜡质表型的材料。水稻是世界三大粮食作物之一，但水稻生产需要大量的水，干旱已成为缺水地区水稻生产最大的限制性因子，因此耐旱相关基因的挖掘和抗旱品种培育，是目前稳定粮食生产的最有效途径。目前，利用正向遗传学和反向遗传学的方法，人们已经从许多物种中克隆出了蜡质相关基因并进行了相关的功能分析。根据这些基因的功能可将它们分为以下几类：蜡质合成基因，蜡质转运基因，蜡质调控基因等。虽然这方面的研究取得了不少进展，但目前与耐旱性状相关的水稻叶片蜡质缺失突变体却鲜有报道，因此利用水稻叶片蜡质缺失突变体克隆与叶片蜡质形成相关的基因，并分析其功能，进一步了解水稻叶表皮蜡质与耐旱性之间的相关性，具有重要的理论意义和实际意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与蜡质形成相关的RNA分子。
本发明所提供的RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
表达上述RNA分子的重组干扰载体也属于本发明的保护范围。
上述重组干扰载体按照包括如下步骤的方法得到：将SEQ ID NO：3所示DNA片段插入出发载体的多克隆位点，得到所述重组干扰载体。
上述重组干扰载体中，所述出发载体为pCam13OX；
所述pCam13OX按照包括如下步骤的方法制备得到：将CaMV35S启动子片段插入载体pCAMBIA1300的Pst I和Hind III的识别位点间，得到的重组载体记作pCam13OXM；将Nos终止子片段插入载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间，得到的重组载体即为pCam13OX。
本发明的另一个目的是提供一种培育蜡质减少的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育蜡质减少的转基因植物的方法，包括如下步骤：使出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到蜡质减少的转基因植物。
上述方法中，所述使出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失的方法为抑制出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因表达。
上述方法中，所述抑制出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因表达的方法包括如下步骤：向所述出发植物中导入上述任一所述重组干扰载体。
上述方法中，所述蜡质为植物表皮蜡质；所述植物表皮蜡质可为植物叶片表面蜡质；
上述方法中，所述植物为单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。
上述方法中，所述SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：1所示蛋白或SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因在调节植物中蜡质形成中的应用也属于本发明的保护范围。
SEQ ID NO：1所示蛋白或SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因在培育耐旱植物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述蜡质为植物表皮蜡质；所述植物表皮蜡质可为植物叶片表面蜡质；
上述应用中，所述植物为单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。
上述应用中，所述SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明基因影响叶片蜡质形成，是一个控制叶片蜡质形成的基因，具体是对叶片蜡质形成起正调控作用。本发明基因对了解水稻叶片蜡质形成的机制具有重要的应用价值，可以探索将其用于水稻育种，通过基因工程手段改良水稻叶表皮性状从而提高抗旱能力。此外，本发明的基因和蛋白控制表皮蜡质的含量，表皮蜡质的含量会影响水稻叶片GUS染色的效果，降低表皮蜡质的含量可以增强水稻叶片GUS染色的效果，因此可利用该基因来培育检测外源基因在叶片表达情况的转基因实验材料。
附图说明
图1为野生型与突变体osgl1植株和叶片表型。
图2为野生型3037和突变体osgl1的表型。
图3为野生型3037与突变体osgl1的叶表皮属性分析。
图4为干旱对野生型3037与突变体osgl1的影响。
图5为互补表达载体的构建。
图6为野生型与pGL1RNAi转基因植株及其叶片表型。
图7为野生型日本晴(WT)和转pGL1RNAi植株OsGL1基因表达量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、基因的发现
1、水稻蜡质缺失突变体osgl1的表型分析
水稻蜡质缺失突变体osgl1是野生型3037的自然突变体。在正常情况下，突变体osgl1与野生型3037相比没有明显差异(图1A)，但在在下雨天或者人工淋浴的情况下，突变体osgl1的叶片表现出高度亲水的表型。在野生型3037中，由于叶表皮蜡质的大量存在，水分子往往会在叶表面聚合形成球形状的水珠，只要稍微抖动一下叶片，都会导致叶片上这些水珠的滴落。而在突变体osgl1中，由于叶片高度亲水，水分子将会均匀散布在整个叶表面而不形成水珠(图1B)。图1中，左为野生型，右为突变体。
2、突变体osgl1的电镜观察分析
通过扫描电镜观察发现，与野生型3037相比(图2A，B)，突变体osgl1叶表皮近轴端与远轴端的蜡质严重减少(图2D，E)，而透射电镜的研究结果表明，野生型3037表皮膜可分为两层结构，最外层为透明层，最内层为非透明层(图2C)，与野生型3037相比，突变体osgl1叶表皮膜变薄，最外层的透明层消失，只含有最内层的非透明层(图2F)。图2中，A为野生型3037的远轴端叶片表面；B为为野生型3037的近轴端叶片表面；C为野生型3037的表皮膜结构；D为突变体osgl1的远轴端叶片表面；E为为突变体osgl1的近轴端叶片表面；F为突变体osgl1的表皮膜结构。P：乳突细胞；CW：细胞壁；TL：透明层；OL：非透明层。
3、水稻蜡质缺失突变体osgl1叶表皮属性的分析
