KR20030042414A - 식물의 전사인자를 코딩하는 유전자 - Google Patents

식물의 전사인자를 코딩하는 유전자 Download PDF

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Abstract

스트레스 내성 유전자에 특이적인 전사인자를 코딩하는, 벼와 같은 단자엽식물 유래의 유전자를 확인하고 그 유전자를 사용하여 새로운 환경 스트레스 내성 식물을 제공한다.
벼 게놈으로부터, 스트레스 응답성 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에 존재하는 시스(cis) 엘리먼트에 결합되며 그 유전자의 전사를 활성화하는 전사인자를 코딩하는 유전자를 확인한다. 또한, 상기 전사인자의 유전자를 사용하여 식물을 형질전환시키는 것에 의해 저온, 건조 및 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 내성을 향상시킨다.

Description

식물의 전사인자를 코딩하는 유전자{Genes encoding plant transcription factors}
본 발명은 벼 유래의 환경 스트레스 내성을 제어하는 단백질, 그를 코딩하는 유전자, 및 그를 이용하는 방법에 관한 것이다.
식물은 건조, 고온, 동결 또는 염 스트레스와 같은 자연에 있는 다양한 유형의 환경 스트레스에 대처하는 내성 메카니즘을 보유한다. 이러한 환경 스트레스 내성을 갖는 식물을 제조함에 있어서, 건조, 염, 또는 저온 내성인 균주를 유전적으로 선택하여 교배하는 수법이 이용되어왔다. 그러나, 이들 수법은 선택시간이 길고 성공률도 낮았다.
한편, 스트레스 내성 메카니즘이 분자 수분으로 밝혀져 있기 때문에, 생물공학적 수법을 이용하여 스트레스 내성 식물을 생성하여 왔다. 예컨대, 스트레스에 노출되면 세포내에서는 LEA 단백질, 물 채널 단백질 또는 적합 용질 합성효소 등의 스트레스 단백질이 유도됨으로써 세포를 그러한 스트레스로부터 보호하는 것이 알려져있다. 따라서, 보리의 LEA 단백질 또는 담배의 해독 효소와 같은 유전자, 또는 삼투조절 물질(예컨대, 설탕, 프롤린 또는 글리신베타인)의 합성효소의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 연구가 시도되어 왔다. 세포막 지질의 변형 효소인 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 w-3 지방산 탈포화효소, 남조류의 D9-탈포화효소 등을 코딩하는 유전자를 사용한 연구도 또한 시도되었다. 상기 연구에서,유전자는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S 프로모터에 결합되어 식물에 도입된다. 그러나 재조합 식물의 스트레스 내성 정도는 낮고 불안정하였다. 따라서, 이들중 어떤 것도 실제로 이용되지 않고 있었다.
한편, 스트레스 내성 메카니즘은 몇 개의 유전자와 복잡하게 관련되어 있는 것으로 밝혀져있다(Plant Physiol., 115: 327-334 (1997)). 따라서, 유전자의 발현을 동시에 활성화시키는 전사 인자를 코딩하는 유전자를 식물에 도입하여 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 연구도 시도되었다(The Plant Cell, 10: 1-17 (1998)). 그러나, 몇 개의 유전자가 동시에 활성화되면, 숙주 식물의 에너지가 유전자 산물의 생산 또는 그러한 유전자 산물로부터 생성한 세포내 대사로 직접적으로 향하게된다. 따라서, 식물 자체의 성장이 지체되거나 왜소화된다.
대조적으로, 본 발명자들은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 스트레스 응답성 엘리먼트에 결합되어 그 엘리먼트의 하류에 위치한 유전자의 전사를 특이적으로 활성화시키는 전사인자를 코딩하는 유전자 DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB2A 및 DREB2B를 분리하였다(일본 특개평 10-228457호). 이들은 상기 유전자를 식물에 도입하고 과발현시키면 식물의 왜소화를 유발함없이 스트레스 내성을 부여할 수 있다고 보고하였다(일본 특개평 10-292348호).
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)는 쌍자엽식물로 분류되는 반면에, 벼, 옥수수 및 밀과 같은 주요 작물은 단자엽식물로 분류된다. 쌍자엽식물은 식물 진화 측면에서 단자엽 식물과 비교적 상이하다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 DREB1A 유전자는 단자엽식물에서는 잘 작용하지만 쌍자엽식물에서는 잘 작용하지 않는 것이 밝혀져있다. 따라서, 단자엽식물 유래의 DREB-상동 유전자를 분리할 수 있다면, 그에 의해 환경 스트레스 내성을 단자엽식물에 더욱 효과적으로 전달할 수 있다.
벼와 같은 단자엽식물로부터 스트레스 내성 유전자에 특이적인 전사인자를 코딩하는 유전자를 분리하고, 또 동일한 유전자를 사용하여 신규한 환경 스트레스 내성 식물을 제공하는 것이 본 발명의 과제이다.
도 1은 OsDREB 단백질(A: OsDREB1, B: OsDREB2)의 구조를 도시,
도 2는 DREB1-상동 단백질(OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C, OsDREB1D; 벼, BCBF3; 보리, DREB1A; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), ACRE111B; 담배)의 아미노산 서열을 도시,
도 3은 DREB2-상동 단백질(OsDREB2A; 벼, DREB2A: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), ORCA1; 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus))의 아미노산 서열을 도시,
도 4는 겔 시프트 분석법의 결과를 도시,
도 5a는 트랜스액티베이션(transactivation)에 사용된 플라스미드의 구조를 도시하고, 도 5b는 트랜스액티베이션에 의한 도입 효율비(GUS/LUC)를 도시,
도 6은 OsDREB 유전자의 발현을 노던 블러팅 분석한 결과를 도시,
도 7은 재조합 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 스트레스 내성 유전자의 발현을 분석한 결과를 도시,
도 8은 재조합 벼에서 스트레스 내성 유전자의 발현을 분석한 결과를 도시,
도 9는 OsDREB1A 및 DREB1A가 도입된 재조합 식물(아라비돕시스탈리아나(Arabidopsis thaliana))의 염 스트레스 내성을 도시.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 집중적인 연구를 실시하였다. 그 결과, 벼 게놈으로부터 DREB-상동 유전자 전부를 확인하는데 성공하였다. 본 발명자들은 또한 상기 유전자를 다른 식물에 도입하면 환경 스트레스 내성을 현저히 향상시킨다는 것도 밝혀내었다. 이를 기준으로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
보다 상세하게는, 본 발명은 다음 (1) 내지 (12)를 제공한다.
(1) 하기 DNA (a) 또는 (b)를 포함하는 분리된 유전자:
(a) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 또는
(b) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)되며 또 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질을 코딩하는 DNA.
(2) 하기 단백질(c) 또는 (d)를 코딩하는 분리된 유전자:
(c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고 또 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질.
(3) 스트레스가 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스인 상기 (1) 또는 (2)에 따른 유전자.
(4) 하기 재조합 단백질 (c) 또는 (d):
(c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
(d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고 또 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질.
(5) 스트레스가 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스인 상기 (4)에 따른 단백질.
(6) 상기 (1) 내지 (3)중 어느 하나에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
(7) 상기 (6)에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
(8) 숙주가 식물인 상기 (7)에 따른 형질전환체.
(9) 숙주가 단자엽식물인 상기 (7)에 따른 형질전환체.
(10) 상기 (8) 또는 (9)에 따른 형질전환체를 배지에서 배양하고 생성한 배양 산물로부터 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질을 생성하는 방법.
(11) 상기 (1) 내지 (3)중의 어느 하나에 따른 유전자의 식물체에서의 전사 수준을 측정하는 것을 특징으로하는, 식물에서 스트레스 수준을 측정하는 방법.
(12) 상기 (1) 내지 (3)중 어느 하나에 따른 유전자를 식물에 도입하는 것에 의해 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 방법.
본 명세서는 본 출원의 우선권인 일본특허출원 2001-358268호의 명세서에 기재된 내용 일부 또는 전부를 포함한다.
발명의 실시형태
본 발명에 따른 유전자는 저온, 건조 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 내성 향상 메카니즘을 갖는 벼 게놈으로부터 유래한 유전자이다.
본 발명의 유전자는 "저온, 건조 또는 염 스트레스와 같은 환경 스트레스에 반응하여 발현된 스트레스 응답성 단백질을 코딩하는 유전자의 상류에 위치하는 시스(cis) 엘리먼트에 결합되어 유전자의 전사를 활성화시키는 전사인자를 코딩하는 분리된 유전자"이다. 상기 시스 엘리먼트의 특정 예는 건조-응답성엘리먼트(dehydration-responsive element: DRE), 압시신산 응답성 엘리먼트(abscisic acid-responsive element: ABRE) 및 저온 응답성 엘리먼트를 포함한다. 본 발명의 유전자에 의해 암호화된 단백질은 상술한 스트레스 응답성 엘리먼트(DRE 등)의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 활성화시키는 작용을 한다.
본 발명에 따른 유전자는 예컨대 다음과 같이 확인할 수 있다.
1. 본 발명의 유전자의 확인
본 발명에 따른 유전자는 상동 작용을 갖는 공지 유전자와 상동성을 기초로하여 스크리닝될 수 있으며, 즉 식물의 스트레스 내성 유전자에 특이적인 전사인자를 코딩하는 유전자이다. 벼의 mRNA 및 cDNA 라이브러리 또는 벼 게놈 라이브러리를 작성하고 스크리닝할 수 있다. 다르게는, 기존의 벼 DNA 데이터베이스를 이용하여 스크리닝할 수 있다.
