BR122020000165B1 - Construção compreendendo molécula de ácido nucleico de fatores de transcrição que regulam biossíntese de nicotina em tabaco, vetor, célula bacteriana transgênica e método de produção de uma planta - Google Patents

Abstract

A presente invenção proporciona ácidos nucleicos que codificam fatores de transcrição e métodos de uso destes ácidos nucleicos para modular produção de nicotina em plantas, e para produzir plantas tendo produção de nicotina modulada. Nicotina é encontrada predominantemente no gênero Nicotiana e em quantidades pequenas em algumas outras espécies da família Solanaceae (Sheen SJ (1988) J Food Science 53: 1572-1573). Nicotina é o alcaloide mais abundante nas tabaco comercial (N. tabacum L.), cultivares (Siminszky et al (2005) Proc Nat! Acad Sci US A 102:14919-14924) e naturalmente apresenta um papel importante na resitência do tamabco a insetos herbívosos (Steppuhn et al (2004) PLoS Biology 2: 1074-1080).

Description

RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório dos Estados Unidos No. de Série 61/771.526, depositado em 1 de março de 2013, a revelação do qual é incorporada por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO RELACIONADA A DEPÓSITO ELETRÔNICO DE UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] Uma Listagem de Sequências em formato de texto ASCII, submetida sob 37 C.F.R. § 1.821, intitulada 5051-826WO_ST25.txt, 37.572 bytes de tamanho, gerada em 20 de fevereiro de 2014, e depositada via EFS-Web, é proporcionada em lugar de uma cópia em papel. Esta Listagem de Sequências é, desse modo, incorporada por referência no relatório descritivo para suas divulgações.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0003] A presente invenção se relaciona a fatores de transcrição e seu uso na modulação de biossíntese de nicotina em plantas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0004] A nicotina é encontrada predominantemente no gênero Nicotiana, e em baixas quantidades em algumas outras espécies da família Solanaceae (Sheen SJ (1988) J Food Science 53: 1572-1573). A nicotina é o alcaloide mais abundante em cultivares de tabaco comercial (N. tabacum L.) (Siminszky et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102: 14919-14924), e naturalmente desempenha um papel importante na resistência do tabaco a herbívoros de inseto (Steppuhn et al (2004) PLoS Biology 2: 1074-1080). A nicotina é sintetizada na ponta da raiz do tabaco e transportada em folha e armazenada em vacúolos de célula de folha por uma multidroga e transportador de extrusão de composto tóxico (MATE) (Morita et al. (2009) ProcNatl Acad Sci 106: 2447-2452). A trajetória para biossíntese de nicotina envolve convergência de duas ramificações biossinteticamente distintas. As enzimas e os genes que codificam estas enzimas envolvidas na trajetória foram identificadas, exceto para a enzima/gene que catalisa a etapa de condensação final de ácido nicotínico e cátion de metil- pirrolinium para formar nicotina, geralmente referido como nicotina sintase. Foi proposto que uma reação de redução ocorre, seguida por oxidação de ácido nicotínico antes da formação de fração de piridina específica que condensa com o cátion de metilpirrolinium para formar nicotina (Friesen and Leete (1990) Tetrahedron Letters 31:62956298). A622 e NBB1 foram propostos como catalisadores das etapas finais de biossíntese de nicotina (Hibi et al. (1994) Plant cell 6:723-35; Shoji et al. (2002) Plant Mol Biol 50:427-440; Hashimoto and Kato 2007; Kajikawa et al. (2009) Plant Mol Biol 69: 287-298; Kajikawa et al. (2011) Plant Physiol 155(4):2010-22). Putrescina N-metiltransferase (PMT) e ácido quinolínico fosforibosiltransferase (QPT), as primeiras enzimas de comprometimento em cada ramificação da trajetória Biosintética da nicotina, são acreditadas serem as enzimas chaves na produção de nicotina (Feth et al. (1986) Planta 168: 402-407; Wagner et al. (1986) Physiol Plantarum 68: 667-672). Alguns poucos alcaloides, incluindo nornicotina, anabasina, e anatabina, são também sintetizados nesta trajetória, com a nornicotina sendo diretamente convertida de nicotina por nicotina demetilase, cujos genes correspondentes foram clonados (Siminszky et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102: 14919-14924).

[0005] Esta invenção procura dar resposta à necessidade de composições e métodos que modulam a trajetória de biossíntese de nicotina em plantas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Em um aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é: (a) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7; (b) uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotídeo de (a) acima; (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina tendo a sequência de amino ácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8; (d) uma sequência de nucleotídeo que difere a partir da sequência de nucleotídeo de (a), (b) ou (c) acima, devido a degeneração do código genético; (e) uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização estringentes para a sequência de nucleotídeo de (a), (b), (c) ou (d) acima, ou um complemento desta; ou (f) qualquer combinação das sequências de nucleotídeos de (a)-(e) acima.

[0007] Em um segundo aspecto, uma construção de ácido nucleico é proporcionada, a construção de ácido nucleico compreendendo, na direção 5’ a 3’, um promotor operável em uma célula de planta e uma molécula de ácido nucleico da invenção posicionados à jusante de referido promotor, e operativamente associados com este. Em alguns aspectos, a molécula de ácido nucleico é posicionado na direção de sentido e, em outros aspectos, a molécula de ácido nucleico é posicionada na direção de antessentido.

[0008] Em um terceiro aspecto, uma construção de ácido nucleico compreendendo molécula de RNA de trançado duplo compreendendo um trançado de antessentido e um trançado de sentido é proporcionado, no qual a sequência de nucleotídeo do trançado de antessentido é complementar a uma porção de uma molécula de ácido nucleico da invenção.

[0009] Em um aspecto adicional, um método de identificação de uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina, é proporcionado, compreendendo a classificação de uma população de plantas por análise de sequência de DNA de alto rendimento usando primeres compreendendo uma ou mais porções de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7,e/ ou por TILLING (Lesões Locais Induzidas de Focalização Em Genomas) usando uma sonda compreendendo SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7, ou uma porção de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7, identificando, desse modo, uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina.

[0010] Um aspecto adicional da invenção proporciona um método de produção de uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina, compreendendo mutagênese dirigida usando um reagente compreendendo um ácido nucleico consistindo de uma porção de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7.

[0011] Um aspecto adicional da invenção proporciona uma construção de ácido nucleico compreendendo, na direção 5’ a 3’, um promotor de planta e uma molécula de ácido nucleico da invenção, ou um fragmento destes posicionados à jusante de referido promotor, e operativamente associados com este, referida molécula de ácido nucleico em orientação de antessentido.

[0012] Em um aspecto adicional, um método de identificação de uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula (por exemplo, regula) biossíntese de nicotina, é proporcionado, compreendendo a classificação de uma população de plantas por análise de sequência de DNA de alto rendimento usando primeres compreendendo uma ou mais porções de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7, e/ou por TILLING (Lesões Locais Induzidas de Focalização Em Genomas) usando uma sonda compreendendo SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7, ou uma porção de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7, desse modo, identificando uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula (por exemplo, regula) biossíntese de nicotina.

[0013] Um outro aspecto da invenção proporciona um método de produção de uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina, compreendendo mutagênese dirigida usando um reagente compreendendo um ácido nucleico consistindo de uma porção de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7, desse modo, produzindo uma planta tendo uma mutação em um gene que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina.

[0014] A presente invenção ainda proporciona vetores e cassetes de expressão compreendendo pelo menos uma construção de ácido nucleico da invenção.

[0015] Em ainda outros aspectos, a presente invenção proporciona um método de produção de uma planta tendo teor de nicotina modulado, compreendendo introdução em uma célula de planta de uma construção de ácido nucleico da invenção, para produzir uma célula de planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico; e regeneração de referida célula de planta transgênica, pata produzir uma planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico. Em alguns aspectos, a planta é uma planta de tabaco.

[0016] Em um aspecto adicional, um método de modulação do teor de nicotina em uma planta é proporcionado, o método compreendendo a introdução em uma célula de planta de uma construção de ácido nucleico da presente invenção, para produzir uma célula de planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico; e regeneração de referida célula de planta transgênica, para produzir uma planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico, desse modo, modulando a produção de nicotina na referida planta transgênica. Nos aspectos, a planta é uma planta de tabaco.

[0017] A presente invenção proporciona adicionalmente células bacterianas, plantas e partes de planta destas, compreendendo pelo menos uma construção de ácido nucleico da invenção, bem como culturas e produtos produzidos de referidas plantas e partes destas.

[0018] Estes e outros aspectos da invenção são colocados em mais detalhe na descrição da invenção abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0019] Figura 1 mostra um mapa de vetor de região de T-DNA de pBI121.

[0020] Figura 2 proporciona uma representação esquemática da região de vetor pQLi usada para clonagem repetida invertida. Ligador Gus: sequência parcial de gene GUS.

[0021] Figura 3 mostra padrão de expressão de órgão de NtMYC2.

[0022] Figura 4 mostra expressão de NtMYC2 em raiz de tabaco após tratamento de cobertura, ferimento, ou de MeJA. Uma hibridização Northern mostra um padrão de indução de curso de tempo de NtMYC2 após cada tratamento. A sonda é de NtMYC2b. O 25S rRNA manchado em gel com EtBr é mostrado como uma referência de carregamento.

[0023] Figura 5 mostra ligação de NtMYC2a ao G2-box em promotor NtQPT2. Raia 1, nenhuma proteína; raia 2, NtMYC2aΔN + sonda; raia 3, NtMYC2aΔN+sonda+500*sonda fria; raia 4, NtMYC2aΔN+sonda + 500*sonda fria mutada. As setas indicam as sondas alteradas (migram mais lentamente) e sondas livres, respectivamente.

[0024] Figura 6 mostra expressão de NtMYC2a e NtMYC2b em linhas de sobre expressão de NtMYC2a ou NtMYC2b. A hibridização Northern mostra o nível de mRNA de NtMYC2 em linhas de sobre expressão de NtMYC2a ou NtMYC2b. O painel de fundo mostra o RNA ribossomal em gel manchado com EtBr como uma referência de controle de RNA. O tipo selvagem e controle de vetor são também mostrados.

[0025] Figura 7 mostra a expressão combinada de NtMYC2a e NtMYC2b em linhas de RNAi de NtMYC2. Painel superior: Hibridização de Northern de nível de mRNA de NtMYC2 em linhas de RNAi de NtMYC2. O painel de fundo mostra RNA ribossomal em gel manchado com EtBr como uma referência de carregamento de RNA. O tipo selvagem e controle de vetor são também mostrados.

[0026] Figura 8 mostra concentração de nicotina de linhas de over- expressão e RNAi de NtMYC2a e NtMYC2b. DW: peso seco.

[0027] Figura 9 mostra nível de expressão de QPT em sobre- expressão de NtMYC2 a, ou b e linhas de tabaco transgênico de RNAi. Hobridização de Northern blot usa sequência de codificação de QPT como sondas. O rRNA manchado com EtBr em gel é mostrado no painel inferior como uma referência de carregamento de RNA.

[0028] Figura 10 mostra expressão de PMT em sobre-expressão de NtMYC2a, ou b e linhas transgênicas de RNAi. Hibridização de Northern blot usando sequência de codificação de PMT parcial como sondas. O rRNA manchado com EtBr em gel é mostrado no painel inferior como uma referência de carregamento de RNA.

[0029] Figuras 11 mostra expressão de trajetória de genes de biossíntese de nicotina medida por qRT-PCR. O nível de expressão no controle de vetor foi ajustado para 1, e a expressão de genes de trajetória em plantas transgênicas T0 é mostrado relativo a este nível. O nível de expressão médio de dois eventos de transformação de cada construção que afeta o nível de nicotina é mostrado; as barras de erro indicam erros padrões.

[0030] Figura 12 mostra níveis de nicotina na folha em plantas transgênicas T1 sob tratamentos de não-cobertura e de cobertura. DW%: percentagem de peso seco. Os valores são a média de plantas transgênicas T1 (PCR positiva, n=15-30) de cada grupo com erros padrões. Letras diferentes indicam diferença significante dentro de cada categoria (t-teste, p <0,05).

[0031] Figura 13 mostra níveis de nornicotina, anabasina e anatabina em folha de plantas transgênicas T1. DW%: percentagem de peso seco. Os valores são a média de plantas transgênicas T1 (PCR positiva, n=15-30) de cada grupo com desvios padrões. Letras deferentes indicam diferença significante dentro de cada categoria (t- teste, p <0,05).

[0032] Figura 14 expressão de NtERF98 em quatro órgãos de planta de tabaco. Hibridização de Northern blot de RNA total isolado de vários órgãos de planta totalmente crescida foi sondada com uma sequência de codificação de NtERF98 parcial. O 25S rRNA manchado com EtBr em gel foi também mostrado como uma referência de carregamento.

[0033] Figura 15 mostra um curso de tempo de expressão de NtERF98 em raízes de tabaco após tratamento de cobertura, ferimento, ou de MeJA. Northern blot foi hibridizado com sequência de codificação de NtERF98 como uma sonda, e 25S rRNA com manchamento de EtBr como uma referência de carregamento.

[0034] Figura 16 mostra expressão de NtERF98 e QPT em dez plantas transgênicas de sobre expressão de NtERF98 putativas. Hibridização de Northern de QPT (topo) e mRNA de NtERR98 (média) é mostrada. 25S rRNA manchado com EtBr é também mostrado como uma referência de carregamento (fundo).

[0035] Figura 17 mostra concentração de nicotina em dez linhas de tabaco transformado de sobre-expressão de NtERF98 e controle tipo selvagem. DW: peso seco.

[0036] Figura 18 mostra análise de Northern de expressão de NtERF98 em suas linhas transgênicas de RNAi. O 25S rRNA manchado com EtBr é mostrado como uma referência de carregamento.

[0037] Figura 19 mostra hibridização de Northern de expressão de QPT em linhas de tabaco transformado de NtERF98 RNAi. O 25S rRNA manchado com EtBr é mostrado no painel inferior como uma referência de carregamento.

[0038] Figura 20 mostra concentração de nicotina em linhas de tabaco transgênico de NtERF98 RNAi e controle tipo selvagem. DW: peso seco.

[0039] Figura 21 mostra uma análise de Northern blot de expressões de NtETTa em raiz de tabaco, caule, folha, e flor. O 25S rRNA manchado com EtBr no gel é mostrado como uma referência de carregamento.

[0040] Figura 22 mostra um curso de tempo de resposta de expressão de NtETTa em raiz de tabaco após tratamento de cobertura, ferimento, ou de MeJA. Mostrados são a hibridização de Northern blot de NtETTa (painel de topo) e o 25S rRNA manchado com EtBr como uma referência de carregamento (painel de fundo).

[0041] Figura 23 mostra níveis de expressão de NtETTa em linhas de sobre expressão e linhas de RNAi. Mostrados são hibridização de Northern de NtETTa (painel de topo) e o 25S rRNA manchado com EtBr como uma referência de carregamento (painel de fundo).

[0042] Figura 24 mostra expressões de QPT em sobre expressão de NtETTa e linhas de RNAi. Mostrados são hibridização de Northern blot de QPT (painel de topo) e o 25S rRNA manchado com EtBr como uma referência de carregamento (painel de fundo).

[0043] Figura 25 mostra concentrações de nicotina de sobre expressão de NtETTa e linhas de RNAi. Os números de linha são os mesmos como nas figuras anteriores. DW: peso seco.

[0044] Figuras 26A-26C mostram níveis totais de alcaloide (% de peso seco (DW)) em plantas T3 crescidas em estufa. Amostras de folha foram tomadas 13 semanas após transplante e antes da cobertura, e a 17 e 31 duas após cobertura. Dois conjuntos de plantas de controle foram incluídos, uma linha transformada com um (VC=vetor não contendo sequência de codificação de MYC2), e VC x NT = plantas de semente de um cruzamento do controle de vetor com tabaco não- transformado.

[0045] Figuras 27A-27C mostram níveis totais de alcaloide (% de peso seco (DW)) em plantas T3 crescidas no campo. Amostras de folha foram tomadas 13 semanas após transplante e antes de cobertura, e nos 17 e 31 dias após cobertura. Dois conjuntos de plantas de controle foram incluídos, uma linha transformada com a (VC=vetor não contendo sequência de codificação de MYC2), e VC x NT = plantas de semente de um cruzamento do controle de vetor com tabaco não-transformado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0046] Esta descrição não é pretendida para ser um catálogo detalhado de todos os modos diferentes em que a invenção pode ser implementada, ou todas as características que podem ser adicionadas à presente invenção. Por exemplo, as características ilustradas com relação a uma modalidade pode ser incorporada em outras modalidades, e características ilustradas com relação a uma modalidade particular podem ser anuladas daquela modalidade. Desse modo, a invenção contempla que em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características aqui colocada pode ser excluída ou omitida. Adicionalmente, numerosas variações e adições às várias modalidades aqui sugeridas serão aparentes àqueles técnicos no assunto à luz da presente revelação, que não fogem da presente invenção. Consequentemente, as seguintes descrições são pretendidas para ilustrarem algumas modalidades particulares da invenção, e não para especificar exaustivamente todas as permutações, combinações e variações desta.

[0047] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente compreendidos por um técnico no assunto ao qual esta invenção pertence. A terminologia usada na descrição da invenção aqui é para a proposta de descrição de modalidades particulares somente, e não é pretendida para ser limitante da invenção.

[0048] Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui citadas, são incorporadas por referência em suas totalidades para os ensinamentos relevantes à sentença e/ou parágrafo em cuja referência é apresentada. Referências à técnicas empregadas aqui são pretendidas para se referirem às técnicas comumente compreendidas na técnica, incluindo variações naquelas técnicas, ou substituições de técnicas equivalentes, que seriam aparentes a um técnico no assunto.

[0049] A menos que o contexto indique de outro modo, é especificamente pretendido que as várias características da invenção aqui descrita possam ser usadas em qualquer combinação. Além disso, a presente invenção também contempla que, em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características aqui colocada podem ser excluídas ou omitidas. Para ilustrar, se o relatório descritivo cita que uma composição compreende componentes A, B e C, é especificamente pretendido que qualquer de A, B ou C, ou uma combinação destes, possa ser omitido e não-reivindicado singularmente. ou em qualquer combinação.

[0050] Conforme usado na descrição da invenção e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma" e "o" são pretendidas para incluírem as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.

[0051] Conforme aqui usado, "e/ou" se refere a e envolve qualquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretados na alternativa ("ou").

[0052] O termo "cerca de", conforme aqui usado, quando se refere a um valor mensurável, tal como uma dosagem ou período de tempo, e similares, se refere a variações de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5%, ou ainda ± 0,1% da quantidade especificada.

[0053] Conforme aqui usado, frases tais como "entre X e Y" e "entre cerca de X e Y", devem ser interpretadas para incluírem X e Y. Conforme aqui usado, frases tais como "entre cerca de X e Y" significa "entre cerca de X e cerca de Y", e frases tais como "de cerca de X a Y" significa "de cerca de X a cerca de Y".

[0054] Os termos "compreende," "compreendem" e "compreendendo", conforme aqui usados, especificam a presença das características citadas, inteiros, etapas, operações, elementos, e/ou componentes, mas não evitam a presença ou adição de uma ou mais outras características, inteiros, etapas, operações, elementos, componentes, e/ou grupos destes.

[0055] Conforme aqui usado, a frase transicional "consistindo essencialmente de" significa que o escopo de uma reivindicação é para ser interpretado para envolver os materiais ou etapas especificados determinados na reivindicação, e aqueles que não afetam materialmente a característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Desse modo, o termo "consistindo essencialmente de" quando usado em uma reivindicação desta invenção não é pretendido para ser interpretado para ser equivalente a "compreendendo."

[0056] A biossíntese de nicotina ocorre predominantemente nas raízes de plantas de tabaco (Dawson RF (1941) Science 94 (2443):396- 397; Dawson RF (1942) American Journal of Botany 29(10):813-815). O córtex e epiderme da região diferenciada da ponta radicular são considerados o local de produção de nicotina. A planta, em seguida, transporta os alcaloides através do feixe vascular para as folhas onde os alcaloides são, em seguida, armazenados nos vacúolos (Hoje et al. (2000) Plant & Cell Physiol 41: 831-839, Shoji et al. (2002) Plant Mol Biol 50: 427-440; Katoh et al. (2005) Plant Biotechnology 22: 389-392.). Vários transportadores podem ser envolvidos no processo de translocação. Um gene transportador, denominado MATE, foi recentemente clonado e caracterizado (Morita et al. (2009) Proc Natl Acad Sci (USA) 106: 2447-2452).

[0057] Estresses bióticos e abióticos, tais como dano de herbívoro, cobertura (decapitação do meristema apical em um estágio anterior de florescimento) e brotação (remoção das mudas axilares de plantas ativadas por cobertura), podem aumentar significantemente o acúmulo de nicotina em folha de tabaco (Baldwin IT (1988) Oecologia 77: 378-381; Wang et al. (2008) Nico J Integr Plant Biol 50: 958-964). A biossíntese e acúmulo de nicotina é mediado por mudanças de fito hormônio endógeno, que afeta a expressão dos genes envolvidos na biossíntese de nicotina. Até agora, ácido jasmônico (JA), etileno, auxina e ácido abscísico (ABA) têm se mostrado afetar a biossíntese de nicotina (Shoji et al. (2000) Plant cell Physiol 41: 1072-1076; Shi et al. (2006) J Exp Bot 57: 2899-2907; Lackman et al. (2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 5891-5896).

[0058] A produção de nicotina estimulada por tratamento com JA é bem documentada. Genes de trajetória biossintéticos de nicotina maiores, incluindo gene de putrescina N-metiltransferase (NtPMT), ácido quinolínico fosforibosiltransferase (NtQPT), gene de ornitina decarboxilase (NtODC), gene de arginina decarboxilase (NtADC), gene de metilputrescina oxidase (NtMPO), um gene similar à isoflavona reductase (NtA622), e um gene similar à enzima de ponte de berberina (NtBBL), se mostraram serem regulados a várias extensões por aplicação de MeJA (Cane et al. (2005) Functional Plant Biology 32: 305; Katoh et al. (2007) Plant cell Physiol 48: 550-554; Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 20070240728). Estimulação de produção de nicotina por MeJA ou ferimento em tabaco é mediada pela trajetória de sinalização de JA similar àquela na Arabidopsis. Ambas expressão de degradação de proteína de NtCOII (Coronatine Insenstive 1) e de NtJAZ (Jasmonate Zim) são requeridas para biossíntese de nicotina (Shoji et al. (2008) Plant cell Physiol 49: 10031012).

[0059] Etapas maiores em trajetória biossintética de nicotina têm sido elucidadas nas últimas duas décadas. Contudo, estudos na regulação desta trajetória no nível de transcrição somente começaram recentemente. Uma base de dados de fator de transcrição de tabaco foi estabelecida baseado em análise in silico de dados de sequenciamento genômico. Mais do que 2500 fatores de transcrição de 64 famílias foram identificadas (Rushton et al. (2008) Plant Physiol 147: 280-295). Contudo, quais fatores de transcrição são envolvidos na biossíntese de nicotina e como estes fatores de transcrição funcionam juntos para regular a trajetória Biosintética de nicotina permanecem não claros.

[0060] Os controles genéticos influenciam o tipo e nível de alcaloides observados em Nicotina tabacum. Em um sistema, dois locais genéticos não-ligados, Nic1 e Nic2 (ou A e B), se mostraram controlar o acúmulo total de alcaloide. Nic1 e Nic2 têm efeitos de dosagem diferentes em acúmulo de alcaloide. Nic1 (A) tem 2,4 vezes maior atividade do que Nic2 (B), e seus efeitos são aditivos (Legg e Collins (1971) Can. J. Genet. Cytol 13: 287-291). Variedades comerciais com alto teor total de alcaloide são consideradas como dominante monozigótico (AABB) nestes dois locais, e genótipos de baixo nível de alcaloide são considerados como recessivo hozigótico (aabb) nestes dois locais. Sob este modelo genético, nove genótipos de plantas de tabaco com níveis diferentes de alcaloides totais foram desenvolvidos (Legg et al. (1969) J. Hered 60: 213-217; Legg and Collins (1971) Can. J. Genet. Cytol 13: 287-291). Muito recentemente, o local de Nic2 foi molecularmente caracterizado. Ele é realmente um grupo de genes de fator de transcrição a partir da família de fator responsiva à etileno (ERF). Eles regulam os genes de trajetória biossintéticos de nicotina (Shoji et al. (2010) The Plant cell 22: 3390-3409).

[0061] Outro sistema controla os tipos de alcaloides produzidos, e tem um local genético que controla a conversão de nicotina em nornicotina. Quando ambos alelos deste local são recessivos, a planta contém predominantemente nicotina. Se um ou ambos alelos são dominantes, a planta principalmente produz nornicotina. A nornicotina resulta de demetilação de nicotina (Mann et al. (1964) Crop Sci. 4:349353). O gene que codifica nicotina demetilase, um gene de citocromo P450, CYP82E4, foi clonado e caracterizado (Siminszky et al. (2005) Proc Natl Acad Sci (USA) 102: 14919-14924)). A supressão da expressão deste gene resulta em uma drástica redução no teor de nicotina (Lewis et al. (2008) Plant Biotechnology Journal 6: 346-354).

