CN113528537A

CN113528537A - 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用

Info

Publication number: CN113528537A
Application number: CN202110918584.0A
Authority: CN
Inventors: 王丙武; 宋中邦; 高玉龙; 王亚辉; 孔光辉; 赵璐; 隋学艺; 张谊寒; 焦芳婵; 吴兴富; 李永平; 贺晓辉
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2021-10-22

Abstract

本发明公开了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，与核苷酸序列为SEQIDNO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229‑230insA突变，该突变使NtQPT2基因编码蛋白质序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变氨基酸。本发明通过系统研究，首次提出了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，本发明提出的降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体获得的烟草植株，烟叶中烟碱含量比对照降低88％，使烟叶的烟碱含量显著降低。

Description

一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用

技术领域

本发明涉及遗传工程技术领域，更具体地，涉及一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用。

背景技术

烟碱是栽培烟草烟叶中重要的特征性化合物，占烟草总生物碱的95％左右。

目前，烟碱的合成途径已基本清晰，多个途径基因家族参与其中，例如PMT基因家族含有5个成员，QPT及MPO家族也都克隆获得了2个成员基因。除了途径基因外，烟碱合成受到多种转录因子基因的调控，如MYC2,ERF等。通过调控转录因子基因能够改变烟叶烟碱含量，如过表达MYC2a或者ERF115能够显著提高转基因烟草烟碱含量；抑制MYC2a的表达基因能够降低烟草烟碱含量。近年来，基因组编辑技术也应用于调控烟叶烟碱含量，比如敲除BBL家族多个基因获得了烟碱含量极低的烟草。

随着新型烟草制品市场的迅速扩展，烟草工业对不同烟碱梯度的烟叶需求日益增加，其中包括低烟碱含量烟草。因此，有必要研究降低烟叶烟碱含量的途径基因突变体及其应用以解决上述技术问题。

发明内容

本发明主要目的在于获得降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，定位出该NtQPT2基因突变体的突变位点及突变类型。在此基础上，提供降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的应用，用于降低烟草植株的烟叶烟碱含量。

因此，一方面，本发明提供了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229-230insA突变，该突变使NtQPT2基因编码氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。

本发明中，采用本领域通用表示法表示突变；c.229-230insA突变表示NtQPT2基因序列229位增加1个A，造成移码突变，该突变能够显著降低烟草烟叶中烟碱含量。

进一步地，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体编码的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

第二方面，本发明还提供一种NtQPT2基因突变体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

1、构建CRISPR/CAS9载体：

(1)根据NtQPT2基因组序列设计靶位点，所述靶位点为：

PAM：SEQ ID NO：5；

(2)根据步骤(1)中的靶位点设计引物，得到靶位点引物，所述靶位点引物为：

P1：SEQ ID NO：6，

P2：SEQ ID NO：7；

(3)根据步骤(1)中的靶位点，在靶位点两侧设计编辑材料的检测引物，得到检测引物，所述检测引物为：

NtQPT2-SdF:SEQ ID NO：8，

NtQPT2-SdR:SEQ ID NO：9，扩增长度为834bp；

(4)根据步骤(2)中的得到的靶位点引物通过退火形成互补DNA oligo，得到dsDNA；

(5)酶切pHSE401载体得到酶切产物，将所述酶切产物与步骤(4)中得到的dsDNA进行连接，得到连接产物；

(6)将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌后进行菌落PCR检测，经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到pHSE401-QPT2载体；

所述菌落PCR检测时，所用引物设计为:

U6-26p-F：SEQ ID NO：10；

U6-26p-R：SEQ ID NO：11；上述引物对NtQPT2基因突变体检测的特异性好，准确性高；

测序时所用引物为：U6-26p-F:SEQ ID NO：10。

2、农杆菌转化

(7)将农杆菌感受态细胞C58C1溶解后加入步骤(6)中得到的载体pHSE401-QPT2进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆；

3、烟草转化

(8)将步骤(7)中得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液；

(9)取野生型烟草叶片利用乙醇和HgCl₂处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；

(10)将步骤(9)中得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入步骤(8)中得到的含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中进行侵染，随后将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；

(11)待步骤(10)中的芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗；

4、测序筛选编辑材料

(12)待步骤(11)中的T0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取DNA，经扩增后得扩增产物，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株NtQPT2基因增加1个碱基A的编辑材料；种植该编辑材料得T1代植株，通过测序筛选该基因纯合突变单株并收种，获得具有NtQPT2纯合突变的T2代烟草种子。