(1) 유전자 라이브러리의 스크리닝
i) mRNA 및 cDNA 라이브러리의 제조
먼저, mRNA 및 cDNA 라이브러리는 다음과 같이 작성한다.
mRNA의 공급원으로서 잎, 줄기, 뿌리 또는 꽃과 같은 벼 식물체의 일부 또는 식물체 전부를 사용할 수 있다. 다르게는, GM 배지, MS 배지 또는 #3 배지와 같은 고형 배지에 벼 종자를 파종하고 이들을 무균적으로 성장시키는 것에 의해 얻은 식물체도 사용할 수 있다. 상기 공급원은 캘러스 또는 무균적으로 성장한 배양된 벼 세포일 수 있으며, 그의 변이체는 세포가 목적하는 유전자의 mRNA를 함유하고 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 또한, 스크리닝할 유전자는 환경 스트레스에 응답하여발현되기 때문에, 저온 스트레스(예컨대, 10 내지 -4℃), 염 스트레스(예컨대 150 내지 250 mM NaCl) 또는 건조 스트레스(예컨대 건조된 상태)에 노출된 식물이 바람직하게 사용될 수 있다.
예컨대, mRNA는 다음과 같이 제조한다. 수경 재배한 벼 식물체를 저온 스트레스, 건조 스트레스 또는 염 스트레스에 노출시킨 다음 액체 질소를 사용하여 동결시킨다. 동결 식물체를 모르타르에서 분쇄시킨다. 생성한 분쇄 물질로부터, 글리옥살법, 구아니딘 티오시아네이트-염화세슘법, 염화리튬-우레아법, 프로테이나제 K-데옥시리보뉴클레아제법 등에 의해 조 RNA 분획을 추출 제조한다. 상기 조 RNA 분획으로부터, 올리고 dT-셀룰로오스 또는 세파로오스 2B상에서 실시된 폴리 U-세파로오스를 사용한 친화성 칼럼법에 의해 또는 배치법에 의해 폴리(A)+ RNA(mRNA)를 수득할 수 있다. 생성한 mRNA는 수크로오스 밀도 구배 원심분리법 등에 의해 더욱 분획할 수 있다.
또한, 이렇게하여 수득한 mRNA를 주형으로 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조할 수 있다. 예컨대, 시판중인 키트(예컨대 ZAP-cDNA 합성 키트: 스트라타진 제조)중에서 올리고(dT) 프라이머 또는 랜덤 프라이머와 역전사효소를 사용하여 단쇄 cDNA를 합성한다. 이어, 생성한 단쇄 cDNA로부터 이중쇄 cDNA를 합성한다. 이어, 적합한 제한 부위를 함유하는 어댑터를 생성한 이중쇄 cDNA에 부가한 다음 이를 람다 파아지 벡터의 클로닝 부위에 삽입시켰다. 생성한 DNA는 Gigapack III Gold packaging extract (스트라타진 제조) 등을 이용하여 팩케이징하고 대장균(E.coli) 숙주에 감염된 다음 증폭된다. 이후, 파아지 입자를 회수하여 보존한다.
ii) 게놈 라이브러리의 제조
예컨대, 람다 파아지 벡터를 사용한 게놈 라이브러리의 제조는 다음과 같이 실시한다. DNA의 공급원으로서, 잎, 줄기, 뿌리 또는 꽃과 같은 벼 식물체의 일부 또는 전체 식물체는 그 조직이 DNA를 함유하고 있는 한 사용될 수 있다. 식물체를 액체 질소 존재하에서 분쇄하고 CTAB법, 염화벤질법 등에 의해 DNA를 추출한다. 생성한 DNA는 제한효소Sau3AI에 의해 부분적으로 분해된 다음 NaCl 밀도 구배 초원심분리법 등에 의해 분획되어 10 내지 20 kb 단편을 회수한다. 이들 단편을 λEMBL3 및 λFIX II와 같은 람다 파아지 벡터의BamHI 절단부위에 삽입시킨다. 그후, Gigapack III Gold packaging extract (스트라자진 제조) 등을 사용하여 팩케이징을 실시한 다음 대장균(E.coli) 숙주에 감염시킨다. 증폭된 파아지 입자를 회수하여 보존한다.
iii) 라이브러리의 스크리닝
라이브러리는 다음과 같이 스크리닝할 수 있다.
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB 유전자(DREB1A 유전자: 서열번호 11, DREB2A 유전자: 서열번호 13, DREB1B 유전자: 서열번호 15, DREB1C 유전자: 서열번호 17, DREB2B 유전자: 서열번호 19)와 같은 식물의 스트레스 내성 유전자에 특이적인 전사 인자를 코딩하는 공지 유전자의 고도로 보존되는 영역에 있는 서열을 기초로하여 DNA 단편을 프로브로서 제조한다. 상기 프로브 DNA는, 상기 영역을 증폭하기 위하여 고도로 보존되는 영역의 각 측면의 서열을 기초로 하여 고안된 약 15 bp 내지 25 bp의 2개의 프라이머를 사용한PCR에 의해 증폭될 수 있다. 고도로 보존된 영역이 짧고 프로브로서 불충분하면, 그와 인접하는 영역과 함께 몇 개의 고도로 보존되는 영역을 증폭시키기 위해 다른 프로브를 고안할 수 있다.
상기 프로브를 사용하여, cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 플라크 하이브리다이제이션(hybridization)법 또는 콜로니 하이브리다이제이션법에 의해 스크리닝한다.
(2) 유전자 데이터베이스를 사용한 스크리닝
아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB 유전자(DREB1A 유전자, DREB1B 유전자, DREB1C 유전자, DREB2A 유전자, DREB2B 유전자) 와 같은 식물의 스트레스 내성 유전자에 특이적인 전사 인자를 코딩하는 공지 유전자의 중요 서열(고도로 보존되는 영역 또는 소망하는 작용을 갖는 것으로 유추되는 영역)을 특정한다. 이어, 상기 특정된 유전자를 기초로하여 기존의 유전자 데이터베이스 상에서 상동 검색을 실시한다. 검색될 유전자 데이터는 EST 또는 전체 길이 유전자일 수 있다. 상동 검색은 BLAST 또는 FASTA와 같은 분석 소프트웨어를 사용하여 GenBank 또는 DDBJ의 데이터베이스를 기초로 실시할 수 있다. 바람직하게는, 검출 대상은 고도로 보존되는 영역 또는 소망하는 작용을 가질 것으로 유추되는 영역에 있는 아미노산 서열과 특히 높은 상동성을 갖는 아미노산 서열, 즉 단백질의 기능에 필수적인 아미노산 서열을 보존하는 서열을 코딩하는 유전자이다. 그 결과 얻은 서열을 기초로, 프라이머를 고안하고 클로닝되지 않은 cDNA(RT-PCR), cDNA 라이브러리, 게놈 DNA 또는 게놈 라이브러리를 주형으로 사용하여 PCR을 실시하여 목적하는 유전자를 수득한다. 다르게는, PCR에 의해 증폭된 DNA 단편을 프로브로 사용하고 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하여 목적하는 유전자를 수득한다.
(3) 뉴클레오티드 서열의 결정
클로닝된 cDNA의 전체 뉴클레오티드 서열은 통상의 방법에 따라 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열결정은 막삼-길버트의 화학적 수식법 또는 M13 파아지를 사용한 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종지법을 포함한다. 통상, 서열결정화는 자동화 뉴클레오티드 서열분석기(예컨대 377 DNA 서열분석기, 퍼킨 엘머사 제조)를 이용하여 실시한다.
따라서, 벼로부터 유도된 DREB-상동 유전자로서 OsDREB1A(서열번호 1), OsDREB1B (서열번호 3), OsDREB1C (서열번호 5), OsDREB1D (서열번호 7) 및 OsDREB2A (서열번호 9)가 확인되었다.
또한, 상기 유전자의 ORF의 분석을 통하여 유전자에 의해 코딩되는 OsDREB1A 단백질(서열번호 2), OsDREB1B 단백질 (서열번호 4), OsDREB1C 단백질(서열번호 6), OsDREB1D 단백질(서열번호 8) 및 OsDREB2A 단백질 (서열번호 10)이 확인되었다.
그러나, 본 발명에 따른 유전자는 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 나타낸 DNA를 포함하는 유전자에 한정되지 않는다. 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 나타낸 DNA를 포함하는 유전자와 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)하는 DNA를 포함하는 유전자도 이들이 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질을 코딩하는 한 역시 본 발명의 유전자이다. "스트린젠트 조건"은 포름아미드 농도가 30 내지 50%이고, 온도가 37 내지 50℃이며 6 x SSC인 조건을 지칭한다. 바람직하게는, 포름아미드 농도는 50%, 온도는 42℃이고 6 x SSC 이다.
본 발명의 유전자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자이다. 단백질이 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열중 하나 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하더라도, 이러한 단백질을 코딩하는 유전자는 그 단백질이 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치한 유전자의 전사를 제어할 수 있는 한 본 발명에 따른 유전자로서 포함된다. 용어 "몇 개의 아미노산"은 바람직하게는 20개 이하 또는 보다 바람직하게는 5개 이하의 아미노산을 지칭한다.
본 발명에 따른 단백질은 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 한정되지 않는다. 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 그것이 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어할 수 있는 한 본 발명에 따른 단백질로 포함된다. 용어 "몇개 아미노산"은 바람직하게는 20개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하의 아미노산을 지칭한다.
본 발명의 유전자에 돌연변이를 도입하는 것은 쿤켈(Kunkel)법, 간극이 있는(Gapped) 이중쇄법 또는 부위-특이적 돌연변이를 이용하는 돌연변이 도입 키트[예컨대, Mutant-K (타카라 제조) 또는 Mutant-G (타카라 제조)] 또는 시험관내에서 Mutagenesis Series Kit(타카라 제조)를 이용한 LA PCR을 사용한 그의 변이법과 같은 통상의 수법에 의해 실시할 수 있다.
본 발명의 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 본 발명의 유전자는 화학적 합성법에 의해, 주형으로 cDNA 또는 게놈 DNA 유전자를 사용한 PCR에 의해, 또는 프로브로서 상기 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 단편의 하이브리다이제이션에 의해 수득할 수 있다.
