KR101056733B1 - 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법 - Google Patents

히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101056733B1
KR101056733B1 KR1020080095267A KR20080095267A KR101056733B1 KR 101056733 B1 KR101056733 B1 KR 101056733B1 KR 1020080095267 A KR1020080095267 A KR 1020080095267A KR 20080095267 A KR20080095267 A KR 20080095267A KR 101056733 B1 KR101056733 B1 KR 101056733B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
histone
h3k27me3
primer pair
low temperature
Prior art date
Application number
KR1020080095267A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20100035891A (ko
Inventor
권창섭
Original Assignee
한국과학기술원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술원 filed Critical 한국과학기술원
Priority to KR1020080095267A priority Critical patent/KR101056733B1/ko
Publication of KR20100035891A publication Critical patent/KR20100035891A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101056733B1 publication Critical patent/KR101056733B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

본 발명은 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저온 유도성 유전자에서 H3 히스톤 단백질의 27번째 아미노산인 리신에서의 3중 메틸화(H3K27me3)를 탐색하는 것을 특징으로 하는 식물체의 저온 노출 여부를 탐색하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 통상의 저온 유도성 유전자의 발현을 확인하는 것 보다 원하는 식물이 저온에 노출되었는지 여부를 좀 더 정확하게 탐색할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 환경 스트레스의 분석을 위하여 정밀한 재배가 요구되는 다양한 경우에 저온 노출 여부의 확인을 위하여 사용할 수 있다.
히스톤, 메틸화, 저온, 스트레스