[0062] Adicionalmente aos dois sistemas genéticos acima descritos, alguns fatores menores ou quantitativos são envolvidos em síntese de alcaloide. Portanto, é possível produzir linhas de tabaco com teor de alcaloide variado dentro da faixa dos níveis de alcaloide de origem (Matzinger et al. (1972) Crop Sci. 12: 40-43, Matzinger et al. (1989) Crop Sci. 29: 74-77).

[0063] O traço de teor de nicotina baixo foi de interesse aos reprodutores de tabaco. LA Burley 21 é uma linha de alcaloide total baixa produzida por incorporação de gene(s) de alcaloide baixo de uma variedade de charuto Cubano em Burley 21 através de vários retro cruzamentos (Legg et al. (1970) Crop Sci 10: 212. Ele tem aproximadamente 0,2% de alcaloides totais (peso seco) comparado aos 3,5% (peso seco) de seu Burley 21 de origem. Similarmente, Chaplin and Burk (Agronomy Journal 75: 133-136 (1983)) desenvolveram linhas de tabaco curado com níveis de alcaloide diferentes por retro cruzamento. Eles usaram NC95, SC58, e Cocker 139 como linhas de origem recorrentes e cruzaram os mesmos com LAFC 53 (uma linha de alcaloide total baixa em antecedente de NC95), seguido por vários retro cruzamentos. Cinco níveis de alcaloide diferentes foram obtidos a partir da família NC95, seis a partir da família SC58, e quatro da família Coker139.

[0064] Contudo, a reprodução de cultivares de tabaco comercial é mais complicada do que simplesmente se focalizando no teor de alcaloide em folha. Verificou-se que o acúmulo de alcaloide é geneticamente ligado com outros traços agronômicos importantes. Por exemplo, uma correlação reversa existe entre alcaloides totais e rendimento. A seleção de rendimento aumentado pode resultar em nível reduzido de alcaloides totais (Chaplin and. Week (1976) Crop Sci 16: 416-418). Métodos de reprodução convencionais não foram muito eficientes na quebra deste relacionamento genético fechado. Acredita- se que a manipulação genética no nível molecular pode encontrar esta necessidade de reprodutores de tabaco por somente modificação de acúmulo de alcaloide sem afetar outros traços, tal como rendimento.

[0065] A presente invenção proporciona composições e métodos para a manipulação genética de acúmulo de alcaloide, mais particularmente, acúmulo de nicotina, em plantas. Desse modo, em um aspecto, a presente invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo uma sequência de nucleotídeo é: (a) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 B SEQ ID NO:7; (b) uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotídeo de (a) acima; (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina tendo a sequência de amino ácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8; (d) uma sequência de nucleotídeo que difere a partir da sequência de nucleotídeo de (a), (b) ou (c) acima, devido a degeneração do código genético, e que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina; (e) uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização estringentes para a sequência de nucleotídeo de (a), (b), (c) ou (d) acima, ou um complemento da mesma; ou (f) qualquer combinação das sequências de nucleotídeo de (a)-(e) acima. As moléculas de ácido nucleico da invenção (as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NO:1 (NtMYC2a cDNA), SEQ ID NO:3 (NtMYC2b cDNA), SEQ ID NO:5 (NtERF98 cDNA), e SEQ ID NO:7 (NtETTa cDNA)) codificam fatores de transcrição que modulam biossíntese de nicotina, suas respectivas sequências de amino ácido sendo SEQ ID NO:2 (NtMYC2a), SEQ ID NO:4 (NtMYC2b), SEQ ID NO:6 (NtERF98) e SEQ ID NO:8 (NtETTa).

[0066] Desse modo, sobre expressão ou expressão reduzida de uma molécula de ácido nucleico isolada ou uma construção de ácido nucleico aqui descritos podem resultar na planta tendo teor de nicotina aumentado ou diminuído (conforme comparado a uma planta tipo selvagem ou uma planta que não compreende referida molécula de ácido nucleico isolada, ou referida construção de ácido nucleico). Desse modo, em um aspecto, a invenção proporciona uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, e similares) sequências de nucleotídeo, cada uma da qual quando expressa em uma planta confere teor de nicotina aumentado ou diminuído na referida planta, no qual a uma ou mais sequências de nucleotídeo compreendem, consistem essencialmente de, ou consistem de: (a) a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7; (b) uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de nucleotídeo de (a) acima; (c) uma sequência de nucleotídeo que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina tendo a sequência de amino ácido de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e/ou SEQ ID NO:8; (d) uma sequência de nucleotídeo que difere a partir da sequência de nucleotídeo de (a), (b) ou (c) acima devido à degeneração do código genético, e que codifica um fator de transcrição que modula biossíntese de nicotina; (e) uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições de hibridização restringentes para a sequência de nucleotídeo de (a), (b), (c) ou (d) acima, ou um complemento destas; ou (f) qualquer combinação das sequências de nucleotídeo de (a)-(e) acima.

[0067] As moléculas de ácido nucleico/fatores de transcrição da presente invenção podem ser compreendidas de qualquer construção útil para modulação ou alteração do teor de nicotina em um organismo que expressa referidos fatores de transcrição. Desse modo, por exemplo, os fatores de transcrição da invenção podem ser compreendidos de construções de antessentido, construções de RNAi, e similares.

[0068] Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção proporciona construção de ácido nucleico compreendendo, na direção 5’ a 3’, um promotor operável em uma célula de planta e a molécula de ácido nucleico da invenção, posicionados à jusante de referido promotor, e operativamente associado com estes. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico é posicionada na direção de sentido. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucleico é posicionada na direção de antessentido. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor hierólogo.

[0069] Em uma modalidade ainda adicional, a presente invenção proporciona uma construção de RNAi compreendendo, consistindo essencialmente de, ou consistindo de uma molécula de ácido nucleico da invenção. Desse modo, em algumas modalidades, uma construção de ácido nucleico compreendendo molécula de RNA de trançado duplo compreendendo um trançado de antessentido e um trançado de sentido, é provido, no qual a sequência de nucleotídeo do trançado de antessentido é complementar a uma porção da molécula de ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, a porção da molécula de ácido nucleico da invenção compreende, consiste essencialmente ou consiste de, cerca de 18 a cerca de 1000 nucleotídeos consecutivos de referida molécula de ácido nucleico, no qual a molécula de RNA de trançado duplo inibe expressão de um fator de transcrição da invenção (por exemplo, sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 e/ou SEQ ID NO:7). Desse modo, em algumas modalidades, a porção da molécula de ácido nucleico da invenção a qual o trançado de antessentido é complementar compreende, consiste essencialmente ou consiste de, cerca de 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000 nucleotídeos e similares, ou qualquer faixa na mesma. Desse modo, em algumas modalidades, a porção pode ser cerca de 18 a cerca de 25 nucleotídeos consecutivos de referida molécula de ácido nucleico, ou qualquer faixa na mesma. Em outras modalidades, a porção pode ser cerca de 75 a cerca de 1000 nucleotídeos consecutivos de referida molécula de ácido nucleico, ou qualquer faixa na mesma. Em ainda outras modalidades, a porção pode ser cerca de 95 a cerca de 900 nucleotídeos consecutivos de referida molécula de ácido nucleico, ou qualquer faixa na mesma. Em uma modalidade adicional, a porção pode ser cerca de 100 a cerca de 500 nucleotídeos consecutivos de referida molécula de ácido nucleico, ou qualquer faixa na mesma. Desse modo, em algumas modalidades, o dsRNA pode compreender dois fragmentos idênticos (auto complementares) de comprimento variado (por exemplo, cerca de 75 a cerca de 900 nucleotídeos contíguos, ou qualquer faixa na mesma) do gene alvo com um espaçador entre (ver, por exemplo, Figura 2), que, em seguida, forma um grampo de cabelo, e pode ser clivado em peças menores que podem, em seguida, agir para inibir expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, o espaçador pode ser um intron (ver, por exemplo, Wesley et al. Plant J 27(6):581-590 (2002).

[0070] Desse modo, em algumas modalidades, a construção de RNAi produz um siRNA ou miRNA. Em outras modalidades, a construção de RNAi pode ser um RNA em grampo de cabelo curto (shRNA). Em ainda outras modalidades, a construção de RNAi pode ser uma construção de RNA em grampo de cabelo (hpRNA). Métodos para produção de tais construções são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Wesley et al. Plant J 27(6):581-590 (2002)).

[0071] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona uma construção de ácido nucleico compreendendo, na direção 5’ a 3’, um promotor de planta e uma molécula de ácido nucleico da invenção, ou um fragmento destes, posicionados à jusante a partir do referido promotor, e operativamente associados com estes, referida molécula de ácido nucleico em orientação de antessentido. Um fragmento de uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser cerca de 10 nucleotídeos consecutivos para o tamanho total da molécula de ácido nucleico (por exemplo, cerca de 2500 bp). Desse modo, um fragmento de uma molécula de ácido nucleico da invenção pode ser cerca de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500 nucleotídeos e similares, ou qualquer faixa na mesma.

[0072] Em algumas modalidades da invenção, sequências de nucleotídeo tendo identidade de sequência significante para as sequências de nucleotídeo da invenção, são providas. "Identidade de sequência significante" ou "similaridade de sequência significante" significa pelo menos cerca de 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e/ou 100% de identidade ou similaridade com outra sequência de nucleotídeo. Desse modo, em modalidades adicionais, "identidade de sequência significante", ou "similaridade de sequência significante", significa uma faixa de cerca de 70% a cerca de 100%, cerca de 75% a cerca de 100%, cerca de 80% a cerca de 100%, cerca de 81% a cerca de 100%, cerca de 82% a cerca de 100%, cerca de 83% a cerca de 100%, cerca de 84% a cerca de 100%, cerca de 85% a cerca de 100%, cerca de 86% a cerca de 100%, cerca de 87% a cerca de 100%, cerca de 88% a cerca de 100%, cerca de 89% a cerca de 100%, cerca de 90% a cerca de 100%, cerca de 91% a cerca de 100%, cerca de 92% a cerca de 100%, cerca de 93% a cerca de 100%, cerca de 94% a cerca de 100%, cerca de 95% a cerca de 100%, cerca de 96% a cerca de 100%, cerca de 97% a cerca de 100%, cerca de 98% a cerca de 100%, e/ou cerca de 99% a cerca de 100% de identidade ou similaridade com outra sequência de nucleotídeo. Portanto, em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo da invenção é uma sequência de nucleotídeo que tem identidade de sequência significante para a sequência de nucleotídeo de qualquer de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, e/ou SEQ ID NO:7.

[0073] Em algumas modalidades, um polipeptídio da invenção compreende, consiste essencialmente de, ou consiste de uma sequência de amino ácido que é pelo menos 70% idêntica, por exemplo, pelo menos 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e/ou 100% idêntica a uma sequência de amino ácido de qualquer de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, e/ou SEQ ID NO:8.

[0074] Em algumas modalidades, um polipeptídio ou sequência de nucleotídeo da invenção pode ser uma variante conservativamente modificada. Conforme aqui usado, "variante conservativamente modificada" se refere a polipeptídio e sequências de nucleotídeo contendo substituições, anulações ou adições adicionais que alteram, adicionam ou anulam um amino ácido simples ou nucleotídeo, ou uma pequena percentagem de amino ácidos ou nucleotídeos na sequência, onde a alteração resulta na substituição de um amino ácido com um amino ácido quimicamente similar. Tabelas de substituição conservativa que proporcionam amino ácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica.

[0075] Conforme aqui usado, uma variante conservativamente modificada de um polipeptídio é biologicamente ativa e, portanto, possui a atividade desejada do polipeptídio de referência (por exemplo, atividade de fator de transcrição; reduzindo ou aumentando o teor de nicotina em uma planta), conforme aqui descrito. A variante pode resultar de, por exemplo, um polimorfismo genético, ou de manipulação humana. Uma variante biologicamente ativa do polipeptídio de referência pode ter pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais identidade de sequência ou similaridade (por exemplo, cerca de 40% a cerca de 99% ou mais identidade de sequência ou similaridade, e qualquer faixa na mesma) para a sequência de amino ácido para o polipeptídio de referência, conforme determinado pelos programas de alinhamento de referência e parâmetros descritos aqui em qualquer lugar. Uma variante ativa pode diferir da sequência de polipeptídio de referência por poucos 1-15 resíduos de amino ácido, poucos 1-10, tal como 6-10, poucos 5, poucos 4, 3, 2, ou ainda 1 resíduo de amino ácido.

[0076] Variantes que ocorrem naturalmente podem existir dentro de uma população. Tais variantes podem ser identificadas pelo uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tais como a reação de cadeia de polimerase (PCR), e hibridização, conforme descrito abaixo. Sequências de nucleotídeo sinteticamente derivadas, por exemplo, sequências geradas por mutagênese direcionada de local ou mutagênese mediada por PCR que ainda codificam um polipeptídio da invenção, são também incluídos como variantes. Uma ou mais nucleotídeo ou substituições, adições, ou anulações de amino ácido podem ser introduzidas em um nucleotídeo ou sequência de amino ácido aqui revelados, tal que as substituições, adições, ou anulações são introduzidas na proteína codificada. As adições (inserções) ou anulações (truncamentos) podem ser produzidas na extremidade N- terminal ou C-terminal da proteína nativa, ou em um ou mais locais na proteína nativa. Similarmente, uma substituição de um ou mais nucleotídeos ou amino ácidos pode ser produzida em um ou mais locais na proteína nativa.

[0077] Por exemplo, substituições de amino ácido conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos de amino ácido prognosticados, preferivelmente não-essenciais. Uma resíduo de amino ácido "não-essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da sequência tipo selvagem de uma proteína sem alterar a atividade biológica, onde uma amino ácido "essencial" é requerido para atividade biológica. Uma "substituição de amino ácido conservativa" é uma em que o resíduo de amino ácido é substituído com um resíduo de amino ácido com uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de amino ácido tendo cadeias laterais similares são conhecidas na técnica. Estas famílias incluem amino ácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Tais substituições não seriam feitas para resíduos de amino ácido conservados, ou para resíduos de amino ácido que residem dentro de um motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para atividade de proteína.

[0078] Por exemplo, variantes de sequência de amino ácido do polipeptídio de referência podem ser preparadas por mutação da sequência de nucleotídeo que codifica a enzima. Os mutantes resultantes podem ser expressos recombinantemente em plantas, e classificados para aqueles que retêm atividade biológica por ensaio de teor de nicotina aumentado ou reduzido usando técnicas de ensaio padrões conforme aqui descrito. Métodos para mutagênese e alterações de sequência de nucleotídeo são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382; and Techniques in Molecular Biology (Walker & Gaastra eds., MacMillan Publishing Co. 1983) e as referências citadas nos mesmos; bem como Patente dos Estados Unidos No. 4.873.192. Claramente, as mutações feitas no DNA que codifica a variante não devem romper a estrutura de leitura e, preferivelmente, não criará regiões complementares que podem produzir estrutura de mRNA secundária. Ver, Publicação de Pedido de Patente EP No. 75.444. Orientações para substituições de amino ácido apropriadas que não afetam a atividade biológica da proteína de interesse podem ser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.

[0079] As anulações, inserções e substituições nos polipeptídios aqui descritos não são esperadas produzirem mudanças radicais nas características do polipeptídio (por exemplo, a atividade do polipeptídio). Contudo, quando é difícil prever o efeito exato da substituição, anulação ou inserção em avanço de se fazer desse modo, um técnico no assunto apreciará que o efeito pode ser avaliado por ensaios de classificação de rotina que podem classificar para as atividades de polipeptídio particular de interesse (por exemplo, conferindo teor de nicotina aumentado ou reduzido a uma planta).

[0080] Em algumas modalidades, as composições da invenção podem compreender fragmentos ativos do polipeptídio. Conforme aqui usado, "fragmento" significa uma porção do polipeptídio de referência que retém a atividade do polipeptídio de conferir teor de nicotina aumentado ou diminuído em uma planta. Um fragmento também significa uma porção de uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídio de referência. Um fragmento ativo do polipeptídio pode ser preparado, por exemplo, por isolamento de uma porção de uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídio que é expressa para produzir o fragmento codificado do polipeptídio (por exemplo, por expressão recombinante in vitro), e ensaiando a atividade do fragmento. As moléculas de ácido nucleico que codificam tais fragmentos podem ser pelo menos cerca de 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2000, 2100, 2200, 2400 ou 2500, nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma molécula de ácido nucleico codificada por polipeptídio de comprimento total. Como tal, os fragmentos de polipeptídio podem ser pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 525, 550, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, ou 800 resíduos de amino ácido contíguos, ou até o número total de resíduos de amino ácido presentes no polipeptídio de comprimento total.

[0081] Desse modo, em algumas modalidades, uma variante ou fragmento funcional de um polipeptídio desta invenção, ou uma variante ou fragmento funcional tendo identidade substancial para uma sequência de polipeptídio desta invenção (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8) quando introduzida em e expressa em uma planta transgênica reduz ou aumenta o teor de nicotina da planta transgênica que produz referidos polipeptídios.

[0082] Conforme aqui usado, os termos "expressa", "expressam", ou "expressão", e similares, com relação a uma molécula de ácido nucleico e/ou a sequência de nucleotídeo (por exemplo, RNA ou DNA), indica que a molécula de ácido nucleico e/ou uma sequência de nucleotídeo é transcrita e, opcionalmente, traduzida. Desse modo, uma molécula de ácido nucleico e/ou uma sequência de nucleotídeo pode expressar um polipeptídio de interesse, ou um RNA não-traduzido funcional.

[0083] Uma sequência de nucleotídeo "heteróloga" ou "exógena" é uma sequência de nucleotídeo não naturalmente associada com uma célula hospedeira em que ela é introduzida, incluindo cópias múltiplas que ocorrem não-naturalmente de uma sequência de nucleotídeo que ocorre naturalmente. Alternativamente, uma sequência de nucleotídeo heteróloga pode ser uma que não ocorre naturalmente com outra sequência de nucleotídeo a qual ela é associada. Por exemplo, uma construção de ácido nucleico compreendendo um "promotor heterólogo" operavelmente associado com uma molécula de ácido nucleico é um promotor que ocorre não-naturalmente com referida molécula de ácido nucleico a qual ele é associado.

[0084] Uma ácido nucleico tipo "nativo" ou tipo "selvagem", sequência de nucleotídeo, polipeptídio ou sequência de amino ácido, se referem a um ácido nucleico que ocorre naturalmente ou endógeno, sequência de nucleotídeo, polipeptídio, ou sequência de amino ácido. Desse modo, por exemplo, um "mRNA tipo selvagem" é um mRNA que está ocorrendo naturalmente em, ou endógeno ao organismo. Uma sequência de ácido nucleico "homóloga" é uma sequência de nucleotídeo naturalmente associada com uma célula hospedeira em que ela é introduzida.

[0085] Também conforme aqui usado, os termos "ácido nucleico," "molécula de ácido nucleico", "sequência de nucleotídeo" e "polinucleotídeo" podem ser usados intercambiavelmente e envolvem ambos RNA e DNA, incluindo cDNA, DNA genômico, mRNA, DNA sintético (por exemplo, sintetizado quimicamente) ou RNA e quimeras de RNA e DNA. O termo polinucleotídeo, sequência de nucleotídeo, ou ácido nucleico, se referem a uma cadeia de nucleotídeos sem se relacionar ao comprimento da cadeia. O ácido nucleico pode ser de trançado duplo ou de trançado único. Onde trançado único, o ácido nucleico pode ser um trançado de sentido ou um trançado de antessentido. O ácido nucleico pode ser sintetizado usando análogos ou derivados de oligonucleotídeo (por exemplo, nucleotídeos de inosina ou fosforotioato). Tais oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar ácidos nucleicos que têm capacidades de emparelhamento base alterada ou resistência á nucleases aumentada. A presente invenção adicionalmente proporciona um ácido nucleico que é o complemento (que pode ser, ou um complemento total, ou um complemento parcial) de um ácido nucleico, sequência de nucleotídeo, ou polinucleotídeo desta invenção. As molécula de ácido nucleico e/ou sequências de nucleotídeo aqui proporcionadas são apresentadas aqui na direção 5’ a 3’, da esquerda para a direita, e são representadas usando o código padrão para representação dos caracteres do nucleotídeo conforme colocado nos Estados Unidos, regras de sequência, 37 CFR §§1.821 - 1.825 e no World Intellectual Property Organization (WIPO) Standard ST.25.

[0086] O termo "sequência de nucleotídeo de antessentido" ou "oligonucleotídeo de antessentido", conforme aqui usado, se refere a uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de DNA ou RNA especificada. Oligonucleotídeos e ácidos nucleicos de antessentido que expressam a mesma sonda podem ser produzidos de acordo com técnicas convencionais. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.023.243 para Tullis; Patente dos Estados Unidos No. 5.149.797 para Pederson et al. A sequência de nucleotídeo de antessentido pode ser complementar à sequência de nucleotídeo total que codifica o polipeptídio ou uma porção deste de pelo menos 10, 20, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 ou mais bases contíguas, e reduzirá o nível de produção de polipeptídio.

[0087] Aqueles técnicos na arte apreciarão que não é necessário que a sequência de nucleotídeo de antessentido seja totalmente complementar à sequência alvo, considerando-se que o grau de similaridade de SEQuência é suficiente para a sequência de nucleotídeo de antessentido hibridizar para seu alvo, e reduzir a produção do polipeptídio ou transcrição. Conforme é conhecido na técnica, um grau mais alto de similaridade de SEQuência é geralmente requerido para sequências de nucleotídeo de antessentido mais curtas, onde um grau maior de desequipar ações bases será tolerado pelas sequências de nucleotídeo de antessentido mais longas.

[0088] Por exemplo, hibridização de tais sequências de nucleotídeo pode ser efetuada sob condições de estringência reduzida, condições de estringência média ou condições ainda estringentes (por exemplo, condições representadas por uma estringência de lavagem de 35-40% de formamida com 5x solução de Denhardt, 0,5% de SDS e 1x SSPE a 37°C; condições representadas por uma estringência de lavagem de 4045% de formamida com 5x solução de Denhardt, 0,5% SDS, e 1x SSPE a 42°C; e/ou condições representadas por uma estringência de lavagem de 50% de formamida com 5x Solução de Denhardt, 0,5% SDS e 1x SSPE a 42°C, respectivamente) para as sequências de nucleotídeo especificamente aqui reveladas. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring Harbor, NY, 1989).

[0089] Em outras modalidades, sequências de nucleotídeo de antessentido da invenção têm pelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98% ou similaridade de sequência mais alta com o complemento das sequências de codificação especificamente aqui reveladas, e reduzirão o nível de produção de polipeptídio.

[0090] O comprimento da sequência de nucleotídeo de antessentido (isto é, o número de nucleotídeos na mesma) não é crítico, considerando-se que ele se liga seletivamente à localização pretendida, e reduz a transcrição e/ou translação da sequência alvo, e pode ser determinado de acordo com procedimentos de rotina. Em geral, a sequência de nucleotídeo de antessentido será de cerca de oito, dez ou doze nucleotídeos de comprimento a cerca de 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 nucleotídeos, ou mais longos, de comprimento.

[0091] Uma sequência de nucleotídeo de antessentido pode ser construída usando síntese química e reações de ligação enzimática por procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo de antessentido pode ser quimicamente sintetizada usando nucleotídeos que ocorrem naturalmente, ou vários nucleotídeos modificados designados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas, ou aumentar a estabilidade física do duplex formado entre e as sequências de nucleotídeo de sentido e de antessentido, por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos com acridina, podem ser usados. Exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser usados para gerar a sequência de nucleotídeo de antessentido incluem 5-fluorouracila, 5-bromouracila, 5-clorouracila, 5- iodouracila, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracila, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5- carboximetilaminomet- hiluracila, dihidrouracila, beta-D- galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1- metilinosina, 2,2-dimetilguanine, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3- metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5- metilaminometiluracila, 5-metoxiaminometil-2-tiouracila, beta-D- manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracila, 5-metoxiuracila, 2- metiltio-N6-isopenten- iladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracila, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2- tiouracila, 2-tiouracila, 4-tiouracila, 5-metiluracila, ácido uracil-5- oxoacético metiléster, uracil-5-ácido oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracila, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracila, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina. Alternativamente, a sequência de nucleotídeo de antessentido pode ser produzida usando um vetor de expressão no qual um ácido nucleico foi clonado em uma orientação de antessentido (isto é, RNA transcrito a partir do ácido nucleico inserido será de uma orientação de antessentido a um ácido nucleico alvo de interesse).

