WO2021210688A1 - 低アルカロイド含量のタバコ属植物体およびその製造方法 - Google Patents

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遼 西口
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Definitions

  • the present invention relates to a plant of the genus Nicotiana having a low alkaloid content and a method for producing the same.
  • the Nic1 and Nic2 loci are known as natural mutation loci that bring low alkaloidity to tobacco (Nicotiana tabacum). At both loci, there are genes such as some transcription factors involved in nicotine biosynthesis. In the nicotine-reduced nic1 and nic2 mutants, there is a large deletion in the genome and those genes are lost from the genome. When mutations are homozygous for both loci, the nicotine content is about 10% (2-4.5 mg / g dry leaves) of general tobacco varieties (15-45 mg / g) (Non-Patent Documents). 1). So far, various studies have been reported to reduce the content of alkaloids such as nicotine in tobacco.
  • Non-Patent Document 1 summarizes examples of producing low nicotine tobacco by suppressing the function of genes of the nicotine biosynthetic enzymes QPT, PMT, and BBL, and the nicotine content in tobacco in which these genes are suppressed is 1.4 mg / g dry leaves, 0.6-2.2 mg / g dry leaves, 4.1-4.4 mg / g dry leaves, respectively.
  • a gene (QPT) that causes malformations by suppressing expression is also included (Non-Patent Document 2).
  • QPT a gene that causes malformations by suppressing expression
  • Non-Patent Document 4 there is a report that the nicotine content of the BBL knockout line is reduced to 0.3% of that of the control.
  • Non-Patent Document 4 Although the nicotine-reducing effect is large, it is necessary to suppress the function of all 5 PMTs present in the tobacco genome, and it is necessary to knock out all 6 BBLs present in the tobacco genome. , It becomes a big barrier to the actual breeding.
  • Non-Patent Document 5 and Non-Patent Document 6 report the results of investigating various genes involved in alkaloid biosynthesis in plants belonging to the genus Nicotiana and their expression, and two plants belonging to the genus Tobacco. It has been suggested that the presence of the aspartate oxidase (AO) gene, AO1 and AO2, AO1 is universally expressed throughout the plant and AO2 is root-specifically expressed.
  • AO is an enzyme that produces iminoaspartic acid by catalyzing the oxidation of aspartic acid.
  • AO is an important enzyme in the body involved in the metabolism of nicotinic acid and nicotinamide.
  • Patent Document 1 describes that the alkaloid content is reduced by down-regulating the nicotine biosynthetic enzyme gene (including the AO gene) in combination with the NBB1 or A622 gene.
  • Patent Document 2 describes that nicotine-related alkaloids are reduced by reducing the expression of nicotine biosynthesis genes (including AO genes) by genome editing technology.
  • Patent Documents 1 and 2 do not have experimental results actually dealing with the AO gene, and AO1 and AO2 are not distinguished.
  • Non-Patent Document 8 In plants other than tobacco, functional disruption of the AO gene is known to bring about lethality to the living body.
  • Non-Patent Document 9 the RNAi construct of tobacco AO2 (described as AO1 in Non-Patent Document 9) was introduced into tobacco, and in transformed tobacco in which the amount of AO2 transcript was reduced, nicotine in the upper lobe 2 weeks after depressing was used. It is described that the content was reduced to about 0.5% or less to 14% of the control. Non-Patent Document 9 also describes that individuals with a low nicotine content exhibit a phenotype of premature aging (white to azuki-colored spots) on fully developed leaves and lower leaves (mature leaves).
  • Nicotiana tabacum is a diploid plant whose genome includes a genome derived from Nicotiana silvestris (S) and a genome derived from Nicotiana tomentoformis (T), often the gene of Nicotiana tabacum.
  • S Nicotiana silvestris
  • T Nicotiana tomentoformis
  • Non-Patent Document 9 does not disclose the sequence of the AO2-T gene, nor does it distinguish between the AO2-S and AO2-T genes.
  • mutants that are non-recombinant and there are no examples of plants of the genus Nicotiana other than Nicotiana tabacum.
  • One embodiment of the present invention has been made in view of the above problems, and tobacco having a low alkaloid content in which a small number (one or two) genes are functionally suppressed by mutations inherent in the genes and the like.
  • the main purpose is to provide a manufacturing method.
  • AO2 is a root-specific aspartate oxidase
  • the alkaloid content of the plant of the genus Nicotiana was reduced by suppressing it. That is, one AO2 gene mutation in the diploid tobacco genus plant (Nicotiana sylvestris), and two AO2 genes (AO2-S and AO2-) in the double diploid tobacco genus plant (Nicotiana tabacum).
  • the tobacco genus plant according to the present invention comprises (a) a polynucleotide encoding a polypeptide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.
  • the coding region includes an endogenous gene contained as a coding region and (b) a polynucleotide encoding a polypeptide having 95% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • a mutation that specifically causes the suppression of the function of at least one of the endogenous genes is introduced into the endogenous gene in the genome.
  • the method for producing a low alkaloid content plant of the genus Tobacco encodes (a) a polypeptide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5.
  • a polynucleotide encoding an endogenous gene containing the above-mentioned polynucleotide as a coding region and (b) a polypeptide having 95% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6.
  • Including a step of introducing into the genome of a plant of the genus Tobacco, a mutation that specifically causes the suppression of the function of at least one of the endogenous genes containing the above as a coding region, and the above-mentioned introduction step is described above in the above-mentioned endogenous gene. Includes introducing mutations.
  • Nsyl AO2_ptn, Ntab AO2-S ptn, and Ntab AO2_T_ptn indicate amino acid sequences translated from the NsAO2, NtAO2-S, and NtAO2-T genes identified in the present invention, respectively.
  • Nsyl stands for Nicotiana sylvestris
  • Ntab stands for Nicotiana tabacum
  • Ntom stands for Nicotiana tomentosiformis
  • Natt stands for N. attenuata.
  • Numbers starting with XP are GenBank accession numbers. It is a figure which shows the expression profile of the AO gene NtAO2-S, NtAO2-T, NtAO1-S, NtAO1-T of Nicotiana tabacum (N.
  • RNA-seq data The unit is FPKM: Fragments Per Kilobase of exon per. Million mapped reads). It is a figure which shows the amount of the transcript in the root and the leaf of AO1, AO2, or AO (both AO1 and AO2). It is a figure which shows the nicotine content in the plant of the genus Nicotiana whose function suppressed the AO2 gene. It is a figure which shows the nicotine content in the plant of the genus Nicotiana whose function suppressed the AO1 gene. It is a figure which shows the state ((a) NtAO1-ssTT and (b) NtAO1-SSTT) of the leaf state of the plant of the genus Nicotiana whose function suppressed the AO1 gene.
  • a polynucleotide encoding a polypeptide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 is used as a coding region.
  • a plant of the genus Tobacco in which a mutation that specifically causes suppression of the function of at least one of the sex genes has been introduced into the endogenous gene in the genome.
  • polypeptide having 95% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in for specifying a polypeptide using the amino acid sequence described in the sequence listing is a wild-type polypeptide.
  • the wild-type polypeptide means a polypeptide normally present in the plants of the genus Nicotiana described below.
  • the wild-type polypeptide is, for example, a protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 5 or 6, or a homologous molecular species of the protein in a plant of the genus Tobacco.
  • polypeptide and “protein” have substantially the same meaning and can be used interchangeably. Therefore, in the present specification, the region encoding a polypeptide present in the endogenous gene is referred to as a coding region (CDS).
  • CDS coding region
  • the above embodiment may satisfy one or more or all of the following conditions.
  • the endogenous gene of (a) there is a mutation that causes the function suppression of the endogenous gene of (a).
  • the endogenous gene of (a) does not have a mutation that causes the function suppression of the endogenous gene of (b).
  • the endogenous gene of (b) there is a mutation that causes the function suppression of the endogenous gene of (b).
  • the endogenous gene of (b) does not have a mutation that causes the function suppression of the endogenous gene of (a).
  • Boombaceae plant refers to whole individuals (eg, adults, seedlings and seeds), tissues (eg, leaves, stems, flowers, roots, reproductive organs, embryos and parts thereof, etc. ), And these dried products.