Description

히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법{Method for detecting cold exposure of plant using histone trimethylation}
본 발명은 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 저온 유도성 유전자에서 H3 히스톤 단백질의 27번째 아미노산인 리신에서의 3중 메틸화(H3K27me3)를 탐색하는 것을 특징으로 하는 식물체의 저온 노출 여부를 탐색하는 방법에 관한 것이다.
진핵세포의 DNA는 히스톤이라는 옥타머(octamer) (H2A, H2B, H3, H4) 염기성 단백질에 2번 감겨 있으면서(총 146염기) 좁은 핵 내 공간에 압축되어 저장되어 있다. 이 같은 압축된 DNA를 유전정보로 활용하기 위해서는 압축을 다시 풀어야 하는데, 이를 위해 세포에는 크로마틴의 구조를 변형, 조절할 수 있는 기전이 있을 것이라 예상하여 왔으며, 최근의 연구결과 뉴클레오솜(nucleosome) 구조를 변형하여 전사 인자와 DNA와의 접근을 촉진시키는 크로마틴 리모델링 인자(chromatin remodeling factor) (SWI/SNF, RSC, NURF, NRD 등이 속함)와 히스톤의 아세틸화 상태를 조절하는 히스톤 아세틸전이효소(Histone acetyltransferase)와 히스톤 디아 세틸라제(HDACs), 히스톤의 메틸화 상태를 조절하는 히스톤 메틸전이효소(Histone methyltransferase)가 중요한 조절 인자임이 밝혀졌다. 특히 히스톤의 아미노 말단에 존재하는 라이신 잔기(H4의 경우 4개)의 양전하를 아세틸화로 중화시키거나(전사 활성화 유도) 탈 아세틸화로 다시 전하를 유도(전사 억제 유도)함으로써, 히스톤의 아세틸화 수준의 평형을 유도하여 전사(transcription) 수준에서 유전자 발현 스위치의 온/오프(on/off)를 조절하는 것으로 알려져 있다.
최근 연구는 히스톤 메틸화 현상이 유전자 침묵화 또는 유전자 활성에 영향을 주고 있음을 보여주고 있다. 메틸화는 히스톤 라이신 잔기와 알기닌 잔기에서 일어나는데 이 때 라이신 잔기에 일어나는 메틸화는 히스톤 메틸 전이효소 (methyltransferase)에 의해서 수행된다. 이들은 대부분의 경우 잘 보존된 SET-도메인을 포함하고 있다.
한편, 식물은 생장시 다양한 환경스트레스에 노출된다. 식물 환경스트레스는 식물의 성장 및 발달에 장애가 되는 모든 요인을 말하며, 병균이나 해충 등에 의한 생물학적 스트레스 (biotic stress)와 고온, 냉해, 동해와 같은 온도변화에 의한 재해, 염해, 한발, 산소부족, UV, 중금속 및 기타 공해 물질 등과 같은 물리 화학적 환경의 변화로 일어나는 비생물학적 스트레스 (abiotic stress)로 구분한다. 환경스트레스는 식물의 생육에 영향을 미쳐 수확량에도 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나, 제어된 조건에서만 재배하기가 어렵기 때문에 갑작스런 환경 스트레 스에는 적절하게 대응하지 못하는 것이 현실이다.
식물은 다양한 환경적 스트레스와 병원균의 공격으로부터 살아남기 위하여 체내에 나름대로의 반응 메커니즘을 갖고 특정 유전자의 발현을 통해 스트레스 적응과 식물 방어 기능을 갖는 여러 가지 관련 단백질을 생산하며, 이 과정에 있어서 전사 수준의 유전자 발현 조절은 중요한 영향을 미치게 된다. 하지만, 이런 스트레스 관련 유전자는 일반적으로 스트레스를 받을 경우 그 발현이 급격히 증가하지만, 스트레스가 사라지는 경우 다시 급격히 감소하는 경향을 보여, 스트레스 당시를 정확히 모니터하지 않는 경우 스트레스를 받았는지 여부를 확실히 확인하기 어려운 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 저온 유도성 유전자에서 그 유전자의 발현 조절에 관하여하는 히스톤 H3의 삼중메틸화(H3K27me3)에 대해서 연구하던 중 히스톤 H3의 삼중메틸화가 저온 유도성 유전자의 발현과 일정한 상관관계를 가지고, 히스톤 H3의 삼중메틸화가 저온 유도성 유전자 보다 탐색이 용이함을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대한 항체; 및 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 식물체의 저온 노출 탐색용 조성물, 상기 프라이머 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 식물체의 저온 노출 여부의 탐색 방법은 저온 유도성 유전자에서 히스톤의 삼중메틸화를 탐색하는 것을 특징으로 한다.
히스톤 단백질은 진핵 세포 전체에 고도로 보존되는 염기성 단백질의 패밀리로서, 히스톤 H1, H2A, H2B, H3 및 H4 등이 알려져 있으며, 코어 히스톤, 일명, H2A, H2B, H3, 및 H4는 뉴클레오좀을 형성하는 단백질 코어를 이룬다. DNA는 이러한 단백질 코어 주위를 감고 있으면서, 그러한 히스톤의 염기성 아미노산이 DNA의 음으로 하전된 인산염 기와 상호작용한다. DNA의 약 146 염기쌍이 히스톤 코어 주위를 감아서 뉴클레오좀 입자, 즉, 크로마틴의 반복적 구조 모티프를 형성한다.
그 중 본 발명에서 탐색하는 삼중메틸화가 이루어지는 부분은 히스톤 H3이며, 보다 구체적으로는 히스톤 H3의 아미노산 서열 중 27번째 아미노산인 리신(lysine, K)를 나타낸다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 히스톤 H3의 아미노산 서열 중 27번째 아미노산인 리신을 나타낸다. 생체 내에서 합성되는 히스톤 H3의 아미노산 서열은 N 말단에 메티오닌을 함유하고 있는데, 이는 핵 내로 진입할 때 제거되어 서열번호 1의 아미노산서열을 가지게 된다.
상기 서열번호 1로 표시되는 히스톤 H3이외에 본 발명의 히스톤은 이의 기능적 동등물일 수 있다. 상기 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 히스톤 H3와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 생리활성"이란 히스톤 복합체를 형성하여 DNA와 함께 뉴클레오좀을 형성하는 히스톤 H3의 본래의 활성을 보이는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 히스톤 H3의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 히스톤 H3의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 히스톤 H3의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분 에 위치한다. 아울러 상기 히스톤 H3의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 히스톤 H3의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 일부 화학 구조가 변형된 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 히스톤 H3의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.