[0092] As sequências de nucleotídeo de antessentido da invenção adicionalmente incluem sequências de nucleotídeo no qual pelo menos um, ou todo, dos resíduos de fosfato em ponte de internucleotídeo são fosfatos modificados, tais como metil fosfonatos, metil fosfonotioatos, fosforomorfolidatos, fosforopiperazidatos e fosforamidatos. Por exemplo, todo outro um dos resíduos de fosfato em ponte de internucleotídeo podem ser modificados, conforme descrito. Em outro exemplos não-limitante, a sequência de nucleotídeo de antessentido é uma sequência de nucleotídeo em que um, ou todos, dos nucleotídeos contêm uma fração 2’ alquila inferior (por exemplo, aquila C1-C4, linear ou ramificado, saturado ou insaturado, tal como metila, etila, etenila, propila, 1-propenila, 2-propenila, e isopropil). Por exemplo, todo outro um dos nucleotídeos pode ser modificado, conforme descrito. Ver também, Furdon et al., Nucleic acids Res. 17:9193 (1989); Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1401 (1990); Baker et al., Nucleic acids Res. 18:3537 (1990); Sproat et al., Nucleic acids Res. 17:3373 (1989); Walder and Walder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5011 (1988); incorporados por referência aqui para seu ensinamento de métodos de produção de moléculas de antessentido, incluindo aquelas contendo bases de nucleotídeo).

[0093] Métodos de emparelhamento de base de hélice Tripla podem também serem empregados para inibir produção de polipeptídios desta invenção (por exemplo, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 e/ou SEQ ID NO:8). O emparelhamento de hélice Tripla é acreditado operar por inibição da capacidade da hélice dupla abrir suficientemente para a ligação de polimerases, fatores de transcrição, ou moléculas regulatórias. Avanços terapêuticos recentes usando DNA triplex foram descritos na literatura (por exemplo, Gee et al., (1994) In: Huber et al., Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY).

[0094] Ácidos nucleicos ou proteins diferentes tendo homologia são referidos aqui como "homólogos". O termo homólogo inclui sequências homólogas a partir das mesmas e outras espécies e sequências ortólogas a partir das mesmas e outras espécies. "Homologia" se refere ao nível de similaridade entre dois ou mais ácido nucleico e/ou sequência de amino ácido em termos de percentagem de identidade posicional (isto é, similaridade de sequência ou identidade). Homologia também se refere ao conceito de propriedades funcionais similares entre ácidos nucleicos ou proteínas diferentes. Desse modo, as composições e métodos da invenção adicionalmente compreendem homólogos às sequências de nucleotídeo e sequência de polipeptídios desta invenção. "Ortólogo", conforme aqui usado, se refere a sequências de nucleotídeo homólogas e/ ou sequências de amino ácido em espécies diferentes que decorrem de um gene ancestral durante especiação. Um homólogo desta invenção tem uma identidade de sequência significante (por exemplo, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, e/ou 100%) para as sequências de nucleotídeo da invenção.

[0095] Conforme aqui usado "identidade de sequência" se refere a extensão a qual dois polinucleotídeo otimamente alinhados ou sequências de peptídeo são invariantes através de toda uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou amino ácidos. "Identidade" pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos incluindo, mas não limitados a, aqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis de SEQuence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991).

[0096] Conforme aqui usado, o termo "percentagem de identidade de sequência" ou "percentagem de identidade" se refere a percentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência de polinucleotídeo linear de uma molécula de polinucleotídeo de referência ("consulta") (ou seu trançado complementar), conforme comparado a uma a molécula de polinucleotídeo teste ("objeto") (ou seu trançado complementar) quando as duas sequências são otimamente alinhadas. Em algumas modalidades, "percentagem de identidade" pode de referir a percentagem de amino ácidos idênticos em uma sequência de amino ácido.

[0097] Conforme aqui usado, a frase "substancialmente idêntica", no contexto de duas moléculas de ácido nucleicos, sequências de nucleotídeo, ou sequências de proteína, se refere a duas ou mais sequências ou subsequências que têm pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 81%, pelo menos cerca de 82%, pelo menos cerca de 83%, pelo menos cerca de 84%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 86%, pelo menos cerca de 87%, pelo menos cerca de 88%, pelo menos cerca de 89%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de nucleotídeo ou identidade de resíduo de amino ácido, quando comparada e alinhada para correspondência máxima, conforme medida usando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequência, ou por inspeção visual. Em algumas modalidades da invenção, a identidade substancial existe sobre uma região das sequências que é pelo menos cerca de 50 resíduos a cerca de 150 resíduos de comprimento. Desse modo, em algumas modalidades da invenção, a identidade substancial existe sobre uma região das sequências que é pelo menos cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, ou mais resíduos de comprimento. Em algumas modalidades particulares, as sequências são substancialmente idênticas sobre pelo menos cerca de 150 resíduos. Em uma modalidade adicional, as sequências são substancialmente idênticas sobre o comprimento total das regiões de codificação. Além disso, em modalidades representativas, sequências de nucleotídeo ou de proteína substancialmente idêntica realizam substancialmente a mesma função (por exemplo, modulação do teor de nicotina).

[0098] Para comparação de sequência, tipicamente uma sequência age como uma sequência de referência a qual sequências testes são comparadas. Quando usando um algoritmo de comparação de sequência, sequências teste e de referência são admitidas em um computador, coordenadas de subsequência são designadas se necessário, e parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência, em seguida, calcula a percentagem de identidade de sequência para a(s) sequência(s) teste(s) relativa(s) à sequência de referência, baseado nos parâmetros de programa designados.

[0099] Alinhamentos ótimos de sequências para alinhamento de uma janela de comparação são bem conhecidos àqueles técnicos no assunto, e podem ser conduzidos por ferramentas, tal como o algoritmo de homologia local de Smith and Waterman, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman and Wunsch, a pesquisa de método de similaridade de Pearson and Lipman, e, opcionalmente, por implementações computadorizadas destes algoritmos, tais como GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA, disponíveis como parte do GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., San Diego, CA). Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são compartilhados pelas duas sequências alinhadas, dividido pelo número total de componentes no segmento da sequência de referência, isto é, a sequência de referência total, ou uma parte definida menor da sequência de referência. A percentagem de identidade de sequência é representada como a fração de identidade multiplicada por 100. A comparação de uma ou mais sequências de polinucleotídeo pode ser para uma sequência de polinucleotídeo de comprimento total, ou uma porção desta, ou a uma sequência de polinucleotídeo mais longa. Para a proposta desta invenção "percentagem de identidade" pode também ser determinada usando BLASTX version 2.0 para sequências de nucleotídeo traduzidas, BLASTN version 2.0 para sequência de polinucleotídeos.

[00100] Software para realizar análise de BLAST é publicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Este algoritmo envolve primeiro identificação de pares de sequência de alta classificação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que, ou se equipara ou satisfaz alguma classificação de limite de valor positivo T quando se alinha com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de base de dados. T é referido como limite de classificação de palavra vizinho (Altschul et al., 1990). Estes acessos de palavra vizinha inicial agem como sementes para fazer com que os pesquisadores encontrem HSPs mais longos contendo as mesmas. Os acessos de palavra são, em seguida, estendidas em ambas as direções ao longo de cada sequência para classificação de alinhamento cumulativo podem ser aumentados. As classificações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeo, os parâmetros M (classificação de recompensa para um par de resíduos de equiparação; sempre > 0) e N (classificação de penalidade para resíduos de desequiparação; sempre < 0). Para sequências de amino ácido, uma matriz de classificação é usada para calcular a classificação cumulativa. A extensão dos acessos de palavra em cada direção é interrompida quando a classificação de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor alcançado máximo, a classificação cumulativa vai a zero ou abaixo devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de classificação negativa, ou a extremidade de qualquer sequência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T, e X determinam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeo) usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos trançados. Para sequências de amino ácido, o programa BLASTP usa como defaults um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de classificação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

[00101] Adicionalmente ao cálculo de percentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade provida pelo algoritmo BLAST é a probabilidade de menor soma (P(N)), que proporciona uma indicação da probabilidade pela qual uma equiparação entre duas sequências de nucleotídeo ou de amino ácido ocorreria por chance. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico teste é considerada similar a uma sequência de referência se a probabilidade de menor soma em uma comparação da sequência de nucleotídeo teste à sequência de nucleotídeo de referência é menos do que cerca de 0,1 a menos do que cerca de 0,001. Desse modo, em algumas modalidades da invenção, a probabilidade de menor soma em uma comparação da sequência de nucleotídeo teste para a sequência de nucleotídeo de referência, é menos do que cerca de 0,001.

[00102] Duas sequências de nucleotídeo podem também serem consideradas serem substancialmente idênticas quando as duas sequências hibridizam entre si sob condições estringentes. Em algumas modalidades representativas, duas sequências de nucleotídeo consideradas serem substancialmente idênticas hibridizam entre si sob condições altamente estringentes.

[00103] "Condições de hibridização estringentes" e "condições de lavagem de hibridização estringentes" no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucleico, tais como hibridizações de Southern e de Northern, são dependentes da sequência, e são diferentes sob parâmetros ambientais diferentes. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization com Nucleic Acid Probes part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993). Geralmente, hibridização altamente estringente e condições de lavagem são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixa do que o ponto de fusão térmico (Tm) para a sequência específica a uma resistência iônica e pH definidos.

[00104] A Tm é a temperatura (sob resistência iônica e pH definidos) na qual 50% da sequência alvo hibridiza a uma sonda perfeitamente equiparada. Condições muito estringentes são selecionadas para serem iguais à Tm para uma sonda particular. Um exemplo de condições de hibridização estringentes para hibridização de sequências de nucleotídeo complementares que têm mais do que 100 resíduos complementares em um filtro em uma mancha de Southern ou northern é 50% de formamida com 1 mg de heparina a 42°C, com a hibridização sendo efetuada durante a noite. Um exemplo de condições de lavagem altamente estringente é 0,1 5M NaCl a 72°C por cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem estringente é uma lavagem de 0,2x SSC a 65°C por 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para uma descrição de tampão de SSC). Frequentemente, uma lavagem de alta estringência é precedida por uma lavagem de baixa estringência, para remover sinal de sonda de fundo. Um exemplo de uma lavagem de média estringência para um duplex de, por exemplo, mais do que 100 nucleotídeos, é 1x SSC a 45°C por 15 minutos. Um exemplo de uma lavagem de baixa estringência para um duplex de, por exemplo, mais do que 100 nucleotídeos, é 4-6x SSC a 40°C por 15 minutos. Para sondas curtas (por exemplo, cerca de 10 a 50 nucleotídeos), condições estringentes tipicamente envolvem concentrações de sal de menos do que cerca de 1,0 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M Na de concentração de íon (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3, e a temperatura é tipicamente pelo menos cerca de 30°C. As condições estringentes podem também serem alcançadas com a adição de agentes de desestabilização, tal como formamida. Em geral, uma razão de sinal para ruído de 2x (ou mais alota) do que observada para uma sonda não- relacionada no ensaio de hibridização particular indica a detecção de uma hibridização específica. Sequências de nucleotídeo que não hibridizam entre si sob condições estringentes são ainda substancialmente idênticas se as proteínas que elas codificam são substancialmente idênticas. Isto pode ocorrer, por exemplo, quando uma cópia de uma sequência de nucleotídeo é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético.

[00105] Os seguintes são exemplos de conjuntos de condições de hibridização/lavagem que podem ser usados para clonar sequências de nucleotídeo homólogas que são substancialmente idênticas às sequências de nucleotídeo de referência da invenção. Em uma modalidade, uma sequência de nucleotídeo de referência hibridiza à sequência de nucleotídeo "teste" em 7% de sulfato de dodecil sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 2X de SSC, 0,1% de SDS a 50°C. Em outra modalidade, a sequência de nucleotídeo de referência hibridiza para a sequência de nucleotídeo "teste" em 7% de sulfato de dodecil sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 1X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, ou em 7% de sulfato de dodecil sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 0,5X SSC, 0,1% de SDS a 50°C. Em modalidades ainda adicionais, a sequência de nucleotídeo de referência hibridiza para a sequência de nucleotídeo "teste" em 7% de sulfato de dodecil sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 50°C, ou em 7% de sulfato de dodecil sódio (SDS), 0,5 M de NaPO4, 1 mM de EDTA a 50°C com lavagem em 0,1X SSC, 0,1% de SDS a 65°C.

[00106] Em modalidades particulares, uma indicação adicional que duas sequências de nucleotídeo ou duas sequências de polipeptídio são substancialmente idênticas pode ser que a proteína codificada pelo primeiro ácido nucleico é imunologicamente reativa cruzada com, ou se liga especificamente a, a proteína codificada pelo segundo ácido nucleico. Desse modo, em algumas modalidades, um polipeptídio pode ser substancialmente idêntico a um segundo polipeptídio, por exemplo, onde os dois polipeptídios diferem somente por substituições conservativas.

[00107] Uma molécula de ácido nucleico "isolada", uma sequência de nucleotídeo "isolada", ou um polipeptídio "isolado", é uma molécula de ácido nucleico, sequência de nucleotídeo, ou polipeptídio que, pela mão do homem, existem à parte de seu ambiente nativo, e é portanto, não um produto da natureza. Uma molécula de ácido nucleico isolada, sequência de nucleotídeo ou polipeptídio podem existir em uma forma purificada que é pelo menos parcialmente separada de pelo menos alguns dos outros componentes do organismo ou vírus que ocorrem naturalmente, por exemplo, a célula ou componentes estruturais virais, ou outros polipeptídios ou ácidos nucleicos comumente encontrados associados com o polinucleotídeo. Em modalidades representativas, a molécula de ácido nucleico isolada, a sequência de nucleotídeo isolada, e/ou o polipeptídio isolado é pelo menos cerca de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou mais puro.

[00108] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolada, sequência de nucleotídeo, ou polipeptídio, podem existir em um ambiente não-nativo, tal como, por exemplo, uma célula hospedeira recombinante. Desse modo, por exemplo, com relação às sequências de nucleotídeo, o termo "isolado" significa que ele é separado a partir do cromossomo e/ou célula em que ele ocorre naturalmente. Um polinucleotídeo é também isolado se ele é separado a partir do cromossomo e/ou célula em que ele ocorre naturalmente em e é, em seguida, inserido em um contexto genético, um cromossomo e/ou uma célula em que ele não ocorre naturalmente (por exemplo, uma célula hospedeira diferente, sequências regulatórias diferentes, e/ou posição diferente no genoma do que conforme encontrado na natureza). Consequentemente, as moléculas de ácido nucleico recombinantes, sequências de nucleotídeo, e seus polipeptídios codificados, são "isolados" em que, pela mão do homem, eles existem à parte de seu ambiente nativo, e, portanto, não são produtos de natureza; contudo, em algumas modalidades, eles podem ser introduzidos em, e existem em uma célula hospedeira recombinante.

[00109] Em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeo e/ou moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser operativamente associadas com uma variedade de promotores para expressão em células hospedeiras (por exemplo, células de planta). Desse modo, em algumas modalidades, a invenção proporciona células hospedeiras transformadas e organismos transformados compreendendo as células hospedeiras transformadas, no qual as células hospedeiras e organismos são transformados com uma ou mais moléculas de ácido nucleico/sequências de nucleotídeo da invenção. Conforme aqui usado, "operativamente associado com", quando se referindo a uma primeira sequência de ácido nucleico que é operativamente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico, significa uma situação quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em um relacionamento funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é operativamente associado com uma sequência de codificação se o promotor efetua a transcrição ou expressão da sequência de codificação.

[00110] Um promotor pode ser qualquer promotor útil para expressão de ácidos nucleicos em plantas e, conforme aqui descrito. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor constitutivo. Em outras modalidades, ele pode ser um promotor preferido de tecido ou um promotor específico de tecido.

[00111] Um "promotor" de DNA é uma sequência de DNA não- traduzida à montante de uma região de codificação que contém o local de ligação para RNA polimerase, e inicia transcrição do DNA. Uma "região promotora" pode também incluir outros elementos que agem como reguladores de expressão de gene. Os promotores podem incluir, por exemplo, promotores constitutivos, induzíveis, temporalmente regulados, de desenvolvimento regulado, quimicamente regulado, preferido de tecido e específico de tecido, para uso na preparação de uma molécula de ácido nucleico recombinante, isto é, genes quiméricos. Em aspectos particulares, um "promotor" útil com a invenção é um promotor capaz de iniciar transcrição de uma sequência de nucleotídeo em uma célula de uma planta.

[00112] A escolha do promotor variará dependendo das requisições temporais e espaciais para expressão, e também dependendo da célula hospedeira a ser transformada. Desse modo, por exemplo, a expressão das sequências de nucleotídeo da invenção pode ser em qualquer planta e/ou parte de planta, (por exemplo, em folhas, em pedúnculos ou caules, em espigas, em florescências, em raízes, sementes e/ou mudas, e similares).

[00113] Promotores úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a, aqueles que acionam expressão de uma sequência de nucleotídeo constitutivamente, aqueles que acionam expressão quando induzidos, e aqueles que acionam expressão em uma maneira específica de tecido, ou maneira de desenvolvimento específica. Estes vários tipos de promotores são conhecidos na técnica.

[00114] Exemplos de promotores constitutivos incluem, mas não são limitados a, promotor do vírus cestrum (cmp) (Patente dos Estados Unidos No. 7.166.770), o promotor de arroz actina 1 (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:3399-3406; bem como Patente dos Estados Unidos No. 5.641.876), promotor de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810812), promotor de CaMV 19S (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), promotor nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), promotor Adh (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), promotor de sacarose sintase (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148), e o promotor ubiquitina. O promotor constitutivo derivado de ubiquitina se acumula em muitos tipos de célula. Os promotores de ubiquitina foram clonados de várias espécies de planta para uso em plantas transgênicas, por exemplo, girassol (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), milho (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632), e arabidopsis (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906). O promotor de ubiquitina de milho (UbiP) foi desenvolvido em sistemas monocot transgênicos e sua sequência e vetores construídos para transformação de monocot são revelados na publicação de patente EP 0 342 926. O promotor de ubiquitina é adequado para a expressão das sequências de nucleotídeo da invenção em plantas transgênicas, especialmente monocotiledôneas. Adicionalmente, os cassetes de expressão do promotor descritos por McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)) podem ser facilmente modificados para a expressão das sequências de nucleotídeo da invenção, e são particularmente adequados para uso em hospedeiros monocotiledôneos.

[00115] Em algumas modalidades, promotores específicos de tecido/promotores preferidos de tecido podem ser usados. Padrões de expressão específicos de tecido ou preferidos de tecido incluem, mas não são limitados a, específicos ou preferidos de tecido verde, específicos ou preferidos de raiz, específicos ou preferidos de caule, e específicos ou preferidos de flor. Promotores adequados para expressão em tecido verde incluem muitos que regulam genes envolvidos na fotossíntese, e muitos destes foram clonados de ambas monocotiledôneas e dicotiledineas. Em uma modalidade, um promotor útil com a invenção é o promotor PEPC de milho a partir do gene de fosfoenol carboxilase (Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol. 12:579-589 (1989)). Exemplos não-limitativos de promotores específicos de tecido incluem aqueles associados com genes que codificam as proteínas de armazenagem de semente (Tais como β-conglucinina, cruciferina, napina e faseolina), zeína ou proteínas de corpo de óleo (tal como oleosina), ou proteínas envolvidas em biossíntese de ácido graxo (incluindo proteína transportadora acila, estearoil-ACP desaturase e ácido graxo desaturases (fad 2-1)), e outros ácidos nucleicos expressos durante desenvolvimento de embrião (tais como Bce4, ver, por exemplo, Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1:209-219; bem como Patente EP No. 255378). Promotores específicos de tecido e preferenciais de tecido úteis para a expressão das sequências de nucleotídeo da invenção em plantas, incluem, particularmente, milho, mas não são limitados a, aqueles que direcionam expressão na raiz, medula, folha ou pólen. Tais promotores são revelados, por exemplo, em WO 93/07278, aqui incorporado por referência em sua totalidade. Outros exemplos não- limitativos de promotores específicos de tecido ou promotores preferidos de tecido úteis com a invenção incluem o promotor de algodão rubisco, revelado na Patente dos Estados Unidos 6.040.504; o promotor de sacarose de arroz sintase revelado na Patente dos Estados Unidos 5.604.121; o promotor específico de raiz descrito por de Framond (FEBS 290:103-106 (1991); EP 0 452 269 para Ciba- Geigy); o promotor específico de caule descrito na Patente dos Estados Unidos 5.625.136 (para Ciba-Geigy), e que aciona expressão do gene de milho trpA; e o promotor de vírus de folha ondulada amarela cestrum, revelado em WO 01/73087, todos incorporados por referência.

[00116] Exemplos adicionais de promotores específicos de tecido/promotores preferidos de tecido incluem, mas não são limitados a, os promotores específicos de raiz RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) e RB7 (Patente dos Estados Unidos No. 5459252), o promotor de lectina (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167; and Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), promotor de álcool de milho de dehidrogenase 1 (Dennis et al. (1984) Nucleic acids Res. 12:3983-4000), S-adenosil-L-metionina sintetase (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8):1108-1115), promotor complexo de coleta leve de milho (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), promotor de protéina de choque de calor (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; and Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458), promotor de ervilha pequena de subunidade RuBP carboxilase (Cashmore, "Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase" pp. 29-39 In: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; and Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205:193-200), promotor de plasmídeo Ti manopina sintase (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-3223), promotor de plasmídeo Ti nopalina sintase (Langridge et al. (1989), supra), promotor de petúnia chalcone isomerase (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7:1257-1263), promotor de proteína 1 rico em feijão glicina (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3:16391646), promotores de CaMV 35S truncado (O'Dell et al. (1985) Nature 313:810-812), promotor de batata patatin (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), promotor de célula de raiz (Yamamoto et al. (1990) Nucleic acids Res. 18:7449), promotores de zeína de milho (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207:90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34:1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic acids Res. 18:6425; Reina et al. (1990) Nucleic acids Res. 18:7449; and Wandelt et al. (1989) Nucleic acids Res. 17:2354), promotor de globulina-1 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), promotor de α-tubulina cab (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:431-440), promotor de PEPCase (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), promotores complexos-associados de gene R (Chandler et al. (1989) Plant cell 1:1175-1183), e promotores de chalcone sintase (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612). Em algumas modalidades particulares, as sequências de nucleotídeo da invenção são operativamente associadas com um promotor preferido de raiz.

[00117] Particularmente útil para expressão específica de semente é o promotor vicilin de ervilha (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235:33-40; bem como os promotores específicos de semente revelados na Patente dos Estados Unidos No. 5.625.136. Promotores úteis para expressão em folhas maturas são aqueles que são permutados no começo da senescência, tal como o promotor SAG de Arabidopsis (Gan et al. (1995) Science 270:1986-1988).

[00118] Adicionalmente, promotores funcionais em plastídeos podem ser usados. Exemplos não-limitativos de tais promotores incluem o gene bacteriófago T3 9 5' UTR, e outros promotores revelados na Patente dos Estados Unidos No. 7.579.516. Outros promotores úteis com a invenção incluem, mas não são limitados a, o promotor S-E9 pequena subunidade RuBP carboxilase, e o promotor de gene do inibidor de Kunitz tripsina (Kti3).

[00119] Em algumas modalidades da invenção, os promotores induzíveis podem ser usados. Desse modo, por exemplo, promotores químicos-regulados podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. A regulação da expressão de Sequências de nucleotídeo da invenção, via promotores que são quimicamente regulados, capacitam que os polipeptídios da invenção sejam sintetizados somente quando as plantas de cultivo são tratadas com os químicos de indução. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível por químico, onde a aplicação de um químico induz expressão de gene, ou um promotor repressível por químico, onde aplicação do químico regride a expressão de gene.

[00120] Promotores induzíveis químicos são conhecidos na técnica, e incluem, mas não são limitados a, o promotor de milho In2-2, que é ativado por protetores de herbicida benzenosulfonamida, o promotor de milho GST, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são usados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor de tabaco PR-1, que é ativado por ácido salicílico (por exemplo, o sistema PR1a), promotores responsivos a esteroide (ver, por exemplo, o promotor induzível por glucocorticoide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421-10425 and McNellis et al. (1998) Plant J. 14, 247257), e promotores induzíveis por tetraciclina e promotores supressíveios por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 229-237, e Patentes dos Estados Unidos Números 5.814.618 e 5.789.156, promotores de sistema repressor de Lac, promotores de sistema induzível por cobre, promotores de sistema induzíveis por salicilato (por exemplo, o sistema PR1a), promotores induzíveis por glucocorticoide (Aoyama et al. (1997) Plant J. 11:605612), e promotores de sistema induzíveis por ecdisona.

[00121] Outros exemplos não-limitativos de promotores induzíveis incluem promotores induzíveis ABA- e turgor, o promotor de gene de proteína de ligação de auxina (Schwob et al. (1993) Plant J. 4:423-432), o promotor de UDP glicose flavonoide glicosil-transferase (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185-197), o promotor de inibidor MPI proteinase (Cordero et al. (1994) Plant J. 6:141-150), e o promotor gliceraldeído-3- fosfato dehidrogenase (Kohler et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29:12931298; Martinez et al. (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565; and Quigley et al. (1989) J. Mol. Evol. 29:412-421). Também incluídos são o benzeno sulfonamida-induzível (Patente dos Estados Unidos No. 5.364.780) e álcool-induzível (Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 97/06269 e WO 97/06268) sistemas e promotores de glutationa S- transferase. Do mesmo modo, pode-se usar qualquer dos promotores induzíveis descritos em Gatz (1996) Current Opinion Biotechnol. 7:168172 and Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89108. Outros promotores quimicamente induzíveis úteis para direcionamento da expressão das sequências de nucleotídeo desta invenção em plantas são revelados na Patente dos Estados Unidos 5.614.395, aqui incorporada por referência em sua totalidade. A indução química de expressão de gene é também detalhada no pedido publicado EP 0 332 104 (para Ciba- Geigy) e Patente dos Estados Unidos 5.614.395. Em algumas modalidades, um promotor para indução química pode ser o promotor de tabaco PR-1a.