  • the above-mentioned plant of the genus Tobacco is not particularly limited as long as it is a plant belonging to the genus Tobacco (Nicotiana). acuminata var. Multzjlora), Nicotiana africana, Nicotiana alata, Nicotiana amplexicaulis, Nicotiana arentsii, Nicotiana arentsii, Nicotiana arentsii ⁇ Benavidesii, Nicotiana benavidesii, Nicotiana benthamiana, Nicotiana bigerovii, Nicotiana bonariensis, Nicotiana bonariensis, Nicotiana bonariensis, Nicotiana bonariensis, Nicotiana cavicola, Nicotiana cavicola, Nicotiana cavicola ⁇ Cordifolia, Nicotiana cordifolia, Nicotiana corymbosa, Nicotiana debneyi, Nicotiana excelsior, Nicotiana forgetiana, Nicotiana fragrans, Nicotiana fragrance Nicotian
  • the alkaloid content in the plant of the genus Nicotiana according to one embodiment of the present invention is lower than that of the wild-type plant of the genus Nicotiana.
  • a "wild-type plant of the genus Nicotiana” is a plant of the genus Nicotiana in which the AO2 gene present in its genome is functioning normally.
  • the "wild-type plant of the genus Tobacco” is preferably a plant of the genus Tobacco in which the AO2 gene and the AO1 gene present in the genome are normally functioning.
  • the AO2 gene (and AO1 gene) is functioning normally means that the factor that suppresses the expression of the AO2 gene (and AO1 gene) has not been introduced into the genome and is mutated to the AO2 gene (and AO1 gene). Means that you do not have.
  • the "wild-type plant of the genus Tobacco” is, for example, Nicotiana silvestris, which contains polynucleotide 1 as a part (coding region) of the AO2 gene in the genome, or polynucleotide 2a and polynucleotide 2b. Each of these is Nicotiana tabacum, which is included in the genome as part of the AO2 gene.
  • the Nicotiana sylvestris preferably contains polynucleotide 3 in its genome as part of the AO1 gene. It is preferable that the Nicotiana tabacum contains each of the polynucleotides 4a and 4b in the genome as a part of the AO1 gene.
  • Polynucleotide encoding a polypeptide having the same Polynucleotide 4a encoding the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62: Polynucleotide 4b encoding the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 63: Sequence It encodes a polypeptide having the amino acid sequence according to number 64.
  • alkaloids generally refers to a basic organic compound containing a nitrogen atom.
  • alkaloids refer to alkaloids produced in the genus Nicotiana, specifically alkaloids include nicotine, nornicotine, anatabine, anabasine and myosmine. Nicotine accumulates as the major alkaloid in Nicotiana tabacum. On the other hand, for some Nicotiana tabacum and Nicotiana sylvestris, nicotine is accumulated during growth, but nicotine is converted to nornicotine during leaf aging and drying. As used herein, alkaloids may refer to the major alkaloids nicotine and nornicotine.
  • alkaloid content refers to the content of alkaloids in plants of the genus Nicotiana. Alkaloid content is usually expressed in% by weight relative to dried leaves (dried leaves). "Low alkaloid content” means an alkaloid content that is reduced compared to the alkaloid content in wild-type plants of the genus Nicotiana. Low alkaloid content or reduced alkaloid content is, for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 9% or less, 8% or less of the alkaloid content in wild-type plants of the genus Tobacco.
  • the low or reduced alkaloid content is, for example, 2.5% or less, 2% or less, 1.5% or less, 1% or less, preferably 0.5% or less, of the dry leaf weight of the plant of the genus Tobacco. 0.4% or less, 0.3% or less, 0.2% or less, 0.1% or less, 0.08% or less, 0.06% or less, 0.04% or less, 0.02% or less, 0. It is 01% or less.
  • Nornicotine among alkaloids can be easily measured, for example, by spraying an isatin solution containing 2,3-indolindione on a filter paper obtained by blotting a leaf extract and then heating it.
  • individual alkaloids can be quantified, such as by gas chromatography / mass spectrometry (GC-MS) analysis.
  • GC-MS gas chromatography / mass spectrometry
  • AO1 and AO2 may be present in plants belonging to the genus Nicotiana, and it is clear that AO2 is expressed in a root-specific manner. And was suggested to be involved in nicotine biosynthesis (Xu, S. et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114: 6133-6138; Kajikawa, M. et al. (2017) ) Plant physiology, 174: 999-1011). On the other hand, AO1 is constitutively expressed in the whole plant.
  • AO oxidizing aspartic acid to produce imino aspartic acid.
  • the enzyme activity can be measured by a known method (Hao et al. (2008) Plant Science 271: 133-142).
  • AO is an important enzyme in the body involved in the metabolism of nicotinic acid and nicotinamide, and it is known that disruption of the AO gene in Arabidopsis thaliana exhibits embryonic lethality (Katoh, A. et). al. (2006) Plant Physiology 141: 851-857).
  • the plant of the genus Nicotiana according to the present embodiment has been realized based on the findings by the present inventors that the content of alkaloids such as nicotine and nornicotine is reduced by suppressing the function of the AO2 gene.
  • suppression of AO gene function may cause various abnormalities or lethality in plants, so the effect of AO gene mutation on the production of alkaloids such as nicotine has not been studied so far. ..
  • suppression of the function of an endogenous gene means a state in which a gene on the genome does not exert its original function. Therefore, “suppression of function of an endogenous gene” means “mutation of an endogenous gene”, “disruption of an endogenous gene”, and suppression of expression of the "endogenous gene” by other than the endogenous gene (including a foreign gene). Is a term that includes.
  • specifically inducing function suppression means suppressing only the function of the target gene without suppressing the function other than the target gene. For example, it is desirable to avoid causing functional suppression of the AO1 gene or causing metabolic disorders by suppressing the function of a plurality of genes under the control of the same transcription factor.
  • Nicotiana tabacum is a diploid, genome derived from the parent plant Nicotiana sylvestris (also referred to as the "S genome”) and Nicotiana tomento. It has a genome (also referred to as "T genome”) derived from Siformis (Nicotiana tomentosiformis).
  • S genome the parent plant Nicotiana sylvestris
  • T genome a genome derived from Siformis (Nicotiana tomentosiformis).
  • the function of the aspartate oxidase gene on both the S genome and the T genome may be specifically suppressed, but the function of the aspartate oxidase gene on either the S genome or the T genome is specific. May be suppressed.
  • specific functional suppression suppresses only the function of the aspartate oxidase gene on one of the S and T genomes without suppressing the function of the aspartate oxidase gene on the other genome.
  • “Mutation of an endogenous gene” is a mutation in a gene that does not produce the original functional polypeptide (decreased or deleted function), or a gene in which a functional polypeptide is produced but the amount produced is reduced. It means a mutation or a mutation in a gene that produces a functional polypeptide but reduces the stability of the polypeptide.
  • “Disruption of an endogenous gene” means that the gene that is inherent in the genome does not exist, or that no transcript is produced from the gene that is on the genome.
  • “suppression of expression of an endogenous gene” the base of the endogenous gene is not changed, but the transcription or translation function of the gene (from transcription to mRNA to subsequent translation into a polypeptide) is another factor. It means a state in which the amount of polypeptide produced is reduced or no polypeptide is produced due to modification via.
  • “Suppression of expression of an endogenous gene” can occur, for example, by degradation of mRNA transcribed from the endogenous
  • mutant has the meaning commonly understood in the art to which this application belongs, eg, in a base on the wild-type genome, or in a wild-type polypeptide. It means any change in an amino acid residue (eg, substitution, deletion, insertion, addition, duplication, inversion or translocation, etc.). Therefore, “mutation of endogenous gene” is a mutation of a gene that does not produce the original functional polypeptide (including a mutation that produces a polypeptide with reduced or deficient function), or a polypeptide is produced.
  • genes genes that produce less, but mutations in genes that produce polypeptides but reduce the stability of the polypeptide, genes (genome DNA sequences containing coding or untranslated regions) It means a loss of a gene, or a mutation in which transcription from a gene is suppressed (such as a deletion of a transcription control region or a transcription initiation region).
  • the promoter sequence including the sequence upstream (5'side) with respect to the coding region) and the terminator sequence (sequence downstream (3'side) with respect to the coding region). 5'untranslated and 3'untranslated regions, conserved sequences at both ends of the intron (eg, GT at the 5'end and AG at the 3'end), and at least one of the coding regions. Can exist.