叶表皮属性分析的检测包括叶绿体渗透实验和叶片的水分散失实验，对于叶绿体渗透实验，主要在暗室中进行，我们以抽穗期每个水稻分蘖的倒三叶为研究对象，将叶片切割成3厘米长并侵泡在浓度为80％的30毫升乙醇中，在1-12小时内，每隔1小时测定叶绿素的含量，每个时间点的叶绿素渗透率，以该时间点渗透出来的叶绿素含量占第12个小时渗透出来的叶绿素含量的百分比表示。对于水分散失实验，也是在暗室中进行，也是以抽穗期每个水稻分蘖的倒三叶为研究对象，在0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，2小时，3小时，4小时，5小时，6小时，7小时，8小时这11个时间点分别测定样品的重量，每个时间点的水分散失率，以该时间点损失的水分重量占最初样品重量的百分比表示。水稻蜡质缺失突变体osgl1与野生型3037的叶绿体渗透率、水分散失率的测定结果如图3所示，表明蜡质缺失突变体osgl1与野生型3037相比，叶绿体渗透型降低，而水分散失率增加。图3中，A为野生型3037与突变体osgl1的叶绿体渗透实验；B为野生型3037与突变体osgl1的水分散失实验。每个样品重复三次。W：野生型3037；M：突变体osgl1。
4、水稻蜡质缺失突变体osgl1的干旱实验分析
将野生型3037和突变体osgl1种在同一个盆里，在正常情况下生长6周后，停止给他们浇水，干旱持续12天后再给他们浇水，观察他们表型的变化。结果表明，野生型3037的大部分叶片能够恢复正常，而突变体osgl1只有少部分叶片能够恢复正常(图4)，这表明突变体osgl1对于干旱更敏感。图4中，A为干旱实验开始之前的野生型3037(左)与突变体osgl1(右)；B为干旱实验结束后的野生型3037(左)与突变体osgl1(右)。
5、水稻蜡质缺失突变体osgl1的遗传分析
水稻蜡质缺失突变体osgl1和粳型野生型材料中花11，二品种杂交得F1代，F1代自交产生F2代，对F2代植株进行表型鉴定，中花11和osgl1分别作为正、负对照，F2代植株的表型鉴定结果如表1所示，表明水稻蜡质缺失这一性状符合单基因控制遗传规律。表1中，正常株数是指具有中花11表型的株数，蜡质缺失osgl1株数是指具有osgl1表型的株数。
表1水稻蜡质缺失突变体osgl1的遗传分析
  组合   正常株数   osgl1株数   总株数   分离比
  osgl1/中花11   410   127   537   3.11∶1
实施例2、OsGL1及其编码基因OsGL1的获得
1、图位克隆OsGL1的基因组基因
为了克隆OsGL1基因，将用纯合的突变体叶片蜡质缺失突变体和中花11进行杂交，获得的F1代自交得到F2群体，对其中180个F2隐性个体(具有叶片蜡质缺失表型的F2代个体)进行OsGL1基因的初步定位。应用STS分子标记，利用PCR的方法，发现位于第9号染色体上的STS标记P1、P2、P3、P4、P5和P6与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和P3之间的交换单株，绝大多数在突变位点和P1、P2之间也进行交换，而突变位点和P4之间的交换单株，绝大多数包含在突变位点和P5、P6之间的交换单株中。同时突变位点和P3之间的交换单株与突变位点和P4之间的交换单株不同，因此推断突变基因可能位于标记P3和标记P4之间的区域。在此基础上，进一步扩大突变体osgl1和中花11的杂交组合，获得了包含1842株突变单株的F2分离群体用于OsGL1精细定位。参照已经完成的水稻基因组序列(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/和http://btn.genomics.org.cn)，对粳稻和籼稻的序列进行比较，利用序列差异发展了5个新的STS分子标记(表2)。最终将OsGL1精细定位于BAC克隆AP005568标记P7和P9之间，这两个标记之间的物理距离约为35kb。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb)分析表明，35kb区域内只有1个功能注释的基因09g25850，该基因与玉米GL1基因的同源性高达85％，而玉米GL1基因的突变导致叶表皮的蜡质严重缺失。将其作为候选基因，通过DNA序列测定进行了突变体和野生型3037序列比较。结果表明，该基因在第十个外显子中发生了一个单碱基的置换，导致该处的氨基酸由组氨酸变成了天冬氨酸。因此，将该基因确定为候选基因，命名为OsGL1(此处OsGL1指野生型基因)。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为4488bp，共有10个外显子，9个内含子，mRNA的全长为1857bp，共编码619个氨基酸。
表2STS标记
Figure BDA0000041300140000051
Figure BDA0000041300140000061
2.OsGL1基因全长ORF的获得
水稻中籼3037叶片总RNA提取采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板，primer 1(5’-ATGGGTGCCGCATTCTTGTC-3’)和primer 2(5’-TCAGACAGGCCGGAGGCCGT-3’)，进行PCR扩增反应，反应条件如下：
反应体积50μl，其中含有：
模板(cDNA)                5μl(5ng)
引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM
dNTP                      终浓度各200μM
Taq DNA聚合酶             2.5U
10×Taq DNA聚合酶缓冲液   5μl
用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸45秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。
扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后与3’有碱基T的线性pBM19-T载体(Biomed，A1360)在室温下下连接20分钟，使用2mm电极杯，2500V转化大肠杆菌DH5α，转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长，挑选克隆，提取质粒，使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序，测得的序列如SEQ ID NO：2所示，为OsGL1的cDNA的ORF，其全长1857bp，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
实施例3、基因OsGL1的应用