[00122] Em aspectos adicionais, as sequências de nucleotídeo da invenção podem ser operativamente associadas com um promotor que é induzível por ferida, ou induzível por peste, ou por infecção patógena. Numerosos promotores foram descritos que são expressos em locais de ferida e/ou nos locais de ataque de peste, ou de infecção fito patógena. Idealmente, tal promotor deve ser ativo somente localmente, em ou adjacente aos locais de ataque, e, desse modo, expressão das sequências de nucleotídeo da invenção será focalizada nas células que estão sendo invadidas. Tais promotores incluem, mas não são limitados a, aqueles descritos por Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu et al. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann et al. Plant cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier and Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek et al. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), Warner et al. Plant J. 3:191-201 (1993), Patente dos Estados Unidos No. 5.750.386, Patente dos Estados Unidos No. 5.955.646, Patente dos Estados Unidos No. 6.262.344, Patente dos Estados Unidos No. 6.395.963, Patente dos Estados Unidos No. 6.703.541, Patente dos Estados Unidos No. 7.078.589, Patente dos Estados Unidos No. 7.196.247, Patente dos Estados Unidos No. 7.223.901, e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos 2010043102.

[00123] Conforme aqui usado, "cassete de expressão" significa uma construção de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo de interesse (por exemplo, as sequências de nucleotídeo da invenção), no qual referida sequência de nucleotídeo é operativamente associada com pelo menos uma sequência de controle (por exemplo, um promotor). Desse modo, algumas modalidades da invenção proporcionam cassetes de expressão designados para expressar as sequência de nucleotídeos da invenção. Desse modo, por exemplo, um ou mais promotores de planta operativamente associados com uma ou mais sequências de nucleotídeo da invenção (por exemplo, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, e/ou SEQ ID NO:7) são proporcionados em cassetes de expressão para expressão em um organismo, ou células deste (por exemplo, uma planta, parte de planta e/ou célula de planta).

[00124] Um cassete de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeo de interesse pode ser quimérico, significando que pelo menos um de seus componentes é heterólogo com relação a pelo menos um de seus outros componentes. Um cassete de expressão pode também ser um que está ocorrendo naturalmente, mas que foi obtido em uma forma recombinante útil para expressão heteróloga. Tipicamente, contudo, o cassete de expressão é heterólogo com relação ao hospedeiro, isto é, a sequência de ácido nucleico particular do cassete de expressão que não ocorre naturalmente na célula hospedeira, e deve ter sido introduzida na célula hospedeira, ou um ancestral da célula hospedeira por um evento de transformação.

[00125] Adicionalmente aos promotores operativamente ligados às sequências de nucleotídeo da invenção, um cassete de expressão da invenção pode também incluir outras sequências regulatórias. Conforme aqui usado, "sequências regulatórias" significam sequências de nucleotídeo localizadas à montante (5' sequências de não- codificação), ou à jusante (3' sequências de não-codificação) de uma sequência de codificação, e que influenciam a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou translação da sequência de codificação associada. Sequências regulatórias incluem, mas não são limitadas a, promotores, intensificadores, introns, líderes de sequência de translação, sinais de terminação, e sequências de sinal de polialdenilação.

[00126] Para proposta da invenção, as sequências regulatórias ou regiões podem ser nativas/análogas à planta, parte de planta, e/ou célula de planta, e/ou as sequências regulatórias podem ser nativas/análogas às outras sequências regulatórias. Alternativamente, as sequências regulatórias podem ser heterólogas à planta (e/ou parte de planta e/ou célula de planta), e/ou entre si (isto é, as sequências regulatórias). Desse modo, por exemplo, um promotor pode ser heterólogo quando ele é operativamente ligado a uma sequência de polinucleotídeo de uma espécie diferente a partir das espécies das quais a sequência de polinucleotídeo foi derivada. Alternativamente, um promotor pode também ser heterólogo a uma sequência de nucleotídeo selecionada se o promotor é a partir da mesma/espécie análoga da qual o polinucleotídeo é derivado, mas um ou ambos (isto é, promotor e/ou polinucleotídeo) são substancialmente modificados de sua forma original e/ou local genômico, e/ou o promotor não é o promotor nativo para o polinucleotídeo operavelmente ligado.

[00127] Um número de sequências líder não-traduzida derivadas de vírus são conhecidas por intensificarem expressão de gene. Especificamente, sequências líderes de Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV, a sequência 'W), Matize Chlorotic Mottle Virus (MCMV) e Vírus do Mosaico da Alfalfa (AMV) se mostraram serem efetivas na intensificação da expressão (Gallie et al. (1987) Nucleic acids Res. 15:8693-8711; and Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79). Outras sequências líderes conhecidas na técnica incluem, mas não são limitadas a, líderes de picornavírus, tal como região de não-codificação 5’ de encefalomiocardite (EMCV) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes de potivírus, tal como um Tabaco Etch Virus (TEV) (Allison et al. (1986) Virology 154:9-20); líder de Maize Dwarf Mosaic Virus (MDMV) (Allison et al. (1986), supra); líder de proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina (BiP) (Macejak & Samow (1991) Nature 353:90-94); líder não-trasuzido a partir do mRNA de proteína de camada de AMV (AMV RNA 4; Jobling & Gehrke (1987) Nature 325:622-625); líder de TMV de mosaico do tabaco (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA 237-256); e líder de MCMV (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968.

[00128] Um cassete de expressão também pode, opcionalmente, incluir uma região de terminação transcricional e/ou translacional (isto é, região de terminação) que é funcional em plantas. Uma variedade de terminadores transcricionais são disponíveis para uso em cassetes de expressão, e são responsáveis pela terminação de transcrição além da sequência de nucleotídeo heteróloga de interesse, e polialdenilação de mRNA correta. A região de terminação pode ser nativa à região de iniciação transicional, pode ser nativa à sequência de nucleotídeo operavelmente ligada de interesse, pode ser nativa ao hospedeiro de planta, ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de nucleotídeo de interesse, ao hospedeiro de planta, ou qualquer combinação destes). Os terminadores transcricionais apropriados incluem, mas não são limitados a, o terminador CAMV 35S, o terminador tmlr, o terminador nopalina sintase, e/ou o terminador pea rbcs E9. Estes podem ser usados e ambas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Adicionalmente, um terminador de transcrição nativa de sequência de codificação pode ser usado.

[00129] Um cassete de expressão da invenção também pode incluir uma sequência de nucleotídeo para um marcador selecionável, que pode ser usado para selecionar uma planta transformada, parte de planta, e/ou célula de planta. Conforme aqui usado, "marcador selecionável" significa uma sequência de nucleotídeo que, quando expressa, concede um fenótipo distinto à planta, parte de planta, e/ou célula de planta, que expressam o marcador e, desse modo, permite que tais plantas transformadas, partes de planta, e/ou células de plantas, sejam distinguidas daquelas que não têm o marcador. Tal sequência de nucleotídeo pode codificar, ou uma marcador selecionável ou classificável, dependendo de se o marcador confere um traço que pode ser selecionado por meios químicos, tal como por usar um agente seletivo (por exemplo, um antibiótico, herbicida, ou similares), ou se o marcador é simplesmente um traço que pode-se identificar através de observação ou teste, tal como por classificação (por exemplo, o traço R- locus). Naturalmente, muitos exemplos de marcadores selecionáveis adequados são conhecidos na técnica, e podem ser usados nos cassetes de expressão aqui descritos.

[00130] Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não são limitados a, uma sequência de nucleotídeo que codifica neo ou nptII, que confere resistência à canamicina, G418, e similares (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-188); uma sequência de nucleotídeo que codifica bar, que confere resistência à fosfiinotricina; uma sequência de nucleotídeo que codifica uma 5-enolpiruvilshikimatp-3-fosfato (EPSP) sintase alterada, que confere resistência à glifosato (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); uma sequência de nucleotídeo que codifica uma nitrilase tal como bxn de Klebsiella ozaenae que confere resistência à bromoxinil (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); uma sequência de nucleotídeo que codifica uma acetolactatp sintase alterada (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfonilureia ou outros químicos de inibição de ALS (Pedido de Patente EP No. 154204); uma sequência de nucleotídeo que codifica uma metotrexato-resistante dihidrofolato reductase (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); uma sequência de nucleotídeo que codifica uma dalapon dehalogenase que confere resistência a dalapon; uma sequência de nucleotídeo que codifica uma manose-6-fosfato isomerase (também referida como fosfomanose isomerase (PMI)) que confere uma capacidade de metabolizar manose (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.767,378 e 5.994.629); uma sequência de nucleotídeo que codifica uma antranilato sintase alterada que confere resistência à 5- metil triptofano; e/ou uma sequência de nucleotídeo que codifica hph que confere resistêcia à higromicina. Um técnico no assunto é capaz de escolher um marcador selecionável adequado para uso em um cassete de expressão da invenção.

[00131] Marcadores selecionáveis adicionais incluem, mas não são limitados a, uma sequência de nucleotídeo que codifica β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para qual vários substratos cromogênicos são conhecidos; uma sequência de nucleotídeo R-locus que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging com Ac," pp. 263-282 In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); uma sequência de nucleotídeo que codifica β-lactamase, uma enzima para qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); uma sequência de nucleotídeo que codifica xylE que codifica um catecol dioxigenase (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105); uma sequência de nucleotídeo que codifica tirosinase, uma enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA e dopaquinona, que, por sua vez, condensa para formar melanina (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); uma sequência de nucleotídeo que codifica β-galactosidase, uma enzima para qual existem substrates cromogênicos; uma sequência de nucleotídeo que codifica luciferase (lux), que permite detecção de bioluminescência (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); uma sequência de nucleotídeo que codifica aequorin, que pode ser empregado em detecção de bioluminescência sensível à cálcio (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268); ou uma sequência de nucleotídeo que codifica proteína fluorescente verde (Niedz et al. (1995) Plant cell Reports 14:403-406). Um técnico no assunto é capaz de escolher uma marcador selecionável adequado para uso em um cassete de expressão da invenção.

[00132] Um cassete de expressão da invenção também pode incluir sequências de nucleotídeo que codificam outros traços desejados. Tais traços desejados podem ser outras sequências de nucleotídeo que conferem vários traços agriculturalmente desejáveis, tais como doença e/ou resistência á inseto, tolerância ou resistência à estresse abiótico, e similares. Tais sequências de nucleotídeo podem ser empilhadas com qualquer combinação de SEQuências de nucleotídeo para criar plantas, partes de planta, ou células de planta tendo o fenótipo desejado. Combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo, mas não limitado a, cruzamento de plantas por qualquer metodologia convencional, ou por transformação genética. Se empilhadas por transformar geneticamente as plantas, as sequências de nucleotídeo que codificam traços desejados adicionais podem ser combinadas em qualquer tempo e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou mais traços desejados pode ser usada como o alvo para introduzir traços adicionalmente por transformação subsequente. As sequências de nucleotídeo adicionais podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de co- transformação com uma sequência de nucleotídeo, molécula de ácido nucleico, construção de ácido nucleico, e/ou composição da invenção, provido por qualquer combinação de cassetes de expressão. Por exemplo, se duas sequências de nucleotídeo serão introduzidas, elas podem ser incorporadas em cassetes separados (trans), ou podem ser incorporadas no mesmo cassete (cis). A expressão das sequências de nucleotídeo pode ser acionada pelo mesmo promotor, ou por promotores diferentes. É adicionalmente reconhecido que as sequências de nucleotídeo podem ser empilhadas em uma localização genômica desejada usando um sistema de recombinação de local específico. Ver, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente Internacional Nos. WO 99/25821; WO 99/25854; WO 99/25840; WO 99/25855 e WO 99/25853.

[00133] Adicionalmente a cassetes de expressão, as moléculas de ácido nucleico e sequências de nucleotídeo aqui descritas podem ser usadas em conjunto com vetores. O termo "vetor" se refere a uma composição para transferir, distribuir ou introduzir um ácido nucleico (ou ácidos nucleicos) em uma célula. Um vetor compreende uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo(s) a ser transferida, distribuída ou introduzida. Vetores para uso na transformação de plantas e outros organismos são bem conhecidos na técnica. Exemplos não-limitativos de classes gerais de vetores incluem, mas não são limitados a, um vetor viral, um vetor de plasmídeo, um vetor de fago, um vetor de fagemídeo, um cosmídeo, um fosmídeo, um bacteriófago, ou um cromossomo artificial. A seleção de um vetor dependerá da técnica de transformação preferida e da espécie alvo para transformação. Consequentemente, em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção pode ser compreendida dentro de um vetor recombinante. O tamanho de um vetor pode variar consideravelmente dependendo de se o vetor compreende um ou múltiplos cassetes de expressão (por exemplo, para empilhamento molecular). Desse modo, um tamanho do vetor pode variar de cerca de 3 kb a cerca de 30 kb. Desse modo, em algumas modalidades, um vetor é cerca de 3 kb, 4kb, 5 kb, 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14kb, 15 kb, 16 kb, 17 kb, 18 kb, 19 kb, 20 kb, 21 kb, 22 kb, 23 kb, 24kb, 25 kb, 26 kb, 27 kb, 28 kb, 29 kb, 30 kb, 40 kb, 50 kb, 60 kb, e similares, ou qualquer faixa na mesma, de tamanho. Em algumas modalidades particulares, um vetor pode ser cerca de 3 kb a cerca de 10 kb de tamanho.

[00134] A presente invenção é direcionada em parte à descoberta que a modulação da expressão por sobre expressão ou inibição de expressão em uma planta de pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada ou construção de ácido nucleico desta invenção, pode resultar na planta tendo teor aumentado de nicotina, ou teor reduzido de nicotina, conforme comparado a uma planta que não compreende referida molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico.

[00135] Desse modo, em algumas modalidades da invenção, um método de produção de uma célula de planta transgênica é proporcionado, referido método compreendendo a introdução em uma célula de planta de uma molécula de ácido nucleico isolada/construção da invenção, produzindo, desse modo, uma célula de planta transgênica que pode regenerar uma planta transgênica tendo teor de alcaloide modulado (por exemplo, aumentado ou diminuído) (por exemplo, nornicotina, nicotina, anabasina, anatabina, e similares), conforme comparado a uma planta regenerada de uma célula de planta que não compreende referida molécula de ácido nucleico/construção. Em algumas modalidades, a célula de planta transgênica compreende mais do que uma (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) molécula de ácido nucleico/sequência de nucleotídeo da invenção. Desse modo, em alguns aspectos da invenção, as plantas transgênicas, ou partes destas, compreendem e expressam uma ou mais molécula de ácido nucleico isolada/construções da invenção, desse modo, produzindo um ou mais polipeptídios da invenção, resultando em teor de alcaloide modulado (por exemplo, reduzido ou aumentado) na referida planta transgênica.

[00136] Em modalidades adicionais da invenção, um método de produção de uma célula de planta transgênica é proporcionado, referido método compreendendo a introdução em uma célula de planta de uma molécula de ácido nucleico isolada/construção da invenção, produzindo, desse modo, uma célula de planta transgênica que pode regenerar uma planta transgênica tendo teor de nicotina modulado (por exemplo, aumentado ou diminuído), conforme comparado a uma planta regenerada de uma célula de planta que não compreende referida molécula de ácido nucleico /construção. Em algumas modalidades, a célula de planta transgênica compreende mais do que uma (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) molécula de ácido nucleico/sequência de nucleotídeo da invenção. Desse modo, em alguns aspectos da invenção, as plantas transgênicas, ou partes destas, compreendem e expressam uma ou mais moléculas de ácido nucleico isolada/construções da invenção, desse modo, produzindo um ou mais polipeptídios da invenção, resultando em teor de nicotina modulado (por exemplo, reduzido ou aumentado) na referida planta transgênica.

[00137] "Introdução", no contexto de uma sequência de nucleotídeo de interesse (por exemplo, as moléculas de ácido nucleico/construções da invenção), significa a apresentação da sequência de nucleotídeo de interesse à planta, parte de planta, e/ou célula de planta, de tal maneira que a sequência de nucleotídeo ganha acesso ao interior de uma célula. Onde mais do que uma sequência de nucleotídeo é para ser introduzida, estas sequências de nucleotídeo podem ser montadas como parte de um polinucleotídeo único, ou construção de ácido nucleico, ou como polinucleotídeo separado, ou construção de ácido nucleicos, e podem estar localizadas nos mesmos ou em vetores de transformação diferentes. Consequentemente, estes polinucleotídeos podem ser introduzidos em células de planta em um evento de transformação único, em eventos de transformação separados, ou, por exemplo, como parte de um protocolo de reprodução. Desse modo, o termo "transformação", conforme aqui usado, se refere a introdução de um ácido nucleico heterólogo em uma célula. A transformação de uma célula pode ser estável ou transiente. Desse modo, em algumas modalidades, uma célula de planta da invenção é estavelmente transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção. Em outras modalidades, uma planta da invenção é transientemente transformada com uma molécula de ácido nucleico da invenção.

[00138] "Transformação transiente" no contexto de um polinucleotídeo significa que um polinucleotídeo é introduzido na célula, e não se integra no genoma ou plastoma da célula, e, consequentemente, referida célula não pode ser regenerada em uma planta estavelmente transformada.

[00139] Por "introduzir estavelmente", ou "estavelmente introduzido", no contexto de um polinucleotídeo introduzido em uma célula é pretendido que o polinucleotídeo seja estavelmente incorporado no genoma da célula, e, desse modo, a célula é estavelmente transformada com o polinucleotídeo.

[00140] "Transformação estável", ou "estavelmente transformado", conforme aqui usado, significa que um ácido nucleico é introduzido em uma célula e se integra no genoma da célula. Como tal, o ácido nucleico integrado é capaz de ser herdado pela progenia deste, mais particularmente, pela progenia de gerações sucessivas múltiplas. "Genoma", conforme aqui usado, também inclui o genoma nuclear e o genoma de plastídeo, e, portanto, inclui integração do ácido nucleico em, por exemplo, o genoma de cloroplasto. A transformação estável, conforme aqui usado, pode também se referir a um transgene que é mantido extracromassomalmente, por exemplo, como um minicromossomo.

[00141] A transformação transiente pode ser detectada por, por exemplo, um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), ou Western blot, que pode detectar a presença de um peptídeo ou polipeptídio que codifica um ou mais transgenes introduzidos em um organismo. A transformação estável de uma célula pode ser detectada por, por exemplo, um ensaio de hibridização de Southern blot de DNA genômico da célula com sequências de ácido nucleico que hibridizam especificamente com uma sequência de nucleotídeo de um transgene introduzida em um organismo (por exemplo, uma planta). A transformação estável de uma célula pode ser detectada por, por exemplo, um ensaio de hibridização de Northern blot de RNA da céluça com sequências de ácido nucleico que hibridizam especificamente com uma sequência de nucleotídeo de um transgene introduzida em uma planta ou outro organismo. A transformação estável de uma célula pode também ser detectada por, por exemplo, uma reação de cadeia de polimerase (PCR), ou outras reações de amplificação, conforme são bem conhecidas na técnica, empregando sequências de primer específicas que hibridizam com sequência(s) alvo(s) de um transgene, resultando na amplificação da sequência de transgene, que pode ser detectada de acordo com métodos de transformação padrões. A transformação pode também ser detectada por protocolos de sequenciamento direto e/ou de hibridização bem conhecidos na técnica.

[00142] Uma molécula de ácido nucleico da invenção (por exemplo, uma ou mais das sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, e/ou uma sequência de nucleotídeo que codifica um ou mais polipeptídios tendo a sequência de amino ácido de qualquer uma de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8), pode ser introduzida em uma célula por qualquer método conhecido àqueles técnicos no assunto.

[00143] Em algumas modalidades da invenção, transformação de uma célula compreende transformação nuclear. Em outras modalidades, a transformação de uma célula compreende transformação de plastídeo (por exemplo, transformação de cloroplasto.

[00144] Os procedimentos para transformação de plantas são bem conhecidos e rotina na técnica, e são descritos através de toda a literatura. Exemplos não-limitativos de métodos para transformação de plantas incluem transformação, via distribuição de ácido nucleico mediada por bactérias (por exemplo, via, Agrobactérias), distribuição de ácido nucleico mediada por vírus, distribuição de ácido nucleico mediada por carbeto de silício, ou mediada por whisker de ácido nucleico, distribuição de ácido nucleico mediada por lipossomo, microinjeção, bombardeio de micropartícula, transformação mediada por fosfato de cálcio, transformação mediada por ciclodextrina, eletroporação, transformação mediada por nanopartícula, sonicação, infiltração, entrada de ácido nucleico mediada por PEG, bem como qualquer outro mecanismo elétrico, químico, físico (mecânico) e/ou biológico, que resulta na introdução de ácido nucleico na célula de planta, incluindo qualquer combinação destes. Guias gerais para vários métodos de transformação de planta conhecidos na técnica incluem Miki et al. ("Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants" em Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E., Eds. (CRC Press, Inc., Boca Raton, 1993), páginas 67-88) and Rakowoczy-Trojanowska (Cell. Mol. Biol. Lett. 7:849-858 (2002)).

[00145] A transformação mediada por Agrobacterium é um método comumente usado para transformação de plantas, em particular, plantas dicotiledôneas, devido a sua alta eficiência de transformação, e devido a sua ampla utilidade com muitas espécies diferentes. A transformação mediada por Agrobacterium tipicamente envolve transferência do vetor binário que conduz o DNA estranho de interesse a uma estirpe de Agrobacterium apropriada que pode depender do complemento de genes vir conduzidos pela estirpe Agrobacterium de hospedeiro, ou em um plasmídeo Ti co-residente, ou cromossomalmente (Uknes et al. (1993) Plant cell 5:159-169). A transferência do vetor binário recombinante ao Agrobacterium pode ser acompanhada por um procedimento de união triparental usando Escherichia coli que conduz o vetor binário recombinante, uma estirpe E. coli auxiliadora que conduz um plasmídeo que é capaz de mobilizar o vetor binário recombinante à estirpe Agrobacterium alvo. Alternativamente, o vetor binário recombinante pode ser transferido ao Agrobacterium por transformação de ácido nucleico (Hofgen & Willmitzer (1988) Nucleic acids Res. 16:9877).

[00146] A transformação de uma planta por Agrobacterium recombinante usualmente envolve co-cultivo do Agrobacterium com explantes a partir da planta, e segue métodos bem conhecidos na técnica. O tecido transformado é regenerado no meio de seleção conduzindo um antibiótico ou marcador resistente ao herbicida entre as bordas de T-DNA de plasmídeo binário.

[00147] Outro método para transformação de plantas, partes de planta, e/ou células de planta, envolve propulsão de partículas inertes ou biologicamente ativas nos tecidos de planta e células. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 4.945.050; 5.036.006 e 5.100.792. Geralmente, este método envolve propulsão de partículas inertes ou biologicamente ativas nas células de planta sob condições efetivas para penetrar na superfície externa da célula, e proporcionar incorporação dentro do interior desta. Quando partículas inertes são utilizadas, o vetor pode ser introduzido na célula por revestimento das partículas com o vetor contendo o ácido nucleico de interesse. Alternativamente, uma célula ou células podem ser circundadas pelo vetor, de modo que o vetor é conduzido na célula pela esteira da partícula. Partículas biologicamente ativas (por exemplo, células de levedura secadas, bactérias secadas, ou um bacteriófago, cada contendo um ou mais ácidos nucleicos a serem introduzidos) também podem ser propulsionados no tecido de planta.

[00148] Desse modo, em modalidades particulares da invenção, uma célula de planta pode ser transformada por qualquer método conhecidos na técnica, e conforme descrito aqui, e plantas intactas podem ser regeneradas a partir destas células transformadas usando qualquer de uma variedade de técnicas conhecidas. A regeneração de planta de células de planta, cultura de tecido de planta e/ou protoplastos cultivados, é descrita, por exemplo, em Evans et al. (Handbook of Plant cell Cultures, Vol. 1, MacMilan Publishing Co. New York (1983)); e Vasil I. R. (ed.) (Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I (1984), e Vol. II (1986)). Métodos de seleção de plantas transgênicas transformadas, células de planta e/ou cultura de tecido de planta, são rotina na técnica, podem ser empregados nos métodos da invenção aqui proporcionados.

[00149] Do mesmo modo, as propriedades genéticas projetadas nas sementes transgênicas e plantas, partes de planta, e/ou células de planta da invenção descrita acima podem ser passadas por reprodução sexual ou crescimento vegetativo e, portanto, podem ser mantidas e propagadas em plantas de progenia. Geralmente, a manutenção e propagação fazem uso de métodos agrícolas conhecidos desenvolvidos para ajustar propostas específicas, tais como coleta, semeadura ou aragem.