  • substitutions in the promoter sequence of a gene, the nucleotide sequences important for gene expression regulation in the 5'untranslated region and the 3'untranslated region reduce the transcriptional activity of the gene or stabilize the transcript from the gene. causess a decrease in sex. Any of these reductions can result in a reduction in translation products with a reduction in transcripts from the above genes.
  • Substitutions (splice mutations) in the above conserved sequences of introns cause abnormal splicing of mRNA, resulting in abnormal mRNA with unwanted introns added or inserted. Abnormal mRNAs either give rise to abnormal translation products or do not terminate translation, for example by frameshifting.
  • the substitution in the coding region is a missense mutation (causing a decrease in the abundance of the wild-type polypeptide)
  • the substitution causes an amino acid different from the original amino acid, so that the polypeptide having a reduced or deleted original function is selected. Can occur.
  • substitutions in the code area can result in incomplete length translations or translations that do not maintain their original function. Incomplete-length translations result from the conversion of amino acid-encoding codons to stop codons (nonsense mutations) by the substitution.
  • the incomplete length translation product lacks one or more consecutive amino acid residues containing the C-terminal amino acid residue as compared to the original translation product.
  • the nonsense mutation occurs at an arbitrary codon upstream of the original stop codon, and is preferably upstream of one or more codons. Therefore, translation products from genes with nonsense mutations are incompletely long. Translation products that impair their original function are produced by amino acid substitutions. In this case, the amount of transcript may be comparable to that of wild-type plants.
  • the translation product has a change in three-dimensional structure or a decrease in function as a functional domain.
  • One preferred embodiment of the mutation of the present invention is an amino acid substitution that results in a translation product that impairs such original function.
  • the amino acid substitutions are preferably non-conservative substitutions that have a high potential to alter the function of the translation product.
  • Non-conservative substitutions are substitutions with amino acids of different charge or hydrophobicity (eg, basic amino acids to acidic amino acids, basic or acidic amino acids to neutral amino acids, neutral amino acids to basic or acidic amino acids, polar amino acids to non-polar amino acids. Substitution with polar amino acids) and substitution with amino acids having side chains with different bulks (three-dimensional size).
  • nonsense-mediated mRNA decay (Brogna and Wen (2009) Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107- 113) can occur.
  • Nonsense-mediated mRNA decay causes transcription degradation, so nonsense mutations can result in reduced transcript volume.
  • the AO2 gene of the wild-type Bemisia tabaci consists of 7 exons and 6 introns. Therefore, a preferred embodiment of a nonsense mutation that results in a nonsense-mediated mRNA decay is that at least one nonsense mutation is present in the first to sixth exons of the AO2 gene.
  • mutations other than substitutions occur within the promoter sequence, the 5'untranslated region and / or the 3'untranslated region, transcription due to reduced transcriptional activity or stability, similar to substitution. A reduction in product volume and a reduction in the amount of polypeptide can occur as a result. Mutations other than substitutions of introns on conserved sequences can also result in translation of polypeptides having a different amino acid sequence than the original, as well as substitutions. Mutations other than substitutions in the coding region also have different amino acid sequences due to deletions or insertions of amino acid residues (caused by deletions or insertions of successive bases in multiples of 3), or frameshifts. It can result in a translation of the polypeptide that is present. Also, a large deletion containing the entire gene or insertion of a large fragment into the gene can result in loss of expression of the gene itself.
  • the mutation or disruption of the gene occurs as a result of, for example, natural mutation, mutagen treatment, gene recombination, genome editing or gene knockout.
  • Spontaneous mutations in the genes are commonly caused by replication errors and gene damage.
  • the cause of the damage is exposure to a known naturally occurring mutagen (eg, radiation, ultraviolet light, etc.).
  • the mutagen treatment of the gene can be carried out by artificially acting the mutagen on a plant of the genus Tobacco (and optionally in combination with suppression of gene repair function).
  • EMS ethylmethanesulfonic acid
  • sodium azide sodium azide
  • ethidium bromide sodium azide
  • nitrite nitrite
  • mutagens include ⁇ -rays, heavy ion beams, X-rays, neutron rays, UVs, etc., but are limited to radiations that cause mutations in the genomic DNA of plants of the genus Tobacco. Not done.
  • the mutagen is preferably EMS. These methods are preferable from the viewpoint that it is not necessary to add an extrinsic factor to the target plant.
  • Recombination of the above gene can be carried out by homologously recombining a part or all of the target gene with a recombination sequence according to a known gene recombination method.
  • Genome editing of the above genes can be performed by known techniques (eg, zinc-finger nucleases: ZFN, transcription activator-like effector nucleases: TALEN, and CRISPR / Cas9 system).
  • the above gene knockout can be performed by inserting a known transposon (mobility genetic factor), T-DNA, or the like.
  • the guide RNA and Cas9 protein can be edited, and in TALEN and ZFN, the fusion protein (where the DNA binding domain and nuclease are fused) is present in the target cell, and the genome can be edited. Therefore, the guide RNA and Cas9 protein, as well as the fusion protein, can all be introduced directly into the target cell. Examples of methods for directly introducing these into target cells include a PEG method, an electroporation method, and a particle bombardment method.
  • a vector into which a construct (including a polynucleotide encoding a guide RNA and Cas9 protein, and an arbitrary promoter and / or terminator) is inserted is introduced into target cells and tissues via Agrobacterium or the like. May be good.
  • the complementary sequence of the nucleotide sequence immediately upstream of XGG on the genome forms a base pair with a part of the guide RNA, and the double-stranded genomic DNA in the nucleotide sequence is formed by Cas9. Get disconnected.
  • each of the pair of DNA-binding domains of the artificial nuclease that forms a dimer binds to a nucleotide sequence that exists at both ends of the FokI cleavage domain via a spacer of 5 to 20 bases.
  • the nucleotide sequence resides on one strand and the other strand of double-stranded genomic DNA, so that one of the pair of DNA-binding domains binds to that one strand and the other to that other strand.
  • the DNA binding domain is composed of a number of modules corresponding to the number of bases to be bound, with 33 to 34 amino acid residues as a repeating unit (module).
  • each of the pair of DNA-binding domains of artificial nucleases that form dimers binds to nucleotide sequences that are present at both ends of the FokI cleavage domain via spacers of 5 to 20 bases.
  • the DNA binding domain is composed of a plurality of zinc finger modules.
  • EMS-treated substitutions of nucleotides in the AO2 gene include, for example, (I) frameshift mutations, (II) nonsense mutations (essentially deleting N-terminal amino acid residues), (III) splice mutations. Or (IV) cause a nonsense mutation. This is because the EMS treatment tends to cause specific nucleotide changes (C ⁇ T substitution and G ⁇ A substitution) in the DNA.
  • the above (I) and (II) occur, for example, as a result of G ⁇ A substitution (disappearance of the start codon) of the start codon ATG encoding 1st methionine.
  • the G ⁇ A substitution can occur, for example, at position 3003 (both G) in SEQ ID NOs: 35 to 37.
  • the loss of the start codon results in (I) when there is an ATG starting at the 3n + 0 or 2-position (n is an integer) of the coding region.
  • the loss of the start codon results in (II) when there is an ATG starting at the 3n + 1 position (n is an integer) in the coding region.
  • the above (III) is, for example, 3135, 3477, 3842, 3933, 4177, 4266, 4324, 4408, 4490, 4778, 4841 and 5069 in SEQ ID NO: 35; 3135, 3478, 3843, 3934, 4178, 4267, 4325, 4409, 4491, 4779, 4842 and 5071 in SEQ ID NO: 36; and 3135, 3278 in SEQ ID NO: 37. , 3634, 3733, 3977, 4078, 4136, 4236, 4318, 4747, 4810 and 5032 (all are conserved sequences of the above-mentioned introns). It occurs in the AO2 gene causing the A substitution.
  • the location where (IV) occurs is one or more of the locations shown in (IVa), (IVc) and (IVe). In certain embodiments, the location where (IV) occurs is one or more of the locations shown in (IVa) and (IVb). In a particular embodiment, the position where the above (IV) occurs is preferably one or more positions shown in (IVa). In other particular embodiments, the location where (IV) occurs is one or more of the locations shown in (IVc) and (IVd). In the other specific embodiment, the position where the above (IV) occurs is preferably one or more positions shown in (IVc). In yet another particular embodiment, the location where (IV) occurs is one or more of the locations shown in (IVe) and (IVf). In the further other specific embodiment, the position where the above (IV) occurs is preferably one or more positions shown in (IVe).