본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 히스톤 H3 폴리펩티드의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 각각의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스 Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.
보다 구체적으로, 본 발명의 식물체의 저온 노출 여부를 탐색하는 방법은 저온 유도성 유전자에서 H3 히스톤 단백질의 27번째 아미노산인 리신에서의 3중 메틸화(H3K27me3)를 탐색하는 것을 특징으로 한다.
상기에서 저온 유도성 유전자는 0 내지 10℃의 온도(저온)에 노출되는 경우 그 발현이 증진되는 유전자로 바람직하게는 COR15A(Cold-Regulated 15A, Lin, C. and Thomashow, M.F. (1992) Plant Physiol, 99, 519-525, NM_180040, NM_129815, NC_003071) 또는 ATGOLS3(ARABIDOPSIS THALIANA GALACTINOL SYNTHASE 3, Taji, T. et al. (2002) Plant J, 29, 417-426, NM_100805, NC_003070)일 수 있다. 상기 저온 유도성 유전자에서 H3 히스톤의 27번째 아미노산(리신)의 삼중메틸화 부위는 COR15A c1의 경우 애기장대 2번 염색체 17,718,000-17,718,700 부위, COR15A c2의 경우 애기장대 2번 염색체 17,718,900-17,719,200 부위이며, ATGOLS3 p의 경우 애기장대 1번 염색체 3,019,400-3,019,700 부위, ATGOLS3 c의 경우 애기장대 1번 염색체 3,020,000-3,020,600 부위일 수 있다.
히스톤 단백질의 메틸화 여부를 탐색하는 것은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있으며, 바람직하게는 크로마틴 면역침강(chromatin immunoprecipation, ChIP) 방법(Gendrel et al. (2002) Science, 297, 1871-1873)에 의해 수행할 수 있다.
본 발명에서 저온 노출 여부의 탐색이 가능한 식물체는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 애기장대, 배추, 양배추, 겨자, 평지(유채), 무, 호무(Brassica napobrassica), 순무(Brassica rapa/Brassica campestris), 트리케일, 콜리플라워, 브로콜리, 냉이, 황새냉이, 장대나물, 꽃다지, 상갓(Brassica juncea), 누른갓(Brassica napus), 브라시카 올레라케아(Brassica oleracea), 콜라비(Brassica caulorapa), 브라시카 핌브리아타(Brassica fimbriata), 브라시카 루보(Brassica ruvo), 브라시카 셉티켑스(Brassica septi-ceps), 검은겨자(Brassica nigra), 코클레아리아 오피키날리스(Cochlearia officinalis), 겨자무(Armoracia lapathifolia), 데스쿠라이니아 핀나타(Descurainia pinnata), 아우브리에타 델토이데아(Aubrieta deltoidea)와 같은 피자식물일 수 있다.
한편, 본 발명은 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대한 항체; 및 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번 호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 식물체의 저온 노출 탐색용 조성물을 제공한다.
상기에서, 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대한 항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하는 것으로 본 발명에서의 상기 항체는 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함하나, 바람직하게는 단클론항체일 수 있다.
아울러, 본 발명은 식물체의 저온 노출 탐색을 위하여 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍으로 이루어진 식물체의 저온 노출 탐색용 프라이머쌍을 제공한다. 상기 프라이머쌍은 실시간 PCR을 위한 프라이머로서 본 발명의 상기 항체와 더불어 H3 히스톤 단백질의 27번째 리신 아미노산의 3중메틸화를 검출하는 데에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대한 항체; 및 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 식물체의 저온 노출 탐색용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상기 항체 및 프라이머쌍 이외에 크로마틴 면역침강 및 실시간 PCR 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 저온-유도성 유전자인 COR15A 및 ATGOLS3에서 히스톤 H3의 27번째 리신이 삼중메틸화(H3K27me3)가 됨을 확인하였으며, 구체적으로, COR15A의 전사 영역의 2부위(c1 and c2 regions), ATGOLS3의 전사 영역(c region) 및 ATGOLS3의 프로모터 영역(p region)에서 H3K27me3가 현저한 수준으로 존재하는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 저온 처리에 따른 COR15A 및 ATGOLS3의 발현 유도 및 이 때의 H3K27me3의 변화를 살펴보았다. 그 결과, COR15A 및 ATGOLS3는 저 온 처리에 의해 1000배 이상 발현이 유도되며, H3K27me3의 레벨은 저온에 노출된 시간에 비례하여 점차적으로 감소함을 알 수 있었다.
본 발명의 또다른 실시예에서는 저온 노출된 식물이 정상 생장온도로 돌아왔을 때 COR15A 및 ATGOLS3의 전사 및 H3K27me3 레벨에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과, 정상 생장온도로 되돌린 후에 COR15A 및 ATGOLS3의 mRNA 레벨은 하루도 되지 않아 저온 노출 전 초기 레벨로 되돌아 왔다. 하지만, H3K27me3의 경우 식물체가 정상 생장온도로 돌아왔을 때, 더 긴 시간(3일간) 유지됨을 알 수 있었다.
참고로 본 발명의 실시예 및 도면은 하기의 기재를 참조할 수 있다:
도 1에서는 H3K27me3가 COR15A 및 ATGOLS3 좌위에서 발견된다는 점을 나타낸다. (A) COR15A(AT2g42540.2) 및 ATGOLS3(AT1G09350)에서 H3K27me3에 대한 개략적인 다이어그램이며, 이는 게놈-와이드 분석(Zhang, X et al. (2007) PLoS Biol, 5, e129.)을 통해서 확인되었다. H3K27me3 프로파일 및 ChIP-qPCR 부위는 타원 및 삼각형으로 각각 표시된다. 큰 사각형 및 작은 사각형은 각각 코딩 엑손 및 미번역 엑손 부위를 나타낸다. (B) H3K27me3 및 여러 게놈 좌위의 ChIP-qPCR 분석. ChIP-qPCR는 11일령 식물의 지상부를 이용하여 수행되었다. FUSCA에 대한 H3K27me3 및 H3의 상대적 레벨은 각각의 게놈 좌위에 대해서 나타나 있다.