[00150] Uma sequência de nucleotídeo, portanto, pode ser introduzida na planta, parte de planta e/ou célula de planta em qualquer número de modos que são bem conhecidos na técnica. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introdução de uma ou mais sequências de nucleotídeo em uma planta, somente que elas ganhem acesso ao interior de pelo menos uma célula da planta. Onde mais do que uma sequência de nucleotídeo é para ser introduzida, elas podem ser montadas como parte de uma construção de ácido nucleico único, ou coma construçãos de ácido nucleico separados, e podem estar localizadas no mesmo ou construções de ácido nucleico diferentes. Consequentemente, as sequências de nucleotídeo podem ser introduzidas na célula de interesse em um evento de transformação simples, em eventos de transformação separados, ou, por exemplo, em plantas, como parte de um protocolo de reprodução.

[00151] Desse modo, em modalidades adicionais, a invenção proporciona um método de produção de uma planta tendo uma planta tendo teor de alcaloide modulado, o método compreendendo a introdução em uma célula de planta de uma construção de ácido nucleico da invenção, para produzir uma célula de planta transgênica, no qual a célula de planta transgênica compreende referida construção de ácido nucleico da invenção em seu genoma; e regeneração de referida célula de planta transgênica, para produzir uma planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico, desse modo, produzindo uma planta tendo teor de alcaloide modulado. Em algumas modalidades, o teor de alcaloide da planta transgênica é aumentando, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em outras modalidades, o teor de alcaloide da planta transgênica é diminuído, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em modalidades representativas, a planta é uma planta de tabaco.

[00152] Em modalidades adicionais, a invenção proporciona um método de produção de uma planta tendo teor de nicotina modulado, o método compreendendo introdução em uma célula de planta de uma construção de ácido nucleico da invenção, para produzir uma célula de planta transgênica, no qual a célula de planta transgênica compreende referida construção de ácido nucleico da invenção em seu genoma; e regeneração de referida célula de planta transgênica, para produzir uma planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico, desse modo, produzindo uma planta tendo teor de nicotina modulado. Em algumas modalidades, o teor de nicotina da planta transgênica é aumentado, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em outras modalidades, o teor de nicotina da planta transgênica é diminuído, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em modalidades representativas, a planta é uma planta de tabaco.

[00153] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um método de modulação do teor de alcaloide em uma planta, compreendendo a introdução em uma célula de planta de uma construção de ácido nucleico da invenção, para produzir uma célula de planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico; e regeneração de referida célula de planta transgênica, para produzir uma planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico, desse modo, modulando o teor de alcaloide na referida planta transgênica, conforme comparado a uma planta que não é transformada com o referida construção de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o teor de alcaloide da planta transgênica é aumentado, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em outras modalidades, o teor de alcaloide da planta transgênica é diminuído, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em modalidades representativas, a planta é uma planta de tabaco.

[00154] Em uma modalidade adicional, a presente invenção proporciona um método de modulação do teor de nicotina em uma planta, compreendendo a introdução em uma célula de planta de uma construção de ácido nucleico da invenção, para produzir uma célula de planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico; e regeneração de referida célula de planta transgênica, para produzir uma planta transgênica compreendendo referida construção de ácido nucleico, desse modo, modulando a produção de nicotina na referida planta transgênica, conforme comparada a uma planta que não é transformada com o (não compreende) referida construção de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o teor de nicotina da planta transgênica é aumento, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em outras modalidades, o teor de nicotina da planta transgênica é diminuído, conforme comparado a uma planta que não compreende referida construção de ácido nucleico. Em modalidades representativas, a planta é uma planta de tabaco.

[00155] A presente invenção adicionalmente proporciona métodos de modulação do teor de alcaloide (por exemplo, no nicotina, nicotina, ambarina, anata bina, e similares) em uma planta, e métodos de produção de plantas tendo teor de alcaloide modulado (por exemplo, no nicotina, nicotina, ambarina, anata bina, e similares), compreendendo modificação in planta de uma ou mais das sequências de nucleotídeo nativas ou tipo selvagem que codificam os fatores de transcrição desta invenção (por exemplo, NtMYC2a, NtMYC2b, NtERF98, Neta). Qualquer método de modificar uma sequência de nucleotídeo in planta pode ser usado com esta invenção para alterar a expressão dos genes que codificam estes fatores de transcrição. Tais métodos podem incluir, mas não são limitados a, mutagênese ou direcionamento/edição de gene usando meganuclease, Zinc Finger nuclease, TALENs, e/ou CRISPR/Cas9 nuclease, e/ou introdução de um ácido nucleico, ou oligonucleobase de reparo de gene compreendendo pelo menos uma porção de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 ou SEQ ID NO:7. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeo de um fator de transcrição da invenção pode ser modificada, tal que um códon de amino ácido é substituído por um códon de parada, resultando em terminação prematura durante translação do polipeptídio e, desse modo, resultando em reduzida ou nenhuma atividade do fator de transcrição, desse modo, modulando o teor de alcaloide da planta.

[00156] Procedimentos para determinação da nicotina e teor de alcaloide são bem conhecidos e rotina na técnica, e são descritos através de toda a literatura. Exemplos não-limitativos de métodos para medição do teor de nicotina/teor de alcaloide incluem métodos tais como cromatografia de gás, espectrometria de massa (Domino et al. 1992 Med Sci Res. 20:859-860; Sheen et al. 2006 J Food Sci 53(5):1572- 1573), HPLC (Keinanen et al. 2001 J Agric Food Chem 49:3553-3558; Halitschke and Baldwin 2003 Plant J 36: 794-807), absorção de UV (Willits et al. 2005 Analytical Chemistry 22:430-433), e similares.

[00157] Conforme aqui usado, o termo "modular", "modular", modulado", ou "modulação", se refere a intensificação (por exemplo, um aumento), ou inibição (por exemplo, uma redução) na atividade especificada (por exemplo, produção de nicotina modulada/teor).

[00158] Conforme aqui usado, os termos "aumenta", "aumentando", "aumentado", "intensifica", "intensificado", "intensificando", e "intensificação" (e variações gramaticais destes), conforme aqui usados, descrevem um aumento no teor de nicotina de uma planta como um resultado da introdução na planta de uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, desse modo, produzindo uma planta transgênica tendo teor de nicotina aumentado. Este aumento no teor de nicotina pode ser observado por comparação do teor de nicotina da planta transformada com a molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, ao teor de nicotina de uma planta que carece (isto é, não transformada com) da referida molécula de ácido nucleico, ou construção de ácido nucleico da invenção, e crescida sob as mesmas condições ambientais (isto é, um controle). O aumento pode ser medido como um aumento na percentagem por peso, ou como uma percentagem de aumento do valor de controle. Desse modo, em algumas modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser aumentado por pelo menos cerca de 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125% 150%, 175%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% ou mais, conforme comparado com um controle. Em algumas modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser aumentado por pelo menos cerca de 30%, conforme comparado com um controle. Em outras modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser aumentado por pelo menos cerca de 50%, conforme comparado com um controle. Em ainda outras modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser aumentado por pelo menos cerca de 100%, conforme comparado com um controle.

[00159] Em algumas modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser cerca de 10 mg/g (por exemplo, cerca de 1%) a cerca de 100 mg/g (por exemplo, 10%) (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 mg/g) de peso seco de nicotina. Em modalidades particulares, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser cerca de 20 mg/g (por exemplo, cerca de 2%) a cerca de 100 mg/g (por exemplo, 10%) de peso seco de nicotina; cerca de 30 mg/g a cerca de 100 mg/g de peso seco de nicotina, cerca de 40 mg/g a cerca de 100 mg/g de peso seco de nicotina, cerca de 50 mg/g a cerca de 100 mg/g de peso seco de nicotina, e similares. Em ainda outras modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser pelo menos cerca de 30 mg/g de peso seco de nicotina, pelo menos cerca de 40 mg/g (por exemplo, cerca de 4%) de peso seco de nicotina, pelo menos cerca de 50 mg/g (por exemplo, cerca de 5%) de peso seco de nicotina, pelo menos cerca de 60 mg/g (por exemplo, cerca de 6%) de peso seco de nicotina, e similares.

[00160] Conforme aqui usado, os termos "reduz", "reduzido", "reduzindo", "redução", "diminui", "suprime", e "diminui" (e variações gramaticais destes), descrevem, por exemplo, uma diminuição no teor de nicotina de uma planta de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, ou qualquer faixa nesta, conforme comparada com um controle conforme descrito aqui. Desse modo, em algumas modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser reduzido por pelo menos cerca de 1%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 95% e similares, conforme comparado. Em outras modalidades, o teor de nicotina de uma planta transformada com uma molécula de ácido nucleico isolada, ou construção de ácido nucleico da invenção, pode ser reduzida, tal que a planta de controle tem um nível de pelo menos cerca de 2 vezes a cerca de 10 vezes (por exemplo, pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes, e similares), conforme comparado à planta transformada. Em modalidades representativas, a redução é por cerca de 5 vezes a cerca de 7 vezes.

[00161] Um aspecto adicional da invenção proporciona células hospedeiras não-humanas transformadas e organismos não-humanos transformados compreendendo as células não-humanas transformadas, no qual as células transformadas e organismos transformados compreendem moléculas de ácido nucleico compreendendo uma ou mais sequências de nucleotídeo da invenção. Em algumas modalidades, a célula hospedeira não-humana transformada inclui, mas não é limitada a, uma célula bacteriana transformada, e/ou uma célula de planta transformada. Desse modo, em algumas modalidades, os organismos não-humanos transformados compreendendo a célula hospedeira não-humana transformada incluem, mas não são limitados a, uma bactéria transformada, e/ou uma planta transformada.

[00162] Em algumas modalidades particulares, a invenção proporciona uma célula de planta transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção, e/ou uma planta transgênica regenerada de referido célula de planta transgênica. Consequentemente, em algumas modalidades da invenção, uma planta transgênica tendo teor de nicotina modulado (por exemplo, aumentado ou reduzido), é proporcionada, referida planta transgênica regenerada de uma célula de planta transgênica compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucleico isolada/construção de ácido nucleico da invenção.

[00163] Aspectos adicionais da invenção incluem um produto coletado produzido a partir das plantas transgênicas e/ou partes destas da invenção, bem como um produto processado produzido de referido produto coletado. Um produto coletado pode ser uma planta completa, ou qualquer parte de planta, conforme descrito aqui, no qual referido produto coletado compreende uma molécula de ácido nucleico recombinante/construção da invenção. Desse modo, em algumas modalidades, exemplos não-limitativos de um produto coletado incluem uma semente, um fruto, uma flor, ou parte destes (por exemplo, uma antera, um estigma, e similares), uma folha, um caule, e similares. Em outras modalidades, um produto processado inclui, mas não é limitado a, cigarro, tabaco de cigarro, tabaco de charuto, um charuto, tabaco de cachimbo, tabaco de mascar, tabaco em folha, tabaco em pedaços, e tabaco cortado, e similares, produzidos de uma planta transgênica da invenção.

[00164] Uma planta útil com esta invenção pode ser qualquer planta que produz nicotina e/ou outros alcaloides relacionados. Desse modo, em algumas modalidades, a planta pode ser Nicotina tabacum, Nicotiana rustica, ou Nicotiana benthamiana. Qualquer variedade de tabaco é útil com esta invenção incluindo, mas não limitada a, Tabaco em folha claro curado em fogo aromático, tabaco em folha claro; Tabaco Burley; Cavendish; Corojo; Criollo; Tabaco Oriental; Perique; tabaco Shade; Thuoc lao; Type 22; NC95, K326, K346, White Burley, Tabaco Selvagem, Y1, e similares.

[00165] Desse modo, em algumas modalidades particulares, uma planta transgênica da invenção inclui, mas não é limitada a, uma planta de tabaco transgênica ou parte desta é provida, no qual o teor de nicotina de referida planta ou parte desta é modulado.

[00166] Conforme aqui usado, o termo "parte de planta" inclui, mas não é limitado a, embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, ramificações, fruto, grãos, espigas, cascas, caules, raízes, pontas radiculares, anteres, célula de plantas incluindo células de planta que são intactas em plantas, e/ou partes de planta, protoplastos de planta, tecidos de planta, culturas de tecido de célula de planta, calo de planta, tufos de planta, e similares. Adicionalmente, conforme aqui usado, "célula de planta" se refere a uma unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreende uma parede de célula, e também pode se referir a um protoplasto. Uma célula de planta da invenção pode estar na forma de uma célula única isolada, ou pode ser uma célula cultivada, ou pode ser uma parte de uma unidade organizada mais alta, tal como, por exemplo, um tecido de planta, ou um órgão de planta. Um "protoplasto" é uma célula de planta isolada sem uma parede de célula, ou com somente partes da parede de célula. Desse modo, em algumas modalidades da invenção, uma célula transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico, e/ou sequência de nucleotídeo da invenção é uma célula de qualquer planta, ou parte de planta, incluindo, mas não limitada a, uma célula de raiz, uma célula de folha, uma célula de cultura de tecido, uma célula de semente, uma célula de flor, uma célula de fruto, uma célula de embrião, uma célula de óvulo, uma célula de pólen, e similares.

[00167] Em algumas modalidades particulares, a invenção proporciona uma semente transgênica produzida de uma planta transgênica da invenção, no qual a semente transgênica compreende uma molécula de ácido nucleico/sequência de nucleotídeo da invenção.

[00168] "Cultura de célula de planta" significa culturas de unidades de planta tais como, por exemplo, protoplastos, células de cultura de célula, células em tecidos de planta, pólen, tubos polínicos, óvulos, embrião, zigotos e embriões em vários estágios de desenvolvimento. Em algumas modalidades da invenção, uma cultura de tecido transgênico ou cultura de célula de planta transgênica é proporcionada, no qual o tecido transgênico ou cultura de célula compreende uma molécula de ácido nucleico/sequência de nucleotídeo da invenção.

[00169] Conforme aqui usado, um "órgão de planta" é uma parte distinta e visivelmente estruturada e diferenciada de uma planta, tal como uma raiz, caule, folha, botão de flor, ou embrião.

[00170] "Tecido de planta", conforme aqui usado, significa um grupo de células de planta organizadas em uma unidade estrutural e funcional. Qualquer tecido de uma planta in planta ou em cultura é incluído. Este termo inclui, mas não é limitado a, plantas completas, órgãos de planta, sementes de planta, cultura de tecido, e quaisquer grupos células de planta organizadas em unidades estruturais e/ou funcionais. O uso deste termo em conjunto com, ou na ausência de, qualquer tipo específico de tecido de planta, conforme listado acima, ou, de outro modo, envolvido por esta definição, não é pretendido para ser exclusivo de qualquer outro tipo de tecido de planta.

[00171] A invenção adicionalmente proporciona um cultivo de planta compreendendo uma pluralidade de plantas transgênicas da invenção plantadas juntas em um campo agrícola. Em algumas modalidades, o cultivo de planta compreende uma pluralidade de plantas de tabaco transgênicas da invenção plantadas juntas em um campo agrícola.

[00172] "Engenharia genética" envolve qualquer metodologia para introdução de um ácido nucleico ou mutação específica em um organismo hospedeiro. Por exemplo, uma planta é geneticamente projetada quando ela é transformada com uma sequência de polinucleotídeo que suprime expressão de um gene, tal que a expressão de um gene alvo é reduzida comparada a uma planta de controle. Uma planta é geneticamente projetada quando uma sequência de polinucleotídeo é introduzida, que resulta na expressão de um novo gene na planta, ou um aumento no nível de um produto de gene que é naturalmente encontrado nas plantas. No presente contexto, "geneticamente projetadas" incluem plantas transgênicas e células de planta, bem como plantas e células de plantas produzidas por meio de mutagênese dirigida efetuada, por exemplo, através do uso de oligonucleotídeos de RNA/DNA quiméricos, conforme descrito por Beetham et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 8774-8778 (1999) and Zhu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S;A. 96: 8768-8773 (1999), ou assim denominada "olionucleobases reconinagênicas", conforme descrito na Publicação de patente internacional WO 2003/013226. Do mesmo modo, uma planta ou célula de planta geneticamente projetada pode ser produzida pela introdução de um vírus modificado, que, por sua vez, causa uma modificação genética no hospedeiro, com resultados similares àqueles produzidos em uma planta transgênica, conforme descrito aqui. Ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4.407.956. Adicionalmente, uma planta ou célula de planta geneticamente projetada pode ser o produto de qualquer abordagem nativa (isto é, não envolvendo sequências de nucleotídeo estranhas), implementada por introdução de somente sequências de ácido nucleico derivadas a partir de espécies de planta hospedeira ou de uma espécie de planta sexualmente compatível. Ver, por exemplo, Pedido de patente publicado dos Estados Unidos No. 2004/0107455.

[00173] "Produto de tabaco" se refere a um produto compreendendo material produzido por uma planta Nicotiana, incluindo, por exemplo, goma e emplastros de nicotina para parar de fumar, tabaco de cigarro incluindo tabaco expandido (inchado) e reconstituído, tabaco de charuto, tabaco de cachimbo, cigarros, charutos, e todas as formas de tabaco sem fumaça, tais como tabaco de mascar, rapé, tabaco úmido e pastilhas. "Cigarros" incluem cigarros eletrônicos e produtos "queimados sem calor" que são dispositivos similares a cigarro que aquecem o tabaco preferivelmente do que queimam o tabaco.

[00174] A invenção será agora descrita com referências ao seguintes exemplos. Deve ser apreciado que estes exemplos não são pretendido para limitar o escopo das reivindicações à invenção, mas são, preferivelmente, pretendidos para serem exemplares de certas modalidades. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem ao técnico no assunto são pretendidas caírem dentro do escopo da invenção. EXEMPLOS Exemplo 1. Materiais e métodos A. Experimentos de um híbrido de levedura para fatores de transcrição de clonagem

[00175] Construção de vetor isca

[00176] Um sistema de um híbrido de levedura, Kit MatchmakerTM One-Hybrid Library Construction and Screening (Clontech, Mountain View, CA), foi empregado para classificar fatores de transcrição que se ligam ao promotor do gene QPT2 do tabaco (Patente dos Estados Unidos No. 5.8378.76). O promotor, 1034 bp de comprimento, foi clivado de construção de pTobRD2-PMTOX provido pelo 22nd Century LLC. (Buffalo, NY), e inserido à montante do promotor mínimo GAL4 no vetor pHIS2.1 para formar a construção isca pTobHis. O inserto foi primeiro verificado por digestão de BamHI e a orientação do promotor foi confirmada por PCR usando os seguintes primeres designados da sequência do promotor QPT2 e gene His3:

[00177] Tob1F: 5’-ACATCTGTAACCGGAACAGCAC-3’ (SEQ ID NO:9)

[00178] His1R: 5’-GGTCGTCTATGTGTAAGTCACC-3’ (SEQ ID NO:10)

[00179] Estirpe de levedura Y187 foi transformada com a construção isca pTobHis, e 100 μL de diluição 1/15 dos transformantes originais foi colocado em meio SD/-Trp e SD/-Trp/-His, respectivamente. As placas foram tituladas com uma série de 3-AT (3-amino-1, 2, 4-triazole) (0, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 75, 100 mM) para otimizar a concentração que suprime a expressão basal da construção isca. As placas foram cultivadas a 30°C por cinco dias.

[00180] Construção de biblioteca de cDNA

[00181] O RNA total foi extraído de raízes de plantas de tabaco crescidas em estufa de dois meses de idade (cv. NC95) 0,5 hora após cobertura. Um oligo(dT) primer, modificado por fusão com uma sequência 25-mer, denominada CDS III, e o primer SMARTTM III do kit, foram usados para síntese do primeiro cDNA de trançado de modo a flanquear o cDNA sintetizado com as duas sequências de primer. PCR de longa distância (LD-PCR) foi realizada para amplificar o cDNA sintetizado usando o kit Advantage 2 PCR (Clontech) com os primeres CDS III e SMARTTM III baseados na instrução do fabricante. O produto de PCR foi examinado em gel de agarose e o cDNA de trançado duplo foi purificado com colunas CHROMA SPIN TE-400 a partir do kit, e concentrado.

[00182] Transformação de levedura e seleção de colônia positiva

[00183] Células competentes de levedura foram preparadas e transformadas com o vetor isca pTobHis, o vetor presa linearizado pGADT7-Rec2, e os ds cDNA (~4 μg), seguindo as instruções do fabricante. A recombinação homóloga entre o vetor presa e o ds cDNA ocorreu nos locais CDS III e SMARTTM III do vetor presa linearizado dentro das células de levedura. As células transformadas foram propagadas, coletadas, e espalhadas em meio DDO (SD/-Leu/-Trp), para estimar a eficiência de classificação da contrainformação, e no meio TDO (SD/-Leu/-Trp/-His), para identificar colônias positivas na seleção de um híbrido.

[00184] Caracterização de colônias positivas de seleção de um híbrido de levedura

[00185] O comprimento do inserto das colônias positivas foi avaliado por uma PCR de 30 ciclos padrão (Bioneer, Alameda, CA) com 1 μL de cultura de levedura durante a noite, e os seguintes dois primeres proporcionados pelo kit:

[00186] Primer 5’ PCR: 5’- TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’ (SEQ ID NO:11)

[00187] Primer 3’PCR: 5’- GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-3’ (SEQ ID NO:12)

[00188] Os produtos de PCR foram examinados em géis de agarose, e todos as construções presas com insertos de cDNA mais longos do que 500 bp foram submetidos a isolamento de plasmídeo com kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Os plasmídedos isolados de colônias de levedura foram subsequentemente transformados em E. coli DH5α para propagação. Os plasmídeos presas foram isolados novamente de E. coli, e os insertos de cDNA foram submetidos a análise de sequência usando o primer T7 e o primer 3’PCR. Qualquer colônia de levedura que continha mais do que uma construção presp foi colocada em SD/-Leu por 2-3 vezes até que o resultado da PCR produz um fragmento amplificado único.

[00189] As sequências dos insertos de cDNA foram usadas para análise de BLAST com a base de dados do Banco de Genes NCBI. Um total de cinco fatores de transcrição foram identificados de cerca de 100 colônias positivas. Contudo, nenhum destes cinco cDNAs de fator de transcrição estava em comprimento total, mas eles todos têm caudas poli(A).

[00190] Recuperação de cDNAs de comprimento total dos TFs

[00191] RNA foi isolado de tecido de raiz de plantas de tabaco NC95 crescidas em estufa 0,5 hora após cobertura. O kit GENERACER™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi usado para obter as sequências ausentes 5’ dos cDNAs de TF seguindo o manual do fabricante. Um ou dois primeres específicos de gene foram designados baseados nas sequências próximas aos terminais 5’ dos cDNAs parciais dos seis genes de TF isolados para PCR junto com o primer GENERACERTM 5’ provido pelo kit. As sequências destes primeres específicos de gene são:

[00192] NtERF GSP1: 5’-CTATCTCCGACTTCTGGTCTTCCTCT-3’ (SEQ ID NO:13)

[00193] NtERF GSP2: 5’-CCACGGTCTCTGCCTTATTCCTCTGTA- 3’ (SEQ ID NO:14)

[00194] NtMYC2a GSP1: 5’- ACACATTTGGTACAACAGCTCTAAGTGC-3’ (SEQ ID NO:15)

[00195] NtMYC2a GSP2: 5’- TGCAATTGCATCACCAAGAAGTGATGCT-3’ (SEQ ID NO:16)

[00196] NtMYC2b GSP: 5’-CGGGGAGTTGGTGTAGTAG-3’ (SEQ ID NO:17)

[00197] NtARF GSP1: 5’- CCTTTTGTGTCTCCCTTCCTACTGATG- 3’ (SEQ ID NO:18)

[00198] NtARF GSP2: 5’- CTAAGTTTTGAGAGCACTGGGTCCCAAG-3’ (SEQ ID NO:19)

[00199] Após os cDNAs de comprimento total serem recuperados, os primeres foram designados para obter as sequências de codificação de comprimento total destes quatro fatores de transcrição por PCR:

[00200] NtERFFL1F:5’- TCTAGAGGATCCCGGGATGTGTGGAGGTGCCATAATCC-3’ (SEQ ID NO:20)

[00201] NtERFFL1R:5’- GCGCCCGGGTTCAGTAAAACAGCTGCTGCTGC-3’ (SEQ ID NO:21)

[00202] NtARFFL1F:5’-GGATCCATGATGTGTGGACTTATTGATC- 3’ (SEQ ID NO:22)

[00203] NtARFFL1R:5’-CCCGGGCTACAAAGCAATATCAAGAATC- 3’ (SEQ ID NO:23)

[00204] NtMYC2a 1F:5’- GCGGTCTAGACAGATCTGAATTGATTTGTCT-3’ (SEQ ID NO:24)

[00205] NtMYC2a 1R:5’- GCGGTCTAGAACATTATTCAGAGCTCACTATG-3’ (SEQ ID NO:25)

[00206] NtMYC2b 1F:5’- GCGTCTAGAATGACGGACTATAGAATACCA-3’ (SEQ ID NO:26)

[00207] NtMYC2b 1R:5’- GCGTCTAGATCATCGCGATTCAGCAATTCT-3’ (SEQ ID NO:27)

[00208] Todas as reações de PCR foram realizadas usando a Taq DNA polimerase de alta fidelidade (Phusion, Finnzymes, Espoo, Finland). Os produtos de PCR foram clonados em vetor pCRBluntII- TOPO ou pCR4-TOPO (Invitrogen) para análise de sequência por um provedor comercial. B. Análise de expressão dos fatores de transcrição isolados em tabaco

[00209] Plantas de tabacos (cv. NC 95), crescidas na estufa por cerca de dois meses até imediatamente antes do florescimento, foram submetidas a análise de expressão de gene em vários órgãos, bem como em raízes após tratamentos de cobertura, ferimento, ou MeJA (Sigma, St. Louis, MO). A cobertura foi realizada por corte do ápice do rebento de plantas imediatamente abaixo do broto. Ferimento foi realizado pelo corte de folhas nas plantas com tesouras: cinco cortes por folha em três folhas totalmente crescidas. Para o tratamento de MeJA, 50 μM de solução (cerca de 5 mL) foi pulverizada em todas as folhas da planta.

