CN113355335A

CN113355335A - 二色补血草基因LbHLH及其应用

Info

Publication number: CN113355335A
Application number: CN202110654718.2A
Authority: CN
Inventors: 王茜; 袁芳; 王宝山
Original assignee: Shandong Normal University
Current assignee: Shandong Normal University
Priority date: 2021-06-11
Filing date: 2021-06-11
Publication date: 2021-09-07

Abstract

本发明提供二色补血草基因LbHLH及其应用。本发明从泌盐盐生植物二色补血草中克隆得到LbHLH基因全长。LbHLH包含一个2067bp的开放阅读框，编码由688个氨基酸组成的蛋白质。LbHLH在氨基酸480～526之间有一个典型的螺旋‑环‑螺旋(HLH)结构域，实验表明，异源表达该基因的拟南芥植株表现出促进表皮毛发育、根毛发育减少和耐盐性增强。酵母双杂交实验显示，LbHLH与AtGL1相互作用。基因LbHLH可能在毛状体和根毛的分化以及抗盐性中发挥重要作用。

Description

二色补血草基因LbHLH及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体地说，涉及二色补血草基因LbHLH及其应用。

背景技术

根据联合国粮食及农业组织(FAO)的数据，全世界有9.5亿公顷土地受到土壤盐分的影响，占世界总土地面积的6.5％以上，全世界近一半的灌溉土壤受到盐碱化的影响。盐碱化的加剧，耕地面积减少，严重影响了粮食生产和粮食安全。因此，开发利用盐碱地显得尤为迫切。传统的盐碱地改良方法，如淡水加压法和暗管排水法，成本高昂，会导致土壤次生盐渍化[8]。因此，开发生物学方法改良盐碱地至关重要。

盐生植物能够在含盐的盐碱生境(≥200mM NaCl)中正常生长并完成其生命周期。盐生植物根据其离子积累和转运的机制分为三类：(1)真盐生植物(稀盐盐生植物)，如盐地碱蓬。能够在液泡中螯合盐离子；(2)假盐生植物(拒盐盐生植物)，如芦苇。能够阻止盐进入细胞；(3)泌盐盐生植物，如二色补血草(Limonium bicolor)，可以向外界环境分泌盐。与其他盐生植物不同，泌盐盐生植物具有特殊的结构，包括盐囊泡和盐腺，它们从植物中收集或分泌盐以避免盐胁迫。其中盐囊泡会积累盐，而盐腺则会主动将多余的盐排出体外。

二色补血草是一种典型的泌盐盐生植物，其茎和叶上均有盐腺的分布，能够分泌过多的盐离子。因此二色补血草被认为是改良盐碱地的先锋植物。在荧光显微镜下很容易观察到这种植物的盐腺，因为它们表现出蓝色的自发荧光。二色补血草第一片真叶的发育可分为五个阶段：未分化阶段(A)、盐腺分化阶段(B)、气孔分化阶段(C)、表皮细胞分化阶段(D)和成熟阶段(E)。

对这些发育时期的叶片进行转录组分析，发现了许多与盐腺分化有关的各种基因。其中一些基因与其他植物中与表皮毛发育相关的基因高度同源，如GLABRA1(GL1),TRANSPARENT TESTA GLABRA1(TTG1),GLABRA3(GL3),ENHANCER OF GLABRA 3(EGL3),SUPERSENSITIVE TO ABA AND DROUGHT2(SAD2),TRIPTYCHON(TRY)和CAPRICE(CPC)。其中一些基因的功能已经通过在拟南芥中的异源表达得到证实。例如，LbTTG1或LbSAD2的异源表达促进了拟南芥的表皮毛的发育并提高了抗盐性；LbTRY的异源表达促进了根毛的发育并提高了盐敏感性。这些发现均表明盐腺和表皮毛可能是起源于同一祖先的同源器官。

转录组分析还发现了另一部分在盐腺发育阶段高度表达但具体功能未知的候选基因。鉴于目前没有任何一个已公开基因组序列的植物具有盐腺结构，因此这些未注释的基因被认为是二色补血草所特有的，并且很有可能在盐腺的发育中发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供二色补血草基因LbHLH及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供二色补血草基因LbHLH，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(b)SEQ ID NO:1所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。

从二色补血草中克隆得到LbHLH基因全长。LbHLH包含一个2067bp的开放阅读框，编码由688个氨基酸组成的蛋白质。LbHLH在氨基酸480～526之间有一个典型的螺旋-环-螺旋(HLH)结构域，除此之外还有三个低复杂度区域。

基因LbHLH编码的蛋白是一种定位于盐腺的功能未知的蛋白质，在叶片发育早期表达量最高。在拟南芥中，LbHLH的过表达通过与AtGL1相互作用诱导与毛发和根毛发育相关基因的表达。此外，LbHLH主要通过缓解高NaCl引起的渗透胁迫来提高耐盐性。

第二方面，本发明提供二色补血草基因LbHLH启动子，其序列为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且具有相同功能的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:2所示序列杂交且具有相同功能的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同功能的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供含有所述基因LbHLH或所述启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第四方面，本发明提供所述启动子在调控下游基因表达中的应用，所述下游基因包括但不限于基因LbHLH，报告基因GUS、GFP等。

第五方面，本发明提供所述基因LbHLH、所述启动子或含有所述基因LbHLH或所述启动子的生物材料在制备转基因植物中的应用。

第六方面，本发明提供所述基因LbHLH或含有基因LbHLH的生物材料的以下任一应用：

(1)用于促进植物表皮毛(植物地上部分表皮毛，地上毛)生长发育；

(2)用于抑制植物根毛(植物地下部分根毛，地下毛)生长发育；

(3)用于促进植物根系生长发育；

(4)用于提高植物发芽率；

(5)用于促进植物子叶生长发育；

(6)用于提高植物耐盐性；

(7)用于提高植物对渗透胁迫的耐受性；

(8)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

(9)用于提高植物脯氨酸含量；

(10)用于降低植物丙二醛(MDA)含量；

(11)用于植物品种改良。

本发明中，所述植物包括但不限于泌盐盐生植物(如二色补血草)、拟南芥。

本发明中，所述渗透胁迫可以是由环境中的NaCl、甘露醇所导致的渗透胁迫。NaCl的浓度范围为0.01～150mM，甘露醇的浓度范围为0.01～180mM。

第七方面，本发明提供一种使植物表皮毛数量增加、根毛数量减少、根系变长、发芽率提高、子叶生长速率提高、耐盐性提高、渗透胁迫耐受性提高、脯氨酸含量提高、丙二醛含量下降的方法，所述方法选自如下①或②：