도 2는 정상 및 저온 유도된 조건에서 COR15A 및 ATGOLS3의 발현을 나타낸다. (A) 11일령 식물 묘목의 지상부에서의 RNA 발현 레벨. RNA 레벨은 PP2A의 발현 레벨로 표준화하였다(Czechowski, et al. (2005) Plant Physiol, 139, 5-17.). (B) COR15A 및 ATGOLS3의 저온 유도 전사. PP2A 및 시작시간(0 hour)에서의 RNA 레벨로 표준화시킨 상대적 RNA 레벨을 표시하였다. 저온(4℃) 노출 시간은 시간으로 표시하였다.
도 3은 저온 유도된 전사기간 동안 H3K27 3메틸화 및 H3 점유도를 나타낸다. 저온 노출 시작시기의 레벨에 대한 H3K27me3 및 H3의 축적(enrichment)을 FUSCA3에서의 레벨로 표준화한 후에 나타내었다. 저온(4℃)에 노출 시간은 일(day)로 나타내었다.
도 4는 저온 노출 및 정상 생장온도로의 복귀 동안 식물의 생장과 RNA 축적을 나타낸다. (A) 저온 및 정상 온도 동안 식물의 생장. 11일령(D11) 애기장대 묘목을 저온에 2일동안(파란색) 노출한 다음 정상 온도(22℃, 노란색)의 생장실로 옮겼다. 아랫줄의 식물은 정상 생장온도에서 지속적으로 재배하였다. (B) 저온 노출 및 정상 생장온도로의 복귀 동안 COR15A 및 ATGOLS3의 RNA 축적. PP2A에 대한 RNA 레벨을 나타내었다. 바(bar)는 저온 노출(파란색) 및 정상 온도에서의 성장(노란색)을 나타낸다. D11에서 D14는 11일령 내지 14일령 식물 묘목을 나타낸다. 저온 노출 및 감쇠시간은 시간(hour)로 표시하였다.
도 5는 저온 노출 및 정상 생장온도로의 복귀 동안 COR15A 및 ATGOLS3에서 H3K27me3 및 H3의 역동적인 변화(fate). 11일령 식물을 표시된 날 수대로 우선 저온(1st, 4°C)에 노출시킨다음 정상 생장온도(2nd, 22°C)로 다시 노출시켰다. (A) H3K27me3 및 H3에 대한 ChIP 분석. 각각의 게놈 좌위에서 ChIP 축적(enrichment)은 우선 FUS3로 표준화하고, 저온 노출 시작시기의 값에 대해서 다시 계산하였다. (B) RNA 레벨의 실시간 분석. RNA 레벨은 우선 PP2A의 RNA 레벨로 표준화하고, 저온 노출시작시기의 RNA 레벨에 대해서 다시 계산하였다.
도 6은 전사 활성화 동안 프로모터 및 전사 부위에서 H3K27me3의 제거 모델을 나타낸다. 각각의 뉴클레오좀에서 2개의 H3 히스톤은 꼬리(곡선)가 달린 타원으로 나타내었다. “m"은 H3K27me3를 나타낸다. 유전자의 프로모터 및 전사 부위는 화살표 머리를 가지고 있는/가지고 있지 않은 바(bar)로 구분하였다. 사각형 부위의 뉴클레오좀은 전사 개시 전에 H3K27me3를 포함하는 것으로 가정된다. 아랫방향 화살표는 전사 활성화를 나타낸다. 사각형 부위 바깥의 뉴클레오좀도 전사 활성화에 종속된다. 전사 부위에서 히스톤 제거(eviction)는 본 연구에서 관찰되지 않았다. 식물 대체 히스톤 H3.2는(채워지고 꼬리달린 타원) 일반 H3.1과 (속이 비고 꼬리 달린 타원) 구분된다.
도 7은 다른 생장 단계에 따른 COR15A 및 ATGOLS3 RNA 레벨을 나타낸다. 11일령 내지 15일령 묘목(D11 내지 D15)에서 지상부 식물 조직의 RNA를 분리하였다. PP2A RNA 레벨을 표준화에 사용하였으며, 11일령의 RNA 레벨을 1로 하였다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
본 발명의 방법은 통상의 저온 유도성 유전자의 발현을 확인하는 것 보다 원하는 식물이 저온에 노출되었는지 여부를 좀 더 정확하게 탐색할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 환경 스트레스의 분석을 위하여 정밀한 재배가 요구되는 다양한 경우에 저온 노출 여부의 확인을 위하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. 식물 재배 및 배양
애기장대 Col-0 종자의 표면을 살균처리한 다음, 4℃에서 3일동안 동화시켰다(imbibe). 그런 다음 16시간 명주기/8시간 암주기의 조건으로 고상 0.5X MS 염(salt) 배지에서 22℃에서 재배하였다. 저온 처리(cold treatment)를 위해서, 11 일된 식물 묘목을 11시에 희미한 빛이 조사되는 4℃ 저온 챔버로 옮겼다. 애기장대의 사진은 DP70 카메라가 장착된 올림푸스 SZX7 현미경으로 촬영하였다.
2. RNA 분리 및 역전사
지면 윗부분의 조직 전체를 간 것을 RNeasy blue kit(Intron, Korea)를 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 전체 RNA 1 를 ImProm-II reverse transcriptase (Promega, U.S.)를 이용하여 제조사의 지침에 따라서 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 정량적 실시간 PCR 분석에 사용하였다.
3. 크로마틴 면역침강분석(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)
ChIP 분석은 공지된 문헌(Gendrel et al. (2002) Science, 297, 1871-1873)에 기재된 방법을 다음과 같이 일부 변형하여 수행하였다. 핵 추출물을 뿌리 부분을 제외한 전체 식물 조직으로부터 얻었다. 크로마틴을 BIORUPTOR (Cosmo Bio, Japan)로 일정한 조건(3 min, 50% duty cycle, high power output)에 따라 초음파 처리하여 200 내지 600bp로 분절된 크로마틴 DNA를 얻었다. 크로마틴을 H3 C 말단에 대한 항체(ab1791, Abcam) 및 H3(trimethyl K27)에 대한 항체(07-449, UPSTATE)로 침전시켰다. 리버스 크로스링킹(reverse cross-linking) 및 프로테이나아제 K(proteinase K) 처리를 한 다음에 인풋(input, 5%)과 면역침전된 DNA는 PCR 정제 키트(Solgent, Korea)로 정제하였다. 이 DNA를 정량적 실시간 PCR 분석에 사용하였다.
4. 프라이머 디자인
PCR 프라이머는 프라이머3 프로그램(primer3 program, http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)으로 기본 매개변수(oligo size, 20 nt and Tm, 60°C)와 0.2kb의 산물을 얻을 수 있도록 하여 디자인하였으며, 다음과 같은 프라이머를 디자인하였다:
COR15A ChIP에 대한 c1 영역 qPCR 프라이머 세트로 서열번호 2(5’ TGG CTT CTT CTT TCC ACA GC 3’) 및 서열번호 3(5’ ATG TTG CCG TCA CCT TTA GC 3’),
COR15A ChIP 및 RT(reverse transcriptation) qPCR에 대한 c2 영역 qPCR 프라이머 세트로 서열번호 4(5’ CAG ATG GTG AGA AAG CGA AAG 3’) 및 서열번호 5(5’ GAC CCT ACT TTG TGG CAT CC 3’),