[00210] Tecidos de raiz foram coletados nos pontos de tempo de 0 h, 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, e 6 h após tratamentos. Amostras de RNA foram isoladas, e análise de Northern blot foi realizada conforme descrito no Capítulo 1. Os primeres designados a partir das sequências de codificação usadas para gerar as sondas para hibridização de Northern, foram:

[00211] NtERFNOR F: 5’-ACACTGCACTAGCACCATCCC-3’ (SEQ ID NO:28)

[00212] NtERFNOR R: 5’-CTGCATTGTACTACGTACTACC-3’ (SEQ ID NO:29)

[00213] NtMYC2a/bNOR F: 5’-GAAGTAACGGATACTGAATGG-3’ (SEQ ID NO:30)

[00214] NtMYC2a/bNOR R: 5’-ATCCTTGTGTTTGCTGAGAAT-3’ (SEQ ID NO:31)

[00215] NtARFNOR F: 5’-CTGCCTATAGCCAACTGTTG-3’ (SEQ ID NO:32)

[00216] NtARFNOR R: 5’-AAGCTGCTGGATACAGGAGC-3’ (SEQ ID NO:33) C. Transformação de Tabaco para sobre expressão e regulamentação dos fatores de transcrição isolados

[00217] pBI121 foi usado como o vetor de suporte para produzir a sobre expressão e construções de gene de RNAi. As sequências de codificação dos fatores de transcrição isolados foram clivadas de seus vetores de clonagem (pCRBluntII-TOPO ou pCR4-TOPO) e inseridas em pBI121 no lugar do gene GUS para estar sob controle do promotor constitutivo CaMV 35S (Figura 1).

[00218] A técnica de RNAi foi usada para regulamentar as TFs individuais em plantas de tabaco transgênicas. Para construção de vetor de RNAi, a sequência de codificação parcial de cada TF foi obtida por PCR com os seguintes pares dos primeres:

[00219] NtERFRNAiF: 5’- GACTGAGCTCTCTAGAGTGGAGGTGCCATAATCCCCGA-3’ (SEQ ID NO:34)

[00220] NtERFRNAiR: 5’- GACTCCCGGGGATATCCGGTCTCTGCCTTATTCCTCTGTA-3’ (SEQ ID NO:35)

[00221] NtMYC2RNAiF: 5’- GGGGAGCTCTCTAGAGCTGCAACAGCGACTCCAGA-3’ (SEQ ID NO:36)

[00222] NtMYC2RNAiR: 5’-ATT CCCGGGGTCGACCCGTTAACAAACGATTGAGTC-3’ (SEQ ID NO:37)

[00223] NtARFRNAiF: 5’- GGGGAGCTCGGATCCGATGGGATTGCAGTATCAGAC-3’ (SEQ ID NO:38)

[00224] NtARFRNAiR: 5’- GGGACTAGTGTCGACGAGTACTTGGATTGCAATGAC-3’ (SEQ ID NO:39)

[00225] O fragmento de PCR foi primeiro clonado em pQLi para substituir as regiões vermelha e azul (conforme mostrado na Figura 2) para criar repetição invertida, e, em seguida, o cassete total foi inserido em pBI121 para substituir o gene GUS. Toda a sobre expressão resultante e vetores de RNAi foram confirmados por digestões de restrição apropriadas e análise de sequenciamento. A Figura 2 proporciona uma representação esquemática da região de vetor pQLi usado para clonagem de repetição invertida.

[00226] Transformação de tabaco mediada por Agrobacterium foi realizada usando estirpe Agrobacterium LBA4404 e um protocolo de disco de folha (Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231). Peças de folha pequenas a partir das plantas a serem transformadas foram misturadas com cultura de Agrobacterium tumefaciens crescida durante a noite (OD600=1,0) por 2 min. Solução de cultura de Agrobacterium em excesso foi removida usando toalha de papel estérila. Co-cultivo foi conduzido por 2-3 dias em meio MS. Meio MS com BA (1 mg/L), IBA (0,1 mg/L) e canamicina (100 mg/L) foi usado como o meio de seleção. Subcultura foi realizada 2-3 vezes em intervalo de 2 semanas. Plantas de controle não-transformadas foram também regeneradas usando o mesmo meio e procedimento, mas sem seleção antibiótica. O meio de enraizamento foi MS com 50 mg/L de canamicina e nenhum hormônio. Plantas de tabaco transgênicas putativas (cv. NC 95) foram crescidas na estufa por cerca de dois meses, e tecidos de raiz foram coletados imediatamente antes do florescimento.

[00227] RNA total foi extraído usando Reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Aproximadamente 700 mg de tecido de raiz ou 200 mg de tecido de folha foram usados para isolamento de RNA. Para análise de Northern blot, o RNA extraído foi dissolvido em água tratada com DEPC, e quantificado com o Nanodrop (ND-1000). Dez μg de RNA foi separado em 1% de gel de agarose em tampão de MOPS. O gel foi manchado com EtBr e a imagem foi fotografada sob iluminação de UV. O RNA separado no gel foi manchado na membrana de nylon Hybond-N+. Os primeres usados para gerar sondas foram os mesmos conforme descrito acima. D. Análise de qRT-PCR de expressão de gene de trajetória

[00228] Raiz foi coletada de plantas transgênicas T0 antes de florescimento. O RNA foi isolado de tecido de raiz usando reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com o manual do fabricante, e o primeiro cDNA do trançado foi sintetizado usando SuperScript™ III ReverseTranscriptase (Invitrogen) com um oligo(dT) primer. qRT-PCR foi realizado usando FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche, Mannheim, Germany) em ABI7900 (Applied Biosycaules, Foster City, CA). O gene actina do tabaco foi escolhido como um controle para normalização. Três réplicas técnicas foram realizada com amostras de RNA de cada evento de transformação usando o seguinte programa de PCR: 50°C por 1 min; 95°C por 15 seg; 40 ciclos de 95°C, 15 seg seguido por 63°C, 1 min com os primeres para os genes de trajetória listados na Tabela S3. Dois eventos de transformação por construção de gene foram analisados. As médias e erros padrões são apresentados. E. Ensaios de alteração de mobilidade eletroforética (EMSA)

[00229] Desde que o rendimento da proteína de MYC2a de comprimento total quando expressa em E. coli foi muito baixo, nós usamos a proteína de MYC2a N-truncada para EMSA. A proteína de MYC2a N-truncada (MYC2aΔN, de No.264 a No.659 AA) foi expressa em fusão com GST em Rosetta 2(DE3) Singles (Novagen, Madison, WI). A cultura de célula foi tratada com 0,2 mM de IPTG por 4 h a 15°C para induzir expressão de proteína.

[00230] A proteína recombinante foi purificada usando gotas de glutationa-agarose (Sigma), e a MYC2aΔN foi clivada e eluída a partir das gotas com trombina (Sigma). A trombina foi removida de solução de MYC2aΔN com pAminobenzamidina-Agarose (Sigma), e a MYC2aΔN foi concentrada por unidades de filtro centrífugas Amicon Ultra Ultra-15 (MWCO 10 kDa) (Millipore, Billerica, MA).

[00231] A sonda foi etiquetada de acordo com o manual de kit (Biotin 3' End DNA Labeling Kit, Pierce, Rockford, IL). Dois oligômeros complementares foram etiquetados nas extremidades 3’. DNA de trançado duplo foi preparado por mistura de quantidade igual de oligômeros etiquetados complementares. A mistura foi aquecida a 95°C por 5 min, e resfriada à temperatura ambiente por 1 h.

[00232] Sonda G2-box:

[00233] -189 5’- AGTAGCTGAACACGTTTTATTTATGGTTGTTGAATAGT-3’-227 (SEQ ID NO:40)

[00234] 3’- TCATCGACTTGTGCAAAATAAATACCAACAACTTATCA-5’ (SEQ ID NO:41)

[00235] Sonda fria mutada G2-box:

[00236] 5’- AGTAGCTGAATCACATTTATTTATGGTTGTTGAATAGT-3’ (SEQ ID NO:42)

[00237] 3’-TCATCGACTTAGTGTAAATAAATACCAACAACTTATCA -5 (SEQ ID NO:43)

[00238] EMSA foi realizada de acordo com o manual do kit (Kit LightShift® Chemiluminescent EMSA, Pierce). O tampão de ligação foi 10 mM de Tris, 50 mM de KCl, 1 mM de DTT, 0,05 μg/μl de poli(di-dc), 0,05% de NP-40, e 2,5%(v/v) de glicerol. A sonda foi 20 fmol para cada reação. A sonda fria e sonda mutada foram 10 pmol (500x), e a proteína foi 0,75 μg de MYC2aΔN. A reação de ligação foi realizada à temperatura ambiente por 20 min. A mistura de reação foi separada em 5% de gel de poliacrilamida e manchada em membrana Hybond™-N+ (Amersham, Piscataway, NJ, USA). Reticulador de UV foi usado para reticular a membrana o DNA à membrana. A membrana foi sondada e sinal foi detectado de acordo com o manual de kit (Chemiluminescent Nucleic acid Detection Module Kit, Pierce). Filme Kodak BioMax MS (Carestream Health, Inc. Rochester, NY) foi exposto para registrar o sinal. F. Quantificação de alcaloides maiores

[00239] Os níveis de nicotina em folhas secas das plantas transgênicas foram quantificados por cromatografia de gás. Cada amostra foi preparada por colocação de 0,2000 ± 0,0010 g de folhas de tabaco moídas secas em um frasco Erlenmeyer de 50 mL. Dois mL de solução de NaOH 2N foram adicionados a cada frasco e agitados para umedecer o tabaco. Após 15 min de repouso, 10 mL de metil terciário butil éter (MTBE) contendo 0,1062 g/mL de quinolina foi adicionado ao frasco. Os frascos foram colocados em um oscilador por 2,5 horas. Após oscilação, os frascos foram permitidos repousar durante a noite para separar. Aproximadamente 1 mL da camada de topo de MTBE foi transferida em um frasco. Análise de GC foi conduzida usando uma injeção repartida (40:1) em um Agilent HP 6890 GC-FID (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) usando uma coluna de 30 metros DB- 5MS (0,53 mm de DI e 1,5 μm de espessura de filme). O gás transportador foi hélio a um velocidade linear de aproximadamente 38 cm/seg. O injetor e detector foram ambos ajustados a 250°C. A análise consiste de um programa de temperatura de 110°C inicialmente mantida por 0,5 min, seguido por uma rampa a 280°C a uma taxa de 25°C/min onde a temperatura final foi mantida por 20 min. Os dados foram coletados e analisados usando software Agilent Chemstation. Uma tabela de calibração de padrão interno de multi ponto foi construída para cada composto. As curvas para cada composto são conforme segue:

[00240] Nicotina: Y = 2,32779e-1*x + 8,05332e-3

[00241] Nornicotina: Y = 2,26220e-1 *x - 3,49890e-3

[00242] Anabasina: Y = 2,23584e-1*x + 2,27888e-4

[00243] Anatabina: Y = 1,33963e-1 *x - 3,08881e-3 Exemplo 2. Identificação dos fatores de transcrição.

[00244] A técnica de um híbrido de levedura foi usada neste estudo para identificar os fatores de transcrição. Esta técnica inclui três componentes importantes: construção isca, vetor presa, e cDNA. A região promotora de QPT2 foi inserida à montante do promotor mínimo GAL4 no vetor isca, que aciona um gene de síntese de histidina HIS3. Desse modo, se a célula de levedura contém o vetor isca e um vetor presa que expressa uma proteína de fusão TF-GAL4 AD (domínio de ativação) que se liga ao promotor QPT2, o gene HIS3 expressará, e a célula será capaz de crescer em um meio de classificação que carece de histidina. A construção isca foi confirmado por digestão de restrição e PCR para a inserção do promotor de QPT2 e sua orientação. Ele foi, em seguida, testado para vazamento de expressão de HIS3 (ou expressão basal devido a fatores de transcrições de levedura endógena). 3-amino-1, 2, 4-triazole (3-AT) é um inibidor competitivo do produto de gene repórter HIS3, e a enzima Biosintética de histidina. Um experimento de titulação de 3-AT foi conduzido para otimizar a concentração de 3-AT no meio de cultura de levedura para minimizar positivos falsos potenciais nos experimentos de classificação. Nenhuma colônia cresceu no meio (SD/-His/-Torp. contendo uma série de 3-AT de 5 mM a 75 mM), enquanto que muitas colônias cresceram na placa de controle de SD/-Trp. Este experimento foi repetido, e o mesmo resultado foi obtido. Desse modo, não foi necessário adicionar 3-AT ao meio de classificação para suprimir a expressão basal de gene HIS3 e o crescimento antecedente.

[00245] O RNA total foi extraído a partir do tecido de raiz coletado 30 min após cobertura, e usado para produzir uma biblioteca de cDNA para a classificação de um híbrido de levedura. Muitos dos genes de trajetória biossintética de nicotina são induzidos várias horas após cobertura, e foi esperado que os genes de fator de transcrição seriam induzidos anteriormente. Um tempo de 30 min após cobertura foi estimado ser apropriado para capturar um "snapshot" da expressão destes fatores de transcrição. A qualidade do cDNA foi examinada por PCR.

[00246] Um total de três experimentos de classificação foram realizados por transformação de células competentes de levedura com o vetor isca, o vetor presa, e a coleção de cDNA (recombinação homóloga ocorreria entre o vetor presa e o cDNA dentro da célula de levedura de modo que o gene de fusão de cDNA-GAL4 AD expressará a partir do vetor presa), e aproximadamente 1,6 milhões de colônias de levedura foram classificadas. Após sete dias de incubação, colônias de levedura que crescem ativamente foram selecionadas para PCR de colônia para classificar plasmídeo presa que tem o inserto de cDNA mais longo do que 500 pares bases. Todas as colônias de levedura que continham mais do que um plasmídeo presa (mais do que um fragmento de DNA amplificado em gel de agarose) foram submetidas a sucessivas colocações em meio SD/-Leu até somente um plasmídeo presa ser deixado na colônia. O plasmídeo presa isolado foi usado para transformar E. coli (estirpe DH5α) para propagação de plasmídeo. Aproximadamente 100 colônias positivas de levedura foram finalmente isoladas e sequenciadas, entre as quais cinco foram fatores de transcrição putativos conforme identificado baseado na análise de BLAST com a base de dados do Banco de Genes NCBI. Estes cinco fatores de transcrição foram mostrados pertencerem a cinco famílias de TF: GRAS, AP2/ERF, bolha, ARF e WRKY.

[00247] Todos os TF cDNAs clonados foram parciais em comprimento com suas 5’ sequências ausentes. Para obter cDNAs de comprimento total para estes TFs, a técnica de 5’ RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen, Carlsbad, CA) foi realizada, e Taq DNA polimerase de alta fidelidade foi usado em todas as reações de PCR. Para cada TF, pelo menos cinco colônias aleatoriamente captadas foram submetidas a análise de sequência. Durante o processo, outro gene bHLH com alta homologia ao gene clonado foi identificado e clonado. Os padrões de sequências e expressão destes genes TF foram caracterizados. Para testar se estes fatores de transcrição têm efeitos na trajetória de biossíntese de nicotina, sobre- expressão transgênica e linhas de RNAi de todos os seis fatores de transcrição foram produzidas. As plantas transformadas foram crescidas na estufa por cerca de dois meses. O RNA total foi extraído do tecido de raiz e submetido a análise de Northern blot de expressão de gene de trajetória e concentração de nicotina. Exemplo 3. Genes de NtMYC2a e NtMYC2b de fator de transcrição

[00248] Dois cDNAs de fator de transcrição bHLH de comprimento total foram clonados com 2214 e 2391bp de comprimento e codificando 659 e 658 AA, respectivamente (ver, Appendix). Eles compartilham 96% de identidade no nível de sequência de cDNA. Os dois TFs foram denominados NtMYC2a e NtMYC2b. A. Padrão de expressão de NtMYC2 em tabaco

[00249] Análise de Northern blot (Figura 3) mostra genes NtMYC2 expressos em raiz de tabaco, caule, folha e flor. O RNA total isolado de vários órgãos de planta totalmente crescida foi sondado com sondas de fragmento de PCR NtMYC2b. O 25S rRNA manchado com EtBr em gel é também mostrado como uma referência de carregamento. Devido à alta homologia entre os dois genes MYC2, a sonda para toda a análise de Nortear blot de MYC2 é uma sequência de codificação parcial de 505 bp de MYC2b, e não pode distinguir os dois genes e, desse modo, eles foram analisados juntos. A análise de Northern blot mostra que, apesar da biossíntese de nicotina ocorrer somente na raiz, e nos genes de trajetória, tais como NtPMT, NtQPT2, e NtMPO, que expressam somente na raiz, NtMYC2 tem expressão em todos os quatro órgãos (raiz, caule, folha e flor) examinados sem qualquer tratamento, e a expressão mais alta no caule (Figura 3). A expressão de NtMYC2 em todos os órgãos maiores indica que os TFs também funcionam em trajetórias metabólicas outras do que biossíntese de nicotina (Dombrecht et al. (2007) Plant cell 19: 2225-2245). B. Padrões de expressão de NtMYC2 em raiz de tabaco após tratamento de cobertura, ferimento, e MeJA

[00250] Desde que o acúmulo de nicotina foi induzido por tratamento de cobertura, ferimento, ou MeJA, a expressão dos genes NtMYC2 na raiz após estes tratamentos individuais foi investigada. Plantas de Tabaco de dois meses de idade (imediatamente antes do florescimento) foram tratadas com cobertura, ferimento ou MeJA, e os RNAs totais de raiz foram usados para análisde de northern. A hibridização de Northern mostra um padrão de indução de curso de tempo de NtMYC2 após cada tratamento. A sonda é de NtMYC2b. O 25S rRNA manchado em gel com EtBr é mostrado como uma referência de carregamento. Conforme mostrado na Figura 4, expressão de NtMYC2 foi induzida na raiz por tratamento de cobertura, ferimento, ou de MeJA. Comparada ao controle, a expressão induzida de NtMYC2 parece ser bifásica: a expressão aumentou 0,25 h após os tratamentos, declinou levemente em seguida, e aumentou novamente em 4 ou 6 horas de ponto de tempo, com ferimento tendo o efeito de indução mais forte entre os três tratamentos. C. NtMYC2a se liga ao G2 box em promotor NtQPT2

[00251] Três G-boxes (G2, G3 e G4) foram identificados no promotor de 0,6 kb NtQPT2 (N° de Acesso no NCBI AJ748263), entre os quais G2 box tem a resistência de ligação mais alta com NtMYC2b (Shoji e Hashimoto, 2011). Para validar que NtMYC2a se liga a G2-box, experimento de EMSA foi realizado com sondas de 38 bp consistindo de um G2 box (CACGTT) e regiões de flanqueamento a partir do promotor NtQPT2 e sonda mutada com mutação na sequência de G2 box. Nós clonamos o comprimento total de NtMYC2a e expressamos a proteína recombinante (NtMYC2a fundida com GST) em E. coli. Devido a produção muito baixa da proteína de comprimento total NtMYC2a, nós truncamos a mesma e somente expressamos o domínio C-terminal bHLH da proteína NtMYC2a (NtMYC2aΔN, de No. 264 a No. 659 AA).

[00252] O experimento de ligação mostrou que NtMYC2aΔN se liga especificamente ao G2 box no promotor NtQPT2 in vitro (Figura 5). Diluição com sonda fria reduziu os sinais de ligação onde diluição com sonda fria mutada manteve muito dos sinais. D. Análise de linhas transgênicas de NTMYC2a e NtMYC2b

[00253] Sete NtMYC2a e nove NtMYC2b de linhas de sobre expressão e nove linhas transgênicas de NtMYC2 RNAi, em que ambos os genes são esperados serem suprimidos, foram gerados para testar o efeito destes dois genes de TF em biossíntese de nicotina. O fragmento de 336 bp usado para construção de RNAi foi de sequência de codificação de NtMYC2b, que compartilha 94% de identidade com esta região de gene NtMYC2a.

[00254] A Figura 6 mostra os níveis de expressão de NtMYC2a andNtMYC2b em plantas transgênicas que sobre expressam gene de NtMYC2a ou NtMYC2b. Comparado ao tipo selvagem e controle de vetor, duas linhas de NtMYC2a (AOE-3, e 6) e sete linhas de NtMYC2b (BOE-7, 10, 11,13,14,16, e 17) foram linhas claramente de sobre expressão.

[00255] A Figura 7 mostra os efeitos da construção de RNAi em expressão de NtMYC2a/b. O nível de expressão de NtMYC2 em três linhas de RNAi (RNAi-1, 2, 3) foi grandemente reduzido. Todas as outras linhas não mostram mudanças substanciais em expressão de NtMYC2.

[00256] Baseado na análise de Northern, os níveis de nicotina de duas linhas de sobre expressão de NtMYC2a e seis linhas de sobre expressão de NtMYC2b com alta expressão de transgene e três linhas de RNAi com expressão muito mais baixa de NtMYC2, foram quantificados (Figura 8).

[00257] A Figura 8 mostra que três linhas de sobre-expressão de NtMYC2b (BOE-10, 16, e 17) e duas linhas de sobre expressão de NtMYC2a (AOE-3 e AOE-6) têm nível de nicotina mais alto do que os controles (41% a 149% mais alto do que controle de vetor). Contudo, outras linhas com nível de expressão mais alto de NtMYC2b, tal como BOE-11, 13, e 14, não têm nível de nicotina mais alto. As três linhas de RNAi (RNAi-1, 2 e 3) mostraram nível de nicotina muito mais baixo (cerca de cinco vezes menos) do que os controles.

[00258] Devido a sobre-expressão e knock down dos genes de NtMYC2 alterarem ambos os níveis de nicotina e alcaloide totais (dados não mostrados), linhas de sobre-expressão e de RNAi selecionadas foram submetidas a análise de hibridização de Northern blot e análise de qRT-PCR para avaliar os efeitos na expressão de genes de trajetória de biossíntese de nicotina. As Figuras 9, 10 e 11 mostram a expressão de genes QPT e PMT conforme afetados pelos dois fatores de transcrição.

[00259] A sobre expressão de NtMYC2b não altera os níveis de mRNA dos genes de trajetória com a expectativa de redução de expressão moderada dos genes NtPMT, NtA622 e NtNBB1. Contudo, a expressão de todos os genes de trajetória foi reduzida por sobre- expressão de NtMYC2a. O silenciamento de RNAi de ambos genes NtMYC2 resulta na diminuição dos níveis de expressão de todos os genes de trajetória que esperam NtADC.

[00260] Surpreendentemente, os níveis de mRNA de estado constante de todos os sete genes de trajetória em linhas de sobre- expressão de NtMYC2a (AOE-3 e AOE-6) foram mais baixos do que o controle, com NtQPT, NtMPO e NtADC ainda mais baixos do que nas linhas de RNAi. Em contraste, mudanças nos níveis de mRNA destes genes em linhas de sobre-expressão de NtMYC2b não foram óbvias, exceto para NtA622 e NtNBB1, expressões das quais foram cerca de 60% do controle (Figura 5). Interessantemente, entre estes sete genes investigados, os níveis de expressão de NtADC foram somente reduzidos em linhas de AOE e virtualmente não afetados em linhas de RNAi e BOE. Considerando que o mesmo não é um gene dedicado de biossíntese de nicotina, é sensível que sua expressão é também regulada por outro circuito de transcrição.