  • the mutation can be one or more of the following mutations present in the coding region of the AO2 gene on the genome of a wild-type plant of the genus Tobacco.
  • the coding region is a region encoding an AO2 protein having 95% or more sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • the AO2 protein has aspartate oxidase activity.
  • the various mutations described above can be easily introduced into plants of the genus Nicotiana by those skilled in the art. That is, based on these sequence information, the region into which the mutation should be introduced, which exists in the genomes of various plants of the genus Nicotiana included in the concept of the present invention, can be appropriately determined.
  • Mutation or disruption of a gene can be determined by detection of the presence or absence of mutations in the gene.
  • a method for detecting a mutation in a gene (1) a method of directly decoding a DNA base sequence using a commercially available sequencer or the like after amplifying the DNA sequence containing the mutation by PCR or the like, and (2) SCSP (Single).
  • SCSP Single-Single
  • a method of detecting the presence or absence of a mutation by cleaving a mismatch site using the method (5) a CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) method in which the presence or absence of a mutation can be determined from the presence or absence of cleavage by restriction enzyme treatment, (6) intentionally mismatching By using a primer set containing A method of determining the presence or absence of a mutation by detecting whether or not it is present (PCR method using a TaqMan probe), (8) Single nucleotide extension using a primer adjacent to the mutation, and the difference in mass of the incorporated bases There are methods for detecting the presence or absence of mutations (MassARRAY analysis method), (9) methods for detecting mutations from differences in the mobility of electrophoresis in the case of deletion or insertion, but methods for determining the presence or absence of mutations.
  • CAPS Cosmetic Amplified Polymorphic Sequence
  • mutation or disruption of a gene can be determined by comparing the size and expression of the protein resulting from the modification of the gene with those of the wild-type protein. Specifically, such a comparison can be made, for example, by performing Western blotting.
  • the mutation or disruption can be analyzed by the "MutMap method".
  • the MutMap method is a method for identifying the causative gene region of a mutant by combining bulk segregant analysis (BSA) and whole genome sequencing (WGS) (Abe, A. et al). ., Nat. Biotechnol., 30 (2): 174-178 (2012)).
  • BSA bulk segregant analysis
  • WGS whole genome sequencing
  • MutMap method first, a mutant line (> M2) having a desired trait is crossed with a parent variety (original line) used for mutagen treatment to obtain an F1 generation, and then an F1 individual is self-propagated. Get the F2 generation.
  • the traits obtained by mutation are often considered recessive. Therefore, the F1 generation phenotype should be wild-type, and the F2 generation phenotype should have a 3: 1 wild-type: mutant phenotype.
  • the MutMap method has been mainly used for gene analysis of rice with a relatively small genome size so far.
  • the present invention has shown that the MutMap method can also be applied to gene analysis of organisms having a relatively large genome size, such as plants of the genus Nicotiana.
  • Nicotiana tabacum is a diploid, and the genome (also referred to as "S genome”) derived from the parent plant Nicotiana sylvestris and Nicotiana sylvestris It has both a genome (also referred to as "T genome”) derived from Formis (Nicotiana tomentosiformis).
  • S genome the genome derived from the parent plant Nicotiana sylvestris and Nicotiana sylvestris It has both a genome (also referred to as "T genome”) derived from Formis (Nicotiana tomentosiformis).
  • Nicotiana tabacum genes represented by the same name are almost always present in the S and T genomes, respectively.
  • the mutant may have the mutation in either the S or T genome. Both the S and T genomes may have the mutations described above.
  • the mutation for deleting the function may have one type of mutation in one gene, or may have a plurality of mutations, and the type of mutation does not matter.
  • mutations may be present in any or all of a total of four alleles, two in each of the S and T genomes, and if mutations are present in multiple alleles, these.
  • the mutations may be the same or different.
  • Suppression of the expression of the gene includes suppression of transcription from the gene to mRNA, suppression of translation of the gene into mRNA via mRNA (for example, degradation of the mRNA), and suppression of the function of the translated polypeptide. Includes. Degradation of mRNA can occur from the above nonsense-mediated mRNA decay. Suppression of transcription can be realized by inhibition of a transcription factor that promotes transcription from the gene, inhibition of access of the transcription initiation factor to the gene, and the like. Translational repression can be achieved using antisense RNA molecules, RNAi molecules, or co-suppressive molecules. Suppression of the function of a polypeptide can be achieved by molecules that inhibit the function of the polypeptide by binding to a functional polypeptide (eg, decoy nucleic acids, ribozymes, antibodies and inhibitory peptides).
  • a functional polypeptide eg, decoy nucleic acids, ribozymes, antibodies and inhibitory peptides.
  • a vector used for transformation of a plant belonging to the genus Tobacco for the purpose of suppressing gene expression or introducing a mutation into a gene a vector capable of expressing a polynucleotide inserted in the vector in a plant cell is possible. If so, it is not particularly limited.
  • the vector for example, pBI-based, pPZP-based, and pSMA-based vectors capable of introducing the desired polynucleotide into plant cells via Agrobacterium are preferably used.
  • plasmids of binary vector systems pBIG, pBIN19, pBI101, pBI121, pPZP202, etc. are preferred.
  • the trigger sequence used to suppress the expression of the target gene by RNAi is inserted into the above vector.
  • the trigger sequence may be, for example, a portion of a polynucleotide (which may have a 0.1-1% substitution) encoding a polynucleotide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, 5 or 6.
  • At least 21-30 contiguous bases that are part of a polynucleotide having SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 35, 36 or 37 (eg,)
  • Polynucleotides (21 bases or more, 22 bases or more, 23 bases or more, 24 bases or more, 25 bases or more, 26 bases or more, 27 bases or more, 28 bases or more, 29 bases or more, and 30 bases or more)
  • the sense RNA portion and the polynucleotide shown in the base sequence complementary to the polynucleotide (antisense RNA portion).
  • the above-mentioned "consecutive at least 21 to 30 bases” base sequence includes continuous 21 bases or more, 23 bases or more, 25 bases or more, 30 bases or more, 35 bases or more, 40 bases or more, 45 bases or more. , 50 bases or more, 60 bases or more, 70 bases or more, 80 bases or more, 90 bases or more, or 100 bases or more.
  • the "trigger sequence” is not a portion of a polynucleotide having SEQ ID NOs: 68-70 or a complementary strand thereof.
  • the above-mentioned inhibition is, for example, the direct introduction of a molecule for achieving the inhibition into the plant, or the introduction of a nucleic acid molecule encoding the molecule into the plant. It can be realized by (transformation of plant body).
  • the nucleic acid molecule is integrated into one or more arbitrary regions in the plant's genome.
  • the nucleic acid molecule need not be integrated into both the S and T genomes as a result of plant transformation, as long as the suppression is achieved.
  • the above-mentioned suppression of function may be a decrease in the amount of translation of the polypeptide which is an expression product of the above-mentioned gene as compared with the wild-type plant.
  • Translation of a polypeptide is due to a decrease in mRNA (due to the instability of the mRNA itself, the abundance of mRNA such as accelerated degradation of mRNA or suppression of mRNA transcription) or a decrease in the amount of translation from mRNA (translation component (translation component (translation component)). It is caused by deficiency of tRNA and ribosome), inhibition of recruitment, functional deficiency, etc.).
  • the above-mentioned suppression of function may be a decrease in the amount of transcription of mRNA from the above-mentioned endogenous gene as compared with the wild-type plant.
  • the decrease in the amount of transcription of mRNA is caused, for example, by the suppression of transcription from an endogenous gene into mRNA.
  • Suppression of transcription can be realized by inhibition of access of the transcription initiation factor to the endogenous gene, which occurs as a result of introduction of a mutation into the endogenous gene.
  • the above-mentioned suppression of function may promote the degradation of mRNA transcribed from the above-mentioned endogenous gene.
  • Degradation of mRNA results in abnormal mRNA production (causing nonsense-mediated mRNA decay), the presence of foreign factors that degrade mRNA, activation of endogenous components that degrade mRNA, or the presence of degradation-promoting sequences in mRNA. Can be caused by such.
  • the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene is promoted in the plant of the genus Nicotiana, the amount of the mRNA in the plant of the genus Nicotiana is reduced.