①使植物表达所述基因LbHLH编码的蛋白；

②在植物中过表达所述基因LbHLH。

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子。

第八方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因植物的以下任一应用：

i.用于植物育种；

ii.用于盐碱地种植。

所述育种方法包括但不限于转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第九方面，本发明提供所述基因LbHLH编码的蛋白与植物表皮毛和根毛发育相关基因编码的蛋白之间的互作的以下任一应用：

A、用于调控植物表皮毛和根毛生长发育；

B、用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育。

所述植物表皮毛和根毛发育相关基因包括但不限于GL1。

第十方面，本发明提供6-苄氨基嘌呤(6-BA)在诱导植物基因LbHLH表达中的应用。

本发明首次从二色补血草中克隆得到基因LbHLH并分析了其生物学功能，该基因在二色补血草盐腺发育早期大量表达且功能未知的基因Lb1G04899。基因LbHLH编码的蛋白具有典型的螺旋-环-螺旋(helix-loop-helix)结构域。实验表明，异源表达该基因的拟南芥植株表现出促进表皮毛发育、根毛发育减少和耐盐性增强。酵母双杂交实验显示，LbHLH与AtGL1相互作用。基因LbHLH可能在毛状体和根毛的分化以及抗盐性中发挥重要作用。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中LbHLH的生物信息学分析结果。(A)：DNAMAN分析LbHLH的核苷酸和推导的氨基酸序列；(B)：LbHLH的保守结构域，包括位于氨基酸480-526的HLH结构域，用SMART绘制；(C)：通过NCBI-BLAST分析发现LbHLH与其他物种最密切相关基因之间的相似性(％)。所有基因与LbHLH的相似性均<30％。

图2为本发明较佳实施例中LbHLH在二色补血草中的亚细胞定位和表达分析结果。(A)：洋葱表皮细胞35S:：LbHLH-GFP亚细胞定位分析。GFP-LbHLH融合蛋白在细胞核中表达。35S:：GFP被用作空载对照。Bar＝50μm。DAPI在细胞核中表现为蓝色荧光，FM4-64在质膜上呈红色荧光。(B)：不同发育阶段和不同处理的叶片中LbHLH表达水平的变化。A：A时期，未分化，播种后4-5天；B：B时期，盐腺分化，播种后6-7天；C：C时期，气孔分化，播种后8-10天；D：D时期，表皮分化，播种后11-16天；E：E时期成熟，播种后17天以上；成熟叶：完全伸展的叶片；NaCl：E期幼苗经200mM NaCl处理24h后的成熟叶片；6-BA：0.04mg/L 6-BA上生长的E期幼苗成熟叶片；ABA：E期幼苗在0.1mg/L ABA上生长的成熟叶片。从E期苗木中采集根和茎。数据是三个重复的SD；不同字母的差异在P＝0.05，根据邓肯的多范围检验。(C)：利用二色补血草的发育叶进行LbHLH的原位杂交。

图3为本发明较佳实施例中LbHLH启动子的元素和活性分析结果。(A)：使用PlantCARE预测LbHLH启动子中的元素(用软件CSDS 2.0绘制)。(B)：pLbHLH：：GUS转化拟南芥幼苗的LbHLH启动子活性分析。GUS染色(蓝色)主要见于叶脉。

图4为本发明较佳实施例中Col-35S:：LbHLH植物的鉴定和分析结果。(A)：Col-35S：：LbHLH株系基因组DNA的PCR；泳道1-4和7-10，不同的转基因系；5泳道，空白对照，以ddH2O为模板；泳道6，阴性对照，以野生型DNA为模板。(B)：qRT-PCR检测LbHLH在Col-35S：：LbHLH中的表达水平。数据是三个重复的标准差；根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

图5为本发明较佳实施例中Col-35S:：LbHLH植物的表皮毛观察分析结果。(A)：Col-0野生型(WT)和Col-35S::LbHLH(OE4、OE26和OE40)前两片真叶上的表皮毛。图片显示为2周大的土培幼苗。(B)：WT、OE4、OE26和OE40植株前两片真叶上的表皮毛数。数据是平均值±20株植物的SD值；根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

图6为本发明较佳实施例中Col 35S::LbHLH植物根毛分析结果。(A)：WT和Col35S::LbHLH(OE4、OE26和OE40)植物在1/2MS培养基上培养5天后的根毛表型(B)选择每根1cm的部分(距根尖0.5-1.5cm)测量每种株系20株植物的根毛数。数据是平均值±20株植物的SD值；根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

图7为本发明较佳实施例中qRT-PCR分析了5日龄幼苗根毛发育相关基因的表达水平，包括10个命运决定基因(AtTTG1、AtTRY、AtCPC、AtGL3、AtGL1、AtGL3、AtSAD2、AtGL2、AtMYB23和AtZFP5)、2个根毛起始基因(AtRHD6和AtRSL1)和1个根毛伸长基因(AtLRL1)。根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

图8为本发明较佳实施例中LbHLH与AtGL1或AtGL3相互作用的酵母双杂交分析。(A)：Y2H金酵母自激活及相互作用的验证。AD+53:AD-T+BD-53(阳性对照)；AD+Lam:AD-T+BD-Lam(阴性对照)；AtGL1+BD:AD-AtGL1+BD(AtGL1自激活试验)；AtGL3+BD:AD-AtGL3+BD(AtGL3自激活试验)；LbHLH+AD:BD-LbHLH+AD(LbHLH自激活试验)；AtGL1+LbHLH:AD-AtGL1+BD-LbHLH(互作试验1)；AtGL3+LbHLH:AD-AtGL3+BD-LbHLH(互作试验2)。(B)：酵母在SD/-Leu/-Trp培养基上的转化。(C)：SD/-Leu/-Trp/X-a-gal/ABA(200ng/mL)和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal/ABA(200ng/ml)培养基上的自激活和相互作用试验。

图9为本发明较佳实施例中35S::LbHLH转基因株系盐耐受性情况。(A)：LbHLH在二色补血草中的表达模式。在100mM NaCl处理后，不同时间处理(0、12、24、48和72h)后的二色补血草；以0h NaCl处理为对照(相对表达水平＝1)。(B)：35S::在不同浓度NaCl(0、50、100和150mM)的培养基上生长5天的LbHLH幼苗。(C)：不同NaCl处理下萌发和幼苗生长的分析。播种后48h和5d测定萌发率。每株种子30粒，重复3次。萌发率数据为平均值±30株植物的SD。在不同培养基上播种3天后，计算子叶生长速率(以出现子叶的植株百分比表示)。每株种子30粒，重复3次。子叶生长速率数据为平均值±30株植物的SD。应用ImageJ软件测定了5日龄幼苗的根长。对30株幼苗进行了分析。根长度数据是平均值±30株植物的SD。不同字母的差异在P＝0.05，根据Duncan的多范围检验。