一、蜡质缺失突变体osgl1表型的互补实验
1、互补载体pCGL及互补对照载体pCGLC的构建
利用Xbal酶切BAC OSJNBb0057D06，获得包含有OsGL1的起始密码子ATG上游的2899个碱基和终止密码子TGA后的1436个碱基的全长序列的DNA片段(8264bp)，克隆到pCAMBIA1300(CAMBIA，Canberra，Australia)的Xbal酶切位点间，得到重组载体；将构建好的互补载体pCGL用HindIII酶切，去除OsGL1部分编码区和基因的5’启动子区，保留3’端的部分编码区和3’调控区，即构建成了互补对照载体pCGLC(图5)。
pCGL，互补表达载体，包括OsGL1基因上游2899bp和下游1436bp；
pCGLC，互补表达载体对照，与pCGL相比少了部分外显子及5`端序列。
2、pCGL和pCGLC转化株系的获得及其表型鉴定
农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105购自北京亚平宁生物科技发展有限公司。
两载体pCGL和pCGLC通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105中，利用农杆菌的介导法分别将pCGL和pCGLC转入蜡质缺失突变体osgl1与中花11杂交群体的自交F2代隐性个体(具有蜡质缺失表型的个体)。转化的具体方法是将该F2代种子的幼胚灭菌后切出，接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有pCGL和pCGLC质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，将水稻愈伤组织接于含有50mg/L潮霉素的选择培养基中，在25℃条件下进行第一轮筛选，两周后长出的新鲜愈伤转入选择培养基进行第二轮筛选。经过两到三轮筛选后，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转入分化培养基中，于16小时光照8小时暗培养条件下进行分化，再生的小苗在1/2MS培养基生根壮苗，最后将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田，观察转基因植株的表型恢复情况。
通过人工淋浴的鉴定方法，我们发现：互补载体pCGL的转基因植株叶片上能形成球形状的水珠，并且只要稍微抖动一下叶片，都会导致叶片上这些水珠的滴落。而互补对照载体pCGLC的转基因植株叶片则不能形成水珠，水分子均匀散布在整个叶表面。这些结果表明互补载体pCGL能恢复蜡质缺失表型为野生型表型，而互补对照载体pCGLC不能恢复蜡质缺失表型。同时提取互补载体pCGL的转基因植株及对照载体pCGLC的转基因植株的基因组DNA，使用基因组特异性引物(保证扩增出来的序列是基因组序列而不是互补载体pCGL及pCGLC序列，用于检测植株的遗传背景是野生型还是突变体)，通过PCR扩增反应并测序，进一步验证互补载体pCGL及对照载体pCGLC的转基因植株的遗传背景。
基因组特异性引物对primer 3(5’-AGAGATTCCAGAAGATACAG-3’)和primer 4(5’-GGGCCCTATGTAAAATCTTA-3’)。
PCR扩增反应条件如下：反应体积20μl，其中含有：模板(基因组DNA)1μl(25ng)，正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶1U，10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μl，用双蒸水补足至20μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性25秒，58℃退火25秒，72℃延伸3分钟，扩增若干个循环；最后在72℃下延伸5分钟。
扩增循环数：30个循环。
结果表明：互补载体pCGL及对照载体pCGLC的转基因植株的遗传背景都是突变体背景。互补实验表明OsGL1控制蜡质形成。
诱导愈伤组织的培养基组成：
N6-1：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2830mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2：CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3：KH2PO4 400mg/L。
N6-4：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5：MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO3 1.6mg/L，KI 0.8mg/L。
N6-6：甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素B1 1mg/L，盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶(Phytagel)2.5g/L，pH 5.8，其余为水，pH 5.8。
第一轮抗性筛选培养基组成：
N6-1：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2830mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2：CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3：KH2PO4 400mg/L。
N6-4：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5：MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO31.6mg/L，KI 0.8mg/L。
N6-6：甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素B1 1mg/L，盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶(Phytagel)2.5g/L，pH 5.8，其余为水，pH 5.8。
25mg/L潮霉素B，500mg/L头孢霉素。
第二轮抗性筛选培养基组成：