2. 본 발명의 단백질의 DRE 결합능 및 전사 활성화능의 분석
(1) DRE 결합능의 분석
DRE에 결합하는 본 발명에 따른 단백질의 능력은 단백질, GST 등으로 구성된 융합 단백질을 사용한 겔 시프트 분석법[Urao, T. et al., Plant Cell 5:1529-1539 (1993)]에 의해 확인할 수 있다. 본 발명에 따른 단백질은 GST 유전자를 코딩하는 플라스미드(예컨대 pGEX-4T-1 벡터; 파마시아 제조)의 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) 코딩영역의 하류에 본 발명에 따른 유전자를, 2개 유전자의 리딩 프레임(reading frame)이 서로 일치하도록 결찰시키고, 융합 단백질의 합성을 유도하는 조건하에서 상기 플라스미드로 형질전환된 대장균(E.coli)을 배양하고 상기 형질전환된 대장균(E.coli)으로부터 단백질을 정제하는 것에 의해제조할 수 있다.
겔 시프트 분석법은 DNA와 단백질 사이의 상호작용을 시험하는 방법이다.32P 등으로 표지된, DRE-함유 DNA 단편을 상술한 융합 단백질과 혼합하고 배양하여 생성한 혼합물을 전기영동처리한다. 건조시킨 후, 상기 겔을 자기방사사진 처리하여 DNA 단편과 단백질의 결합의 결과로서 뒤로 이동한 밴드를 검출한다. DRE 서열에 대한 본 발명에 따른 단백질의 특이적 결합은, 돌연변이된 DRE 서열을 함유하는 DNA 단편이 사용되면 상술한 밴드가 검출되지 않는 것을 제시하는 것에 의해 확인될 수 있다.
(2) 전사 활성화 능력의 분석
본 발명의 단백질의 전사 활성화 능력은 벼 프로토플라스트 계를 사용한 트랜스액티베이션 시험에 의해 분석할 수 있다. 예컨대, OsDREB1A cDNA를 CaMV35S 프로모터를 함유하는 pBI221 플라스미드(클론테크 제조)에 결찰시켜 이펙터(effector) 플라스미드를 작성한다. 한편, DRE-함유 DNA 단편은 β-글루쿠로니다제(GUS) 유전자의 상류에 위치한 TATA 프로모터의 상류에 결찰시켜 리포터(reporter) 플라스미드를 작성한다. 이어, 이들 2개 플라스미드를 벼 프로토플라스트에 도입한 다음 GUS 활성을 측정한다. OsDREB1A 단백질의 동시 발현에 의해 GUS 활성이 증가하면, 프로토플라스트에서 발현된 OsDREB1A 단백질은 DRE 서열을 통하여 전사를 활성화시키는 것으로 생각된다.
본 발명에서, 프로토플라스트의 제조 및 플라스미드 DNA를 프로토플라스트에도입하는 것은 아벨 등[Abel, S. et al., Plant J. 5: 421-427 (1994)]의 방법에 의해 실시될 수 있다. 플라스미드 DNA 도입 효율의 차이로 인한 실험 오차를 최소화 하기 위하여, 루시페라제 유전자가 CaMV35S 프로모터의 하류에 결찰된 플라스미드를 상술한 2개 플라스미드와 함께 프로토플라스트에 도입하여, 루시페라제 활성에 대한 β-글루쿠로니다제 활성을 측정할 수 있다. 이어, 측정된 값은 전사 활성화 능력을 지시하는 것으로 볼 수 있다. β-글루쿠로니다제 활성은 제퍼슨 등[Jefferson, R. A. et al., EMBO J. 83:8447-8451 (1986)]의 방법에 의해 측정할 수 있고; 또 루시페라제 활성은 PicaGene Luciferase Assay Kit (토요 잉크 제조)를 이용하여 측정할 수 있다.
3. 재조합 벡터 및 형질전환체의 제조
(1) 재조합 벡터의 제조
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 유전자를 적합한 벡터에 결찰(삽입)하는 것에 의해 얻을 수 있다. 본 발명의 유전자가 삽입된 벡터는 그것이 숙주에서 복제될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등을 사용할 수 있다. 플라스미드 DNA는 pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119와 같은 대장균 숙주용 플라스미드; pUB110 및 pTP5와 같은 고초균(Bacillus subtilis) 숙주용 플라스미드; YEp13, YEp24 및 YCp50과 같은 효모 숙주용 플라스미드; 및 pBI221 및 pBI121과 같은 식물세포 숙주용 플라스미드를 포함한다. 파아지 DNA는 λ파아지 등을 포함한다. 또한 레트로바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스 벡터; 또는 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 벡터도 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 유전자를 벡터에 삽입하기 위하여, 예컨대 정제된 DNA를 적합한 제한효소로 절단한 다음 적합한 벡터 DNA의 제한부위 또는 멀티 클로닝 부위에 삽입하여 벡터에 연결하는 방법이 적용된다. 본 발명의 유전자는 유전자의 기능이 발휘되도록 벡터에 혼입되어야한다. 이를 위하여, 프로모터 및 본 발명의 유전자 이외에, 필요에 따라서, 인헨서와 같은 시스(cis) 엘리먼트, 접합 시그널, 폴리(A) 부가 시그널, 선택 마커, 리보솜 결합서열(SD 서열) 등을 함유하는 것을 본 발명의 벡터에 연결시킬 수 있다. 선택 마커의 예는 디히드로엽산 환원효소 유전자, 암피실린 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자 등이다.
(2) 형질전환체의 제조
본 발명의 형질전환체는 본 발명의 재조합 벡터를, 목적 유전자가 발현될 수 있도록 숙주에 도입하는 것에 의해 얻을 수 있다. 숙주는 본 발명의 유전자가 그 속에서 발현될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 숙주의 특정 예는 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 등의 에세리키아 속 세균; 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실루스 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스 속 세균; 리조븀 멜릴로티(Rhizobium meliloti)와 같은 리조븀 속 세균; 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 담배, 옥수수, 벼, 당근 등으로부터 제조된 식물세포주 또는 그러한 식물로부터 제조된 프로토플라스트; COS 세포, CHO 세포와 같은 동물세포; 또는 Sf9 세포 및 Sf21 세포와 같은 곤충세포를 포함한다.
대장균과 같은 세균을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명의 재조합 벡터는 숙주중에서 자율 복제가능한 동시에 프로모터, 리보솜 결합서열, 본 발명의 유전자 및 전사 종결서열에 의해 구성되는 것이 바람직하다. 상기 벡터는 프로모터를 제어하는 유전자를 또한 함유할 수 있다. HMS174(DE3), K12 또는 DH1과 같은 에세리키아 콜리(Escherichia coli) 균주가 사용될 수 있다. MI 114 또는 207-21과 같은 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주도 사용될 수 있다.
프로모터로서는 대장균과 같은 숙주중에서 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 한 어떤 것이라도 사용될 수 있다. 예컨대, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터 또는 PR프로모터와 같은 대장균 또는 파아지에 유래한 프로모터가 사용될 수 있다. tac 프로모터와 같은 인위적으로 설계 개변된 프로모터도 또한 사용될 수 있다. 재조합 벡터를 세균에 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 그의 예는 칼슘 이온을 사용하는 방법[Cohen, S.N. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69: 2110-2114 (1972)] 및 엘렉트로포레이션법을 포함한다.
사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 또는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모를 숙주로서 사용하는 경우, 프로모터로서는 특별히 제한되지 않으며, 효모에서 목적하는 유전자를 발현시킬 수 있는 한 어떤 프로모터라도 사용될 수 있다. 예컨대, gal1 프로모터, gal10 프로모터, 열충격 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 또는 AOX1 프로모터도 사용될 수 있다.
재조합 벡터를 효모에 도입하는 방법은 특별히 제한되지 않으며 그 예는 엘렉트로포레이션법[Becker, D.M. 등, Mathods Enzymol., 194: 182-187 (1990)], 스페로플라스트법[Hinnen, A. 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929-1933 (1978)] 및 아세트산 리튬법[Itoh, H., J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)]을 포함한다.
식물 세포, 예컨대 벼, 옥수수, 밀, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 담배, 당근 등으로부터 만들어진 세포주 또는 식물로부터 제조된 프로토플라스트를 숙주로서 사용한 경우, 사용할 프로모터는 목적하는 유전자를 식물중에서 발현시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 그의 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 프로모터, rd29A 유전자 프로모터 및 rbcS 프로모터를 포함한다.
재조합 벡터를 식물에 도입하는 방법은 Abel 등의 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 방법[Abel, H. et al., Plant J. 5: 421-427 (1994)] 및 엘렉트로포레이션법을 포함한다. 동물 세포, 예컨대 원숭이 세포 COS-7 또는 Vero 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO 세포), 마우스 L 세포, 레트 GH3 세포, 인간 FL 세포 등을 숙주로서 사용한 경우, SRα 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, CMV 프로모터 등을 사용할 수 있다. 인간 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 등의 초기 유전자 프로모터도 또한 사용될 수 있다.
재조합 벡터를 동물 세포에 도입하기 위하여, 예컨대 엘렉트로포레이션법,인산칼슘법, 리포펙션(lipofection)법 등을 사용할 수 있다. 곤충 세포, 예컨대 Sf9 세포, Sf21 세포 등을 숙주로서 사용하는 경우, 인산칼슘법, 리포펙션법, 엘렉트로포레이션법 등을 사용할 수 있다.
4. 본 발명에 따른 단백질의 생산
본 발명의 단백질은 본 발명의 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 갖는 단백질; 또는 상술한 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 돌연변이된 아미노산 서열을 갖고 스트레스 응답성 엘리먼트 하류에 위치한 유전자의 전사를 제어할 수 있는 단백질이다.
본 발명의 단백질은 형질전환체를 배지에서 배양하고 그 배양물로부터 단백질을 회수하는 것에 의해 얻을 수 있다. 용어 "배양물"이라는 것은 배양 상층액, 배양 세포, 배양된 미생물 또는 파쇄된 세포 또는 미생물중의 어느 하나를 의미한다. 배지에서 본 발명의 형질전환체는 숙주를 배양하는 통상의 방법에 의해 배양된다.