图10为本发明较佳实施例中对照和100mM NaCl生长条件下35S::LbHLH系的Na⁺、K⁺、MDA和脯氨酸含量分析结果。在两周龄的幼苗上进行测量，每个品系进行五次重复。数据是平均数±五个重复的SD值；根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

图11为本发明较佳实施例中LbHLH通过减轻拟南芥的渗透胁迫来增强耐盐性。(A)：在含有180mM甘露醇、10mM氯化锂、100mM氯化钠的培养基上生长5天的幼苗。(B)：在不同培养基上播种后每天计算，萌发率。每个处理每行播30粒种子，进行3次重复。数据是平均数±30株植物的SD值。(C)：用ImageJ软件测定5日龄幼苗的根长。每行分析30株幼苗。数据是平均数±30株植物的SD值；根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

图12为本发明较佳实施例中用qRT-PCR方法检测基因AtSOS1、AtSOS3、AtP5CS1和AtP5CS2的相对表达水平。进行3个生物学重复(单独实验)；根据Duncan的多重范围检验，不同小写字母表示P＝0.05的显著差异。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的植物材料和生长条件：

采集黄河三角洲(中国山东省)的盐碱地(N37°20'；E118°36')上的二色补血草种子。干燥的种子在4℃下贮藏至少6个月再进行使用，使用前，用70％乙醇对种子进行表面消毒5min，然后用6％(v/v)NaClO(Sigma，USA)震荡消毒17min。消毒后的种子用无菌蒸馏水洗涤5次，再在无菌水中静置20min，然后播种在MS基本培养基上。培养条件是28±3℃/23±3℃(白天/夜晚)，光照强度为600μmol/m²/s(15小时光周期)和65％相对湿度。

使用的拟南芥生态型Col-0(Columbia-0)种子由山东省逆境植物重点实验室提供。种子的采集和试验研究均符合国家有关规定。将拟南芥生态型Col-0种子用70％乙醇表面消毒3次，每次4min；再用95％乙醇表面消毒3次，每次4min。消毒后的种子用无菌蒸馏水洗净，在1/2MS培养基上播种。在4℃春化两天后，在22℃/18℃温度，16h/8h(光/暗)循环下，亮度为150μmol/m²/s和70％相对湿度的环境中培养。为了促进农杆菌的侵染和转化，将幼苗在1/2MS培养基上培养一周，然后移栽到充满了营养丰富的土壤(营养土：蛭石：珍珠岩，体积比为3:1:1)的花盆中(9cm高×9cm直径)。

以下实施例中采用的统计分析方法：使用SPSS确定P＝0.05(Duncan多重范围检验)的统计显著性。方差分析与正交对照和平均值比较程序被用来检测不同处理之间的显著差异。

实施例1LbHLH基因的克隆、生物信息学分析、亚细胞定位及原位杂交

1、LbHLH基因的克隆及生物信息学分析

大量收集叶片发育不同时期的第一片真叶，包括未分化期(A期；播后4-5天，5000叶)，盐腺分化期(B期；播后6-7天，4000叶)，气孔分化期(C期；播后8-10天，3000叶)，表皮细胞分化期(D期；播后11-16天，1000叶)，成熟期(E期；播种后17天以上，1000叶)。

用植物总RNA提取试剂盒(RC401-01；诺唯赞生物科技有限公司)提取二色补血草的总RNA。根据已报道的二色补血草的转录组组装序列中获得的LbHLH序列作为参考，用Primer 5.0设计引物LbHLH-S和LbHLH-A(表1)克隆全长LbHLH。利用在线工具SMART对LbHLH的保守域进行预测(http://smart.embl-heidelberg.de/)。

基因LbHLH包含一个2067bp的开放阅读框，编码由688个氨基酸组成的蛋白质(图1A)。LbHLH在氨基酸480～526之间有一个典型的螺旋-环-螺旋(HLH)结构域，除此之外还有三个低复杂度区域(图1B)。经NCBI-BLAST分析，未检测到与LbHLH具有30％以上相似性的基因(图1C)。

2、LbHLH的亚细胞定位

LbHLH的亚细胞定位是通过使用含有GFP位点的表达载体转化洋葱表皮细胞来确定的。先用SalI限制酶将pCAMBIA1300环状载体进行酶切形成线性载体。并设计带有SalI酶切位点的引物LbHLH OE-S和LbHLH OE-A(表1)，再通过PCR获得LbHLH的全长。在CaMV 35S强启动子的控制下，利用同源重组试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)将携带SalI酶切位点的LbHLH全长编码序列(CDS)与pCAMBIA1300线性载体连接成环状质粒。再利用农杆菌GV3101将pCAMBIA1300-LbHLH重组载体转化进入洋葱表皮细胞。在光照下培养两天后，在TCS S8-MP双光子激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica)下检测LbHLH的GFP荧光信号。用DAPI染色液定位细胞核，在358nm的激发光下观察。用FM4-64定位质膜，并在559nm激发下观察。

用携带p35S：：LbHLH-GFP的农杆菌转化洋葱表皮细胞。如图2A所示，与DAPI和FM4-64染色位置相比，LbHLH-GFP仅位于细胞核内，而未融合的GFP位于细胞核内和质膜上。进一步地，分析了LbHLH在二色补血草不同发育阶段和不同处理下表达量水平(图2B)。LbHLH在A期叶片中表达量最高，在根中表达量最低，除此之外6-BA能诱导LbHLH的表达。

3、二色补血草的表达量分析及原位杂交

鉴于LbHLH在盐腺发育早期高表达，本发明进行了原位杂交以确定LbHLH是否定位于二色补血草的盐腺上。

大量收集在MS培养基上生长的二色补血草的茎、根、老叶和A-E期时期的第一片真叶以及不同处理下(100Mm NaCl，0.04mg/L 6-BA和0.1mg/L ABA)的幼苗进行总RNA的提取。使用Beacon Designer软件(7.8版)设计荧光定量RT-qPCR引物LbHLH-RT-S和LbHLH-RT-A(表1)。RT-qPCR反应体系共20μl，包括10μl SYBR qPCR主混合物(诺唯赞生物科技有限公司)，0.2μM引物和300ng cDNA按照以下条件进行：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。二色补血草基因Lbtubulin(引物Lbtubulin-RT-S和Lbtubulin-RT-A，表1)作为内参对照。使用公式2^–ΔΔC(T)计算LbHLH在不同组织和不同处理幼苗中的相对表达水平，以水平最低的根中的表达水平为对照(设为1)，进行三个生物学重复。