N6-1：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2830mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2：CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3：KH2PO4 400mg/L。
N6-4：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5：MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO3 1.6mg/L，KI 0.8mg/L。
N6-6：甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素B11mg/L，盐酸吡哆醇B60.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶(Phytagel)2.5g/L，
pH 5.8，其余为水，pH 5.8。
50mg/L潮霉素B，300mg/L头孢霉素。
分化培养基组成：MS盐分和维生素，酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，6-BA2mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，植物凝胶(Phytagel)3g/L，潮霉素B 50mg/L，头孢霉素200mg/L，其余为水，pH 5.8。
MS盐分和维生素组分：
大量元素(mg/L)
NH4NO3         1650
KNO3           1900
CaCl2·2H2O    440
MgSO4·7H2O    370
KH2PO4         170
微量元素(mg/L)
KI             0.83
H3BO3          6.2
MnSO4·4H2O    22.3
ZnSO4·7H2O    8.6
Na2MoO4·2H2O  0.25
CuSO4·5H2O    0.025
CoCl2·6H2O    0.025
铁盐(mg/L)
FeSO4·7H2O    27.85
Na2-EDTA·2H2O 37.25
有机成分(mg/L)
肌醇                    100
烟酸(维生素B5)          0.5
盐酸吡哆醇(维生素B6)    1
盐酸硫胺素(维生素B1)    0.5
甘氨酸                  2
二、osGL1基因RNA干扰实验
中籼3037和农杆菌EHA105在文献“农杆菌介导籼稻中籼3037转化体系的优化及其应用.王歆，于恒秀，曾燕楠，刘巧泉，龚志云，程祝宽.分子植物育种，2008，6(3)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
1、干扰载体pGL1RNAi的构建
载体pCam13OX的构建方法：用引物对35S-F ：(5’-AAGCTTCCCAGATTAGCCTTTTCAAT-3’)和35S-R：(5’-CTGCAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3’)PCR扩增质粒pBI121(购自北京鼎国生物技术有限公司，货号：MCV032)得到约850bp的组成型CaMV35S启动子片段，将该片段用PstI和Hind III双酶切然后连入载体pCAMBIA1300(购自北京鼎国生物技术有限公司，货号：MCV033)的Pst I和Hind III识别位点间，构成中间载体pCam13OXM。用EcoR I和Sac I双酶切质粒pBI121，将回收的约300bp的Nos终止子片段连入中间载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间，最终得到过表达载体pCam13OX。
利用获得的OsGL1的cDNA的一个片段反向重复地分别连到内含子序列的两端，然后将这三段拼合的序列与组成型CaMV35S启动子连接，克隆到pCam13OX的Pst I和Sal I识别位点间，即构建成了RNAi干扰载体pGL1RNAi。
pGL1RNAi详细构建方法：
提取水稻中籼3037的RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，用引物对primer3(5’-AGAGATTCCAGAAGATACAG-3’)和primer 4(5’-TCAGACAGGCCGGAGGCCGT-3’)进行PCR扩增。
反应条件如下：反应体积50μl，其中含有：模板(cDNA)5μl(5ng)，引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP  终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶2.5U，10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl，用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，扩增30个循环；最后在72℃下延伸8分钟。
扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，28706)按产品说明书进行纯化，然后连入3’有碱基T的线性载体pMD19-T(Takara，D101)中得到载体pMD19-GL1，分别用Sal I和BamHI以及Pst I和Xba I双酶切载体pMD19-GL1得到422bp左右的片段1(即包含SEQ ID NO：3中第7bp-428bp片段)和422bp左右的片段2(即包含SEQ ID NO：3中第640bp-1061bp片段)，用Bgl II和Xba I双酶切载体pUCCRNAi得到约211bp左右的片段3(即包含SEQ ID NO：3中第429bp-639bp片段)；用Pst I和SalI酶切过表达载体pCam13OX，回收载体大片段；将载体大片段和片段1、片段2、片段3连接，得到重组载体，记作RNAi干扰载体pGL1RNAi。
载体pUCCRNAi在文献“Gan，D.，Zhang，J.，Jiang，H.，Jiang，T.，Zhu，S.，and Cheng，B.Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection.Plant Cell Rep 29，1261-1268.”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