ATGOLS3 ChIP에 대한 p 영역 qPCR 프라이머 세트로 서열번호 6(5’ CCC TCA GCT TCT TCT TCG TG 3’) 및 서열번호 7(5’ AAG ATG CCC GAA ATG ATG AC 3’)
ATGOLS3 ChIP 및 RT에 대한 c 영역 qPCR 프라이머 세트로 서열번호 8(5’ TCT TCC TGA CGG CAA CTT CT 3’) 및 서열번호 9(5’ GGG AGG GAC AAC TTT GAG TG 3’)
FUSCA3 ChIP-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 10(5’ GTG GCA AGT GTT GAT CAT GG 3’) 및 서열번호 11(5’ AGT TGG CAC GTG GGA AAT AG 3’)
GAPDH (GAPC-2) ChIP-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 12(5’ TGT TGA TCT GCG ATT CTT CG 3’) 및 서열번호 13(5’ CAA CCA AAC GAC CGA TTC TT 3’)
SAND ChIP-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 14(5’ ATT TCT GCA ATG GCG ACT TC 3’) 및 서열번호 15(5’ GTT AGC CGA TGC AAC CTC AT 3’)
Ta3LTR ChIP-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 16(5’ CTA TCT GGC CCC AGA CGT AG 3’) 및 서열번호 17(5’ CGA GTA AGC CTC GCT CTG AT 3’)
GAPDH RT-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 18(5’ CTC TTC GGT GAG AAG CCA GT 3’) 및 서열번호 19(5’ CAG CAG CCT TGT CTT TGT CA 3’)
SAND RT-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 20(5’ CAG GCA AAC CGA TAT ATT CCA 3‘) 및 서열번호 21(5’ TAG CTG AAA ATC CAG CAA GC 3’)
PP2A RT-qPCR 프라이머 세트로 서열번호 22 (5' TAT CGG ATG ACG ATT CTT CGT GCA G 3’) 및 서열번호 23 (5’ GCT TGG TCG ACT ATC GGA ATG AGA G 3’).
5. 실시간 PCR(Real-time PCR, qPCR)
실시간 PCR 분석은 iCycler iQ5 cycler (Bio-Rad, U.S.)에서 iQ SYBR Green Supermix를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. PCR 증폭은 95°C 20초, 57°C 20초 및 72°C 20초의 45싸이클로 수행하였다. PCR 증폭시 프라이머의 특이성을 아가로스 겔 전기영동을 통하여 테스트하였다. PCR 증폭을 한 다음 단일 PCR 산물이 증폭되었는지 확인하기 위하여 용해 곡선 분석(melting curve analysis)을 수행하였다. 인풋 DNA 및 cDNA 혼합물을 순차적으로 희석(serial dilution)하여 ChIP 및 RT 산물에 대한 표준 곡선(standard curve)를 각각 작성하였다. 각각의 게놈 부위에서 H3K27 삼메틸화(trimethylation) 및 H3에 대한 ChIP enrichment는 인 풋과 FUS3 레벨과의 표준화(normalization)에 의해 얻었다. mRNA의 상대적 레벨은 PP2A 레벨과 비교하여 정량화되었다.
<실험 결과>
1. COR15A 및 ATGOLS3는 H3K27me3의 표적이 된다.
본 발명자들은 H3K27me3에 대한 목적 유전자의 리스트에서 저온-반응성 COR15A 및 ATGOLS3 유전자를 확인하였다. 애기장대 묘목에서 H3K27me3의 게놈에 대한 프로파일링을 통해 H3K27me3 시그너쳐(signature)에 대한 두 개의 피크(peak)가 COR15A 및 ATGOLS3 부위(locus)에 각각 존재한다는 것을 나타내었다(도 1A). 본 발명자들은 ChIP-qPCR을 수행하여 H3K27me3의 시그너쳐(signature)가 11일된 식물 묘목의 지상부 조직 전체에서 보존되는지 여부를 관찰하였다(도 1B). 본 발명자들은 FUSCA3가 씨에서 발현되고 생장기에는 발현되지 않기 때문에, H3K27me3에 대한 참조로 FUSCA3를 사용하였고, FUSCA3는 그 유전자 부위에 걸쳐서 H3K27me3의 광범위한 도메인을 함유하고 있다. 본 발명자들은 COR15A의 전사되는 영역(c1 and c2 regions), ATGOLS3의 전사되는 영역(c region) 및 ATGOLS3의 프로모터 영역(p region)에서 H3K27me3가 현저한 수준으로 존재하는 것을 확인하였다(도 1B). 이와 대조적으로 폭넓고 항상 발현되는 유전자인 GAPDH 및 SAND 유전자의 5’의 전사되는 영역에서는 H3K27me3가 매우 낮은 수준으로 존재한다(도 1B). 헤테로크로마틴 Ta3 레트로트렌스포존(heterochromatic Ta3 retrotransposon) 역시 인식할 정도의 H3K27me3 레벨을 가지고 있지는 않았다(도 1 참조, Ta3LTR). 테스트한 유전자들에 서 이렇게 다른 H3K27me3 레벨이 히스톤 밀도의 차이로 인한 것인지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 히스톤 H3의 보존된 C 말단에 대한 항체를 이용하여 히스톤 점유도(histone occupancy)를 확인하였다. ATGOLS3(ATGOLS3p)의 프로모터 영역을 제외하고는, 테스트한 모든 게놈 영역의 히스톤 H3 레벨은 유사하였으며, 이는 GAPDH, SAND 및 Ta3LTR에서 H3K27me3의 부재가 낮은 히스톤 H3 점유도 때문인 것은 아니라는 점을 나타낸다(도 1B). 대조적으로, ATGOLS3p에서 H3가 2배 정도 낮은 것은 이 영역에서 H3K27me3의 축적(enrichment)이 상대적으로 낮은 것에 부분적으로 기인하는 것으로 보인다.
2. COR15A 및 ATGOLS3는 기저 발현 수준은 상이하나 유사한 정도로 저온-유도된다.
H3K27me3가 전사에 대해서 음성 마커로 생각되기 때문에, 본 발명자들은 COR15A 및 ATGOLS3가 GAPDH 및 SAND에 비해서 낮은 수준으로 발현되기 때문에 COR15A 및 ATGOLS3가 H3K27me3를 함유하는지를 우선 확인하였다. 비록 ATGOLS3는 이들 4개의 유전자들 중에 가장 낮은 발현량을 가지고 있지만, COR15A의 발현은 SAND의 발현에 필적하였으며(도 2A), 이는 발현 레벨이 H3K27me3의 침작에 대한 유일한 결정자는 아니라는 것을 암시한다. 반면에, 배타적인 것은 아니지만, COR15A 부위가 H3K27me3에 대한 목표인 특정 세포형에서는 COR15A가 비활동적일 수도 있다. 대조적으로, 본 발명자들은 SAND가 발달 단계 및 조직 형태와 무관하게 발현되는 가장 좋은 마커 유전자들 중에 하나이기 때문에, SAND는 대부분의 세포형에서 낮지만 편재하도록 발현되는 것을 예측한다.