为了进一步探讨LbHLH在二色补血草中的表达模式。将二色补血草萌发5-8天的第一片真叶收集并固定起来用于原位杂交。具体地，将叶片固定在4％多聚甲醛中，包埋在石蜡中，并用酒精系列脱水。组织薄片(8μm)用蛋白酶K处理，并在6ng/μL杂交溶液中37℃过夜。地高辛标记的LbHLH探针(5'-DIG-cuccuaacuucagauccagccc-3'，经高效液相色谱纯化)呈蓝紫色。

实验结果显示，在盐腺中检测到杂交信号(图2C)，表明LbHLH在盐腺发育和分化中起作用。

实施例2基因LbHLH启动子的克隆及组织化学分析

使用植物DNA提取分离试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)获得二色补血草的总DNA，以二色补血草基因组中LbHLH的全长启动子序列作为参考，以提取的二色补血草的DNA为模板，用引物LbHLH-P-S和LbHLH-P-A(表1)克隆获得LbHLH的全长启动子序列。利用PlantCARE对启动子中的元件进行了预测(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)并使用CSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)绘制了元件示意图。

为了用LbHLH启动子替换掉pCAMBIA3301中的35S启动子，使用限制酶HindIII和NcoI利用双酶切方法从pCAMBIA3301中切除CaMV 35S启动子获得线性载体，并使用引物3301-LbHLH-P-S和3301-LbHLH-P-A(表1)克隆得到含有HindIII和NcoI酶切位点的LbHLH启动子，将线性载体pCAMBIA3301和插入的LbHLH启动子用融合HD克隆试剂盒(Takara)连接在一起，构建重组载体。

将重组质粒转化进入农杆菌感受态细胞中，并侵染野生型拟南芥Col-0，得到Col::pLbHLH-GUS。用除草剂(Bsata除草剂，购自Coolaber，主要成分为草铵膦，0.1％，v/v)筛选转基因苗得到T3代纯合植株用于组织化学染色。将10日龄幼苗浸泡在GUS染色液中，37℃过夜孵育。再用70％乙醇洗脱2-3次，对染色植物材料进行脱色，并在解剖显微镜下观察(日本尼康)。

最终获得长度为2058bp的启动子序列。如图3A所示，LbHLH启动子富含典型的TATA盒和CAAT盒元件，并含有各种应激反应元件，如ABRE和ARE。MYB结合位点表明LbHLH可能受MYB型转录因子的调控。为了验证LbHLH的表达位点，我们构建了pLbHLH：：GUS，并用该重组载体转化了拟南芥。GUS染色模式分析显示LbHLH在拟南芥叶脉中表达(图3B)。

实施例3 Col-35S：：LbHLH转基因植物的构建

使用携带NcoI酶切位点的引物LbHLH-OEAt-S和LbHLH-OEAt-A(表1)克隆得到LbHLH的全长CDS，同时利用限制酶NcoI单酶切pCAMBIA3301得到线性载体，利用同源重组试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)将线性载体pCAMBIA3301和LbHLH的全长CDS连接在一起产生p35S：：LbHLH。将p35S：：LbHLH导入农杆菌GV3101，转化拟南芥Col-0。用除草剂(Bsata除草剂，主要成分为草铵膦，0.1％，v/v)筛选3代后，得到阳性转基因株系并对Col-35S：：LbHLH过表达株系进行生理测定。

先用引物LbHLH-OEAt-S和LbHLH-OEAt-A对阳性转基因植株进行分子水平上的鉴定。然后按照说明书，使用植物总RNA提取试剂盒从不同的Col-35S:：LbHLH转基因株系中提取mRNA。利用引物LbHLH RT-S和LbHLH RT-A，通过qRT-PCR分析不同Col-35S：：LbHLH转基因株系中的LbHLH表达水平(表1)。鉴于在拟南芥中未检测到LbHLH的同源基因，因此将具有最低LbHLH表达水平的转基因株系(OE35)用作对照(相对表达水平设为1)来计算Col-35S：：LbHLH转基因株系中LbHLH的表达水平。每组进行三个生物学重复。根据LbHLH的表达水平，保留了3个Col-35S：：LbHLH过表达株系(高表达OE40、中表达OE26和低表达OE4)进行表型分析和生理鉴定。

实施例4 Col-35S：：LbHLH中毛发/根毛相关基因的表型观察及表达分析

为了探索LbHLH在表皮毛和根毛形成中的作用，在拟南芥生态型Col-0中异源表达了LbHLH。鉴定了8个含有Col-35S：：LbHLH的株系(图4A)，并通过qRT-PCR分析了它们的基因表达水平(图4B)。选择具有低、中、高LbHLH表达水平的系OE4、OE26和OE40进行表型观察。

在解剖显微镜下(日本尼康)对一周龄幼苗(三个过表达株系OE4、OE26、OE40和野生型拟南芥)的第一片真叶上的表皮毛以及5日龄幼苗根尖上方0.5cm～1.5cm的根毛进行观察。并用ImageJ软件计算表皮毛数和根毛数。每种株系至少观察20株幼苗。

提取在1/2MS培养基上生长1周的幼苗的RNA。应用荧光定量实时PCR方法检测了10个参与表皮毛分化和根发命运决定的基因的表达水平，包括表皮毛发育和根毛命运决定相关基因AtTTG1,AtTRY,AtCPC,AtEGL3,AtGL1,AtGL3,AtSAD2,GLABRA 2(AtGL2),MYB DOMAINPROTEIN 23(AtMYB23)和ZINC FINGER PROTEIN 5(AtZFP5)。根毛发育起始基因ROOT HAIRDEFECTIVE 6(AtRHD6)、RING FINGER OF SEED LONGEVITY 1(AtRSL1)和根毛延伸基因LJRHL1-LIKE 1(AtLRL1)。表1中列出了qRT PCR中使用的所有引物序列，命名为基因名-RT-Sense(基因名-RT-S)和基因名-RT-反向(基因名-RT-A)(例如AtEGL3-RT-S和ATEGL3-RT-A)。以AtActin(引物AtActin-RT-S和AtActin-RT-A)作为内参对照；进行三次生物学重复。

比较了野生型(WT)、OE4、OE26和OE40的第一片真叶上的表皮毛数量，发现Col-35S:：LbHLH过表达系包含的表皮毛明显多于野生型(图5A)。此外，LbHLH的表达水平对表皮毛的数量有剂量效应(图5B)，即LbHLH的表达水平越高，产生的表皮毛越多。以上实验结果表明，LbHLH促进表皮毛发育。