  • the suppression of function may be a decrease in the amount of mRNA transcribed from the endogenous gene as compared with the wild-type plant.
  • “decrease in the abundance of mRNA transcribed from an endogenous gene” is 70% or less, 60% or less, 50% or less, based on the abundance of a transcript of the endogenous gene in a wild-type plant. It means the presence of 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 1% or less of the transcript.
  • the mutation may be the insertion of a polynucleotide expressing a factor that promotes the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene outside the region where the endogenous gene is present.
  • the factor may be an antisense RNA molecule, an RNAi molecule or a co-suppressing molecule.
  • the embodiment of the genus Nicotiana in which the above mutation is inserted outside the region where the above endogenous gene exists, can be replaced with the two (8) in the item (summary) immediately before the example.
  • SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of AO2 of Nicotiana silvestris (also referred to as "NsAO2" in the present specification), and SEQ ID NO: 5 is AO2 encoded by the S genome of Nicotiana tabacum ("NtAO2-" in the present specification.
  • SEQ ID NO: 6 shows the amino acid sequence of AO2 (also referred to as “NtAO2-T” in the present specification) encoded by the T genome of Nicotiana tabacum.
  • SEQ ID NO: 1 indicates the CDS sequence of the NsAO2 gene (encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 2).
  • SEQ ID NO: 35 is a genomic DNA sequence of the NsAO2 gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the coding region.
  • SEQ ID NO: 3 shows the CDS sequence of the NtAO2-S gene (encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 5).
  • SEQ ID NO: 36 is a genomic DNA sequence of the NtAO2-T gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the coding region.
  • SEQ ID NO: 4 shows the CDS sequence of the NtAO2-T gene (encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 6).
  • SEQ ID NO: 37 is a genomic DNA sequence of the NtAO2-T gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the coding region.
  • the plant belonging to the genus Tobacco is a poly encoding a polypeptide having 95% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5 or 6 and having aspartate oxidase activity.
  • the function of endogenous genes containing nucleotides as coding regions is suppressed.
  • the plant of the genus Tobacco has 95% or more (96%, 97%, 98%, 99% and 100%) sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62, 63 or 64.
  • the function of an endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polypeptide having aspartate oxidase activity as a coding region is not suppressed.
  • the coding region of one of the endogenous genes encodes a polypeptide having the sequence identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 62 or 63. ..
  • the coding region of the other endogenous gene encodes a polypeptide having the sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 64.
  • SEQ ID NO: 62 shows the amino acid sequence of AO1 (NsAO1) of Nicotiana sylvestris.
  • SEQ ID NO: 65 shows the CDS sequence of the NsAO1 gene (encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 62).
  • SEQ ID NO: 68 is a genomic DNA sequence of the NsAO1 gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 65 in the coding region.
  • SEQ ID NO: 63 shows the amino acid sequence of AO1 (NtAO1-S) encoded by the S genome of Nicotiana tabacum.
  • SEQ ID NO: 66 shows the CDS sequence of the NtAO1-S gene (encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 63).
  • SEQ ID NO: 69 is a genomic DNA sequence of the NtAO1-T gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 66 in the coding region.
  • SEQ ID NO: 64 shows the amino acid sequence of AO1 (NtAO1-T) encoded by the T genome of Nicotiana tabacum.
  • SEQ ID NO: 67 shows the CDS sequence of the NtAO1-T gene (encoding the amino acid shown in SEQ ID NO: 64).
  • SEQ ID NO: 70 is a genomic DNA sequence of the NtAO1-T gene containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 67 in the coding region.
  • sequence identity of amino acid sequence
  • sequence identity means the ratio of the referred (amino acid) sequence to the reference (amino acid) sequence.
  • mismatched portion of the sequence is the portion where substitutions, additions, deletions or insertions (of amino acid residues) are present.
  • polypeptide having 95% or more sequence identity with respect to the amino acid sequence shown in for specifying the polypeptide using the amino acid sequence described in the sequence listing is usually used for plants of the genus Tobacco. It may be an existing polypeptide. As used herein, “polypeptide” and “protein” have substantially the same meaning and can be used interchangeably.
  • the specific polypeptide whose abundance is reduced in the plant of the genus Tobacco according to the present invention is a polypeptide having 95% or more sequence identity with each amino acid sequence shown in the sequence listing.
  • the sequence identity is preferably higher (eg, 96%, 97%, 98%, or 99% or higher).
  • the "decrease in abundance" of a polypeptide is 70% or less, 60% or less, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less based on the abundance of wild-type polypeptide. It means the presence of 5% or less, or 1% or less of the polypeptide.
  • the abundance of the polypeptide based on the abundance of the wild-type polypeptide can be appropriately selected from the above-mentioned values that result in low alkaloid content in plants of the genus Tobacco.
  • the decrease in the abundance of the above-mentioned polypeptide in the plant of the genus Nicotiana according to the present invention is genetically stable in cultured cells, callus, protoplasts, seeds, and progeny obtained from the plant of the genus Nicotiana. It is preferable that it is inherited. Therefore, the plant of the genus Nicotiana according to the present invention can be an individual generated from cultured cells, callus, protoplasts, seeds, and offspring generated through artificial manipulation, and these materials for obtaining the individual. Is included in the scope of the present invention.
  • the plant of the genus Nicotiana according to the present invention can further include the breeding progeny obtained by mating.
  • Many plant species, including rice, wheat, barley, and soybean are bred using mutants.
  • a mutant isolated from a mutagen-treated mutant population has a large number of mutations in addition to the gene of interest. Therefore, backcrossing is generally performed to remove extra mutations.
  • backcrossing is generally performed to remove extra mutations.
  • a cultivar having excellent traits a cultivar having higher added value can be obtained by introducing the trait possessed by the mutant into the cultivar. Since the traits of the mutants are derived from the mutations, it is necessary to select individuals with the mutations in order to proceed with backcrossing.
  • a method for easily detecting the presence or absence of mutation and whether the mutation is homozygous or heterozygous is required. This method can be performed by using the method for detecting a mutation described later.
  • MAS Marker Assisted Selection
  • a background marker showing a polymorphism between the mutant and the cultivar it is possible to efficiently obtain a line having a high return rate to the cultivar with a small number of crosses. Can be done.
  • polymorphic marker SNP and SSR (Simple Sequence Repeat) known for tobacco can be used. If necessary, a new polymorphism marker can be obtained and used by decoding the genome sequence of the tobacco to be used and identifying the difference in the base sequence and the difference in the number of repetitive sequences.
  • the tobacco genus plant comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, 5 or 6, and aspartate oxidase.
  • the function of an endogenous gene containing a polynucleotide encoding an active polypeptide as a coding region is suppressed.
  • the number of amino acids deleted, substituted or added in each amino acid sequence is, for example, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, 1 to 10, 1 to 1. 9 pieces, 1-8 pieces, 1-7 pieces, 1-6 pieces, 1-5 pieces, 1-4 pieces, 1-3 pieces, 1-2 pieces, or 1 piece.
  • SEQ ID NOs: 1, 3 and 4 are encoded by AO2 (NsAO2) of Nicotiana sylvestris, AO2 (NtAO2-S) encoded by the S genome of Nicotiana sylvestris, and T genome of Nicotiana sylvestris, respectively.
  • the coding region nucleotide sequence of AO2 (NtAO2-T) is shown.
  • a plant belonging to the genus Tobacco hybridizes with a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, 3 or 4 under stringent conditions. Moreover, the function of an endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having aspartic acid oxidase activity as a coding region is suppressed.
  • the stringent condition is a condition in which a double-stranded polynucleotide specific to a so-called nucleotide sequence is formed, but the formation of a non-specific double-stranded polynucleotide is significantly suppressed.
  • Tm value melting temperature
  • the temperature is 60 to 68 ° C., preferably 65 ° C., more preferably 68 ° C. in a buffer solution consisting of 0.25M Na2HPO4, pH7.2,7% SDS, 1 mM EDTA, 1 ⁇ Denhardt solution. Hybridize underneath for 16-24 hours and further in a buffer consisting of 20 mM Na2HPO4, pH 7.2, 1% SDS, 1 mM EDTA under conditions of temperature 60-68 ° C, preferably 65 ° C, more preferably 68 ° C. The condition that the washing for 15 minutes is performed twice can be mentioned.