[00261] A partir dos dados nas linhas de sobre expressão e de RNAi, é evidente que os genes NtMYC2a e/ou NtMYC2b modulem expressão de gene de trajetória Biosintética de nicotina e nível de nicotina. É mais notável que nas três linhas de Raí (RNAi-1, -2, e -3) que tem expressão de NtMYC2 substancialmente diminuída, ambos níveis de mRNA de PMT e QPT foram reduzidos por aproximadamente dez vezes, e o nível de nicotina diminuiu cerca de cinco vezes. Mais interessantemente, embora NtMYC2a e NtMYC2b sejam altamente homólogos, suas funções parecem serem diversas: Sobre-expressão de NtMYC2a conduz a níveis de mRNA de PMT e QPT mRNA grandemente reduzidos ainda mais altos que o nível de nicotina (mais do que duas vezes do controle e ao redor de 1% de peso seco de folha), onde a sobre expressão de NtMYC2b causou pouca mudança nos níveis de mRNA de PMT e QPT entre as quatro linhas analisadas, enquanto que a concentração de nicotina tem um aumento moderado (próximo a 50%) em três das quatro linhas. Além disso, é surpreendente ver que plantas tendo o nível de nicotina mais alto (AOE-3 e -6) foram as plantas com os níveis de morna de PMT e QPT mais baixos, e plantas com o nível mais baixo de nicotina (RNAi-1, -2, e -3) têm nicotina mais leve (mas muito reduzida em comparação aos controles), e mRNA de PMT e QPT. Os dados sugerem que o nível de nicotina pode, não necessariamente, estar associado com os níveisde mRNA de PMT e QPT. E. Herança de teor de nicotina em linhas transgênicas de T1 NtMYC2a e NtMYC2b

[00262] Para avaliar adicionalmente as funções de ambos genes NtMYC2 e a herança de traço relacionada, as plantas T1 das linhas de AOE-3, AOE-6, BOE-16, BOE-17, RNAi-1, RNAi-2, e controle de vetor foram crescidas em estufa por cerca de dois meses, e PCR foi usada para classificar os segregados não-transgênicos. O nível de nicotina da folha foi medido em plantas não-cobertas e plantas 10 dias após cobertura separadamente. Os resultados mostram que plantas não- cobertas transgênicas NtMYC2aOE (AOE-3 e AOE-6), na média, têm 2,4 vezes de nível de nicotina do controle de vetor, enquanto que linhas de NtMYC2bOE (BOE-16 e BOE-17) têm 1,4 vezes de teor de nicotina. Plantas de RNAi (RNAi-1 e RNAi-2) contêm somente 14% de teor de nicotina das plantas de controle de vetor. Aumentos similares foram observados no tratamento de cobertura. Estes resultados (Figura 12) são altamente consistentes com aqueles de plantas T0 (Figura 8), indicando que o traço ganho foi herdado.

[00263] Em ambos os tratamentos, o nível de nicotina em plantas NtMYC2aOE foi mostrado ser significantemente mais alto do que aquele em plantas NtMYC2bOE (p< 0,0001), indicando que aqueles dois paralogs proximamente relacionados funcionam diferencialmente em biossíntese de nicotina. F. Teores de outros alcaloides em linhas de sobre expressão de T1 NtMYC2a e NtMYC2b

[00264] Os teores de nornicotina, anabasina e anatabina foram também testados em plantas T1 de AOE-3, AOE-6, BOE-16, BOE-17 e linhas de controle de vetor (ver, Figura 13).

[00265] Conforme mostrado na Figura 13, com cobertura, os níveis de cada um destes alcaloides aumentaram significantemente em ambas linhas de sobre expressão de NtMYC2a e NtMYC2b comparado ao controle de vetor. Quando as plantas não foram cobertas, somente anatabina tem aumento significante em linhas de sobre expressão de NtMYC2a e NtMYC2b. No nicotina e anabasina foram significantemente aumentadas somente em NtMYC2a, mas não linhas de sobre expressão de NtMYC2b. No todo, os teores de todos os três alcaloide s em plantas NtMYC2a OE foram significantemente mais altos do que aqueles em linhas de NtMYC2b OE com ambos tratamentos de não-cobertura e de cobertura. Exemplo 4. Fator de transcrição de NtERF98

[00266] O comprimento total do fator de transcrição de cDNA ERF foi 1019 bp de comprimento, e codifica uma proteína de 257 AA. O papel deste na biossíntese de nicotina não foi reportado. A. Padrão de expressão de NtERF98 em órgãos diferentes da planta

[00267] O padrão de expressão de NtERF98 na raiz, caule, folha, e flor, nas planta de tabacos NC95 tipo selvagem, foram examinados. A Figura 14 mostra que NtERF 98 foi principalmente expressa na raiz, caule, e flor, e tem pouca expressção, se houver, nas folhas. B. Padrão de expressão de NtERF98 sob tratamentos de cobertura, ferimento, e MeJA

[00268] Desde que o acúmulo de nicotina é induzido pelo tratamento de cobertura, ferimento, e JA, estes três tratamentos foram aplicados individualmente neste estudo para testar se expressão de NtERF98 foi também afetada por estes tratamentos. Os tecidos de raiz foram coletados 0,25 h, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h e 6 h após tratamentos. A Figura 15 mostra o padrão de expressão de gene em raízes das plantas de tabaco tratadas.

[00269] A expressão de NtERF98 sob estes três tratamentos tem um padrão de declínio bifásico similar. O nível de mRNA de NtERF98 de estado constante foi reduzido dentro de 15 min após iniciação de cada um destes tratamentos. De 0,25 h a 0,5 h, o nível de expressão aumentou até o nível basal do controle tipo selvagem em todos os três tratamentos. Após 0,5 h, os níveis de mRNA estavam em declínio novamente nos tratamentos de cobertura e ferimento. No tratamento de MeJA, o nível de expressão alcançou seu pico a 1 h, e declinou em seguida. C. Análise de linhas de sobrepexpressão transgênicas

[00270] A Figura 16 mostra a análise de Northern de NtERF98 e QPT em linhas de sobre expressão putativa de NtERF98. Seis de 10 linhas mostraram nível de expressão muito mais alto de NtERF98. Entre as seis linhas de sobre expressão de NtERF98, cinco tinham expressão de QPT reduzida. OE-19 e OE-25 mostraram padrão similar de expressão destes dois genes como a planta de controle, que tem expressão muito baixa de NtERF98 e alta expressão de QPT. Uma correlação negativa parece existir entre o padrão de expressão de NtERF98 e QPT em muitas das plantas transgênicas que sobre expressam NtERF98.

[00271] A concentração de folha de nicotina de todas as linhas transformadas foi determinada. A Figura 17 mostra que níveis de nicotina nas linhas de sobre expressão tranformadas de NtERF98 aumentam, exceto para as linhas de OE-15 e OE-16, que exibem reduções leves. Nenhuma correlação aparente foi encontrada entre a concentração de nicotina e o nível de expressão de NtERF98 ou QPT. D. Análise de linhas de Raí transgênicas de NtERF98

[00272] Um fragmento de PCR de 309 bp de sequência de codificação de NtERF98 foi usado para produzir a construção de RNAi. Análise de Northern foi realizada para avaliar se o knockdown de NtERF98 tem um efeito na expressão de QPT. A Figura 18 mostra que, das 10 linhas transformadas, seis têm a expressão de NtERF98 completamente reprimida (RNAi-6 a -12), e as outras quatro têm expressão levemente ou moderadamente reduzida.

[00273] A análise de Northern de expressão de gene de QPT das linhas de RNAi de NtERF98 foi realizada. A Figura 19 mostra a expressão de QPT nas plantas de RNAi quando comparada a uma planta de controle. Vários graus de redução na expressão de QPT foram observados entre as plantas transgênicas. Contudo, quando a concentração de nicotina foi examinada, sete das dez plantas de RNAi têm aumento moderado no nível de nicotina (30-60% mais alto) com as outras três tendo níveis similares àquele do controle não-transgênico (Figura 20).

[00274] No todo, NtERF98 parece desempenhar um papel na modulação de expressão de QPT. É intrigante que ambas sobre- expressão e supressão de sua expressão geralmente conduzem a uma redução do nível de mRNA de QPT, e a um aumento leve a moderado de concentração de nicotina. A observação realça a natureza complexa da regulação da trajetória de biossíntese de nicotina. A investigação da expressão de gene relevante e nível de nicotina das plantas transgênicas após tratamento de cobertura ou ferimento podem proporcionar mais percepção no papel de NtERF98 na biossíntese de nicotina. Exemplo 5. Fator de transcrição de NtETTa

[00275] A sequência de cDNA de comprimento total do gene de NtETTa de fator de transcrição foi 2429 bp de comprimento, e codifica uma proteína de 739 AA. O gene de fator TF clonado foi denominado NtETTa. A. Padrão de expressão de NtETTa em planta de tabaco

[00276] A expressão do gene de NtETTa em planta de tabaco matura foi examinada por análise de Northern. A Figura 21 mostra que ela tem expressão mais alta no caule, e baixa expressão na raiz, folha, e flor. B. Expressão de NtETTa em raiz de tabaco após tratamento de cobertura, ferimento, ou de MeJA.

[00277] Os três tratamentos foram também aplicados para testar as respostas da expressão de gene de NtETTa em raiz de tabaco. A Figura 22 mostra uma clara regulamentação de expressão de fene de NtETTa 0,25 h após qualquer destes tratamentos com nível de mRNA aumentando mais por cobertura e ferimento. Contudo, diferente dos genes de MYC2, nenhum padrão de aumento bifásico claro foi observado para expressão de gene de NtETT. MeJA parece ser o tratamento efetivo mínimo com relação a indução de NtETTa. C. Análise de plantas transgênicas que sobre- ou sub-expressam gene de NtETTa

[00278] Quatro linhas de sobre expressão de NtETTa e três linhas de tabaco transgênico de RNAi foram obtidas. Análise de Northern blot foi suportada para caracterizar estas linhas. A Figura 23 mostra que todas as quatro linhas de sobre expressão têm níveis de expressão de NtETTa mais altos com OE-6 e OE-7 sendo muito mais alto do que os controles, e três linhas de RNAi mostraram quase nenhuma expressão detectável.

[00279] Para testar o efeito de NtETTa na expressão de gene de QPT, análise de Northern destas linhas de sobre expressão e RNAi foi realizada. A Figura 24 mostra que ambas linhas de sobre expressão de NtETTa e linhas de RNAi têm níveis de expressão de QPT mais baixos quando comparados aos controles. Duas linhas de RNAi (RNAi-1 e RNAi-2) exibiram o nível de expressão de QPT mais baixo.

[00280] Para todas estas linhas, a concentração de nicotina na folha foi determinada. A Figura 25 mostra que OE-4, -5 e RNAi-2, -3 têm aproximadamente 25% de nível de nicotina mais baixo do que os controles, enquanto que a concentração de nicotina no OE-6 foi levemente mais alta (25%).

[00281] A expressão do gene de fator de transcrição de ARF isolado neste experimento, NtETTa, foi rapidamente induzida por tratamento de cobertura, ferimento, e MeJA. Isto afeta a expressão de QPT conforme revelado em, ou linhas transgênicas de sobre expressão, ou linhas transgênicas de RNAi. Foi mostrado nas linhas de RNAi-1 e -2 que a supressão de expressão de NtETTa pode conduzir a redução severa de nível de mRNA de QPT, mas somente mudança limitada no nível de nicotina. Isto novamente aponta para o controle complicado de biossíntese de nicotina, e a nossa prévia observação que o nível de nicotina pode não ser correlacionado ao nível de mRNA de QPT (e, possível, PMT). Experimentos adicionais para determinar o efeito de estimulações similares a tratamento de cobertura, ferimento, ou de MeJA, nas plantas transgênicas (em termos de níveis de mRNA de PMT e QPT mRNA e o acúmulo de nicotina), devem elucidar o papel de NtETTa na trajetória de biossíntese de nicotina adicionalmente. Exemplo 6. Caracterização de plantas transgênicas T3.

[00282] A. Plantas T3 crescidas em estufa (NC-GH-2013)

[00283] Plantas T3 de eventos AOE e BOE foram crescidas em uma estufa de semente de plantas T2 de eventos AOE3, AOE6, BOE16 e BOE17. As sementes foram plantadas em bandejas de 288 células em um sistema flutuante improvisado em estufas. As plantas T3 individuais de cada subfamília foram testadas para a presença de um gene de inserto de T-DNA por análise de PCR para o gene marcador para determinar o padrão de segregação. Subfamílias não-segregantes foram identificadas para eventos AOE3 (AOE3-46-68), AOE6 (AOE6- 30-77), e BOE16 (BOE16-37-93, BOE16-37-94), e plantas destas subfamílias compreendem 4 dos conjuntos no ensaio. Três conjuntos adicionais incluídos no ensaio, AOE3-46(S), AOE6-30(S), e BOE17- 12(S), consistem de plantas positivas de PCR de lotes de semente segregante. Dois conjuntos de plantas de controle foram incluídos, uma linha transformada com um vetor contendo nenhuma sequência de codificação de MYC2 (VC), e plantas de semente de um cruzamento do controle de vetor com tabaco não-transformado (VC x NT).

[00284] Cada conjunto consiste de três plantas. Mudas foram transplantadas para sacos plásticos de 4 gal. com furos de drenagem puncionados nos mesmos contendo aproximadamente 14 litros de mistura/saco de envasamento.

[00285] Amostras de folha de pré-cobertura foram tomadas 13 semanas após transplante, e, em seguida, as plantas foram cobertas. Amostras de folha adicionais foram tomadas 17 e 31 dias após cobertura. As amostras de folha foram permitidas secar à temperatura ambiente por 10 dias e, em seguida, as lâminas de folha foram secadas a 60°C. A lâmina de folha secada foi analisada para alcaloides nicotínicos totais.

[00286] Conforme mostrado nas Figuras 26A-26C, os níveis totais de alcaloide foram mais altos em plantas de AOE ambos antes e após cobertura. Os alcaloides totais nas plantas de BOE foram similares aos níveis de controle antes da cobertura, mas aumentaram após cobertura.

[00287] B. Plantas T3 crescidas no campo (2013-VA-1)

[00288] As plantas T3 de eventos de AOE e BOE descritas acima, foram crescidas no campo. O ensaio inclui 10 conjuntos de plantas a partir das mudas usadas no Exemplo 6, parte A, acima, os dois controles, VC e VC x NT, e 2 entradas de cada dos quatro eventos transgênicos AOE3, AOE6, BOE16 e BOE17. Quatro entradas, AOE3- 46-68, AOE6-30-77, BOE16-37-93, e BOE16-37-94, foram compostas de plantas de lotes de semente não-segregante. Quatro entradas, AOE3-46(S), AOE6-30(S), BOE17-12(S1), e BOE17-12(S2), foram compostas de plantas positivas de PCR selecionadas de lotes de semente T3 segregantes. Cada conjunto foi plantado em 5 réplicas de 3 plantas cada.

[00289] As amostras de folha foram tomadas antes da cobertura e 17 e 31 dias após cobertura. As amostras de folha foram secadas e alcaloides totais na lâmia de folha medidos como em A.

[00290] Conforme mostrado nas Figuras 27A-27C, os níveis totais de alcaloide foram mais altos em plantas de AOE ambos antes e após cobertura. Exemplo 7. Discussão Promotor QPT2 e classificação de um híbrido de levedura

[00291] Entre os genes relacionados à síntese de nicotina maiores, somente a sequência de promotor de NtPMT1a foi analisada em detalhe, e três motivos regulatórios de transcrição básicos foram identificados. Eles são um G-box (GCACGTTG, -103 a - bp de local de iniciação de transcrição), um GCC-similar a box (TGCGCCC, -62 a -56 bp), e uma região rica em AT entre (-80 a -69 bp, 92,8% de bases A e T). Estes elementos foram demonstrados serem importantes na regulação de acúmulo de nicotina sob tratamento de JA, e foram denominados motivo de GAG (Timko et al. (2010). Recent Advances in Tobacco Science 36: 25-39). Embora o motivo de GAG fosse encontrado em todos os promotores de gene de NtPMT, uma pesquisa BLAST pode não identificar tal motivo em outros promotores de gene na base de dados publicamente disponível (Id.), sugerindo que o motivo é um elemento crítico requerido para coordenar expressão dos membros da família de NtPMT. Ele também implica que a expressão de outros genes de síntese de nicotina de trajetória não pode ser regulada no mesmo modo, embora sua expressão tenha que ser um tanto coordenada para produzir nicotina eficientemente. O promotor de gene de QPT2 de tabaco foi usado neste estudo como uma isca para isolar fatores de transcrição que se ligam ao promotor de QPT2, e regular sua expressão de gene. A desvantagem é que o promotor de gene de QPT2 não foi previamente analisado e caracterizado em detalhe. Uma análise de escaneamento de sequência do promotor verifica que uma sequência de "G-box" (AACGTG) ocorre a -205 bp à montante do local de partida translacional ATG, conforme previsto pelo software baseado na web (plantCARE, bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/).

[00292] No sistema de um híbrido de levedura, uma biblioteca de proteínas fundidas com o domínio de ativação de GAL4 é classificada por sua ligação a sequência de promotor de isca, e ativa a expressão de gene repórter (His3 neste caso). Conforme recomendado no manual do usuário, pelo menos três cópias em tandem da sequência alvo (isca) devem ser incluídas no vetor isca à montante do gene repórter para aumentar a chance de ligação. Usualmente, cie elementos de menos do que 20 bp são usados para produzir as cópias em tandem, e a isca total é ai redor de 100 bp de comprimento. Neste estudo, devido a região do promotor de QPT não ser bem caracterizada, o promotor de gene de QPT2 de 1 kb foi usado como uma isca. Um total de ao redor de 100 colônias positivas foram isoladas e suas sequências foram determinadas e analisadas. Três de cinco genes de TF isolados a partir do sistema têm papéis na regulação de genes na trajetória de biossíntese de nicotina. Isolamento de quatro fatores de transcrição envolvidos na biossíntese de nicotina

[00293] Um total de quatro TFs foram isolados, que são envolvidos na trajetória de biossíntese de nicotina. Eles modulam o nível de morna de QPT e afetam a concentração de nicotina. Sua expressão nas raízes é responsiva ao tratamento de cobertura, ferimento, e MeJAs em uma maneira similar: seus níveis de expressão mudam tão rapidamente quanto dentro de 15 min após os tratamentos. NtMYC2a e 2b são positivamente induzidos por estes tratamentos, e mostraram dois picos de indução dentro das primeiras seis horas após tratamentos. Em contraste, onde o nível de mRNA de NtERF98 foi negativamente regulado, e exibiu diminuição bifásica dentro de seis horas, a expressão de NtETTa foi também induzida pelos tratamentos dentro de 15 min, mas não mostram um padrão bifásico claro. O sinal de movimento de longa distância que causa tais mudanças rápidas (dentro de 15 min) em nível de expressão de gene em raízes é ainda desconhecido. Nem JA nem auxina parecem se mover rápido dentro das plantas (Hertel and Flory (1968) Plant 82: 123-144; Baldwin et al. (1997) Planta 201: 397404; Shi et al. (2006) J Exp Bot 57: 2899-2907). De outra perspectiva, ferimento pode induzir produção de smRNA. Pesquisa recente mostra que RdR1 silenciado (RNA direcionado RNA polimerase) em Nicotiana attenuate torna as plantas susceptíveis a herbívoros (Pandey et al. (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:4559-4564). Este resultado sugere que o smRNA está envolvido na resposta induzida por ferimento de planta de tabaco, e pode ser um candidato de sinal de rápido movimento.

[00294] O fato que estes genes de TF são expressos em todos os tecidos testados não é surpreendente. Cada um destes TFs são, do mesmo modo, envolvidos na trajetória de sinalização de JA, que regula não somente biossíntese de nicotina (ou outros alcaloides), mas também muitos outros processos fisiológicos e de desenvolvimento, tais como crescimento de raiz, fertilidade, resistência a doenças, e ainda respostas a estresse abiótico similar a secura (Kazan and Manners (2008) Plant Physiol 146: 1459-1468). Interessantemente, apesar de seus papéis múltiplos potenciais no crescimento de planta, plantas transgênicas com sobre expressão constitutiva ou regulamentação de cada um destes quatro genes de TF genes todas parecem normais quando do crescimento em estufa. Fatores de transcrição de NtMYC2a, NtMYC2b são reguladores positivos de biossíntese de nicotina

[00295] MYC2 tem sido considerado o TF núcleo na trajetória de sinalização de JA por regulação de uma cascata de fatores de transcrição em respostas de planta a JA. É conhecido que MYC2 se liga ao motivo de G-box de um promotor (Dombrecht et al. (2007) Plant cell 19: 2225-2245). Devido a todos os promotores de gene de PMT conterem o G-box (Timko et al. (2010) Recent Advances in Tabacco Science 36: 25-39) e o promotor de QPT ter uma sequência de "G-box", é provável que MYC2 regula diretamente expressão destes dois genes chaves. Em duas linhas de sobre-expressão de NtMYC2a, o nível de nicotina constitutivo (não-tratada) foi mais do que dobrado, alcançado cerca de 1% de peso seco de folha, que é muito alto. NtMYC2b também facilita um aumento de aproximadamente 50% no nível de nicotina em três linhas de sobre expressão. Em contraste, três linhas de RNAi, em que é provável que ambos NtMYC2a e b foram regulamentados (a sonda usada na análise de Northern blot não pode distinguir os dois), tem diminuído aproximadamente cinco vezes em nível de nicotina acompanhado por diminuição aproximada de 10 vezes em níveis de mRNA de genes de PMT e QPT. Tudo indica um papel regulador positive de NtMYC2a e b em biossíntese de nicotina.

[00296] Notavelmente, uma diminuição dramática de ambos níveis de PMT e mRNA de QPT no NtMYC2a foi observada nas linhas de sobre expressão. Isto pode indicar um circuito de retorno negativo quando o nível de nicotina avança um certo nível limite para impedir um acúmulo não-controlado (Kazan and Manners (2008) Plant Physiol 146: 14591468). Alternativamente, embora os mRNAs de PMT e QPT fossem desregulados por um mecanismo desconhecido relacionado à sobre expressão de NtMYC2a, seus níveis de proteína foram aumentados, ou suas enzimas foram mais ativas para intensificar a produção de nicotina. Adicionalmente, devido aos níveis de PMT e mRNA de QPT não serem afetados muito nas linhas de sobre expressão de NtMYC2b, estes resultados também revelam uma possível função diversa entre as isoformas 2a e 2b. O fenômeno pode ser explanado por um circuito regulatório negativo encontrado em Arabidopsis. Aqui, AtMYC2 foi demonstrado regular proteína de JAZ de repressor, que, por sua vez, liga, e reprime, a atividade de AtMYC2 (Staswick (2007) Trends in Plant Sci 13: 66-71). Similarmente, níveis altos de NtMYC2b não seriam capazes de ativar a expressão de PMT e QPT se ela regula a expressão de NtJAZ.

[00297] No todo, NtMYC2b parece ser a isoforma "mais fraca" entre os dois porque em seis linhas de sobre expressão, seus níveis de mRNA aumentam aproximadamente 10 vezes, e o nível de nicotina foi somente intensificado por cerca de 50%.

[00298] Os genes TF, NbbHLH1 e NbbHLH2, a partir do mesmo subgrupo da família bHLH foram recentemente isolados e caracterizados em N. benthamiana (Todd et al. (2010) Plant J 62: 589600). NbbHLH1 compartilha 70% de homologia AA com o NtMYC2b, enquanto que NbbHLH2 tem 96% de identidade AA com o gene de NtMYC2a. NbbHLH1 e 2 se ligam na sequência de G-box do promotor de gene de NbPMT, e positivamente regula biossíntese de nicotina em plantas de tabaco transgênicas. Contudo, Todd et al. (Id.) foram também confundidos pela observação de pouca mudança ou mesmo redução de níveis de mRNA de muitos genes de biossíntese de nicotina, incluindo QPT, em plantas de tabaco transgênicas de sobre expressão de NbbHLH1 e NbbHLH2. Este relatório verifica que nossa observação não foi uma exceção ou erro experimental, e aponta para uma rede regulatória mais complicada na trajetória de biossíntese de nicotina.

[00299] Zhang et al. (2012) também reportarem isolamento e caracterização de três genes de NtMYC2 relacionados: NtMYC2a, 2b e 2c, ente os quais 2b e 2c têm sequências de amino ácido idênticas, mas são diversas em sequência de nucleotídeo. Contudo, após exame da sequência AA, o NtMYC2a e 2b que eles reportaram (No. no Banco de Genes HM466974 e HM466975) se mostraram ser os mesmos fatores de transcrição como NtMYC1b (ADH04268) e NtMYC1a (ADH04267), respectivamente, e não NtMYC2a e NtMYC2b. Possíveis papéis de fatores de transcrição de NtERF98 e NtETTa em biossíntese de nicotina

[00300] O etileno e interação de sinalização de JA é preferivelmente complexo e pode ser ambos sinergístico e antagonístico (Kazan and Manners (2008) Plant Physiol 146: 1459-1468). Ambos fatores de ativação de etileno tipo repressor e ativador (ERFs) foram reportados (McGrath et al. (2005) Plant Physiol 139: 949-959). No tabaco, o etileno é mostrado ter efeitos negativos na biossíntese de nicotina (Wang et al. 1994; Shoji et al. (2000) Plant cell Physiol 41: 1072-1076; Winz and Baldwin (2001) Plant Physiol 125: 2189-2202). Nossa pesquisa revelou que NtERF98 tem um papel preferivelmente complicado na biossíntese de nicotina. NtERF98 é um regulador negativo de síntese de nicotina em que sua expressão é desregulada por todos os três tratamentos que estimulam a síntese de nicotina, e que os níveis de nicotina aumentam por até 50% em uma maioria de suas linhas de RNAi. Adicionalmente, existe uma boa correlação negativa entre os níveis de NtERF98 e de mRNA de QPT em muitas das linhas de sobre expressão. Contudo, nestas linhas, enquanto que QPT foi desregulado, o nível de nicotina foi não-mudado ou aumentado somente moderadamente. Além disso, nas linhas de Raí onde os níveis de nicotina foram geralmente aumentados, os níveis de mRNA de QPT foram reduzidos levemente. No todo, o NtERF98 pode ter uma função de modificação no nível de nicotina, mas pode ser mais responsável pela modulação do nível de mRNA de QPT. Este TF pode estar envolvido no controle rigoroso de nível de mRNA de QPT.