相同的基因参与了表皮毛和根毛发育的起始，但它们在这些过程中起着相反的作用。进一步地，计算了每种株系的根毛。Col-35S：：LbHLH过表达株系产生的根毛比WT少(图6A)，并且这种表型也显示出剂量效应，因为根毛的数量随着LbHLH表达水平的提高而减少(图6B)。这些结果表明LbHLH对根毛发育有抑制作用。

实施例5酵母双杂交法检测LbHLH的自激活并鉴定候选LbHLH相互作用蛋白

鉴于LbHLH的异源表达增加了拟南芥的表皮毛数量，减少了根毛数量，进一步分析了这些株系中与表皮毛和根毛发生和发育相关的基因的表达水平，包括AtTTG1，AtTRY，AtCPC，AtEGL3，AtGL1，AtGL3，AtSAD2，AtGL2，AtMYB23，ATRL1，AtRHD6，AtRSL1和AtZFP5(图7)。大多数基因在OE40中的表达水平最高，而WT和OE4之间的表达水平没有显著差异。在这些基因中，AtGL1和AtGL3在OE26和OE40中的表达水平最高，因此，LbHLH很可能与AtGL1或AtGL3相互作用，从而影响毛发和根毛的发育。

使用携带NdeI酶切位点的引物BD-LbHLH-S和BD-LbHLH-A(表1)得到LbHLH全长，并用同种NdeI限制酶酶切pGBKT7(BD)载体使其线性化，利用同源重组试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)将线性载体和目的片段连接在一起形成BD-LbHLH重组载体。采用相同的方法，使用pGADT7(AD)和带有NdeI酶切位点的引物AD-AtGL1-S、AD-AtGL1-A、AD-AtGL3-S和AD-AtGL3-A构建形成了重组载体AD-AtGL1和AD-AtGL3(表1)。

为了在体外验证LbHLH和AtGL1、LbHLH和AtGL3之间的相互作用，进行了酵母双杂交试验(图8A)。所有菌落在SD/-Leu/-Trp培养基上正常生长，表明酵母转化成功(图8B)。当在SD/-Leu/-Trp/X-a-gal/ABA和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal/ABA培养基上生长时，只有阳性对照和BD-LbHLH&AD-AtGL1变蓝并显示正常生长(图8C)，而BD-LbHLH&AD-AtGL3不生长。并且未检测到LbHLH的自激活。以上实验结果表明，LbHLH与根毛发育所需的MYB蛋白AtGL1有强烈的相互作用，使得转基因株系中根毛的形成受到显著抑制。

设计了七组实验来验证LbHLH和AtGL1、AtGL3之间的相互作用：BD-53和AD-T(阳性对照)、BD-Lam和AD-T(阴性对照)、BD和AD-AtGL1(验证AtGL1自激活)、BD和AD-AtGL3(验证AtGL3自激活)、BD-LbHLH和AD(验证LbHLH自激活)，BD-LbHLH和AD-AtGL1(验证LbHLH和AtGL1之间的相互作用)和BD LbHLH和AD-AtGL3(验证LbHLH和AtGL3之间的相互作用)。按照说明书，使用Yeastmaker酵母转化系统将质粒分别转化到Y2H酵母(Saccharomycescerevisiae)细胞中。所有实验组首先在SD/-Leu/-Trp培养基上进行，根据菌落的存在来确定转化步骤成功与否。再在SD/-Leu/-Trp/X-a-gal/ABA(200ng/ml)和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-gal/ABA(200ng/ml)培养基上进一步验证。培养2天后，根据菌落的生长状况和蓝色的有无来确定LbHLH是否有自激活和验证可能的相互作用。

实施例6测定NaCl处理二色补血草时间进程中LbHLH的表达水平、耐盐指标和生理指标

由于LbHLH的异源表达减少了拟南芥根毛的数量，为进一步探讨这种表型是否与耐盐性有关。进一步检测了LbHLH在二色补血草被100mM NaCl处理的时间过程中的表达水平(图9A)。与NaCl处理开始时LbHLH的表达水平相比，NaCl处理12h后LbHLH的表达显著增加，但24h后又恢复到较低水平。这些结果表明LbHLH的表达受NaCl的调控，有可能是由于NaCl带来的渗透作用。

接下来，通过将转基因拟南芥种子播种在含有NaCl浓度梯度的培养基上，研究了转基因拟南芥种子在萌发和植株早期生长过程中的耐盐性。正如所料，在高盐条件下，转基因株系表现出比野生型更好的生长(图9B)，并且OE40(具有最高的LbHLH表达水平)生长最好。与野生型相比，所有三个Col-35S:：LbHLH系在播种后48小时表现出较高的发芽率(图9C)，特别是在100mM NaCl处理下，OE系的发芽率是野生型的两倍以上。在150mM NaCl处理下，效果更为明显，因为只有少数OE26种子发芽，其他株系没有。培养5d后，在0和50mm NaCl处理下，株系间无明显差异；然而，在100和150mM NaCl处理下，转基因株系的发芽率显著高于野生型(图9C)。

子叶的生长速率表现出相似的趋势(图9C)。在50和100mM NaCl处理下，Col-35S:：LbHLH系的子叶生长明显好于野生型，随着NaCl浓度的增加，根系生长受到抑制，但在每一NaCl浓度下，Col-35S:：LbHLH系的根系都比野生型根系长。

为了确定转基因株系耐盐性增强的可能原因，测定了0和100mM NaCl处理下植物的各种生理指标(图10)。在100mM NaCl处理下，OE40积累的Na⁺最少，脯氨酸和K⁺最多，而野生型的结果相反。在NaCl处理下，转基因株系的MDA含量低于野生型株系，说明过表达株系受到的伤害小于盐处理下的野生型株系。

二色补血草幼苗在土壤中培养20天后用100mM NaCl分别处理0、12、24、48和72小时，并在处理时间完成后立即取材，从每个样本中提取总RNA，并使用引物LbHLH-RT-S和LbHLH-RT-A(表1)进行qRT-PCR，以分析在100mM NaCl处理的时间长短进程中LbHLH的表达模式。

为了研究不同转基因株系间的耐盐性，将OE4、OE26、OE40和野生型(WT)拟南芥种子撒播在含1％琼脂的各种1/2MS培养基(分别含有0、50、100或150mM NaCl)上萌发。每天对发芽的种子进行计数，持续5天：从种皮中长出的胚根>1毫米的种子被视为已发芽。发芽率(％)＝发芽种子数/种子总数计算×100％.每个处理每种株系一次播种30粒种子，进行3个生物学重复。