第三方面，本发明提供NtQPT2基因突变体应用于降低烟叶烟碱的含量，所述NtQPT2基因突变体应用于降低烟草植株烟叶的烟碱含量。

(13)对步骤(12)中得到的具有NtQPT2基因纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T383-2010的方法检测植株烟叶烟碱含量。

(14)含有突变序列的T2代烟草相比含有SEQ ID NO:1序列的烟草叶片烟碱含量显著降低。

本发明的有益效果是：

1、本发明通过系统研究，首次提出了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，本发明提出的降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体烟草植株，烟叶中烟碱含量比对照降低88％，使烟叶的烟碱含量显著降低。

2、本发明通过系统研究，通过构建CRISPR/CAS9载体，农杆菌转化、烟草转化及测序筛选编辑材料，获得NtQPT2基因序列229位增加1个A，造成移码突变的突变体，该突变体烟叶的烟碱含量显著降低，满足烟草工业对低烟碱烟叶的需求。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1为突变体突变位点测序峰图。

图2为本发明NtQPT2突变体株系与野生型烟草叶片烟碱含量对比示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1，本发明的第一方面，本发明提供了一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229-230insA突变，该突变使NtQPT2基因编码氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。

烟草野生型烟草植株的NtQPT2基因的cDNA序列如下所示：

本发明发生c.229-230insA突变的NtQPT2基因突变体，在上述野生型烟草植株序列的加框示出处增加1个A。该位点的单核苷酸改变将导致NtQPT2基因编码的氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。

通过测序筛选纯合突变单株并收种，获得具有NtQPT2突变的可显著降低烟叶烟碱含量的T2代烟草种子；根据本发明的实施例，该突变体的核酸为培育低烟碱烟草品种提供基因资源。

本申请中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。

进一步地，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体编码的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。其中，野生型烟草NtQPT2基因cDNA编码的氨基酸序列如下：

通过对比发现，与SEQ ID NO.1相比，本发明的NtQPT2基因突变体的cDNA具有c.229-230insA突变，进而，其编码产物与野生型的NtQPT2的氨基酸序列相比，在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。综上，存在c.229-230insA突变可显著改变NtQPT2基因的功能。

实施例2，请参考图1，根据本发明的第二方面，提出了NtQPT2基因突变体的制备方法,具体制备方法包括以下步骤：

1、构建CRISPR/CAS9载体：

(1)根据NtQPT2基因组序列设计靶位点，所述靶位点为：

PAM：GGCGACGATTCCTGTTGATATGG；

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)	末端修饰
				6	P1	ATTGGGCGACGATTCCTGTTGATA	无
7	P2	AAACTATCAACAGGAATCGTCGCC	无

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)	末端修饰
				8	NtQPT2-SdF	AAGGATGGAGGGTACTAACC	无
9	NtQPT2-SdR	CAATTCAGCAGTCTCTGACC	无

扩增长度为834bp。

(4)制备dsDNA：根据步骤(2)中的得到的靶位点引物通过退火形成互补DNAoligo，得到dsDNA；具体反应体系为：反应体系50μL，包括P1 20μL，P2 20μL，10×Annealingbuffer 5μL，灭菌双蒸水5μL。退火程序为：95℃，5min；90℃，1min；80℃，1min；70℃，1min；60℃，1min；50℃，1min；40℃，1min；30℃，1min；20℃，1min；10℃，1min。

具体步骤为：利用BsaI酶对pHSE401载体进行酶切，酶切体系50μL，包括：质粒5μL，10×buffer 5μL，Bsa I 2μL，灭菌双蒸水38μL，37℃酶切1h；

酶切后对酶切产物进行电泳检测分析，可见1200bp和11520bp两个条带，回收11520bp的酶切产物备用；

利用T4DNA连接酶将所回收的大片段酶切产物与步骤(4)所制备dsDNA进行连接，连接体系20μL：所回收载体酶切产物3μL，退火所形成dsDNA产物10μL，T4 DNA buffer 2μL，T4 DNA连接酶1μL，灭菌双蒸水4μL，16℃过夜连接，得到连接产物；

(6)测序验证：将步骤(5)中得到的连接产物转化为大肠杆菌，筛选阳性克隆(pHSE401载体抗性为卡那霉素)并进行菌落PCR检测；所述菌落PCR检测时，所用引物设计为:

SEQ ID NO：	名称	序列(5’→3’)	末端修饰
				10	U6-26p-F	TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC	无
11	U6-26p-R	AAACCGATTCATCGCAACCAATTC	无

经PCR检测验证正确的阳性克隆菌株培养扩增后进一步进行测序分析，得到pHSE401-QPT2载体；

测序时所用引物为上述U6-26p-F。

2、农杆菌转化

(7)将农杆菌感受态细胞C58C1溶解后加入步骤(6)中得到的载体pHSE401-QPT2进行农杆菌转化，得到含有目标载体的农杆菌克隆。具体为：从-80℃冰箱中取出农杆菌感受态细胞(C58C1)，放置冰上溶解后加入载体pHSE401-QPT2 4μL；液氮速冻1分钟，转入37℃水浴5分钟，再冰浴2分钟，向混合物中加入1mL LB液体培养基，28℃、220rpm培养3～4小时；培养物涂布于含有卡那霉素100mg/L和利福平25mg/L的LB固体培养基上，28℃倒置培养2～3天，可见含有目标载体的农杆菌克隆。

3、烟草转化

(8)将步骤(7)中得到的含有目标载体的农杆菌克隆经划线接种后，在含有卡那霉素和利福平的LB培养基中进行扩繁，得到含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液；具体为：挑取含有目标载体的农杆菌克隆，在含有卡那霉素和利福平的LB平板上划线，28℃培养2～3天；刮取划线菌斑接菌于含有卡那霉素和利福平的LB培养基中，28℃，220rpm震荡培养，菌液浓度达到OD＝0.5～0.8时进行侵染。

(9)取野生型烟草叶片利用乙醇和HgCl₂处理后用无菌水进行冲洗，并吸去烟草叶片表面液体，得到无菌野生型烟草叶片；具体为：将野生型烟草叶片置于500mL广口瓶中，加入适量75％乙醇，漂洗1min；弃乙醇，加入0.1％的HgCl₂溶液，置摇床上室温振荡15～30分钟；弃溶液，用无菌水冲洗6遍。

(10)将步骤(9)中得到的无菌野生型烟草叶片切成小片后，放入步骤(8)中得到的含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中进行培养后，将烟草叶片转入分化培养基中进行培养，直至烟草叶片切口处逐渐形成愈伤组织并分化出芽；具体为：将步骤(9)中得到的无菌野生型烟草叶片取出，用无菌吸水纸洗去表面液体，取无菌叶片用剪刀切成1cm×1cm的小片，将切成小片的烟草叶片放入含目标载体的农杆菌LB液体培养基悬浮菌液中，静置15～20min；取出烟草叶片，用无菌滤纸吸去多余菌液，于含有6-BA(0.02mg/L)、NAA(2mg/L)的MS培养基中25℃暗培养两天；将烟草叶片转入分化培养基中，切口接触培养基，分化培养基为含有6-BA(0.5mg/L)、NAA(0.1mg/L)、潮霉素(20mg/L)、头孢霉素(500mg/L)的MS培养基，每2～3周继代一次，切口处逐渐形成愈伤组织，最后分化出芽。

(11)待步骤(10)中的芽长至3～5cm时，切取芽，将切取的芽诱导生根，生根后移植于灭菌的营养土中，得到多株T0代转基因烟草幼苗；具体为；将长至3～5cm的芽切下，转入MS培养基诱导生根，生根后的转基因植株由生根培养基中取出，用自来水洗净培养基，移植于灭菌的营养土中。

4、测序筛选编辑材料

(12)待步骤(11)中的0代转基因烟草幼苗生长1周后，选取叶片提取DNA，经扩增后得扩增产物，扩增产物纯化后利用正向引物测序，经对测序结果进行分析，获得一株NtQPT2基因增加1个碱基A的编辑材料；种植该编辑材料得T1代植株，通过测序筛选纯合突变单株并收种，获得具有NtQPT2纯合突变的T2代烟草种子。具体为:待T0代转基因苗生长1周左右，选取20株烟苗取叶片并利用DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)提取DNA，利用步骤(3)中设计的引物NtQPT2-SdF/SdR进行扩增，扩增产物纯化后利用正向引物测序。对测序结果分析，获得一株NtQPT2基因增加1个碱基A的编辑材料(如图1所示)。种植该编辑材料T1代植株，通过测序筛选纯合突变单株并收种获得T2代种子。