  • Other examples include 25% formamide, under more severe conditions 50% formamide, 4 ⁇ SSC (sodium chloride / sodium citrate), 50 mM Hepes pH 7.0, 10 ⁇ Denhardt solution, 20 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA. After prehybridization in a hybridization solution at 42 ° C. overnight, a labeled probe is added and the mixture is kept warm at 42 ° C. overnight for hybridization.
  • the cleaning liquid and temperature conditions in the subsequent cleaning are about "1 x SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and the stricter conditions are about "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”.
  • One embodiment of the present invention is a step of introducing a mutation that specifically causes functional suppression of at least one of the endogenous genes (a) and (b) above into the endogenous gene in the genome of a plant of the genus Nicotiana.
  • a method for producing a plant belonging to the genus Nicotiana For details on the mutations introduced into the plants of the genus Nicotiana, see item [1. Tobacco plants].
  • an individual showing a desired phenotype may be further selected from a mutant population of a plant having a mutation.
  • selecting individuals a procedure for selecting a desired individual from a mutant population (panel) obtained when treated with a mutagen will be described.
  • Variants of functionally deficient plants of the genus Tobacco that have mutations in two alleles include, for example: Can be obtained by the method. As described above, plants of the genus Tobacco are treated with mutagens to prepare a mutant population (panel) in which mutations occur in the entire genome, and genomic DNA is extracted. Each gene-specific primer is used to amplify a target gene (polynucleotide) from the genomic DNA of the panel, determine the base sequence of the product, and select a strain having a homozygous mutation.
  • a strain (M2) having a homozygous mutation in each of the S genome and the T genome is obtained, and F1 is produced by crossing them. Further, the self-fertilized progeny (F2) is cultivated, and a strain having a homozygous mutation in both the S and T genomes is obtained from the breed. Regarding the acquisition of a mutant of a non-target plant of the genus Tobacco, which has a mutation in only one of the S genome and the T genome, no mutation has occurred in the gene on the non-target genome in the acquired M2. You just have to check.
  • the selection of individuals showing the desired phenotype may be performed by measuring the alkaloid content or measuring the aspartate oxidase activity.
  • the tobacco is treated with a mutagen such as EMS as described above to prepare a tobacco mutant population (panel) in which the entire tobacco genome is mutated. Extract genomic DNA.
  • the AO2 gene is amplified from each of the panel's genomic DNAs or from a pool of them, the nucleotide sequence of the product is determined, and homozygous mutations are included. Select the new strain. First, a line having a homozygous mutation in the S-type genome and a line having a homozygous mutation in the T-type genome are obtained, and F1 is produced by crossing them.
  • the self-fertilized progeny (F2) is bred, and a line containing homozygous mutations in both the S-type genome and the T-type genome is obtained from the strain (obtained with a probability of 1/16 due to two-factor recessiveness). ).
  • the method of the above embodiment may further include one or more steps. -The process of creating a tobacco mutant population (panel) that has mutated the entire tobacco genome, -Step of extracting genomic DNA from the strains included in the above panel, -Step of determining the base sequence of the AO2 gene in genomic DNA, -A step of selecting a line containing a homozygous mutation from the above panel, and-a step of confirming the alkaloid content in the above line.
  • the above line can be crossed with a line that has not been mutated at any time before the step of confirming the alkaloid content. Mating allows the elimination of mutations that may exist outside the AO2 gene.
  • the strain having a mutation in the AO2 gene can be backcrossed multiple times with a strain that has not been mutated (the original strain used to make the panel).
  • the genomic DNA from the tobacco mutant may be extracted based on a known method, and a commercially available extraction kit may be used.
  • the genomic DNA may be a crude product or a refined product that has undergone several purification steps.
  • the polynucleotide can be amplified by, for example, the PCR method, but it may also be performed by another known gene amplification method, for example, the LCR (ligase chain reaction) method or the LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplification) method.
  • LCR ligase chain reaction
  • LAMP Loop-Mediated Isothermal Amplification
  • the primer sequence for amplifying each polynucleotide can be designed from, for example, a base sequence. From the results of homology analysis between the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36 (genome sequence of S-type AO2 gene) and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 (genome sequence of T-type AO2 gene), first, the S-type specific region and T Find type-specific regions. By designing a primer in that region, the S-type and T-type AO2 genes can be specifically amplified from the extracted genomic DNA (including S-type and T-type), respectively.
  • the site to be designed can be selected from S-type or T-type specific regions, but is preferably an intron, 5'untranslated region or 3'untranslated region.
  • the length of the primer is preferably 15 to 30 bases, particularly preferably 17 to 25 bases.
  • the primer sequence may be designed based on the sequence of a region specific to the base sequence or a region common to both base sequences. It may also contain one or more substitutions, deletions, and / or additions in the sequence as long as it can function as a primer for amplifying the sequence of a predetermined number of bases including the mutation site.
  • the primer may be labeled with a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like, if necessary.
  • each polynucleotide to be amplified is not particularly limited as long as various detection methods described later can be used, but for example, it is 20 bases to 5000 bases, more preferably 50 bases to 2000 bases, and further preferably 100 bases. Bases to 700 bases, more preferably 100 bases to 500 bases.
  • One embodiment of the present invention provides a method for determining a plant of the genus Nicotiana with a low alkaloid content.
  • the determination method includes the following steps: The process of obtaining a sample by collecting a part of a plant belonging to the genus Nicotiana; Steps to detect mutations that specifically cause functional suppression of the endogenous gene on the genome contained in the sample; The process of determining as.
  • the suppression of the function results in a low alkaloid content in the plant of the genus Nicotiana. That is, the above determination method is used for a method for producing a plant belonging to the genus Nicotiana.
  • One embodiment of the present invention provides a method for breeding a plant belonging to the genus Nicotiana.
  • the method includes the step of mating a low alkaloid content Tobacco genus plant determined by the above determination method.
  • One embodiment of the present invention is the above-mentioned tobacco genus plant, the above-mentioned tobacco genus plant obtained by the above-mentioned production method, the above-mentioned tobacco genus plant determined by the above-mentioned determination method, or the above-mentioned tobacco genus plant obtained by the above-mentioned breeding method.
  • Providing breeding progeny obtained by mating offspring or plants of the genus Tobacco for example, in the case of Nicotiana sylvestris, suppression of the function of one AO2 gene alone results in extremely low nicotine content.
  • breeding by a single-factor recessive inheritance pattern using a mutation on the AO2 gene as a marker becomes possible, and the labor involved in breeding is significantly reduced as compared with the conventional case.
  • suppression of the function of two AO2 genes results in extremely low nicotine content. Therefore, breeding by a two-factor recessive inheritance pattern using mutations on the AO2-S gene and mutations on the AO2-T gene as markers is possible, and labor related to breeding is reduced as compared with the conventional case.
  • hyponicotineity is also brought about by suppressing the function of one AO2 gene
  • breeding by a single factor recessive inheritance using a mutation on the AO2-S gene or AO2-T gene as a marker becomes possible for breeding.
  • the labor involved is significantly reduced compared to the past.
  • mutants Many plant species are bred using mutants.
  • a mutant isolated from a mutant population treated with a mutagen has a large number of mutations in addition to the gene of interest. Therefore, backcrossing is generally performed to remove extra mutations.
  • backcrossing is generally performed to remove extra mutations.
  • the desired trait possessed by the mutant can be introduced into an existing cultivar.
  • the breeding progeny thus obtained can be a variety that gives high added value to an existing cultivar. At that time, the smaller the number of target mutations that result in low alkaloids, the smaller the number of mutations of interest, thus reducing the effort involved in backcrossing.
  • One embodiment of the present invention includes the above-mentioned tobacco genus plant, the above-mentioned tobacco genus plant obtained by the above-mentioned production method, the above-mentioned tobacco genus plant determined by the above-mentioned determination method, and the above-mentioned tobacco genus plant obtained by the above-mentioned breeding method.
  • leaf tobacco harvested from the above-mentioned offspring or posterity of breeding is provided.
  • Leaf tobacco refers to the leaves that are harvested from the genus Nicotiana and used in the production of tobacco products.
  • One embodiment of the present invention provides dried leaves (dried tobacco) obtained from the above-mentioned leaf tobacco.