绿色子叶的出现被当作子叶生长的指标。发芽3天后测定各株系子叶生长速率。子叶生长率(％)＝(有子叶的种子数/试验种子总数)×100％。每个盐处理每种株系分别进行3个生物学重复。在不同培养基上连续培养5d后，用ImageJ软件测定不同株系的根长。每个盐处理每种株系分别进行3个生物学重复。为了进一步验证转基因株系具有抗盐性，而不是种子自身发育带来的影响，将四种拟南芥种子先在普通1/2MS培养基上萌发4天后，得到大小几乎无差异的幼苗，再转移到分别含有0、50、100或150mM NaCl的培养基上培养5天，观察幼苗的长势，并拍照。

5日龄幼苗从1/2MS培养基上移栽到不同浓度NaCl(0或100mM NaCl溶于Hoagland溶液，pH6.2)灌溉的基质中。在对照或100mM NaCl处理后，分别收获两周龄幼苗的叶片(每个重复0.5g)。Na⁺、K⁺、脯氨酸和MDA含量的测量参见文献(Han G,Yuan F,Guo J,Zhang Y,Sui N,Wang B:AtSIZ1 improves salt tolerance by maintaining ionic homeostasisand osmotic balance in Arabidopsis.Plant Sci 2019,285:55-67；Guo J,Li Y,Han G,Song J,Wang B:NaCl markedly improved the reproductive capacity of theeuhalophyte Suaeda salsa.Funct Plant Biol 2018,45(3):350-361)。用火焰光度计(Cole Parmer，美国)测量离子浓度。每个生理指标进行五次重复。

为了进一步探索LbHLH是如何提高耐盐性，在含有180mM甘露醇(其具有与100mMNaCl相同的渗透势)和含有10mM LiCl(可诱导与100mM NaCl相同的离子胁迫)的培养基中培养了三个转基因拟南芥系和野生型WT(图11A)。在10mM LiCl处理下，所有株系均表现出相似的生长抑制水平，转基因株系中未检测到生长优势。然而，在等渗甘露醇处理下，过表达系表现出与在100mM NaCl处理下相同的生长趋势，即OE40具有最高的发芽率(图11B)和最长的根(图11C)。实验结果表明，在NaCl胁迫下，野生型植株同时受到渗透胁迫和离子胁迫，而LbHLH的异源表达显著提高了对渗透胁迫的抗性，使转基因株系在萌发期的表现优于野生型。

为了验证LbHLH缓解盐胁迫的效果，所有转基因株系在180mM甘露醇(引起与100mMNaCl相同的渗透压)中培养。培养5d后，测定发芽率和根长，比较离子胁迫和渗透胁迫对LbHLH表达的影响。同样地，为了排除种子自身发育带来的影响，将四种拟南芥种子先在普通1/2MS培养基上萌发4天后，得到大小几乎无差异的幼苗，再转移到180mM甘露醇和10mM氯化锂培养基上继续培养5天，观察幼苗的长势，并拍照。

实施例7转基因拟南芥盐胁迫相关标记基因的qRT-PCR分析

为了研究盐胁迫下基因的表达情况，所有株系在含0或100mM NaCl的1/2MS培养基中培养约10天后，使用植物总RNA提取试剂盒(诺唯赞生物科技有限公司)将两种处理下的几种拟南芥的RNA提取出来，并将RNA反转录成cDNA，用于qRT-PCR。

选择四个与胁迫抗性有关的标记基因进行qRT-PCR分析：SALT OVERLY SENSITIVE1(AtSOS1),AtSOS3,DELTA1-PYRROLINE-5-CARBOXYLATE SYNTHASE 1(AtP5CS1)和AtP5CS2(表1)。以AtACTIN为内对照。进行三个生物学重复。

为了从分子水平上探讨LbHLH转化能显著提高拟南芥耐盐性的原因，检测了这些植物在盐胁迫下标记基因的表达。AtP5CS1和AtP5CS2在Col-35S:：LbHLH株系中的表达水平远高于在WT株系中的表达水平，而在转基因株系中AtSOS1和AtSOS3的表达水平下降(图12)；这些表达水平与这些植物的脯氨酸积累水平(图10)和抗渗透胁迫水平(图11)相对应。

二色补血草是一种典型的具盐腺的泌盐盐生植物。二色补血草中越来越多的基因已经被证明参与了抗盐性，但所有这些基因都是已知功能基因的同源基因，如LbTTG1、LbTRY和LbSAD2。目前已公布基因组序列的植物均没有盐腺结构，因此，研究盐腺发育过程中表达的未知功能基因的功能对于了解盐腺发育和抗盐性具有重要意义。本发明基因LbHLH编码一种功能未知的蛋白，通过与拟南芥中的AtGL1相互作用，诱导与毛状体和根毛发育相关的基因表达。此外，LbHLH主要通过缓解高NaCl引起的渗透胁迫来提高耐盐性。

生物信息学分析表明LbHLH含有一个HLH(helix-loop-helix)结构域。HLH结构域主要在转录因子中检测到，如拟南芥中的OrbHLH2O和水稻中的SbHLH148。令人惊讶的是，目前研究发现LbHLH没有自激活活性(图8)。并且原位杂交结果表明，LbHLH在盐腺中有表达。由此认为LbHLH与盐生植物二色补血草中的其他转录因子或功能蛋白相互作用来调控盐腺发育。另外，LbHLH的异源表达导致拟南芥表皮毛的增加。根据以前报道的二色补血草在不同发育阶段(Yuan et al.，2015)，盐腺和表皮毛发育可能涉及到同源基因，具有相似发育模式。这些发现有力地说明LbHLH与盐腺发育直接相关，并解释了LbHLH异源表达影响拟南芥表皮毛发育的原因。

用酵母双杂交法检测了LbHLH与AtGL1的相互作用。在拟南芥中，AtGL1正向调节毛状体发育，gl1突变体在其叶表面缺乏毛状体。这些发现表明LbHLH通过直接与AtGL1相互作用来调节毛发和根毛的发育。有趣的是，该基因对地上毛和地下根毛的发育有相反的影响；也就是说，LbHLH通过与AtGL1相同的相互作用促进毛发发育并抑制根毛生长。但LbHLH在毛发和根毛发育中起相反的作用的确切机制还不清楚，有待进一步研究。