대장균 또는 효모와 같은 미생물 숙주로부터 얻은 형질전환체를 배양하기 위한 배지로서는, 그것이 미생물에 의해 동화될 수 있는 탄소 공급원, 질소 공급원 및 무기 염을 함유하여 효과적으로 형질전환체를 배양시킬 수 있는 한 천연 또는 합성 배지도 사용될 수 있다. 식물 세포를 숙주로서 사용한 경우, 필요에 따라서 티아민 및 피리독신과 같은 비타민을 배지에 부가할 수 있다. 동물 세포를 숙주로서 사용한 경우, RPM1640과 같은 혈청을 필요에 따라 배지에 부가할 수 있다.
탄소 공급원의 예는 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스 및 녹말과 같은 탄수화물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기 산; 및 에탄올과 프로판올과 같은 알코올을 포함한다. 질소 공급원의 예는 암모니아; 염화 암모늄, 황산 암모늄, 아세트산 암모늄 및 인산 암모늄과 같은 무기 또는 유기 산의 암모늄 염; 기타 질소 함유 화합물; 펩톤; 육류 추출물; 및 옥수수 스팁 리커(steep liquor)를 포함한다.
무기 물질의 예는 인산제일칼륨, 인산제이칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 황산구리 및 탄산칼슘을 포함한다. 통상, 배양은 호기 조건하(진탕배양 또는 통기 교반 배양과 같은), 30 내지 37℃에서 약 6시간 내지 3일간 실시한다. 배양하는 동안, pH는 약 7.0 내지 7.5로 유지된다. pH는 무기 또는 유기 산, 알칼리 용액 등으로 조정한다.
배양하는 동안, 필요에 따라 암피실린 또는 테트라사이클린과 같은 항생물질을 배지에 부가할 수 있다. 유도성 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우, 필요에 따라 유도물질을 배지에 부가할 수 있다. 예컨대, Lac 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 등을 배지에 부가할 수 있다. trp 프로모터를 함유하는 발현벡터로 형질전환된 미생물을 배양하는 경우, 인돌아크릴산(IAA) 등을 배지에 부가할 수 있다.
통상, 배양은 5% CO2의 존재하에, 약 30 내지 37℃에서 약 6시간 내지 3일간 실시한다. 배양하는 동안, 필요에 따라서 카나마이신 또는 페니실린과 같은 항생물질을 배지에 부가할 수 있다. 배양한 후, 본 발명의 단백질이 미생물 또는 세포에생산되는 경우, 본 발명의 단백질은 배양된 미생물 또는 세포를 파쇄시키는 것에 의해 추출한다. 본 발명의 단백질이 미생물 또는 세포의 외부로 분비되는 경우, 배양액을 그대로 다음 단계에 사용하거나 또는 원심분리처리시켜 미생물 또는 세포를 제거한다. 그후, 단백질을 분리/정제하는데 사용되는 통상적인 생화학적 수법, 예컨대 황산암모늄 석출법, 겔 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피를 독립적으로 또는 적합하게 조합하여 적용하여 본 발명의 단백질을 상기 배양물로부터 분리 및 정제한다.
5. 본 발명의 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물의 제조
환경 스트레스, 특히 저온, 동결 및 건조 스트레스에 대하여 내성인 트랜스제닉 식물은 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA를 유전자 공학적 수법을 이용하여 숙주 식물에 도입하는 것에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 유전자를 숙주 식물에 도입하는 방법은 아그로박테륨(Agrobacterium) 감염법 등의 간접 도입법과 파티클 건 (particle gun)법, 폴리에틸렌 글리콜법, 리포좀 법 및 미량주입법과 같은 직접 도입법을 포함한다. 아그로박테륨 감염법을 이용하는 경우, 본 발명의 트랜스제닉 식물은 다음 과정에 의해 제조될 수 있다.
(1) 식물에 도입할 재조합 벡터의 제조 및 아그로박테륨의 형질전환
식물에 도입할 재조합 벡터는 본 발명의 유전자를 포함하는 DNA를 적합한 제한 효소로 절단하고, 필요한 경우 생성한 DNA에 적합한 링커를 결찰시키고 그 DNA를 식물세포 숙주용 클로닝 벡터에 삽입하는 것에 의해 제조할 수 있다. pBI2113Not, pBI2113, pBI101, pBI121, pGA482, pGAH 및 pBIG와 같은 바이너리 벡터형 플라스미드, 또는 pLGV23Not, pNCAT 및 pMON200과 같은 중간 벡터형 플라스미드를 클로닝 벡터로서 사용할 수 있다.
바이너리 벡터형 플라스미드를 사용하는 경우, 목적하는 유전자는 바이너리 벡터의 보더 서열(LB, RB) 사이에 삽입한다. 생성한 재조합 벡터를 대장균에서 증폭한다. 증폭된 재조합 벡터는 동결-해동법, 엘렉트로포레이션 등에 의해 아그로박테륨 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) C58, LBA4404, EHA101, C58C1RifR, EHA105 등에 도입한다. 생성한 아그로박테륨을 목적하는 식물의 형질전환용으로 사용한다.
본 발명에서는, 본 발명의 유전자를 함유하는 식물 감염용 아그로박테륨을 제조하기 위하여 삼자접합법[Nucleic Acids Research, 12: 8711 (1984)]을 또한 이용할 수 있다. 특히, 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드-함유 대장균, 헬퍼 플라스미드-함유 대장균(예컨대 pRK2013) 및 아그로박테륨을 혼합하고 리팜피신 및 카나마이신을 함유하는 배지에서 배양한다. 따라서, 식물감염용 접합체 아그로박테륨을 얻을 수 있다.
외래 유전자 등을 식물체내에서 발현시키기 위하여, 식물용 프로모터 및 터미네이터는 구조 유전자의 상류 및 하류에 각각 위치하여야한다. 본 발명에 사용될 수 있는 프로모터의 특정 예는 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV)-유래 35S 전사물[Jefferson, R.A. et al., The EMBO J. 6:3901-3907 (1987)]; 옥수수 유비퀴틴 유전자용 프로모터[Christensen, A.H. et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689(1992)]; 노팔린 합성효소(NOS) 유전자용 프로모터; 및 옥토핀(OCT) 합성효소 유전자용 프로모터를 포함한다. 유용한 터미네이터의 특정 예는 CaMV-유래 터미네이터 및 NOS-유래 터미네이터를 포함한다. 프로모터와 터미네이터는 이들이 식물체내에서 작용하는 것으로 알려지는 한, 상술한 것에 한정되지 않는다.
트랜스제닉 식물에 사용된 프로모터가 목적하는 유전자의 구성적 발현을 담당하는 프로모터(예컨대 CaMV 35S 프로모터) 이고 또 그의 사용이 트랜스제닉 식물의 성장지연 또는 왜소화를 초래하면, 목적하는 유전자를 일시적으로 발현시키는 프로모터(예컨대 rd29A 유전자 프로모터)를 사용할 수 있다. 필요한 경우, 본 발명의 유전자의 발현을 향상시키는 인트론 서열은 프로모터 서열과 상기 유전자 사이에 위치할 수 있다. 예컨대 옥수수 알코올 탈수소화제(Adh1)로부터의 인트론[Genes & Development 1:1183-1200 (1987)]을 도입할 수 있다.
목적하는 형질전환된 세포를 효과적으로 선택하기 위하여, 유효한 선택 마커 유전자를 본 발명의 유전자와 병용하는 것이 바람직하다. 선택 마커로서는, 카나마이신 내성(NPTII) 유전자, 식물상에서 항생물질 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(htp) 유전자, 비알라포스(bialaphos)에 대한 내성을 부여하는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제(bar) 유전자 등으로부터 선택된 1개 이상의 유전자를 사용할 수 있다. 본 발명의 유전자 및 선택마커 유전자는 함께 단일 벡터에 도입될 수 있다. 다르게는, 각기 별도의 벡터에 혼입된 2개 유형의 재조합 DNA를 사용할 수 있다.
(2) 본 발명의 유전자를 숙주에 도입
본 발명에서 형질전환체의 숙주는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 식물이다. 상기 식물은 식물 배양세포, 재배식물의 식물체 전체, 식물기관(예컨대 잎, 꽃잎, 줄기, 뿌리, 근경, 또는 종자) 또는 식물조직(예컨대 표피, 체관부, 유조직, 목부 또는 유관속 등)일 수 있다. 식물은 벼, 옥수수 및 밀과 같은 단자엽 식물인 것이 바람직하다. 식물 배양세포, 식물체, 식물기관 또는 식물조직을 숙주로서 사용하는 경우, 본 발명의 단백질을 코딩하는 DNA는 식물 절편에 벡터를 아그로박테륨 감염법, 파티클 건법 또는 폴리에틸렌 글리콜법을 이용하여 도입함으로써 식물숙주를 형질전환시킬 수 있다. 다르게는, 벡터를 엘렉트로포레이션법에 의해 프로토플라스트에 도입하여 형질전환된 식물을 생성할 수 있다.
아그로박테륨 감염법에 의해 유전자를 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 도입하는 경우, 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 함유하는 아그로박테륨으로 식물을 감염시키는 공정이 필수적이다. 이 공정은 진공 인필트레이션(infiltration)법[CR Acad. Sci. Paris, Life Science, 316: 1194 (1993)]에 의해 실시할 수 있다. 특히, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)는 등량의 버미큘라이트와 펄라이트로 구성된 토양에서 생육된다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를, 본 발명의 유전자를 포함하는 플라스미드를 함유하는 아그로박테륨의 배양액에 직접적으로 침지시키고, 데시케이터에 넣은 다음 진공 펌프로 65-70 mmHg까지 흡입시킨다. 이어, 식물을 실온에서 5-10분간 방치시킨다. 화분을 트레이로 옮기고 랩(wrap)으로 싸서 습도를 유지시킨다. 다음 날 랩을 제거한다. 식물을 그대로 성장시켜 종자를 수확한다.