将干扰载体pGL1RNAi进行测序验证，结果在pCam13OX的Pst I和Sal I识别位点间插入的DNA片段序列如SEQ ID NO：3所示。SEQ ID NO：3中，第7-428位核苷酸为干扰序列，第429-639位核苷酸为内含子，第640-1061位核苷酸为干扰序列的反向重复序列。
2、转化
通过电击的方法将载体pGL1RNAi转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中，抗性筛选得到阳性重组农杆菌。
利用农杆菌的介导法将干扰载体转入粳型野生型材料日本晴中，具体如下：
将日本晴种子的幼胚灭菌后切出，接种到诱导愈伤组织的培养基中，培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用作转化的受体。用含有干扰载体pGL1RNAi的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗处25℃培养3天后，将水稻愈伤组织接于含有50mg/L潮霉素的选择培养基中，在25℃条件下进行第一轮抗性筛选培养，两周后长出的新鲜愈伤转入选择培养基进行第二轮筛选。经过两轮筛选后，选择生长旺盛的抗性愈伤组织转入分化培养基中，于25℃、16小时光照8小时暗培养条件下进行分化，再生的小苗在1/2MS培养基生根壮苗，最后将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗，7天后移栽到水田。
诱导愈伤组织的培养基组成及浓度如下：
N6-1：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2830mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2：CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3：KH2PO4 400mg/L。
N6-4：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5：MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO3 1.6mg/L，KI 0.8mg/L。
N6-6：甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素B1 1mg/L，盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶(Phytagel)2.5g/L，pH 5.8，其余为水，pH 5.8。
第一轮抗性筛选培养基组成：
N6-1：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2830mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2：CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3：KH2PO4 400mg/L。
N6-4：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5：MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO3 1.6mg/L，KI 0.8mg/L。
N6-6：甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素B1 1mg/L，盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶(Phytagel)2.5g/L，pH 5.8，其余为水，pH 5.8。
25mg/L潮霉素B，500mg/L头孢霉素。
第二轮抗性筛选培养基组成：
N6-1：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2830mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2：CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3：KH2PO4 400mg/L。
N6-4：FeSO4·7H2O 27.8mg/L，EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5：MnSO4·4H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，H3BO3 1.6mg/L，KI 0.8mg/L。
N6-6：甘氨酸2mg/L，盐酸硫胺素B1 1mg/L，盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，2，4-D 2mg/L，植物凝胶(Phytagel)2.5g/L，pH 5.8，其余为水，pH 5.8。
50mg/L潮霉素B，300mg/L头孢霉素。
分化培养基组成：
大量元素(mg/L)
NH4NO3                1650
KNO3                  1900
CaCl2·2H2O           440
MgSO4·7H2O           370
KH2PO4                170
微量元素(mg/L)
KI                    0.83
H3BO3                 6.2
MnSO4·4H2O           22.3
ZnSO4·7H2O           8.6
Na2MoO4·2H2O         0.25
CuSO4·5H2O           0.025
CoCl2·6H2O           0.025
铁盐(mg/L)
FeSO4·7H2O           27.85
Na2-EDTA·2H2O        37.25
有机成分(mg/L)
肌醇                  100
烟酸(维生素B5)        0.5
盐酸吡哆醇(维生素B6)  1
盐酸硫胺素(维生素B1)  0.5
甘氨酸                2
酪蛋白水解物0.5g/L，蔗糖30g/L，6-BA 2mg/L，NAA 0.5mg/L，KT 0.5mg/L，植物凝胶(Phytagel)3g/L，潮霉素B 50mg/L，头孢霉素200mg/L，其余为水，pH 5.8。
同时设转空载体pCam13OX对照。
3、pGL1RNAi植株OsGL1表达量的定量检测：