[00301] A auxina e trajetórias de sinalização de JA são intimamente interligadas. Mostrou-se que um fitotohormônio ativa os genes de biossíntese do outro e vice versa. Além disso, pelo menos dois ARFs são requeridos para a biossíntese de JA e fertilidade de planta (para revisão, ver Kazan and Manners (2008) Plant Physiol 146: 1459-1468). Recentemente, foi reportado que I gene repressor de JAZ1 é ativado por ambos JA e auxin (Grunewald et al. (2009) EMBO Rep. 10: 923928). Na presente invenção, o gene de ARF TF clonado, NtETTa, parece regular positivamente expressão de QPT, conforme mostrado nas linhas de RNAi onde mRNA de QPT foi reduzido aproximadamente 15 vezes, indicando que NtETTa é requerido para expressão de QPT. Contudo, a sobre expressão de NtETTa não aumenta a expressão de QPT e, frequentemente, reduziu moderadamente seu nível de mRNA, implicando um papel de NtETTa no controle rigoroso complicado de nível de mRNA de QPT.

[00302] Recentemente, um fator de transcrição responsivo à auxina, NbARF1, foi reportado como um regulador negativo de síntese de nicotina. A supressão de NbARF1 por VIGS intensificou significantemente o nível de nicotina em plantas não-tratadas (Todd et al. (2010) Plant J 62: 589-600). NtETTa é um fator de transcrição responsivo à auxina, mas ele age como um regulador positivo na expressão de QPT, embora ele pareça ter efeitos menores no nível de nicotina.

[00303] Em conclusão, quatro genes de TF foram clonados neste estudo. Eles são NtMYC2a e NtMYC2b a partir da família bHLH family, NtERF98 a partir da família AP2/ERF, e NtETTa a partir da família ARF. Eles estão todos envolvidos na regulação de nível de raiz de mRNA de QPT e/ou nível de folha de nicotina, com NtMYC2a e NtMYC2b tendo efeitos mais positivos, e NtERF98 e NtETTa sendo preferivelmente moduladores mais complicados. NtMYC2a parece desempenhar um papel mais importante na regulação de síntese de nicotina: Sobre expressão aumenta o nível de nicotina constitutivo por até 2,5 vezes, onde a desregulação do gene (junto com NtMYC2b) reduz o mesmo por cinco vezes. Nossa pesquisa também revelou que a síntese de nicotina mais alta não está sempre associada com níveis de mRNA mais altos de um gene de trajetória chave, QPT, apontando para um circuito de retorno negativo, e/ou possível controle translacional e/ou pós- translacional, na trajetória.

[00304] O precedente é ilustrativo da invenção, e não é para ser construído como limitando a mesma. A invenção é definida pelas seguintes reivindicações, com equivalentes das reivindicações a serem incluídas nas mesmas. APÊNDICE

[00305] Nucleotídeo e sequências de amino ácido dos fatores de transcrição isolados neste cDNA NtMYC2a pesquisado (comprimento total, 2214 bp) CACACACTCTCTCCATTTTCACTCACTCCTTATCACCAAACAATTCT TGGGTGTTTGAATATATACCCGAAATAATTTCCTCTCTGTATCAAG AATCAAACAGATCTGAATTGATTTGTCTGTTTTTTTTTCTTGATTTT GTTATATGGAATGACGGATTATAGAATACCAACGATGACTAATATA TGGAGCAATACTACATCCGATGATAATATGATGGAAGCTTTTTTAT CTTCTGATCCGTCGTCGTTTTGGCCCGGAACAACTACTACACCAA CTCCCCGGAGTTCAGTTTCTCCAGCGCCGGCGCCGGTGACGGGG ATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCTATGCCATATTTCAACCAAGAGT CACTGCAACAGCGACTCCAGACTTTAATCGATGGGGCTCGCAAAG GGTGGACGTATGCCATATTTTGGCAATCGTCTGTTGTGGATTTCG CGAGCCCCTCGGTTTTGGGGTGGGGAGATGGGTATTATAAAGGT GAAGAAGATAAAAATAAGCGTAAAACGGCGTCGTTTTCGCCTGAC TTTATCACGGAACAAGCACACCGGAAAAAGGTTCTCCGGGAGCTG AATTCTTTAATTTCCGGCACACAAACCGGTGGTGAAAATGATGCTG TAGATGAAGAAGTAACTGATACTGAATGGTTTTTTCTGATTTCCAT GACACAATCGTTTGTTAACGGAAGCGGGCTTCCGGGCCTGGCGA TGTATAGTTCAAGCCCGATTTGGGTTACTGGAACAGAGAGATTAG CTGTTTCTCACTGTGAACGGGCCCGACAGGCCCAAGGTTTCGGG CTTCAGACTATTGTTTGTATTCCTTCAGCTAATGGTGTTGTTGAGC TCGGGTCAACTGAGTTGATATTCCAGACTGCTGATTTAATGAACAA GGTTAAAGTTTTGTTTAATTTTAATATTGATATGGGTGCGACTACG GGCTCAGGATCGGGCTCATGTGCTATTCAGGCCGAGCCCGATCC TTCAGCCCTTTGGCTGACTGATCCGGCTTCTTCAGTTGTGGAAGT CAAGGATTCGTCGAATACAGTTCCTTCAAGGAATACCAGTAAGCA ACTTGTGTTTGGAAATGAGAATTCTGAAAATGGTAATCAAAATTCT CAGCAAACACAAGGATTTTTCACTAGGGAGTTGAATTTTTCCGAAT ATGGATTTGATGGAAGTAATACTCGGTATGGAAATGGGAATGCGA ATTCTTCGCGTTCTTGCAAGCCTGAGTCTGGTGAAATCTTGAATTT TGGTGATAGTACTAAGAGGAGTGCTTGCAGTGCAAATGGGAGCTT GTTTTCGGGCCAATCACAGTTCGGGCCCGGGCCTGCGGAGGAGA ACAAGAACAAGAACAAGAAAAGGTCACCTGCATCAAGAGGAAGCA ACGATGAAGGAATCCTTTCATTTGTTTCGGGTGTGATTTTGCCAAG TTCAAACACGGGGAAGTCCGGTGGAGGTGGCGATTCGGATCAAT CAGATCTCGAGGCTTCGGTGGTGAAGGAGGCGGATAGTAGTAGA GTTGTAGACCCCGAGAAGAAGCCGAGGAAACGAGGGAGGAAACC GGCTAACGGGAGAGAGGAGCCATTGAATCATGTGGAGGCAGAGA GACAAAGGAGGGAGAAATTGAATCAAAGATTCTATGCACTTAGAG CTGTTGTACCAAATGTGTCAAAAATGGATAAAGCATCACTTCTTGG TGATGCAATTGCATTTATCAATGAGTTGAAATCAAAGGTTCAGAAT TCTGACTCAGATAAAGAGGACTTGAGGAACCAAATCGAATCTTTAA GGAATGAATTAGCCAACAAGGGATCAAACTATACCGGTCCTCCCC CGTCAAATCAAGAACTCAAGATTGTAGATATGGACATCGACGTTAA GGTGATCGGATGGGATGCTATGATTCGTATACAATCTAATAAAAAG AACCATCCAGCCGCGAGGTTAATGACCGCTCTCATGGAATTGGAC TTAGATGTGCACCATGCTAGTGTTTCAGTTGTCAACGAGTTGATGA TCCAACAAGCGACTGTGAAAATGGGAAGCCGGCTTTACACGCAAG AACAACTTCGGATATCATTGACATCCAGAATTGCTGAATCGCGATG AAGAGAAATACAGTAAATGGAAATTATCATAGTGAGCTCTGAATAA TGTTATCTTTCATTGAGCTATTTTAAGAGAATTTCTCCT AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:1 Sequência de amino ácido NtMYC2a (659 AA) M T D Y R I P T M T N I W S N T T S D D N M M E A F L S S D P S S F W P G T T T T P T P R S S V S P A P A P V T G I A G D P L K S M P Y F N Q E S L Q Q R L Q T L I D G A R K G W T Y A I F W Q S S V V D F A S P S V L G W G D G Y Y K G E E D K N K R K T A S F S P D F I T E Q A H R K K V L R E L N S L I S G T Q T G G E N D A V D E E V T D T E W F F L I S M T Q S F V N G S G L P G L A M Y S S S P I W V T G T E R L A V S H C E R A R Q A Q G F G L Q T I V C I P S A N G V V E L G S T E L I F Q T A D L M N K V K V L F N F N I D M G A T T G S G S G S C A I Q A E P D P S A L W L T D P A S S V V E V K D S S N T V P S R N T S K Q L V F G N E N S E N G N Q N S Q Q T Q G F F T R E L N F S E Y G F D G S N T R Y G N G N A N S S R S C K P E S G E I L N F G D S T K R S A C S A N G S L F S G Q S Q F G P G P A E E N K N K N K K R S P A S R G S N D E G I L S F V S G V I L P S S N T G K S G G G G D S D Q S D L E A S V V K E A D S S R V V D P E K K P R K R G R K P A N G R E E P L N H V E A E R Q R R E K L N Q R F Y A L R A V V P N V S K M D K A S L L G D A I A F I N E L K S K V Q N S D S D K E D L R N Q I E S L R N E L A N K G S N Y T G P P P S N Q E L K I V D M D I D V K V I G W D A M I R I Q S N K K N H P A A R L M T A L M E L D L D V H H A S V S V V N E L M I Q Q A T V K M G S R L Y T Q E Q L R I S L T S R I A E S R SEQ ID NO:2 cDNA NtMYC2b (comprimento total, 2391bp) GTAACAAACCCTCTCCATTTTCACTCACTCCAAAAAACTTTCCTCT CTATTTTTTCTCTCTGTATCAAGAATCAAACAGATCTGAATTGATTT GGGAGTTTTTTTTCTTCTTGTTTTTGTTATATGGAATGACGGACTAT AGAATACCAACGATGACTAATATATGGAGCAATACAACATCCGAC GATAACATGATGGAAGCTTTTTTATCTTCTGATCCGTCGTCGTTTT GGGCCGGAACAAATACACCAACTCCACGGAGTTCAGTTTCTCCGG CGCCGGCGCCGGTGACGGGGATTGCCGGAGACCCATTAAAGTCG ATGCCGTATTTCAACCAAGAGTCGCTGCAACAGCGACTCCAGACG TTAATCGACGGGGCTCGCGAAGCGTGGACTTACGCCATATTCTGG CAATCGTCTGTTGTGGATTTCGTGAGCCCCTCGGTGTTGGGGTGG GGAGATGGATATTATAAAGGAGAAGAAGACAAGAATAAGCGTAAA ACGGCGGCGTTTTCGCCTGATTTTATTACGGAGCAAGAACACCGG AAAAAAGTTCTCCGGGAGCTGAATTCTTTAATTTCCGGCACACAAA CTGGTGGTGAAAATGATGCTGTAGATGAAGAAGTAACGGATACTG AATGGTTTTTTCTGATTTCAATGACTCAATCGTTTGTTAACGGAAG CGGGCTTCCGGGCCTGGCTATGTACAGCTCAAGCCCGATTTGGG TTACTGGAAGAGAAAGATTAGCTGCTTCTCACTGTGAACGGGCCC GACAGGCCCAAGGTTTCGGGCTTCAGACTATGGTTTGTATTCCTT CAGCTAATGGTGTTGTTGAGCTCGGGTCAACTGAGTTGATATTCC AGAGCGCTGATTTAATGAACAAGGTTAAAATCTTGTTTGATTTTAAT ATTGATATGGGCGCGACTACGGGCTCAGGTTCGGGCTCATGTGC TATTCAGGCTGAGCCCGATCCTTCAACCCTTTGGCTTACGGATCC 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GCCGCTCTCATGGAATTGGACTTAGATGTGCACCATGCTAGTGTT TCAGTTGTCAACGAGTTGATGATCCAACAAGCGACAGTGAAAATG GGGAGCCGGCTTTACACGCAAGAGCAGCTTCGGATATCATTGACA TCCAGAATTGCTGAATCGCGATGAAGAGAAATACAGTAAATGGAA ATTATTAGTGAGCTCTGAATAATGTTATCTTTCATTGAGCTATTTTA AGAGAATTTCTCCTATAGTTAGATCTTGAGATTAAGGCTACTTAAA AGTGGAAAGTTGATTGAGCTTTCCTCTTAGTTTTTTGGGTATTTTTC AACTTTTATATCTAGTTTGTTTTCCACATTTTCTGTACATATAATGTG AAACCAATACTAGATCTCAAGATCTGGTTTTTAGTTCTGTAATTAGA AATAAATATGCAGCTTCATCTTTTTCTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAA SEQ ID NO:3 Sequência de amino ácido NtMYC2b (658 AA) M T D Y R I P T M T N I W S N T T S D D N M M E A F L S S D P S S F W A G T N T P T P R S S V S P A P A P V T G I A G D P L K S M P Y F N Q E S L Q Q R L Q T L I D G A R E A W T Y A I F W Q S S V V D F V S P S V L G W G D G Y Y K G E E D K N K R K T A A F S P D F I T E Q E H R K K V L R E L N S L I S G T Q T G G E N D A V D E E V T D T E W F F L I S M T Q S F V N G S G L P G L A M Y S S S P I W V T G R E R L A A S H C E R A R Q A Q G F G L Q T M V C I P S A N G 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ACCCGTCGGAAACCGCTGCCGGAAAATCACTGCTAGTGACCTCTG GGCTGAGCTTGACCCTATCTCCGACTTCTGGTCTTCCTCTTCCTCT TCCTCCTCCATTGCCGGCAAATCTGATTCCGTTCAGTCGCTAACC CACTCCTACAATAAGCCTCAGAAATCAGATTCCGGCAAACTTAATC AACTCGAAAAAGGTACAATAAGTGTGAAGGTTGAGAAGGAGAGCA GTGGCCCAAGGGCGAGGAAGAACAAATACAGAGGAATAAGGCAG AGACCGTGGGGAAAATGGGCTGCTGAGATACGTGATCCTCAGAA AGGCGTCCGCGTGTGGTTAGGTACATTCAACACGGCTGAGGAAG CTGCCAGGGCATATGACGAGGCTGCAAAGCGAATCCGCGGTGAC AAGGCTAAGCTCAACTTTCCAGAGCCACCTTCGCCACCAGCCAAG CGACACTGCACTAGCACCATCCCTGATCAGCCCACACGTTCTGAC TTAATGTCTCAGAAACCGGCCTCAATAATGTTGAACTATGGATATG AAAACCAAACACCCTACTACCCCATGGAAATGCCCGCTGCTGAGG ATCCTCAACATCATGATTATGAGCTCAAGGAGCAGATTTCCAACTT GGAGTCATTCCTGGATTTAGAGCCAGACTCAGGGATCGTCGATTC TGACCCCCTCAATATTTTTCTGATGGATGACTTTGCTGCAACTCAG CAGCAGCAGCTGTTTTACTGAACACTGTAAAAATTATCATATACTA CTAGTTAATTTCATCCTAAGTTGTTTGGTGTGCGTTTTCTGATGAG TGACTAGTTAGCTTTTGGTAGTACGTAGTACAATGCAGAAAGTACA TACAATAATAAGTTGCGTGCCTTTGCATGCAATTTGTAATATTAATG TCATGTTGTTTTGTGCTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:5 Sequência de amino ácido NtERF98 (257 AA) M C G G A I I P D Y E P V G N R C R K I T A S D L W A E L D P I S D F W S S S S S S S S I A G K S D S V Q S L T H S Y N K P Q K S D S G K L N Q L E K G T I S V K V E K E S S G P R A R K N K Y R G I R Q R P W G K W A A E I R D P Q K G V R V W L G T F N T A E E A A R A Y D E A A K R I R G D K A K L N F P E P P S P P A K R H C T S T I P D Q P T R S D L M S Q K P A S I M L N Y G Y E N Q T P Y Y P M E M P A A E D P Q H H D Y E L K E Q I S N L E S F L D L E P D S G I V D S D P L N I F L M D D F A A T Q Q Q Q L F Y SEQ ID NO:6 NtETTa cDNA (comprimento total, 2429bp) AGCAAAAGGGTTTGAAGATGATGTGTGGACTTATTGATCTAAATAC TGTGGATAACGATGACGTCGGAGAAGAAACGACGGCGCCGGTGT CACCAGCGTCATCGTCGACGGCGTCTGGATGTTCGGATTTGACGT CGTCATCTCTGCCGGCGATGGCATCGGTTTGTCTGGAGCTGTGG CATGCGTGTGCTGGACCGTTGATTTCTCTGCCGAAGAAAGGAAGT GCTGTTGTGTACCTACCTCAAGGTCACTTGGAACATCTCTCTGAGT ACCCGCCCATAGCCTATAACCTCCCTCCTCACGTTTTTTGTCGCGT CGTAGACGTGAAGCTACAAGCGGATGCGGCGAGTGATGAGGTCT ATGCACAAGTCTCACTGGTTCCAGACAATCAGATTGAGCAGAAAT GGAGGGATGGAGACATTGATGCAGATACTGAAGAGGAGGAAATA GAAGGTGCTGGAAAATCAACAACACCACACATGTTCTGCAAGACT CTCACTGCTTCGGATACCAGCACTCATGGCGGTTTTTCTGTCCCT CGCCGGGCTGCAGAAGATTGCTTTCCTCCATTGGATTACAGACAA CAGCGGCCCTCACAGGAGCTGGTAGCCAAAGATCTACATGGTATC GAGTGGAAATTTCGGCATATCTATCGTGGTCAGCCACGAAGGCAT CTGCTCACTACAGGATGGAGTGCGTTTGTAAACAGGAAGAAGCTT GTTTCTGGTGACGCTGTGCTTTTCTTAAGGACTGCTGATGGAGAA CTTAGGCTAGGGGTGAGACGAGCTGCCCAAGCTAAAACATGTTCA AATTATCTAGCTGCCTATAGCCAACTGTTGAATGTCAGTGGTATTG TGGATGTGGTTAAGGCCATATCTAGCACAAATGCCTTCAGTATCTG TTATAACCCGAGGGCTAGCTCATCAGGCTTCATTTTACCTTACCAC AAATTCTCAAAGACTCTTGCACATCCCTTTTCAGCTGGAATGAGAT TTAAGATGCGTGTCGAAACAGAAGATGCAGCTGAACAAAGGTTCA CTGGACTTGTTGTAGGAGTCAGCGATGTAGATCCAGTTCGCTGGC CTGGTTCTAAATGGAGGTGCCTATTGGTCAGGTGGGATGATCTTG ATGTTTCTCGGCATAATAGGGTTTCACCGTGGGAAATTGAGCCAT CTGGTTCAGCTCCTGTATCCAGCAGCTTGGTGATGCCTTCTGCGA AGAGGACCAGGGTTGGCTTTCCAATTACAAAGGCCGATTTTCCAA TTCCTAGAGATGGGATTGCAGTATCAGACTTTGGGGAATCTTCTA GGTTCCAGAAGGTCTTGCAAGGTCAAGAAATTTTGGGGATTAGTT CTCCTTTTGTCGGTTTTGATGCTCACAGTCCTCGTACAGCGGGGA TAAGATGCTTTCCTGGTTTTCCTAGTTCTGGGGCATCTAGATTGGG AAACAGCATCAGAACCCTGCTTGGTGACACAGACAAGTCCCCTGA AAGCATTGGCTTTAGTGATTCTTCTCGATACAATAAGGTCTTGCAA GGTCAAGAAACTTTTTCAACCCCTCCTTATGGGAGAGGTCATGCA GGTAGCCTAATGCAGGAAAAAAGTAGAACTGGTATTATCGTCGGT ATTCAGGTTCCAAGCCACGTAAACAGGTGGTCTGCTCCAAATCAG GGTAATCGCAGTCATTGCAATCCAAGTACTCTTGTCCCGGCATCA TCACCTCCTTCTGTGCTCAGCTTTCAGCCTCCCAGGTCTCCAGCA TCAAAATTCCAGGCTATGTTCAATCATAAACATGGGAAGCTTGAGA CTGCTACCCAGGCTTTGGATATGTCTGAGAGCTGTAGTAGGCATC TCGCATCTGGCTCACATGCCGAGGACATCAGTAGGAAGGGAGAC ACAAAAGGAATCAGTTCTTTTAGTTTCTTAAAGGAGCAAAAGCAAA CAGGAATTTCATATCTTTCTCTTGGGACCCAGTCGTCTCAAAACTT AGTTTCCATGTGTAAAACCAGTTGCAGGATCTTTGGATTCCCCTTG ACCGAGAGTAAAATAAATGCAGCTAGAGCGGAGAATCCTGCCGAG GCTGTATATTCACATGGTCTAGAAACAACATTTCTGCCTTCCAGTG ATGGAAAGTTGCAGCCAGGGCCACCATTGATGACTAATGTTGTGG GAACAAACTTTACTAAAGTAAATGACCTCTATGCTGCAAGAGATGT GATTCTTGATATTGCTTTGTAGCAAGTATTTGTTGTGAAGTCATGA GCATATGTAAACTGAAGGATGTGTGAGCAGTATTATTGATTCTTAG ATTTTAGTTGGCTGATTAGTTTTGGCCAATGAACGCAAGCATGTAG TTGCCAGTACAATGCTTATCCTGAGATGAGTATTGAGAGTTTTTAT TGTAAGGAACACAGTGAAGATTAGTATTGTAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA SEQ ID NO:7 Sequência de amino ácido NtETTa (739 AA) M M C G L I D L N T V D N D D V G E E T T A P V S P A S S S T A S G C S D L T S S S L P A M A S V C L E L W H A C A G P L I S L P K K G S A V V Y L P Q G H L E H L S E Y P P I A Y N L P P H V F C R V V D V K L Q A D A A S D E V Y A Q V S L V P D N Q I E Q K W R D G D I D A D T E E E E I E G A G K S T T P H M F C K T L T A S D T S T H G G F S V P R R A A E D C F P P L D Y R Q Q R P S Q E L V A K D L H G I E W K F R H I Y R G Q P R R H L L T T G W S A F V N R K K L V S G D A V L F L R T A D G E L R L G V R R A A Q A K T C S N Y L A A Y S Q L L N V S G I V D V V K A I S S T N A F S I C Y N P R A S S S G F I L P Y H K F S K T L A H P F S A G M R F K M R V E T E D A A E Q R F T G L V V G V S D V D P V R W P G S K W R C L L V R W D D L D V S R H N R V S P W E I E P S G S A P V S S S L V M P S A K R T R V G F P I T K A D F P I P R D G I A V S D F G E S S R F Q K V L Q G Q E I L G I S S P F V G F D A H S P R T A G I R C F P G F P S S G A S R L G N S I R T L L G D T D K S P E S I G F S D S S R Y N K V L Q G Q E T F S T P P Y G R G H A G S L M Q E K S R T G I I V G I Q V P S H V N R W S A P N Q G N R S H C N P S T L V P A S S P P S V L S F Q P P R S P A S K F Q A M F N H K H G K L E T A T Q A L D M S E S C S R H L A S G S H A E D I S R K G D T K G I S S F S F L K E Q K Q T G I S Y L S L G T Q S S Q N L V S M C K T S C R I F G F P L T E S K I N A A R A E N P A E A V Y S H G L E T T F L P S S D G K L Q P G P P L M T N V V G T N F T K V N D L Y A A R D V I L D I A L SEQ ID NO:8

Claims (5)

1. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende, na direção 5’ a 3’, um promotor heterólogo operável em uma célula de planta e posicionados à jusante do referido promotor e operativamente associados com mesmo uma molécula de ácido nucleico compreendendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:5.

2. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o promotor é um promotor constitutivo, um promotor preferido de tecido, ou um promotor específico de tecido.

3. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

4. Célula bacteriana transgênica, caracterizada pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 3.

5. Método de produção de uma planta transgênica Nicotiana tabacum tendo teor de alcaloide aumentado, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir em uma célula de planta Nicotiana tabacum a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 2, ou o vetor, como definido na reivindicação 3, para produzir uma célula de planta transgênica compreendendo a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 2; e regenerar referida célula de planta transgênica Nicotiana tabacum para produzir uma planta transgênica Nicotiana tabacum compreendendo a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 1 ou 2 ou o vetor, como definido na reivindicação 3.

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