  • Dried leaves are obtained by drying leaf tobacco. Any method can be used as the drying method, and examples thereof include, but are not limited to, natural drying, hot air drying, and hot air drying.
  • the dried leaf includes a cut filler, a powder, a sheet, a middle bone, a granule, and an extract obtained from the dried leaf.
  • Tobacco products can be in any form, for example, chopped tobacco, leaf-rolled tobacco, pipe tobacco, cigarettes, electronic tobacco, smokeless tobacco, snuff (including snooze, snuff), water tobacco, and generated by heating tobacco. Examples include, but are not limited to, non-combustion-heated tobacco products that use aerosol as an aerosol source, and non-heated tobacco products that suck the flavor of tobacco without heating it.
  • An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 as a coding region and Specificly suppresses the function of at least one of the endogenous genes containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 as a coding region.
  • a method for producing a plant belonging to the genus Nicotiana An endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 5 as a coding region, and SEQ ID NO: 6 A mutation that specifically causes suppression of the function of at least one of an endogenous gene containing a polynucleotide encoding a polynucleotide having 95% or more sequence identity to the amino acid sequence shown in A method for producing a tobacco genus plant, which comprises a step of introducing the substance into the genome of the tobacco genus plant.
  • the introduction step comprises inserting a polynucleotide expressing a factor that promotes the degradation of mRNA transcribed from the endogenous gene outside the region where the endogenous gene is present. 12) The production method according to any one of (15).
  • Nicotiana sylvestris is diploid, it is possible to observe the phenotype caused by the mutation of one gene in the M2 generation following the initial generation (M1 generation) in which the mutation occurred. Therefore, we prepared a Nicotiana sylvestris mutant library and attempted to obtain a low nicotine-producing mutant.
  • the seeds of Nicotiana sylvestris were treated with 0.6% EMS for 16 hours, and then washed with distilled water 8 times for 30 minutes each. The treated seeds were sown and the plants of the current generation (M1 generation) were cultivated. Self-fertilized seeds (M2 generation) were obtained from each line. About 200 or more seeds could be obtained from each of 4,945 EMS mutant Nicotiana sylvestris strains.
  • the main alkaloid of Nicotiana sylvestris is nornicotine.
  • nicotine is converted to nornicotine during aging and drying. Therefore, it was considered that by selecting the Nicotiana sylvestris mutants having decreased nornicotine-producing ability after aging and drying, a mutant having decreased nicotine, which is a precursor of nornicotine, could be obtained.
  • the leaves of greenhouse-grown seedlings in the 6th to 7th leaf stages were dried (aged) at 37 ° C. and humidity of 85% for 3 days to promote the conversion of nicotine to nornicotine.
  • a part of the treated leaf (tip 2 cm ⁇ 2 cm) was immersed in 30% NaOH containing 1% Tween-20 for several seconds to destroy the tissue, and then immersed in 0.4 mL chloroform for 1 hour to extract the content components. ..
  • a standard nornicotine content of 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, and 0.75% was prepared as an indicator in five stages to develop color. It was used as a standard of degree. These colors were defined as nornicotine index values (or nornicotine index) 1, 2, 3, 4, and 5, respectively. Those showing an index value of 1 were selected.
  • the leaves were grown in the field, the mature leaves one month after heart-holding were air-dried for one month, and then the leaf notches were subjected to minor alkaloid analysis (Beitr. Tabakforsch). . Int., 21: 369-379 (2005)), nicotine, nornicotine, anatabin, anabacin and myosmin were measured. The results are shown in Table 2.
  • the total amount of nicotine and nornicotine was 1.2% to 1.3% (12 to 13 mg / g dry leaves) per weight of dried leaves.
  • the total alkaloid content was less than 0.04% (0.4 mg / g dry leaves) in all low nicotine strains (Table 2).
  • Table 3 the ID of the SNIC system was assigned to each of the eight systems.
  • Example 2 characterization of SNIC system
  • Six of the eight SNIC strains obtained in Example 1 and control Nicotiana sylvestris were cultivated in the field. Twelve individuals were tested for each strain. The heart was stopped during the flowering period, and about 6 weeks later, the second leaf from the top was sampled from 3 individuals for each line. Air drying (1 cycle of 24 hours (30 ° C., humidity 75%, 16 hours ⁇ 22 ° C., humidity 85%, 8 hours) was repeated for 30 days (30 cycles)). Then, the middle bone was removed, and after freeze-drying, it was subjected to minor alkaloid analysis.
  • the total of the nicotine content and the nornicotine content of all SNIC strains was 0.04% (0.4 mg / g dry leaves) or less. This was less than 2.6% of the content (100%) in the control Nicotiana sylvestris (Table 4).
  • the total alkaloid content of the nicotine content, nornicotine content, anatabine content, and anabasine content of the SNIC strain was about 0.1% (1 mg / g dry leaf) or less.
  • the F1 strain was created by forward / reverse mating of all combinations except the combination with SNIC6 as the pollen parent (Fig. 1). Four individuals were raised in the greenhouse for each strain. The lower leaves of the individuals about 2 weeks after transplanting to the No. 3 pot 5 weeks after sowing were sampled and subjected to the above-mentioned simple nornicotine test.
  • the F1 generation was produced by crossing two strains of SNIC4 and SNIC7 with Nicotiana sylvestris, respectively, and further self-fertilized to obtain the F2 generation.
  • 96 F2 individuals were bred for each of the two strains, and a low alkaloid segregation ratio was confirmed (here, "alkaloid" is a general term for nicotine and nornicotine combined).
  • the lower leaves of individuals about 2 months after sowing were sampled and subjected to a simple nornicotine test, and individuals with a nornicotine index of 2 or less were transplanted to No. 4 pot. Approximately one week after transplanting to No. 4 pot, cardiac arrest was performed, and the lower leaves were further removed to leave only three upper leaves.
  • Topdressing was carried out 10 days after the heartbeat, and whole leaves were harvested 30 days later. The middle bone was then lyophilized and subjected to minor alkaloid analysis. If the nicotine concentration is low, CORESTA recommended method No. According to 62, nicotine was extracted from the chopped leaves and then measured using GC-MS.
  • alkaloid content As a result, there were 25 individuals with a total of nicotine content and nornicotine content (hereinafter, also referred to as "alkaloid content”) of 0.04% or less for the F2 generation derived from SNIC4 and 18 for the F2 generation derived from SNIC7.
  • alkaloid content a total of nicotine content and nornicotine content
  • SNIC4 As a result, there were 25 individuals with a total of nicotine content and nornicotine content (hereinafter, also referred to as "alkaloid content”) of 0.04% or less for the F2 generation derived from SNIC4 and 18 for the F2 generation derived from SNIC7.
  • Nsy1-1 to “Nsy1-5" show the results for the wild-type Nicotiana sylvestris strain used as a control.
  • Other individuals showed at least 2.3% alkaloid content. This confirmed a clear separation of alkaloid content.
  • the alkaloid content of F2 individuals showing low alkaloidity was 0.8 to 1.3% or less of that of wild-type Nicotiana sylvestris.
  • the F2 strain showing low alkaloidity grew normally like the wild-type Nicotiana sylvestris.
  • the "MutMap method” is a method for identifying the causative gene region of a mutant by combining bulk segregant analysis (BSA) and whole genome sequencing (WGS) (Abe, A. et al., Nat. Biotechnol., 30 (2): 174-178 (2012)).
  • BSA bulk segregant analysis
  • WGS whole genome sequencing
  • the MutMap method first, a mutant line having a desired trait is crossed with the parent variety used for the mutagen treatment to obtain an F1 generation, and further, an F1 individual is self-fertilized to obtain an F2 generation.
  • the traits obtained by the mutation are often attributed to recessive mutations. Therefore, the F1 generation phenotype should be wild-type, and the F2 generation phenotype should have a 3: 1 wild-type: mutant phenotype.
  • Genomic DNA was extracted from the Ethiolate-treated leaves of Nicotiana sylvestris according to the CTAB method. This genomic DNA was used for nucleotide sequence analysis using a next-generation sequencer to construct a genomic sequence, which was used as a reference genome.
  • the constructed reference genome was composed of 3,518 scaffolds, and the N50 was 48.7 Mb.
  • Roots (6 weeks after sowing: root 1, 1 week after heart-stopping: root 2), stems (1 week after flowering), leaves (6 weeks after sowing) from Nicotiana silvestris to predict the gene region in the reference genome.