이어, 종자를 목적하는 유전자를 보유하는 개체를 선택하기 위해 적절한 항생물질을 첨가한 MS 한천 배지에 파종한다. 이 배지에서 성장한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 화분으로 옮기고 그 곳에서 성장시킨다. 그 결과, 본 발명의 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물의 종자를 수득할 수 있다. 일반적으로, 유전자는 유사한 방식으로 숙주 식물의 게놈으로 도입된다. 그러나, 유전자가 도입되는 게놈의 특정 위치의 차이로 인하여, 도입된 유전자의 발현이 다르게된다. 이러한 현상을 "위치 효과"라 칭한다. 도입 유전자의 DNA 단편을 프로브를 사용한 노던법으로 검정하는 것에 의해, 도입 유전자가 보다 강하게 발현하고 있는 형질전환체를 선택할 수 있다.
본 발명의 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물 및 그의 다음 세대에 목적하는 유전자가 통합되어 있는 것의 확인은 상기 식물의 세포 및 조직으로부터 DNA를 추출하고 또 도입 유전자를 당해 분야에서 통상적인 방법인 PCR법 또는 노던 분석법에 의해 검출하는 것에 의해 실시할 수 있다.
(3) 본 발명의 유전자의 식물조직에서의 발현 수준 및 발현 부위의 분석
본 발명의 유전자를 도입한 트랜스제닉 식물에 있어서 상기 유전자의 발현 수준 및 발현 부위의 분석은 식물의 세포 및 조직으로부터 RNA를 추출하고 또 당해 분야의 통상적인 방법인 RT-PCR법 또는 노던 분석에 의해 도입한 유전자의 mRNA를 검출하는 것에 의해 실시할 수 있다. 다르게는, 유전자 산물에 대한 항체를 사용하여 본 발명의 유전자의 웨스턴블럿 등에 의해 발현 수준 및 발현부위를 직접적으로 분석할 수 있다.
(4) 본 발명의 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물에서 각종 유전자의 mRNA 수준의 변화
본 발명의 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물에서 본 발명의 전사인자의 작용의 결과로서 발현 수준이 변화된 것으로 생각되는 유전자는 노던 하이브리다이제이션에 의해 확인할 수 있다.
예컨대, 수경재배 등으로 성장한 식물에 소정 기간(예컨대 1 내지 2주) 동안 환경 스트레스를 가한다. 환경 스트레스의 예는 저온, 건조 및 염 스트레스를 포함한다. 예컨대, 건조 스트레스는 수경재배 배지로부터 식물을 뿌리채 뽑아내서 여과지상에서 그것을 10분 내지 24시간 동안 건조시키는 것에 의해 가해질 수 있다. 저온 스트레스는 식물을 15 내지 -4℃에서 10분 내지 24시간 동안 유지시키는 것에 의해 가해질 수 있다. 염 스트레스는 예컨대 수경 용액을 50 내지 500 mM NaCl 용액으로 교체해서 식물을 10분 내지 24시간 동안 유지시키는 것에 의해 가해질 수 있다.
스트레스가 가해지지 않은 대조 식물 및 환경 스트레스가 가해진 식물로부터 전체 RNA를 제조하고 생성한 전체 RNA를 엘렉트로포레이션 처리시킨다. 관찰할 유전자의 프로브를 사용한 노던 하이브리다이제이션에 의해 발현 패턴을 분석할 수 있다.
(5) 환경 스트레스에 대한 트랜스제닉 식물의 내성 평가
본 발명의 유전자가 도입된 트랜스제닉 식물의 환경 스트레스에 대한 내성은 트랜스제닉 식물을 버미큘라이트, 펄라이트 등으로 구성된 토양을 함유하는 화분에심고, 그 식물을 다양한 환경 스트레스에 노출시키고 그 식물의 생존을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 환경 스트레스는 저온, 건조 및 염 스트레스를 포함한다. 예컨대, 건조 스트레스에 대한 내성은 식물에 물을 주지 않은 채 2 내지 4주 방치시킨 다음 그 생존을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다. 저온 및 동결 스트레스에 대한 내성은 식물을 15 내지 -10℃에서 1 내지 10일간 방치하고, 그것을 20 내지 35℃에서 2일 내지 3주간 성장시킨 다음 그의 생존율을 조사하는 것에 의해 실시할 수 있다. 염 스트레스에 대한 내성은 식물을 100 내지 600 mM NaCl에서 1시간 내지 7일간 방치하고, 20 내지 35℃에서 1 내지 3주간 성장시킨 다음 그의 생존율을 조사하는 것에 의해 평가할 수 있다.
6. 식물에서 스트레스 수준의 측정
본 발명에 따른 유전자의 전사는 저온 스트레스, 건조 스트레스 또는 염 스트레스에 의해 활성화된다. 따라서, 본 발명의 유전자의 전사 수준을 측정하면 식물에 가해진 저온, 건조 또는 염 스트레스와 같은 스트레스 수준을 평가할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자의 전사 수준은 예컨대 RNA 겔 블럿 분석법 또는 정량적 PCR에 의해 측정할 수 있다. RNA 겔 블럿 분석법에 사용되는 프로브는 본 발명에 따른 유전자 및/또는 이 유전자와 인접하는 특정 서열을 포함하는 100 내지 1000 bp 영역을 기초로, 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 정량적 PCR에 사용될 프라이머는 본 발명의 유전자를 코딩하는 영역 또는 그와 인접하는 영역에 있는 서열을 기초로하여 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다.
상술한 프로브 또는 프라이머는 본 발명에 따른 유전자의 전사 수준을 측정하기 위한 키트로서 사용될 수 있다.
7. 기타
또한, 본 발명에 따른 단백질은 단백질에 대한 항체를 제조하는 것에 의해 사용될 수 있다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 항체를 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 통상의 방법에 따라서 제조될 수 있다[예컨대, Sambrook, J et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 참조]. 상기 항체는 예컨대 웨스턴 블럿팅 또는 면역침강법에 의한 목적하는 단백질의 검출에 사용될 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 참조하여 더욱 자세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 벼 OsDREB 유전자의 스크리닝
1. 데이터베이스에 대한 상동성 검색
이하에 나타낸 바와 같은 DREB1A, DREB1B, DREB1C, DREB2A 및 DREB2B 유전자의 전장 아미노산 서열을 기초로하여, GenBank의 벼 DNA의 데이터베이스에 대한 BLAST에 의해 상동성 검색을 실시하였다.
그 결과, 4종류의 유전자가 발견되었다: EST 데이터로부터의 1종류(OsDREB1B), DREB1-상동 유전자 측면에서 게놈 서열 데이터로부터의 2종류(OsDREB1C 및 OsDREB1D), 및 DREB2-상동 유전자 측면에서 EST 데이터로부터의1종류(OsDREB2A).
2. cDNA 라이브러리의 검색
(1) cDNA 라이브러리의 제조
벼 종자(니혼바레종)를 증류수를 사용한 수경재배로, 암흑하 25℃에서 15일간 배양하였다. 생성한 식물체를 4℃에서 2시간 또는 24시간 동안 처리하고, 배양기로부터 뿌리채 뽑아서 여과지상에서 10일간 건조시키거나, 또는 250 mM NaCl로 10시간 동안 처리한 다음 액체 질소로 냉동시켰다. 냉동된 샘플로부터 구아니딘 티오시아네이트-염화 세슘법을 이용하여 전체 RNA를 추출하고, mRNA를 올리고(dt)-셀룰로오스 칼럼을 사용하여 제조하였다. 생성한 mRNA를 주형으로 사용하고 또 HybriZAP-2.1 two-hybrid cDNA Gigapak clonig kit(스트라타진 제조)를 이용하여 cDNA를 합성하고 그 cDNA를 HybridZAP-2.1 파아지미드 벡터의EcoRI-XhoI절단부위에 삽입 클로닝하였다. 이 파아지미드 DNA를 Gigapack III Gold packaing extract(스트라타진 제조)를 사용하여 팩케이징하였다. cDNA를 함유하는 수득한 람다 파아지 입자를 사용하여 숙주 대장균을 감염시킨 다음 증폭시키고 이어 회수하였다. 생성한 파아지 현탁액을 저장하였다.
(2) 프로브를 사용한 검색
(1)에서 수득한 OsDREB1D 게놈 서열의 ERF/AP2 도메인 및 N 말단측 보존 영역을 함유하는 서열을 PCR에 의해 증폭시켜 프로브를 작성하였다. (1)에서 제조된 cDNA 라이브러리는 상기 프로브를 사용하여 검색하였다. 그 결과, 새로운 DREB1-상동성 cDNA(OsDREB1A)를 얻었다.
OsDREB1B에 상당하는 EST 클론은 벼 게놈 연구 프로젝트에 의해 제공되었다. 단백질-코딩 영역의 전장을 증폭시키기 위하여, OsDRE1C 및 OsDREB1D를, 전사 개시 부위 및 종결 코돈의 게놈 서열로부터 예상한 것을 기초로 작성된 프라이머를 사용하여 PCR 처리시켰다.
OsDREB2A의 전장 cDNA를 검색하기 위한 프로브는 EST의 서열을 기초로 제조함으로써 cDNA 라이브러리를 검색하였다. 생성한 cDNA는 불완전한 길이로 예상되기 때문에, cDNA 라이브러리로부터 제조된 DNA를 전장 서열을 결정하기 위한 주형으로서 사용하여 5'RACE를 실시하였다. 상기 서열을 기초로하여, 전장 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머를 설계하고 RT-PCR에 의해 전장 유전자를 얻었다.
(3) 뉴클레오티드 서열의 결정
생성한 DREB-상동성 유전자의 cDNA의 뉴클레오티드 서열은 377 DNA 서열결정기(퍼킨-엘머 제조)를 이용하여 결정하였다. 또한 ORF를 분석하여 모든 아미노산 서열을 결정하였다.