取转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片，提取总RNA，采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke，RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物，以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。通过semi-qPCR扩增反应比较转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片cDNA中OsGL1基因的表达量，以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照。扩增OsGL1基因用引物对primer 5(5’-ACCCCAACGTACCACACGAT-3’)和primer 6(5’-ACCCCTGCGCTGGTTTTCTT-3’)。扩增Ubiquitin基因用引物对primer 7(5’-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’)和primer8(5’-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’)。
PCR扩增反应条件如下：反应体积20μl，其中含有：模板(cDNA)1μl(25ng)，正向引物、反向引物终浓度各0.2μM，dNTP终浓度各200μM，Taq DNA聚合酶1U，10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μl，用双蒸水补足至20μl体积。
反应温度、时间：94℃，变性5分钟；然后94℃变性25秒，58℃退火25秒，72℃延伸25秒，扩增若干个循环；最后在72℃下延伸5分钟。
扩增循环数：OsGL1基因30个循环；Ubiquitin基因25个循环。
结果显示以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照，转pGL1RNAi植株中OsGL1基因的表达明显下调，确实达到了干扰的效果。图7为野生型(WT)和转pGL1RNAi植株OsGL1的基因表达量；上为OsGL1基因的表达量，下为对照Ubiquitin(UBQ)基因的表达量；左为野生型材料日本晴(WT)抽穗期叶片的cDNA，右为转pGL1RNAi植株抽穗期叶片的cDNA。转空载体植株与野生型植物的OsGL1表达量无显著差异。
4、观察移入大田后的植株的表型
以野生型日本晴作为对照，观察植株各个时期的、下雨或者人工淋雨后的叶片表面蜡质表型。
实验设3次重复。
结果：得到的转基因植株在幼苗期即显示出蜡质缺失叶片亲水的表型，随着植株生长，蜡质缺失叶片亲水的表型逐渐明显，到抽穗期时，整个叶面几乎都表现出蜡质缺失叶片亲水的表型；而野生型对照在整个生长时期均没有蜡质缺失叶片亲水的表型(图6，A为植株，B为叶片)。图6中，左图为野生型，右图为转pGL1RNAi植株。而空载体pCam13OX对照的转基因植株与野生型表型相同。
获得的干扰植株由于蜡质含量较少，有利于GUS染色液的吸附和渗透，这非常方便于外源基因在叶片表达情况的GUS染色检测，同时，由于其来源于日本晴背景，转化效率比较高，因此是理想的检测外源基因在叶片等组织中表达的转基因实验材料。
Figure IDA0000041300230000011
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Claims (10)

1.一种RNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.表达权利要求1所述RNA分子的重组干扰载体。
3.根据权利要求2所述的重组干扰载体，其特征在于：所述重组干扰载体按照包括如下步骤的方法得到：将SEQ ID NO：3所示DNA片段插入出发载体的多克隆位点，得到所述重组干扰载体。
4.根据权利要求2或3所述的重组干扰载体，其特征在于：所述出发载体为pCam13OX；
所述pCam13OX按照包括如下步骤的方法制备得到：将CaMV35S启动子片段插入载体pCAMBIA1300的Pst I和Hind III的识别位点间，得到的重组载体记作pCam13OXM；将Nos终止子片段插入载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间，得到的重组载体即为pCam13OX。
5.一种培育蜡质减少的转基因植物的方法，包括如下步骤：使出发植物中的SEQID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失，得到蜡质减少的转基因植物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述使出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的功能丧失的方法为抑制出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因表达；
所述抑制出发植物中的SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因表达的方法包括如下步骤：向所述出发植物中导入权利要求2-4中任一所述重组干扰载体。
7.SEQ ID NO：1所示蛋白或SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因在调节植物中蜡质形成中的应用；SEQ ID NO：1所示蛋白或SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因在培育耐旱植物中的应用。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述蜡质为植物表皮蜡质；所述植物为单子叶植物。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述植物表皮蜡质为植物叶片表面蜡质；所述单子叶植物为水稻。
10.根据权利要求5-9中任一所述的方法或应用，其特征在于：所述SEQ ID NO：1所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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