由于根毛直接参与离子的吸收，因此根毛发育的减少会影响耐盐性。正如预期的那样，Col-35S:：LbHLH株系比野生型拟南芥表现出更好的萌发。根毛数量的减少使得Col-35S:：LbHLH株系比WT吸收更少的Na⁺、遭受更少的离子胁迫和积累更少的MDA，在表达LbTTG1的拟南芥中也观察到这种表型。此外，在转基因株系中观察到一个典型的剂量效应：LbHLH的表达水平越高，株系的耐盐性越强。甘露醇和氯化锂分别被广泛用于模拟渗透和离子胁迫，这些物质的作用很容易根据表型来确定。Col-35S：：LbHLH株系对甘露醇的耐受性提高，而对LiCl的耐受性没有表现提高，表明转基因株系对NaCl胁迫的耐受性提高是由于对渗透胁迫的耐受性增强。在NaCl处理12h后，LbHLH的表达被高度诱导，表明该基因对短期渗透胁迫有反应，可能参与盐生植物的耐盐性。

本发明主要通过在模式植物拟南芥中异源表达LbHLH基因来研究LbHLH的功能。原位杂交和二色补血草在盐腺发育过程中的表达显示LbHLH在盐腺发育中起作用。因为有转化体系应用在二色补血草上，可以使用CRISPR介导的基因编辑来进一步研究LbHLH在二色补血草及其在盐腺发育中的作用。本发明成功揭示了二色补血草基因LbHLH的功能，为研究盐腺在盐胁迫中的作用和提高盐碱地利用奠定了基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

表1本发明所用的引物信息

序列表

<110> 山东师范大学

<120> 二色补血草基因LbHLH及其应用

<130> PI202110022

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 688

<212> PRT

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 1

Met Gly Ile Ile Ser Gln Glu Lys Ala Leu Asp Asn Leu Arg Lys Gln

1 5 10 15

Leu Gly Val Ala Val Arg Ser Val Gln Trp Ser Tyr Ala Ile Phe Trp

20 25 30

Ser Ser Ser Pro Ser Gln Pro Gly Val Leu Glu Trp Thr Glu Gly Tyr

35 40 45

Tyr Asn Gly Asp Ile Lys Thr Arg Lys Thr Ile Leu Ala Glu Asp Val

50 55 60

Asn Ala Asp Lys Leu Ser Leu Arg Arg Ser Glu Gln Leu Lys Asp Leu

65 70 75 80

Tyr Glu Ser Leu Leu Glu Gly Glu Ser Asp Leu Asp Ser Gly Gly Asn

85 90 95

Lys Arg Pro Ser Ala Ser Leu Ser Pro Glu Asp Leu Ser Asp Leu Glu

100 105 110

Trp Tyr Tyr Leu Val Cys Met Ser Phe Val Phe Thr Pro Gly Gln Gly

115 120 125

Leu Pro Gly Arg Val Leu Ala Ser Gly Arg Ser Ile Trp Leu Cys Asn

130 135 140

Ala Gln Asp Ala Asp Ser Lys Leu Phe Val Arg Ser Leu Leu Ala Lys

145 150 155 160

Ser Ala Ser Val Gln Thr Val Ile Cys Phe Pro His Ala Glu Gly Val

165 170 175

Leu Glu Leu Gly Ile Thr Asp Met Val Pro Glu Asp Pro Asn Leu Ile

180 185 190

Gln His Ile Arg Thr Ser Leu Leu Glu Phe Asp Lys Pro Val Cys Ser

195 200 205

Glu Lys Ser Ser Met Gln Arg Asn Thr Asp Tyr Asp Lys Asn Gly Ile

210 215 220

Gly Leu Thr Ile Pro Asp Glu Thr Asp His Glu Thr Ile Glu Pro Glu

225 230 235 240

Gln Gln Phe Thr Asn Leu His Pro Thr Ser Thr Lys Glu Ile Lys Phe

245 250 255

His Glu Glu Met Val Asn Glu Leu His Gly Thr Ala Thr Met Phe Glu

260 265 270

Asn Phe Asn Asn Asn Met Asp Asp Ser Pro Asp Asp Asp Cys Ser Asp

275 280 285

Met Cys Cys Gly Gly His Asn Leu Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Thr

290 295 300

Glu Asp Ser Phe Met Leu Asp Glu Thr Glu Ile Asp Asp Leu Ser His

305 310 315 320

Cys Phe His Asp Ser Ile Asp Ser Ser Gly Cys Ile Ser Gln Ala Phe

325 330 335

Glu Phe Gln Glu Lys Pro Leu Cys Ser Pro Lys Ser Lys Ser Val Tyr

340 345 350

Asn Arg Phe Gln Leu Gln Glu Leu Glu Val Phe Asn Pro Ala Arg Phe

355 360 365

Gly Ser Leu Gly Leu Gly Asn Cys Asn Asp Asp Glu Asp Leu His Tyr

370 375 380

Lys Arg Ile Val Ala Val Ile Leu Gln Ser Pro Ser Arg Trp Ser Phe

385 390 395 400

Lys Ser Arg Ser Ser Leu Gly Asn Ser Ser Arg Gly Ser Ser Phe Ile

405 410 415

Pro Trp Lys Arg Glu Ala Arg Val Gly Arg His Ser Ser Thr Val Pro

420 425 430

Val Gln Gln Arg Ala Leu Lys Lys Met Leu Phe Thr Val Pro Leu Met

435 440 445

Ile Gly Arg Thr Ala Val Lys Val Ala Lys Glu Lys Gln Asp Ala Arg

450 455 460

Asp Trp Lys Pro Gln Pro Pro Asp Ser Thr Arg Ala Arg Ser Asn Ile

465 470 475 480

Leu Ser Glu Lys Cys Arg Glu Asn Glu Lys Tyr Met Val Leu Gly Ser

485 490 495

Ile Ile Pro Ser Val Asn Lys Ile Asp Lys Thr Ser Ile Leu Asn Asn

500 505 510

Thr Ile Glu Tyr Leu Gln Glu Leu Glu Ala Arg Val Glu Glu Leu Glu

515 520 525

Ser Cys Ile Asn Val Ser Asp Ser Glu Ala Gly Thr Arg Arg Asn Lys

530 535 540

His Asn Met Asp Met Val Glu Gln Thr Ser Asp Asn Asn Tyr Asp His

545 550 555 560

Asn Asn Lys Asn Lys Ser Gly Arg Lys Phe Leu Leu Ser Lys Arg Lys

565 570 575

Ala Ser Asp Ile Asp Glu Lys Asp Thr Asp Asp His Pro Leu Gln Gln

580 585 590

Gln Cys Thr Thr Ser Thr Ile Pro Leu Asp Asp Ile Asn Lys Ala Gly

595 600 605

Leu Asp Leu Lys Val Asn Val Arg Glu Asn Glu Val Val Ile Glu Met

610 615 620

Arg Cys Cys Trp Arg Glu Tyr Leu Leu Leu Asp Ile Met Asp Ala Val

625 630 635 640

Asn Thr Leu Asn Leu Asp Ala His Thr Val Gln Ser Ser Thr Leu Asp

645 650 655

Gly Ile Leu Asp Leu Lys Leu Lys Ser Lys Phe Arg Gly Gly Gly Ala

660 665 670

Phe Ile Ser Ala Gly Met Ile Lys Gln Ala Leu Arg Arg Thr Val Cys

675 680 685

<210> 2

<211> 2058

<212> DNA

<213> 二色补血草(Limonium bicolor)