결과:
그 결과, 5종류의 OsDREB 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 OsDREB 단백질의 상응하는 아미노산 서열을 확인하였다. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB 단백질로서, 모든 OsDREB 단백질은 중앙부에 ERF/AP2 DNA 결합 도메인, N-말단에 핵 이행 시그널 및 C-말단에 산성 액티베이션 도메인으로 추정되는 영역을 갖고 있었다(도 1).
도 2 및 도 3에서, 다양한 식물로부터의 DREB-상동성 단백질의 아미노산 서열을 서로 비교하여 고도로 보존된 서열을 찾고자 하였다. 색을 가진 배경상의 도더라지는 글자가 고도로 보존되는 영역을 나타낸다.
각 OsDREB의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열의 서열번호는 다음과 같다:
OsDREB1A: 뉴클레오티드 서열(서열번호 1), 아미노산 서열(서열번호 2)
OsDREB1B: 뉴클레오티드 서열(서열번호 3), 아미노산 서열(서열번호 4)
OsDREB1C: 뉴클레오티드 서열(서열번호 5), 아미노산 서열(서열번호 6)
OsDREB1D: 뉴클레오티드 서열(서열번호 7), 아미노산 서열(서열번호 8)
OsDREB2A: 뉴클레오티드 서열(서열번호 9), 아미노산 서열(서열번호 10)
[서열 2] OsDREB 단백질의 DRE 결합능의 분석
글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST)와 OsDREB1A 및 OsDREB2A 단백질의 융합 단백질은 대장균을 사용하여 제조하였다. 생성한 단백질을 겔 시프트 분석법에 의해 분석하여 DRE에 대한 단백질의 결합능을 조사하였다.
OsDREB1A cDNA의 뉴클레오티드 서열의 위치 69 내지 위치 545에 위치한 477 bp의 DNA 단편 또는 OsDREB2A cDNA의 뉴클레오티드 서열의 위치 334 내지 위치 822에 위치하는 489 bp의 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켰다. 이어, 증폭된 단편을 플라스미드 pGEX-4T-1(파마시아 제조)의EcoRI-XhoI부위에 결찰시켰다. 이 플라스미드를 대장균 XL1-Blue MRF에 도입한 후, 이 대장균을 500 ml의 2 x YT 배지(Molecular Cloning (1982), Cold Spring Harbor Laboratory Press)에서 배양하였다. 이 배양물에, 플라스미드 pGEX-4T-1의 프로모터를 활성화시키는 0.1 mM 이소프로필 β-티오갈락토사이드를 부가하여 단백질 OsDREB1A와 GST의 융합 단백질의 합성을 유도하였다.
단백질이 유도된 대장균을, 18 ml의 완충액(10 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 400 mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.1 mM 플루오르화 페닐메틸술포닐, 0.1 mM 디티오트레이톨)에 현탁시켰다. 이어, 1% Triton X-100 및 1 mM EDTA를 부가하였다. 세포를 초음파처리에 의해 파쇄시킨 후, 파쇄된 물질을 20,000 g에서 1시간 동안 원심분리시켰다. 이어, 단백질을 글루타치온-세파로오스(파마시아 제조)를 이용하여 상층액으로부터 정제시켰다. 생성한 융합 단백질을,32P로 표지된 DRE 서열-함유 75 bp DNA 단편(서열번호 16)을 프로브로 사용하여 실온에서 20분간 배양하였다. 이 혼합물을, 0.25x Tris-붕산염-EDTA를 함유하는 5% 폴리아크릴아미드를 사용하여 90분간 전기영동시켰다. 상기 겔 시프트 분석의 결과로, 뒤쪽으로 이동하는 밴드가 검출되었다. 돌연변이된 DRE 서열을 함유하는 DNA 단편을 프로브로 사용하면, 이러한 밴드는 검출되지 않았다. 따라서, OsDRE1A 및 OsDREB2A 단백질이 특이적으로 DRE 서열에 결합하는 것이 분명하게 되었다(도 4).
[실시예 3] 형질전환체(트랜스제닉 식물)의 제조
(1) 식물 플라스미드의 작성
1) OsDREB1A 유전자 단편의 제조
OsDREB1A 유전자의 cDNA의 뉴클레오티드 서열의 위치 69 내지 위치 785에 위치하는 717bp DNA 단편을 이하의 프라이머를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. 그후,증폭된 단편을 벡터 pBluescript SK(-) (스트라타진 제조)의BamHI절단부위에 결찰시켜 재조합 플라스미드 pSKOsDRE1A를 얻었다. 이 pSKOsDREB1A를BamHI으로 분해시켜 OsDREB1A 유전자를 함유하는 약 700 bp DNA 단편을 얻었다.
Forward: 5'-GGGGATCCATGTGCGGGATCAAGCAGGAGATG-3' (서열번호 22)
Reverse: 5'-GGGGATCCCTAGTAGCTCCAGAGTGGGAC-3' (서열번호 23)
2) pBE2113Not, G-ubi, G35S-ShΔ의 제조
pBE2113Not (Plant Cell 10: 1391-1406 (1998)), G-ubi 및 G35S-ShΔ를 프로모터 DNA를 갖는 플라스미드로서 사용하였다. G-ubi 및 G35S-ShΔ는 다음과 같이 제조하였다. 우선, pBIG 플라스미드(Nucleic Acids Research 18: 203 (1990))를BamHI으로 절단 및 평활화 처리한 후 결찰시켜BamHI절단부위를 제거하였다. 그후, 이 플라스미드를HindIII및EcoRI으로 절단하였다. 생성한 단편 및 동일한 방식으로 pBE2113Not 플라스미드를 절단시켜 얻은 약 1.2 kb 단편을 서로 결찰시켜 pBIG2113Not 플라스미드를 작성하였다.
이어, 이 pBIG2113Not를HindIII및BamHI으로 절단하고, 동일한 방식으로 절단된 rd29A 프로모터 (약 0.9 kb, Nature Biotechnology 17: 287-291 (1999))의 단편에 걸찰시켜 pBIG29APHSNot 플라스미드를 작성하였다. 이어, 이 pBIG29APHSNot 플라스미드를HindIII및SalI으로 절단한 다음, 동일한 방식으로 절단된 옥수수의 유비퀴틴 유전자(Ubi-1) 프로모터의 단편(약 2.0 kb, Plant Molecular Biology 18: 675-689 (19920)에 결찰시키거나, 또는 p35S-shΔ-stop의 CaMV 35S 프로모터 및 옥수수의 수크로오스 합성효소 유전자(Sh1)의 인트론의 일부를 함유하는 단편(약 1.6kb, Proceeding National Academy of Science USA 96: 15348-15353 (1999))에 결찰시켰다. 이렇게하여, G-ubi 플라스미드 또는 G35S-shΔ 플라스미드를 제조하였다. 상술한 pBE2113Not, G-ubi 및 G35S-shΔ를 각각BamHI으로 절단하고 Ligation high (토요보 컴패니 리미티드 제조)를 사용하여 OsDREB1A 유전자 단편에 결찰시켰다. 이렇게하여 수득한 결찰산물을 사용하여 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 형질전환체를 배양한 후, 그로부터 플라스미드 pBE35S: OsDREB1A, G-ubi: OsDREB1A 및 G35S-ShΔ: OsDREB1A를 정제하였다. 이어, 이들의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 센스 방향으로 결합된 OsDREB1A 유전자를 갖는 서열을 선택하였다.
3) 아그로박테륨으로 도입
pBE35S: OsDREB1A 함유 대장균 DH5α, 헬퍼 플라스미드 pRK2013-함유 대장균 HB101 및 아그로박테륨 C58을 혼합하고 LB 한천 배지, 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 생성한 콜로니를 긁어내고 1 ml의 LB 배지에 현탁시켰다. 이 현탁액(10 ㎕)을, 100 mg/리터의 리팜피실린 및 20 mg/리터의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 배지에 피복하고 28℃에서 2일간 배양하여 접합체 아그로박테륨 C58 (pBE35S: OsDREB1A)을 얻었다. 엘렉트로포레이션에 의해, 플라스미드 G-ubi: OsDREB1A 및 플라스미드 G35S-ShΔ: OsDREB1A를 별도로 아그로박테륨 EHA105에 도입한 다음, 배양한 후 10% 글리세롤로 세척하였다. 이렇게하여, 아그로박테륨 EHA105 (G-ubi: OsDREB1A) 및 아그로박테륨 EHA105 (G35S-shΔ: OsDREB1A)를 제조하였다.
(2) 아그로박테륨 감염에 의한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로 유전자 도입
상기 접합체를, 100 mg/리터의 리팜피실린 및 20 mg/리터의 카나마이신을 함유하는 10 ml의 LB 배지중, 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이어, 이 배양액을 500 ml의 LB 배지에 부가하여 24시간 동안 배양하였다. 생성한 배양액을 원심분리에 의해 배지를 제거하고, 500 ml의 감염용 완충액[1 리터당 2.3 g의 무라시게 및 스쿠그 Plant Salt Mixture (니혼 파마슈티컬 컴패니 리미티드 제조), 1 ml의 감보르그 비타민 용액, 50 g의 수크로오스, 200 ㎕의 L-77 (니뽕 유니카 컴패니 리미티드 제조) 및 10 ㎍의 6-벤질아미노퓨린]에 현탁시켰다.
한편, 4 내지 5개의 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물체를, 등량의 버미큘라이트 및 펄라이트로 구성된 토양을 함유하는 9 cm 화분에서 6주간 성장시켰다. 이어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 식물체를 아그로박테륨 C58 (pBI35S: OsDREB1A)의 아그로박테륨 현탁액에 직접적으로 침지시키고 이것을 데시케이터에 넣고 진공 펌프로 흡입하여 650 mm Hg까지 감압시킨 다음 10분간 방치하였다. 이어, 식물 화분을 트레이로 옮기고 랩을 씌어 습도를 유지하였다. 그 다음 날, 랩을 제거하였다. 그후, 식물을 그대로 생육시켜 종자를 생성하였다. 차아염소산 나트륨 수용액으로 멸균시킨 후, 종자를 선택용 한천 배지(100 mg/리터의 반코마이신 및 30 mg/리터의 카나마이신이 보충된 MS 배지)상에서 성장시켰다. 이 배지상에서 성장한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 화분으로 옮겨 형질전환된 식물의 종자를 얻었다.