COR15A 및 ATGOLS3가 저온에 노출되면 급격하게 유도된다는 것이 알려져 있다(Lin et al., (1992) Plant Physiol, 99, 519-525). 이에 본 발명자들은 두 유전자의 유도 역학(induction kinetics)를 저온에 노출시킨 다음 6일 동안 비교하였다(도 2B). COR15A 및 ATGOLS3 모두 기저 발현 레벨에 관계없이 1000배이상 발현이 유도되었다.(도 2A 및 2B). ATGOLS3는 좀 더 빠르게 유도되었고, 하루만에 최고의 발현 레벨에 도달하였으며, 반면에 COR15A는 2일이 걸렸다(도 2B). 최고의 발현 레벨에 도달한 이 후, 두 유전자 모두 저온 노출 후 최소 6일까지 상당히 안정적으로 발현 레벨을 유지하였다(도 2B)
3. H3K27me3는 저온-유도 전사 동안 COR15A 및 ATGOLS3에서 감소한다.
COR15A 및 ATGOLS3가 이들의 게놈 좌위(locus)에서 H3K27me3로 변형되어 있고(도 1), 둘 다 저온 노출에 의해 강한 전사 유도를 보였기 때문에(도 2B), 본 발명자들은 저온-유도 전사기간 동안 H3K27me3의 변화를 살펴보았다. 모든 시험된 부위(COR15A의 c1 및 c2 부위 및 ATGOLS3의 p 및 c 부위)에서 H3K27me3의 레벨은 저온에 노출된 시간에 비례하여 점차적으로 감소하였다(도 3). 이는 COR15A 및 ATGOLS3에서 관찰된 RNA의 축적 레벨과는 다음과 같이 상이하였다: 최고의 발현 레벨에 도달한 이후에, RNA 레벨은 사실상 변하지 않았다(도 2B 및 도 3을 비교). 만약 근접부의(proximal) 프로모터 및 전사되는 영역에서 전사가 활성되는 동안 대량 으로 히스톤이 상실된다면 H3K27me3의 감소가 될 수 있다. H3K27me3의 감소된 레벨이 이러한 유전자들의 강한 발현 동안 히스톤이 제거(eviction)된 결과인지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 저온-유도 전사기간 동안 히스톤 H3의 레벨을 모니터하였다(도 3). COR15A의 c1 및 c2 부위 및 ATGOLS3의 c 부위에서 H3의 적당한 변화는 H3K27me3 레벨의 점진적인 감소를 설명할 수는 없었으며, 이는 이러한 영역에서의 H3K27me3의 변화가 주로 히스톤 H3의 점유도(occupancy)와는 무관함을 나타낸다(도 3). 대조적으로 본 발명자들은 ATGOLS3의 프로모터 영역에서 H3 점유도가, 특히 1일째에 강하게 감소하는 것을 관찰하였으며, 이는 히스톤의 제거가 저온 노출 1일 후 H3K27me3 레벨의 감소에서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다(도 3) 또한, H3의 유실과 무관한 H3K27me3의 감소가 특히 저온 노출 후 3일에서 6일째 사이에 ATGOLS3의 프로모터 영역(ATGOLS3p)에서 관찰된다는 점은 주목할 만하다(도 3). 따라서, ATGOLS3p 영역에서의 H3 제거와 무관한 H3K27me3의 제거가 연장된 저온 노출기간동안 일정한 역할을 하는 것으로 보인다.
4. COR15A 및 ATGOLS3의 저온-유도 전사는 정상 생장 온도로의 복귀에 의해 억제된다.
COL15A 및 ATGOLS3에서 H3K27me3 레벨이 저온 노출 기간 동안 감소하였기 때문에(도 3), 본 발명자들은 저온 노출된 식물이 정상 생장온도로 돌아왔을 때 H3K27me3의 변화에 대해서 관심을 가졌다. 본 발명자들은 우선, 저온 노출 및 식물의 정상 생장온도로 복귀하는 동안 식물의 성장(도 4A) 및 RNA 축적(도 4B)을 살펴 보았다. 본 발명자들은 11일된 식물 묘목을 4℃에 2일동안 노출한 다음 정상 생장온도로 되돌렸다(도 4A). 또한 본 발명자들은 저온 노출한 식물의 생장과 정상 생장 온도에서만 재배한 대조군 식물의 생장을 비교하였다(도 4A). 식물의 생장은 저온 처리로 크게 감소되었으며, 정상 온도로 되돌린 다음에 회복되었다(도 4A). 본 발명자들은 관찰되는 잎의 수 및 발아되는 잎의 크기로 볼 때, 2일간 저온 노출된 14일령의 식물은 정상 생장온도에서 재배된 12일 내지 13일령의 식물의 상태임을 대강 예측할 수 있었다(도 4A). 성장 표현형을 제외하고는 저온 노출된 식물에서 어떠한 형태적 결함을 발견할 수 없었다(도 4A).
본 발명자들은 그 다음으로 저온 노출 및 정상 생장온도로 되돌리는 동안 COR15A 및 ATGOLS3의 전사 레벨을 분석하였다(도 4B). 정상 생장온도로 되돌린 후에 COR15A 및 ATGOLS3의 mRNA 레벨은 하루만에 저온 노출 전 초기 레벨로 되돌아 왔다(도 4B). 따라서, COR15A 및 ATGOLS3에서 저온 유도된 전사 유도의 완전한 저해는 정상 온도에서 1일만 노출시키는 것을 충분한 것으로 보인다. 흥미롭게도 ATGOLS3 전사 수준은 5시간만에 강하게 감소하고, 이에 비해서 COR15A는 같은 시간에서 완만하게 영향을 받을 뿐이었다(도 4B). 1일동안의 COR15A 및 ATGOLS3의 완전한 억제는 강한 전사 억제 뿐만 아니라 mRNA 분해가 필요하다는 점을 암시한다. 이를 뒷받침하는 점으로, COR15A 전사체는 8.4시간 이내의 추정 반감기를 가지고 있지만(Narsai et al. (2007) Plant Cell, 19, 3418-3436.), 24시간내에 COR15A mRNA가 1000배 감소하는 것과는 일치되지는 않는다(도 4B).
5. H3K27me3에서 저온 유도성 감소는 정상 생장온도로 복귀된 다음에도 유지된다.
COR15A 및 ATGOLS3의 저온 유도성 전사가 정상 생장온도로 되돌려진 후 1일에 완전히 억제되었기 때문에(도 4B), 본 발명자들은 H3K27me3에서 저온 유도성 감소도 저온 유도 전의 초기 레벨로 회복될 것인지, 또는 전사 상태와 무관하게 유지될 것인지 확인하였다. 2일간의 저온 노출은 H3K27me3의 감소를 초래하고, 이 감소는 식물체에서 정상 생장온도로 돌아왔을 때, 3일간 유지되었다(도 5A). 이는 COR15A 및 ATGOLS3는 정상 생장온도로 되돌려진 후 1일째에 완전히 억제되었고, 3일째에 완곡한 증가된 것과 같은 mRNA의 축적과는 상이하였다(도 5B). 3일째에 COR15A 및 ATGOLS3 mRNA의 완곡한 증가는 이들 유전자의 기저 발현 수준이 발달단계 후기에서는 약간 높아지기 때문에 성장으로 인한 다른 발달단계의 결과로 보인다(도 7). 히스톤 H3 점유도는 AGTOLS3p 영역을 제외하고는 실험 조건을 통해 크게 변하지 않았다(도 5A). ATGOLS3p 영역에서 히스톤 H3 레벨은 ATGOLS3 전사와 역의 상관관계를 가지고 있는 것으로 보였고, 이는 히스톤 제거(eviction)가 전사와 밀접하게 연계되어 있다는 점을 암시한다(도 5B). 따라서 본 발명자들은 저온 신호가 COR15A 및 ATGOLS3에서 H3K27me3 레벨의 감소를 일으키고, 이는 초기의 환경 신호(environmental cue)를 제거한 후에도 유지될 수 있다고 결론을 지었다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법은 통상의 저온 유도성 유전자의 발 현을 확인하는 것 보다 원하는 식물이 저온에 노출되었는지 여부를 좀 더 정확하게 탐색할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 환경 스트레스의 분석을 위하여 정밀한 재배가 요구되는 다양한 경우에 저온 노출 여부의 확인을 위하여 사용할 수 있다.