实施例3，请参考图2，本发明的另一方面在于提供NtQPT2基因突变体应用于降低烟叶烟碱的含量。

(13)对步骤(12)中得到的具有NtQPT2纯合突变的T2代烟草种子在温室进行种植，得到T2代烟草株系，利用YC/T383-2010的方法检测植株烟叶烟碱含量；具体为：在温室种植得到的突变体株系与野生型烟草植株对照，在烟株旺长期，取整株叶片，杀青烘干，利用YC/T383-2010的方法检测烟叶烟碱含量。

(14)含有突变序列的T2代烟草相比含有SEQ ID NO:1序列的烟草叶片烟碱含量显著降低；如图2所示，降低至88％左右。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体及其应用

<130> 2021

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgtttaggg ctcttccttt cactgcaaca gtgcatccat atgcaattac agctccaagg 60

ttggtggtga aaatgtcagc aatagccacc aagaatacaa gagtggagtc attagaggtg 120

aagccaccag cacacccaac ttatgattta aagggtgtta tgcaacttgc actctctgaa 180

gatgctggga atttaggaga tgtgacttgt aaggcgacga ttcctgttga tatggaatcc 240

gatgctcatt ttctagcaaa ggaagacggg atcatagcag ggattgcact tgctgagatg 300

atattcgcgg aagttgatcc ttcactaaag gtggagtggt atgtaaatga tggtgataaa 360

gttcataaag gcttgaaatt tggcaaagta caaggaaacg cttacaacat tgttatagct 420

gagagggttg ttctcaattt tatgcaaaga atgagtggaa tagctacact aactaaggaa 480

atggcagatg ctgcacaccc tgcttacatc ttggagacta ggaaaactgc tcctggatta 540

cgtttggtgg ataaatgggc ggtattgatc ggtggtggga agaatcacag aatgggctta 600

tttgatatgg taatgataaa agacaatcac atatctgctg ctggaggtgt cggcaaagct 660

ctaaaatctg tggatcagta tttggagcaa aataaacttc aaataggggt tgaggttgaa 720

accaggacaa ttgcagaagt acgtgaggtt ctagaatatg catctcaaac aaagacttcg 780

ttgactagga taatgctgga caatatggtt gttccattat ctaacggaga tattgatgta 840

tccatgctta aggaggctgt agaattgatc aatgggaggt ttgatacgga ggcttcagga 900

aatgttaccc ttgaaacagt acacaagatt ggacaaactg gtgttaccta catttctagt 960

ggtgccctga cgcattctgt gaaagcactt gacatttccc tgaagatcga tacagagctc 1020

gcccttgaag tcggacgacg tacaaaacga gcatga 1056

<210> 2

<211> 351

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Met Phe Arg Ala Leu Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile

1 5 10 15

Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn

20 25 30

Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr

35 40 45

Asp Leu Lys Gly Val Met Gln Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn

50 55 60

Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Val Asp Met Glu Ser

65 70 75 80

Asp Ala His Phe Leu Ala Lys Glu Asp Gly Ile Ile Ala Gly Ile Ala

85 90 95

Leu Ala Glu Met Ile Phe Ala Glu Val Asp Pro Ser Leu Lys Val Glu

100 105 110

Trp Tyr Val Asn Asp Gly Asp Lys Val His Lys Gly Leu Lys Phe Gly

115 120 125

Lys Val Gln Gly Asn Ala Tyr Asn Ile Val Ile Ala Glu Arg Val Val

130 135 140

Leu Asn Phe Met Gln Arg Met Ser Gly Ile Ala Thr Leu Thr Lys Glu

145 150 155 160

Met Ala Asp Ala Ala His Pro Ala Tyr Ile Leu Glu Thr Arg Lys Thr

165 170 175

Ala Pro Gly Leu Arg Leu Val Asp Lys Trp Ala Val Leu Ile Gly Gly

180 185 190

Gly Lys Asn His Arg Met Gly Leu Phe Asp Met Val Met Ile Lys Asp

195 200 205

Asn His Ile Ser Ala Ala Gly Gly Val Gly Lys Ala Leu Lys Ser Val

210 215 220

Asp Gln Tyr Leu Glu Gln Asn Lys Leu Gln Ile Gly Val Glu Val Glu

225 230 235 240

Thr Arg Thr Ile Ala Glu Val Arg Glu Val Leu Glu Tyr Ala Ser Gln

245 250 255

Thr Lys Thr Ser Leu Thr Arg Ile Met Leu Asp Asn Met Val Val Pro

260 265 270

Leu Ser Asn Gly Asp Ile Asp Val Ser Met Leu Lys Glu Ala Val Glu

275 280 285

Leu Ile Asn Gly Arg Phe Asp Thr Glu Ala Ser Gly Asn Val Thr Leu

290 295 300

Glu Thr Val His Lys Ile Gly Gln Thr Gly Val Thr Tyr Ile Ser Ser

305 310 315 320

Gly Ala Leu Thr His Ser Val Lys Ala Leu Asp Ile Ser Leu Lys Ile

325 330 335

Asp Thr Glu Leu Ala Leu Glu Val Gly Arg Arg Thr Lys Arg Ala

340 345 350

<210> 3

<211> 1057

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atgtttaggg ctcttccttt cactgcaaca gtgcatccat atgcaattac agctccaagg 60

ttggtggtga aaatgtcagc aatagccacc aagaatacaa gagtggagtc attagaggtg 120

aagccaccag cacacccaac ttatgattta aagggtgtta tgcaacttgc actctctgaa 180

gatgctggga atttaggaga tgtgacttgt aaggcgacga ttcctgttga atatggaatc 240

cgatgctcat tttctagcaa aggaagacgg gatcatagca gggattgcac ttgctgagat 300

gatattcgcg gaagttgatc cttcactaaa ggtggagtgg tatgtaaatg atggtgataa 360

agttcataaa ggcttgaaat ttggcaaagt acaaggaaac gcttacaaca ttgttatagc 420

tgagagggtt gttctcaatt ttatgcaaag aatgagtgga atagctacac taactaagga 480

aatggcagat gctgcacacc ctgcttacat cttggagact aggaaaactg ctcctggatt 540

acgtttggtg gataaatggg cggtattgat cggtggtggg aagaatcaca gaatgggctt 600

atttgatatg gtaatgataa aagacaatca catatctgct gctggaggtg tcggcaaagc 660

tctaaaatct gtggatcagt atttggagca aaataaactt caaatagggg ttgaggttga 720

aaccaggaca attgcagaag tacgtgaggt tctagaatat gcatctcaaa caaagacttc 780

gttgactagg ataatgctgg acaatatggt tgttccatta tctaacggag atattgatgt 840

atccatgctt aaggaggctg tagaattgat caatgggagg tttgatacgg aggcttcagg 900

aaatgttacc cttgaaacag tacacaagat tggacaaact ggtgttacct acatttctag 960

tggtgccctg acgcattctg tgaaagcact tgacatttcc ctgaagatcg atacagagct 1020

cgcccttgaa gtcggacgac gtacaaaacg agcatga 1057

<210> 4

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Met Phe Arg Ala Leu Pro Phe Thr Ala Thr Val His Pro Tyr Ala Ile

1 5 10 15

Thr Ala Pro Arg Leu Val Val Lys Met Ser Ala Ile Ala Thr Lys Asn

20 25 30

Thr Arg Val Glu Ser Leu Glu Val Lys Pro Pro Ala His Pro Thr Tyr

35 40 45

Asp Leu Lys Gly Val Met Gln Leu Ala Leu Ser Glu Asp Ala Gly Asn

50 55 60

Leu Gly Asp Val Thr Cys Lys Ala Thr Ile Pro Val Glu Tyr Gly Ile

65 70 75 80

Arg Cys Ser Phe Ser Ser Lys Gly Arg Arg Asp His Ser Arg Asp Cys

85 90 95

Thr Cys

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ggcgacgatt cctgttgata tgg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

attgggcgac gattcctgtt gata 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

aaactatcaa caggaatcgt cgcc 24

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

aaggatggag ggtactaacc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 9

caattcagca gtctctgacc 20

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 10

tgtcccagga ttagaatgat taggc 25

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 11

aaaccgattc atcgcaacca attc 24

Claims

1.一种降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于：所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，与核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的NtQPT2基因相比，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体具有c.229-230insA突变，该突变使NtQPT2基因编码氨基酸序列在突变位点之后发生改变，并形成截断的突变蛋白质。

2.根据权利要求1所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体，其特征在于，所述降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种根据权利要求1或2所述的降低烟叶烟碱含量的NtQPT2基因突变体应用，其特征在于：所述NtQPT2基因突变体在降低烟叶中烟碱含量上的应用。