(3) 아그로박테륨 감염에 의한 벼로의 유전자 도입
벼 종자를 70% 에탄올중에서 1분간 침지시킨 다음 2% 차아염소산 나트륨에 1시간 동안 침지시키는 것에 의해 멸균시켰다. 멸균된 종자를 멸균수로 세척하고 각 종자 9개를 N6D 고형배지[1 리터당 3.98 g의 CHU[N6] Basal Salt Mixture (시그마 제조), 30 g의 수크로오스, 100 mg의 미오-이노시톨, 300 mg의 카사미노산, 2.878 mg의 L-프롤린, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 염산, 1 mg의 티아민 염산, 2 mg의 2,4-D 및 4 g의 겔라이트, pH 5.8) 플레이트에 파종한 다음 24일간 배양하였다. 따라서, 캘러스가 유도되었다. 약 20개 종자로부터 형성된 캘러스를 새로운 N6D 고형 배지로 옮긴 다음 3일간 더 배양하였다.
별도로, 아그로박테륨 EHA105 (G-ubi: OsDREB1A) 및 아그로박테륨 EHA105 (G35S-ShD: OsDREB1A)를, 100 mg/리터의 리팜피실린 및 20 mg/리터의 카나마이신을 함유하는 5 ml의 YEP 배지[1리터당 10 g의 Bacto 펩톤, 10 g의 Bacto 효모 추출물, 5 g의 NaCl 및 406 mg의 MgCl2·6H2O, pH 7.2]중, 28℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이 아그로박테륨을, 20 mg/리터의 아세토시린곤을 함유하는 AAM 배지[1리터당 10 mg의 MnSO4·5H2O, 3 mg의 H3BO3, 2 mg의 ZnSO4·7H2O, 250 ㎍의 Na2MoO4·2H2O, 25 ㎍의 CuSO4·5H2O, 25 ㎍의 CoCl2·6H2O, 750 ㎍의 KI, 150 mg의 CaCl2·2H2O, 250 mg의 MgSO4·7H2O, 40 mg의 Fe-EDTA, 150 mg의 NaH2PO4·2H2O, 1 mg의 니코틴산, 10 mg의 티아민 염산, 1 mg의 피리독신 염산, 100 mg의 미오-이노시톨, 176.7 mg의 L-아르기닌, 7.5 mg의 글리신, 900 mg의 L-글루타민, 300 mg의 아스파탐산 및 3 g의 KCl, pH 5.2)로 희석시켜 O.D.660을 0.1로 만들었다. 이어, 20 ml의 아그로박테륨 현탁액을 제조하였다.
이어, 3일간 배양된 캘러스에 아그로박테륨 현탁액을 부가한 다음 1분간 혼합하였다. 그후, 상기 캘러스를 멸균 종이 타월에 놓아 과량의 아그로박테륨 현탁액을 제거한 다음 멸균 여과지가 놓인 2N6-AS 고형 배지[1리터당 3.98 g의 CHU[N6] Basal Salt Mixture, 30 g의 수크로오스, 10 g의 글루코오스, 100 mg의 미오-이노시톨, 300 mg의 카사미노산, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 염산, 1 mg의 티아민 염산, 2 mg의 2,4-D, 10 mg의 아세토시린곤 및 4 g의 겔라이트, pH 5.2]중, 25℃에서 3일간 암소에서 배양하였다. 3일간 배양한 후, 배양산물을, 그 산물이 백탁되지 않을 때 까지 500 mg/리터의 카르베니실린을 함유하는 3% 수크로오스 수용액으로 완전히 세척하였다. 세척된 배양산물을, 500 mg/리터의 카르베니실린 및 10 mg/리터의 히그로마이신을 함유하는 N6D 고형 배지상에서 1주간 더 배양하였다. 그후, 생성한 배양산물을, 500 mg/리터의 카르베니실린 및 50 mg/리터의 히그로마이신을 함유하는 N6D 고형배지로 옮겨서 18일간 배양하였다. 또한, 캘러스를 재생 배지[1 리터당 4.6 g의 무라시게 및 스쿠그 Plant Salt Mixture (니혼 파마슈티컬 컴패니 리미티드 제조), 30 g의 수크로오스, 30 g의 소르비톨, 2 g의 카사미노산, 100 mg의 미오-이노시톨, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 염산, 0.1 mg의 티아민 염산, 0.2 mg의 NAA, 2 mg의 키네틴, 250 mg의 카르베니실린, 50 mg의 히그로마이신 및 8 g의 아가로오스, pH 5.8]로 옮겼다. 그 산물을 매주 새로운 배지로 옮기고 재생시켰다. 약 1 cm까지 성장한 싹을 갖는것을 호르몬을 갖지 않는 배지[1리터당 4.6 g의 무라시게 및 스쿠그 Plant Salt Mixture (니혼 파마슈티컬 컴패니 리미티드 제조), 30 g의 수크로오스, 2 mg의 글리신, 0.5 mg의 니코틴산, 0.5 mg의 피리독신 염산, 0.1 mg의 티아민 염산, 50 mg의 히그로마이신 및 2.5 g의 겔라이트, pH 5.8)로 옮겼다. 호르몬을 갖지 않는 배지상에서 약 8 cm로 성장한 식물체를, 합성 입상 포팅 토양(Bonsol No. 1, 스미토모 케미컬 컴패니 리미티드 제조)으로 전달하여 트랜스제닉 식물이 종자를 생성하도록 하였다.
[실시예 4] 벼 프로토플라스트를 사용한 전사 활성화 메카니즘의 분석
도 5에 도시한 바와 같이, 이펙터 플라스미드를 작성하기 위하여, OsDREB1A cDNA, OsDREB2A cDNA, DREB1A cDNA 및 DREB2A cDNA를 CaMV 35S 프로모터와 옥수수의 수크로오스 합성효소의 인트론 서열의 하류에 위치시키고 pBI221 플라스미드(클론테크 제조)에 결찰시켰다. 이와 별도로, 최소 프로모터-61rd29A 및 GUS 리포터 유전자의 상류에 rd-29A 프로모터의 DRE를 함유하는 75 bp DNA 단편이 2회 반복해서 삽입된 리포터 플라스미드를 작성하였다.
이어, 이들 2개 플라스미드를 벼 프로토플라스트에 도입하고 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루쿠로니드의 분해에 의한 형광 세기에서의 변화를 기초로 GUS 활성을 측정하였다. CaMV35S 프로모터-LUC의 융합 유전자도 각 실험에서 도입 효율에 대한 표준으로서 동시에 도입하였다. 그 결과, OsDREB1A 및 OsDREB2A 유전자는 DRE를 통하여 전사를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다.
[실시예 5] 형질전환체에서 OsDREB 유전자의 발현 분석
(1) 비형질전환체에서 OsDREB 유전자의 발현 분석
야생형 벼에서 OsDREB1A, OsDREB1B, OsDREB1C 및 OsDREB2A 유전자의 발현특성은 노던 하이브리다이제이션법에 의해 분석하였다. 수경재배로, 25℃에서 낮 16시간 및 밤 8시간의 일조 조건으로 17일간 벼를 재배하였다. 압시신산, 건조, 저온, 염(NaCl), 상해 및 물 스트레스를 식물체에 각기 부여하였다. 매 0, 10, 20, 40, 60분, 2, 5, 10 및 24시간 마다 스트레스 부가된 벼에 대한 샘플링을 실시하였다.
각 스트레스는 다음과 같이 벼에 부가하였다: 압시신산 스트레스는 100 μM ABA를 함유하는 용액에 침지시키는 것에 의해 부가되며; 건조 스트레스는 여과지상에서 건조시키는 것에 의해 부가되며; 저온 스트레스는 4℃로 냉각된 배양기로 전달하는 것에 의해 부가되며; 염(NaCl) 스트레스는 250 mM NaCl을 함유하는 수용액중에 침지시키는 것에 의해 부가되며; 상해 스트레스는 8 내지 10 cm- 높이의 잎으로 절단하는 것에 의해 부가되었다. 스트레스를 부가하지 않은 대조 식물과 스트레스가 부가된 상기 식물로부터 전체 RNA를 별도로 제조하였다. 이 RNA를 전기영동처리시켰다. 이렇게하여, 노던법에 의해 각 유전자의 발현을 관찰하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
분석으로부터, OsDREB1A 유전자의 발현과 OsDREB1B의 발현은 주로 저온 스트레스에 의해 유도되었다. 대조적으로, OsDREB2A의 발현은 주로 건조 및 염 스트레스에 의해 유도되었다. OsDREB1C에서는 유전자 발현이 일정하게 확인되었다.
(2) 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에서 OsDREB유전자의 발현분석
실시예 3과 유사한 방식으로, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에 도입된 OsDREB1A, OsDREB1D 및 OsDREB2A 유전자를 갖는 형질전환체를 제조하였다. 이 형질전환체 도입 유전자 OsDREB1A, OsDREB1D 및 OsDREB2A와 도입 유전자가 발현을 변화시킨 것으로 생각되는 유전자의 mRNA 수준을 노던법에 의해 분석하였다. 특히, rd29A 유전자, cor15a 유전자, kin1 유전자 및 erd10 유전자의 부분적 단편을 프로브(rd29A: 서열번호 24, cor15a: 서열번호 25, kin1: 서열번호 26, erd10: 서열번호 27)로서 사용하여 mRNA 수준을 분석하였다. 형질전환체 이외에, DREB 상동 유전자를 함유하지 않는 pBI121 플라스미드(클론테크 제조)를 도입한 형질전환 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 대조용으로서 사용하여 유전자 발현을 비교하였다.