도 1은 COR15A 및 ATGOLS3 좌위에서의 H3K27me3 부위의 모식도(A) 및 여러 게놈 좌위에서의 H3K27me3 레벨을 ChIP-qPCR로 확인한 것(B)이다.
도 2는 정상 및 저온 유도된 조건에서 COR15A 및 ATGOLS3의 발현을 나타낸 것이다.(A : 11일령 식물 묘목의 지상부에서의 RNA 발현 레벨; B : COR15A 및 ATGOLS3의 저온 유도 전사)
도 3은 저온 유도시 H3K27me3 레벨 및 H3 점유도를 나타낸 것이다.
도 4는 저온 노출 및 정상 생장온도로의 복귀 동안 식물의 생장(A)과 RNA 축적(B)을 나타낸 것이다.
도 5는 저온 노출 및 정상 생장온도로의 복귀 동안 COR15A 및 ATGOLS3에서 H3K27me3 및 H3 점유도의 변화(A) 및 COR15A 및 ATGOLS3의 mRNA 레벨(B)을 나타낸 것이다.
도 6은 전사 활성화 동안 프로모터 및 전사 부위에서 H3K27me3의 제거 모델을 나타낸 것이다.
도 7은 생장 단계에 따른 COR15A 및 ATGOLS3 RNA 레벨을 나타낸 것이다.
<110> Korea advanced institute of science and technology <120> Method for detecting cold exposure of plant using histone trimethylation <130> NP08-0107 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 135 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Ala Arg Thr Lys Gln Thr Ala Arg Lys Ser Thr Gly Gly Lys Ala Pro 1 5 10 15 Arg Lys Gln Leu Ala Thr Lys Ala Ala Arg Lys Ser Ala Pro Ala Thr 20 25 30 Gly Gly Val Lys Lys Pro His Arg Phe Arg Pro Gly Thr Val Ala Leu 35 40 45 Arg Glu Ile Arg Lys Tyr Gln Lys Ser Thr Glu Leu Leu Ile Arg Lys 50 55 60 Leu Pro Phe Gln Arg Leu Val Arg Glu Ile Ala Gln Asp Phe Lys Thr 65 70 75 80 Asp Leu Arg Phe Gln Ser Ser Ala Val Ala Ala Leu Gln Glu Ala Ala 85 90 95 Glu Ala Tyr Leu Val Gly Leu Phe Glu Asp Thr Asn Leu Cys Ala Ile 100 105 110 His Ala Lys Arg Val Thr Ile Met Pro Lys Asp Ile Gln Leu Ala Arg 115 120 125 Arg Ile Arg Gly Glu Arg Ala 130 135 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COR15A c1 primer 1 <400> 2 tggcttcttc tttccacagc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COR15A c1 primer 2 <400> 3 atgttgccgt cacctttagc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COR15A c2 primer 1 <400> 4 cagatggtga gaaagcgaaa g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COR15A c2 primer 2 <400> 5 gaccctactt tgtggcatcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGOLS3 p primer 1 <400> 6 ccctcagctt cttcttcgtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGOLS3 p primer 2 <400> 7 aagatgcccg aaatgatgac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGOLS3 c primer 1 <400> 8 tcttcctgac ggcaacttct 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGOLS3 c primer 2 <400> 9 gggagggaca actttgagtg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FUSCA3 primer 1 <400> 10 gtggcaagtg ttgatcatgg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FUSCA3 primer 2 <400> 11 agttggcacg tgggaaatag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer 1 <400> 12 tgttgatctg cgattcttcg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH primer 2 <400> 13 caaccaaacg accgattctt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAND primer 1 <400> 14 atttctgcaa tggcgacttc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAND primer 2 <400> 15 gttagccgat gcaacctcat 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ta3LTR primer 1 <400> 16 ctatctggcc ccagacgtag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ta3LTR primer 2 <400> 17 cgagtaagcc tcgctctgat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH RT primer 1 <400> 18 ctcttcggtg agaagccagt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH RT primer 2 <400> 19 cagcagcctt gtctttgtca 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAND RT primer 1 <400> 20 caggcaaacc gatatattcc a 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAND RT primer 2 <400> 21 tagctgaaaa tccagcaagc 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2A primer 1 <400> 22 tatcggatga cgattcttcg tgcag 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2A primer 2 <400> 23 gcttggtcga ctatcggaat gagag 25