<400> 2

ctttctcttg gcttatgatg cccatttcgt gcaacctcac aaaatagaat ccctttttac 60

cccaaacccc agaaaaggaa gaatattcaa gggccaacaa atcaggcttt agcaagtggg 120

taaaaccaca gatttcgata caggtagaca gctcctcaat ttccagcagc aagacacaac 180

agtagcccct agcagcttgt ccccaaacca acccgagttc ccttgtgaat tctgatggtg 240

ggatccgatc cgactccatc ttagaactta gaaggggctc ttatcccatg catatatggt 300

taacaacctg gagaatcaaa ataaaaacaa acatatacca aacagattaa agttaatgcg 360

ctcctgcagg ctcgatcagt accaattgaa aattcatgtg aatttttttt ttgacaatta 420

aaagcaggct tgcggtaatt tgattttgac aattaaagga ttagaatact tatctctact 480

aatatagtct aatagtacga gtttacaatt cttgtcaagt tattgcctca ctcactcccc 540

ctcatattac aaacggaaat attaacttta tctactatat cacgtaacac taaaatcttg 600

ttattccacc tcaattcagt atctatttct tcttcaatac tctcctctca ttagaggaca 660

tctccttcac agtttatacg gtattagagt cttgaccgtc cttgaatcaa tcatcgatct 720

accaagtaaa cgttatagta ttaattaact tacacactca caaatattag caattaaaca 780

tcgctcacaa ggcaaaagta ctagtagtaa ttcataaagt gtatgtgtac tgtatcatca 840

gtttttcatt cttaggggcg tttaatgaag aaatgtatgc attaatggac tagattataa 900

atactcgatt agacaagacc gtgatttggg caaaaaaatc acggcgaaac attatcgtag 960

gaactttatc tagagattct ataagctcca ctttatttgt ttatgtcaaa agacatatta 1020

ccactttatc ctcacttatt ttgtttccgt acattacatt ctgagaggat taaaaaagca 1080

aggaccacta gtgtcttttc tattaaaata aagacaatta taacttcttg gtttcagatt 1140

tcgtgtgatg ccaccataaa ctccccgtgt attgtgccaa aagattaatg tcatcgtcga 1200

acaggggctt acatagtaat tataaggaat taaagtttct ttaaaaaaaa caaagcgagt 1260

ctagtcaaac tcaattaggc tagtcgaact gtgggagcat catcatggat ctacgaggtc 1320

aacaaaagtt agagcctcgt gacaccacca tatcccgcag acattcaact acttcttgac 1380

attacggatt agtttaatca aatcttggat tatactagac aaaggatcac gcaaattaat 1440

cagagcggac taaggtcacc ctcactttcc cattcctttt ccaacagcaa aaatagtaaa 1500

caaattataa tgaaagaatg gtctgcttta aagaggaaga agacaaacga acttattaac 1560

aagctagctg gggtactgtt gatactgcca cgatcttgtc ccaccaaacc caacgacgtc 1620

tccactgtct tcacttgttc atccccttct tcccctcgct gcggttcttt cccccttttt 1680

ctgcctgctg caaacctaaa tatctgacat atttcttatc tctgcgctgg cttttagatc 1740

ctaaatctta tagtatcatc tttgtagcga aaggtagacc cgtcatccgc cctatattcg 1800

cttcccgaac ccacaacccc tttccccttt ctcaaaacca ttcatttgtc atcctgcttg 1860

atttggtgaa aatttctatt ttcatgtgat ttcagcttcg cccactgtca acaatgtctt 1920

gaacccaatc tgtctacccg tatcgaaatc tgtggtttta cccacttgct aaagcctgat 1980

ttgttggccc ttgaatattc ttccttttct ggggtttggg gtaaaaaggg attctatttt 2040

gtgaggttgc acgaaatg 2058

Claims

1.二色补血草基因LbHLH，其特征在于，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

2.二色补血草基因LbHLH启动子，其特征在于，其序列为：

i)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；或

3.含有权利要求1所述基因LbHLH或权利要求2所述启动子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求2所述启动子在调控下游基因表达中的应用，其特征在于，所述下游基因包括权利要求1所述基因LbHLH，报告基因GUS、GFP。

5.权利要求1所述基因LbHLH、权利要求2所述启动子或权利要求3所述生物材料在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述基因LbHLH或含有基因LbHLH的生物材料的以下任一应用：

(1)用于促进植物表皮毛生长发育；

(2)用于抑制植物根毛生长发育；

(3)用于促进植物根系生长发育；

(4)用于提高植物发芽率；

(5)用于促进植物子叶生长发育；

(6)用于提高植物耐盐性；

(7)用于提高植物对渗透胁迫的耐受性；

(8)用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

(9)用于提高植物脯氨酸含量；

(10)用于降低植物丙二醛含量；

(11)用于植物品种改良；

优选地，所述植物包括泌盐盐生植物、拟南芥；和/或

所述渗透胁迫是指由环境中的NaCl、甘露醇所导致的渗透胁迫。

7.使植物表皮毛数量增加、根毛数量减少、根系变长、发芽率提高、子叶生长速率提高、耐盐性提高、渗透胁迫耐受性提高、脯氨酸含量提高、丙二醛含量下降的方法，其特征在于，所述方法选自如下①或②：

①使植物表达权利要求1所述基因LbHLH编码的蛋白；

②在植物中过表达权利要求1所述基因LbHLH；

所述过表达的方式选自以下1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒；

2)通过增加植物染色体上所述基因的拷贝数；

3)通过改变植物染色体上所述基因的启动子序列；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接；

5)通过导入增强子；

优选地，所述植物包括泌盐盐生植物、拟南芥；和/或

8.根据权利要求7所述方法获得的转基因植物的以下任一应用：

i.用于植物育种；

ii.用于盐碱地种植；

优选地，所述植物包括泌盐盐生植物、拟南芥。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

10.权利要求1所述基因LbHLH编码的蛋白与植物表皮毛和根毛发育相关基因编码的蛋白之间的互作的以下任一应用：

A、用于调控植物表皮毛和根毛生长发育；

B、用于调控泌盐盐生植物盐腺生长发育；

优选地，所述植物表皮毛和根毛发育相关基因包括GL1。