GM 한천 배지상에서 3주간 성장한 약 1 g의 식물체를 건조 스트레스 및 저온 스트레스에 노출시켰다. 건조 스트레스는 식물을 한천 배지로부터 뿌리채 뽑아 페트리 접시에서 5시간 동안 건조시키는 것에 의해 가해졌다. 저온 스트레스는 식물을 4℃에서 5시간 동안 배양하는 것에 의해 가해졌다. 스트레스가 부가되지 않은 대조 식물 및 건조 스트레스 및 저온 스트레스가 가해진 식물로부터 각기 전체 RNA를 제조하였다. 생성한 전체 RNA를 전기영동처리시켰다. 이어, 노던법에 의해 유전자 발현을 분석하였다.
일반적으로, 유전자는 형질전환체의 게놈에 유사한 방식으로 도입되지만, 게놈에서의 위치 차이로 인하여 도입된 유전자의 발현은 다르게된다. 이러한 현상을"위치 효과"라 칭한다. 이 실험에서는, 도입 유전자의 DNA 단편을 프로브로 사용하고 노던법에 의해 형질전환체를 분석하는 것에 의해, 도입 유전자가 강하게 발현되어 있는 형질전환체를 선택하였다. 또한 스트레스 내성에 관련될 수 있는 유전자의 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 것에 의해, OsDREB1A를 도입하였다. 이렇게하여, mRNA의 수준이 상이한 유전자를 확인하였다. 그 결과를 도 7에 도시한다.
그 결과, 프로모터에 GCCGAC를 갖는 유전자는 ACCGAG를 갖는 유전자에 비하여 더 강하게 유도되었다. 단자엽 식물의 스트레스 내성 유전자 군에서, GCCGAC를 DRE 서열로서 갖는 군은 ACCGAG를 갖는 군에 비하여 더 많은 양으로 존재한다. 따라서, 단자엽 식물에서, OsDREB 유전자는 DREB 유전자에 비하여 더욱 효과적으로 스트레스 내성 유전자를 발현시킬 수 있다는 것이 시사된다.
(3) 형질전환된 벼에서 OsDREB 유전자의 발현 분석
실시예 3과 유사한 방식으로, 벼에 도입된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 OsDREB1A, OsDREB1B 및 DREB1C 유전자를 갖는 형질전환체를 제조하였다. 형질전환체 도입 유전자 OsDREB1A, OsDREB1B 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 DREB1C와 도입 유전자가 발현을 변화시킨 것으로 생각되는 유전자의 mRNA 수준을 노던법에 의해 분석하였다. 특히, OsDREB1A 유전자, OsDREB1B 유전자, DREB1C 유전자, lip9 유전자, Wsi724 유전자 및 SalT 유전자의 부분적 단편을 프로브(OsDREB1A: 서열번호 28, OsDREB1B: 서열번호 29, DREB1C: 서열번호 30, lip9: 서열번호 31, Wsi724: 서열번호 32 및 SalT: 서열번호 33)로서 사용하여 mRNA의 발현 수준을 분석하였다. 이 분석에서는, 형질전환체 이외에, DREB 상동 유전자를 포함하지 않는 G-ubi를 갖는 형질전환된 벼를 대조용으로 사용하여 유전자 발현을 비교하였다.
30 mg/ml의 히그로마이신을 함유하는 0.1% 벤레이트 용액에서 5일간 선택을 실시하였다. 그후, 식물을, Bonsol No. 1을 함유하는 화분으로 옮겨서 12일간 성장시켰다. 성장한 식물 약 2g을 염(NaCl) 및 저온 스트레스에 처리시켰다. 염 스트레스는 식물체를 토양으로부터 뿌리채 뽑아서 시험관내 250 mM NaCl에 5시간 동안 침지시키는 것에 의해 부가된다. 저온 스트레스는 식물체를 4℃에서 5시간 동안 배양하는 것에 의해 부가된다. 스트레스가 부가되지 않은 대조 식물과 염 스트레스 및 저온 스트레스가 부가된 식물로부터 각각 전체 RNA를 제조한 다음 전기영동처리시켰다. 이렇게하여, 각 유전자를 발현을 (2)에서와 동일한 방식으로 노던법에 의해 관찰하였다. 결과를 도 8에 도시한다.
그 결과, OsDREB1A, OsDREB1B 및 DREB1C 유전자가 도입된 형질전환된 벼에서, 프로모터 영역에 DRE 서열을 갖는 lip9 유전자의 발현이 유도되었고, DRE 서열을 프로모터 영역에 갖지 않는 salT 유전자의 발현은 유도되지 않았다. 또한, 프로모터 영역이 확인되지 않았지만 스트레스 부가시 발현 패턴(건조, 염, 저온 유도성이 건조, 염에 비하여 느림)으로부터 OsDREB의 표적으로 되어 있는 것으로 예상된 Wsi724 유전자의 발현도 이들 형질전환체에서 유도되었다.
[실시예 6] 아라비돕시스 탈리아나( Arabidopsis thaliana )의 스트레스 내성에 대한 OsDREB 유전자의 영향
실시예 3과 동일하게 하여, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)에도입된 OsDREB1A 및 DREB1A 유전자를 갖는 형질전환체를 제조하였다. 대조용으로서, DREB-상동 유전자를 함유하지 않는 pBI121로 형질전환된 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 제조하였다. 다음 조건하에서 각 내성 실험을 실시하였다.
(1) NaCl 내성
NaCl 내성은 다음과 같이 조사하였다. GM 배지에서 3주간 성장한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 600 mM NaCl의 수용액에 2시간 동안 침지시킨 다음 세척하였다. 그후, 식물체를 프로페셔널 포팅 토양을 함유하는 화분으로 옮겨서 3주간 배양한 다음 그의 생존율을 평가하였다.
(2) 건조 내성
건조 내성은 다음과 같이 조사하였다. GM 배지에서 3주간 성장한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를, 동량의 버미큘라이트 및 펄라이트로 구성된 토양을 함유하는 화분에 옮겨서 1주간 배양한 다음 물 공급을 중지하였다. 2주간 배양한 후, 그의 생존율을 평가하였다.
(3) 동결 내성
동결 내성은 다음과 같이 조사하였다. GM 배지에서 3주간 성장한 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를, 프로페셔널 포팅 토양을 함유하는 화분으로 옮겨서 1주간 배양하였다. 그후, 식물체를 -6℃에서 36시간 동안 방치한 다음 22℃에서 5일간 배양하였다. 그의 생존율을 평가하였다.
염 스트레스 내성을 조사하기 위한 실험에서, 생존율은 대조용의 경우 12%이었고 OsDREB1A-도입된 식물의 경우 55% 또는 65% 이었다. DREB1A-도입된 식물의 경우, 생존율은 35S: DREB1A에서는 68%이었고 29A:DREB1A에 대하여는 90% 이었다. 이것은 OsDREB 유전자가 쌍자엽 식물에서 스트레스 내성을 향상시킨다는 것을 시사한다(도 9).
본 명세서에서 인용한 모든 문헌, 특허 및 특허 출원은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.
서열목록의 설명:
서열번호 12: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB1A 유전자의 코딩서열에 의해 코딩되는 단백질,
서열번호 14: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB2A 유전자의 코딩서열에 의해 코딩되는 단백질,
서열번호 16: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB1B 유전자의 코딩서열에 의해 코딩되는 단백질,
서열번호 18: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB1C 유전자의 코딩서열에 의해 코딩되는 단백질,
서열번호 20: 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터 유도된 DREB2B 유전자의 코딩서열에 의해 코딩되는 단백질,
서열번호 21: 프로브,
서열번호 22: 프라이머
서열번호 23: 프라이머
서열번호 24: rd29a용 프로브
서열번호 25: cor15a용 프로브
서열번호 26: kin1용 프로브
서열번호 27: erd10용 프로브
서열번호 28: OsDREB1A용 프로브
서열번호 29: OsDREB1B용 프로브
서열번호 30: DREB1C용 프로브
서열번호 31: lip9용 프로브
서열번호 32: Wsi724용 프로브
서열번호 33: salT용 프로브
본 발명은 단자엽 식물 유래의 스트레스 내성 전사 인자 및 이 전사 인자를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명에 따른 유전자의 사용에 의해 단자엽 식물인 곡물류에 스트레스 내성을 보다 효과적으로 전달할 수 있다.

Claims (12)

  1. 하기 DNA (a) 또는 (b)를 포함하는 분리된 유전자:
    (a) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA; 또는
    (b) 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA와 스트린젠트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈(hybridize)되며 또 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질을 코딩하는 DNA.
  2. 하기 단백질(c) 또는 (d)를 코딩하는 분리된 유전자:
    (c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
    (d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고 또 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스트레스가 건조 스트레스, 저온 스트레스또는 염 스트레스인 유전자.
  4. 하기 재조합 단백질 (c) 또는 (d):
    (c) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질; 또는
    (d) 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8 또는 서열번호 10에 나타낸 아미노산 서열에서 하나 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고 또 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 스트레스가 건조 스트레스, 저온 스트레스 또는 염 스트레스인 단백질.
  6. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  8. 제7항에 있어서, 숙주가 식물인 형질전환체.
  9. 제7항에 있어서, 숙주가 단자엽식물인 형질전환체.
  10. 제8항 또는 제9항에 따른 형질전환체를 배지에서 배양하고 생성한 배양 산물로부터 단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는, 스트레스 응답성 엘리먼트의 하류에 위치하는 유전자의 전사를 제어하는 단백질의 제조방법.
  11. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 유전자의 식물체에서의 전사 수준을 측정하는 것을 특징으로하는, 식물에서 스트레스 수준을 측정하는 방법.
  12. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 따른 유전자를 식물에 도입하는 것에 의해 식물의 스트레스 내성을 향상시키는 방법.
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