Claims (7)

  1. 저온 유도성 유전자인 COR15A에서 H3 히스톤 단백질의 27번째 아미노산인 리신에서의 3중 메틸화(H3K27me3)를 탐색하는 것을 특징으로 하는 애기장대의 저온 노출 여부를 탐색하는 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 H3 히스톤 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대한 항체; 및
    서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 식물체의 저온 노출 탐색용 조성물.
  6. 서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍으로 이루어진 식물체의 저온 노출 탐색용 프라이머쌍.
  7. 27번째 리신 아미노산이 3중 메틸화된 H3 히스톤 단백질에 대한 항체; 및
    서열번호 2 및 서열번호 3로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍, 서열번호 6 및 서열번호 7로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍 및 서열번호 8 및 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가지는 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 프라이머쌍을 유효성분으로 포함하는 식물체의 저온 노출 탐색용 키트.
KR1020080095267A 2008-09-29 2008-09-29 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법 KR101056733B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080095267A KR101056733B1 (ko) 2008-09-29 2008-09-29 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080095267A KR101056733B1 (ko) 2008-09-29 2008-09-29 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20100035891A KR20100035891A (ko) 2010-04-07
KR101056733B1 true KR101056733B1 (ko) 2011-08-12

Family

ID=42213632

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080095267A KR101056733B1 (ko) 2008-09-29 2008-09-29 히스톤 삼중메틸화를 이용한 식물체의 저온 노출 여부의 탐색방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101056733B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101997034B1 (ko) 2010-04-19 2019-10-18 삼성전자주식회사 인터페이스 방법 및 장치

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030042414A (ko) * 2001-11-22 2003-05-28 인터내셔널 리서치 센터 포 애그리컬춰럴 사이언스 식물의 전사인자를 코딩하는 유전자
KR20030086078A (ko) * 2002-05-03 2003-11-07 학교법인고려중앙학원 고추 한별 품종 유래의 ｃａｓａｒ 82ａ 단백질을코딩하는 유전자 염기서열 및 마커로의 이용

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030042414A (ko) * 2001-11-22 2003-05-28 인터내셔널 리서치 센터 포 애그리컬춰럴 사이언스 식물의 전사인자를 코딩하는 유전자
KR20030086078A (ko) * 2002-05-03 2003-11-07 학교법인고려중앙학원 고추 한별 품종 유래의 ｃａｓａｒ 82ａ 단백질을코딩하는 유전자 염기서열 및 마커로의 이용

Also Published As

Publication number Publication date
KR20100035891A (ko) 2010-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhao et al. Histone modifications and their regulatory roles in plant development and environmental memory
Gu et al. Photoperiodic regulation of flowering time through periodic histone deacetylation of the florigen gene FT
Liang et al. Kicking against the PRCs–a domesticated transposase antagonises silencing mediated by Polycomb group proteins and is an accessory component of Polycomb repressive complex 2
Li et al. The Arabidopsis SWI2/SNF2 chromatin remodeler BRAHMA regulates polycomb function during vegetative development and directly activates the flowering repressor gene SVP
Zhao et al. Arabidopsis BREVIPEDICELLUS interacts with the SWI2/SNF2 chromatin remodeling ATPase BRAHMA to regulate KNAT2 and KNAT6 expression in control of inflorescence architecture
Derkacheva et al. H2A deubiquitinases UBP12/13 are part of the Arabidopsis polycomb group protein system
Servet et al. Histone acetyltransferase AtGCN5/HAG1 is a versatile regulator of developmental and inducible gene expression in Arabidopsis
Zhu et al. Liquid-liquid phase separation of RBGD2/4 is required for heat stress resistance in Arabidopsis
Cartagena et al. The Arabidopsis SDG4 contributes to the regulation of pollen tube growth by methylation of histone H3 lysines 4 and 36 in mature pollen
Wang et al. Shoot-specific down-regulation of protein farnesyltransferase (α-subunit) for yield protection against drought in canola
Jarillo et al. Two related low-temperature-inducible genes of Arabidopsis encode proteins showing high homology to 14-3-3 proteins, a family of putative kinase regulators
Kazama et al. Suppression mechanism of mitochondrial ORF79 accumulation by Rf1 protein in BT‐type cytoplasmic male sterile rice
Jiang et al. Arabidopsis COMPASS-like complexes mediate histone H3 lysine-4 trimethylation to control floral transition and plant development
Richter et al. Floral regulators FLC and SOC1 directly regulate expression of the B3-type transcription factor TARGET OF FLC AND SVP 1 at the Arabidopsis shoot apex via antagonistic chromatin modifications
He Control of the transition to flowering by chromatin modifications
Paponov et al. The evolution of nuclear auxin signalling
Zhang et al. Overexpression of a NF-YB3 transcription factor from Picea wilsonii confers tolerance to salinity and drought stress in transformed Arabidopsis thaliana
Zhang et al. The SWI2/SNF2 chromatin-remodeling ATPase BRAHMA regulates chlorophyll biosynthesis in Arabidopsis
Han et al. Mutation of Arabidopsis BARD1 causes meristem defects by failing to confine WUSCHEL expression to the organizing center
Lu et al. Nuclear factor Y subunit GmNFYA competes with GmHDA13 for interaction with GmFVE to positively regulate salt tolerance in soybean
BR122020000175B1 (pt) Construção compreendendo molécula de ácido nucleico de fatores de transcrição que regulam biossíntese de nicotina em tabaco, vetor, célula bacteriana transgênica e método de produção de uma planta
Zhang et al. Phase separation of Arabidopsis EMB1579 controls transcription, mRNA splicing, and development
Gong et al. Divergent functions of the GAGA‐binding transcription factor family in rice
Yan et al. Ectopic overexpression of a membrane‐tethered transcription factor gene NAC60 from oilseed rape positively modulates programmed cell death and age‐triggered leaf senescence
Wang et al. Identification and Characterization of Cotton Genes Involved in Fuzz‐F iber Development

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140724

Year of fee payment: 4

LAPS Lapse due to unpaid annual fee