  • Leaf 1, 1 week after flowering: Leaf 2, Maturity (40 days after heart-stopping): Leaf 3, Yellow Dry 2nd day: Leaf 4, Air-drying 3rd day: Leaf 5), Side bud, Flower (stem) Top: Flower 1, Bud: Flower 2, 1 day after flowering: Flower 3, 4 days after flowering: Flower 4), sprouted seeds, crows (root origin: crows 1, leaves origin: crows 2), a total of 16 types of organs RNA was extracted from (n 3) using RNeasy Plant Mini Kit (Kiagen) and used for RNA-seq by NextSeq500 (Illumina).
  • the prediction of the gene region was performed by mapping the RNA-seq read to the reference genome and combining the mechanical prediction and the CDS region prediction based on the protein sequence of a closely related plant.
  • the Nicotiana sylvestris genome sequence constructed above was used as the reference genome.
  • CDSID nsv1s000268m03938
  • AO L-aspartate oxidase
  • SNIC1 Substitution that causes a non-conservative amino acid substitution (Val ⁇ Glu) from a neutral amino acid to an acidic amino acid in the second exon (T ⁇ A at position 3756 of SEQ ID NO: 35);
  • SNIC2 Nonsense mutation in the 7th exon (C ⁇ T at position 5533 of SEQ ID NO: 35);
  • SNIC5 Splice mutation at the start of the 4th exon (G ⁇ A at position 4266 of SEQ ID NO: 35);
  • SNIC6 Substitution that causes a non-conservative amino acid substitution (Gly ⁇ Arg) from a neutral amino acid to a basic amino acid in the third exon (G ⁇ A at position 4033 of SEQ ID NO: 35).
  • Example 4 Characterization of Tobacco (Nicotiana) AO sequence
  • AO1 and AO2 are present in the genus Nicotiana.
  • AO2.1 Sol Genomics gene no. 19078
  • AO1 Sol Genomics gene no. 57190
  • the AO identified as the causative gene of the low alkaloid mutation of Nicotiana silvestris in Example 3 had 99.9% sequence identity with AO2.1 and 97.6% sequence with AO2.2. Since it was considered to be an AO2 gene because it showed identity and 93.1-93.5% sequence identity with AO1 (with multiple splicing variants), it is referred to as "NsAO2". However, since the length of the sequence of AO2.1 is only 1107bp, while the length of CDS of NsAO2 is as long as 1947bp, it is considered that AO2.1 is an incomplete sequence and NsAO2 is a complete sequence. rice field.
  • RNA-seq analysis performed using RNA obtained from various organs and stages of Nicotiana sylvestris showed that NsAO1 was expressed at low levels in all organs, whereas NsAO2 was root-specific. It was shown that it was strongly expressed (Fig. 2). Since nicotine biosynthesis takes place in the roots, it was suggested that NsAO2 contributes to nicotine biosynthesis.
  • the nucleotide sequence (CDS) of the coding region of the NsAO2 gene is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • CDS The nucleotide sequence of the coding region of the NsAO2 gene
  • amino acid sequence of the encoded protein is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the genes shown in Table 7 had 97% or more of the same sequence. It was a hit as a gene indicating sex. These were considered to be AO2 genes. In addition to these, genes with sequence identity in the 93% range were hit, but these were considered to be AO1.
  • amino acids shown in Table 8 were hit as amino acids showing 97% or more sequence identity. These were considered to be the amino acid sequences of AO2. In addition to these, amino acid sequences having a sequence identity in the 90% range were hit, but these were considered to be the amino acid sequences of AO1.
  • NtAO2-S The genome sequence of the tobacco (N. tabacum) variety "Tsukuba No. 1" was analyzed, and AO2 (NtAO2-S, ID: nttv1s110m00779, SEQ ID NO: 3) thought to be derived from the S genome and AO2 (SEQ ID NO: 3) thought to be derived from the T genome were analyzed.
  • NtAO2-T ID: nttv1s507m02461, SEQ ID NO: 4
  • Table 9 When the CDS sequences of NtAO2-S and NtAO2-T were subjected to a homology search against the NCBI database, the genes shown in Table 9 were hit. The homology was as high as 97% or more, and these were considered to be AO2 genes.
  • genes with homology in the 92-93% range were hit, but these were considered to be AO1 genes.
  • amino acid sequences of NtAO2-S and NtAO2-T SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively
  • amino acids shown in Table 10 were hit. The homology was as high as 96% or more, and these were considered to be the amino acid sequences of AO2.
  • genes with homology in the 90-92% range were hit, but these were considered to be the amino acid sequence of AO1.
  • Figure 3 shows the molecular phylogenetic tree of the AO amino acid sequence of plants of the genus Nicotiana drawn using the genetic information processing software Genetyx. Furthermore, AO genes (NtAO2-S, NtAO2-T, NtAO1-S, NtAO1-T) using RNA-seq data of RNA prepared from various organs of tobacco (N. tabacum) "Tsukuba No. 1" The expression profile is shown in FIG. Similar to Nicotiana sylvestris, tobacco AO1 (NtAO1-S, NtAO1-T) is constitutively weakly expressed throughout the plant, while AO2 (NtAO2-S, NtAO2-T) is root-specific. It was strongly expressed.
  • Example 5 Production of Nicotiana tabacum and Nicotiana sylvestris recombinants in which the function of AO2 is suppressed and analysis of the amount of alkaloids thereof]
  • 5-1 Plant recombination operation RNA was extracted from the roots of Nicotiana sylvestris seedlings using RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen), and PrimeScript (trademark) RT reagent Kit (Takara Bio Inc.) was used. The cDNA was synthesized. Using this cDNA as a template, two types of NsAO2 gene fragments (RNAi trigger sequences) were amplified using the primers shown in Table 11.
  • This gene fragment is a trigger sequence for RNAi designed to specifically target NsAO2 in Nicotiana sylvestris and both NtAO2-S and NtAO2-T in Nicotiana sylvestris.
  • PrimeSTAR registered trademark
  • Max DNA Polymerase Takara Bio Inc.
  • RNAi vector pSP231 (see International Publication No. 2011/102394) using GATEWAY (registered trademark) LR Cloning (registered trademark) II Enzyme Mix (Thermo Fisher Scientific). The insert was cloned into.
  • pSP231 is a binary vector based on pHellsgates12 (see Wesley et al., Plant J., 27: 581-590 (2001)) and contains the Green Fluorescence protein (GFP) gene.
  • RNAi sequence which has a pdk / cat intron sandwiched between inverted repeats of the trigger sequence, is driven by the cauliflower mosaic virus 35SRNA gene promoter. After cloning into pSP231, the RNAi trigger sequence and its orientation were confirmed and used as the final RNAi construct.
  • RNAi constructs with trigger sequences amplified using primer sets (SEQ ID NOs: 21 and 22) were introduced into Agrobacterium LBA4404 by electroporation. After confirming the presence of the RNAi trigger sequence in the obtained transformant Agrobacterium by PCR, the cultivar "Tsukuba No. 1" (N. tabacum) was transformed using the Agrobacterium (hereinafter referred to as "Tsukuba No. 1"). Described as "NtAO2-RNAi strain”). As a control, a transformant of Tsukuba No. 1 by Agrobacterium into which a pSP231 vector containing no trigger sequence was introduced (hereinafter referred to as "Empty line”) was produced.
  • Empty line a transformant of Tsukuba No. 1 by Agrobacterium into which a pSP231 vector containing no trigger sequence was introduced
  • Redifferentiated individuals resistant to kanamycin were obtained from callus obtained by infecting leaf sections with Agrobacterium and culturing on Linsmaier and Skoog (LS) medium containing kanamycin (50 ⁇ g / mL).
  • LS Linsmaier and Skoog
  • kanamycin 50 ⁇ g / mL
  • individuals in which GFP fluorescence could be confirmed on the entire leaf were cultivated in a plant box, and when they grew sufficiently in the plant box, they were transplanted to No. 3 pot. At the time of transplantation, a part of the leaves and roots of each individual was sampled, frozen in liquid nitrogen, and stored at ⁇ 80 ° C.
  • elf ⁇ elongation Factor-1 ⁇
  • Table 12 shows the sequences of the primers and probes used to detect each gene. Some of the primers and probes used to detect AO1 and AO2 are designed for the nucleotide sequence of the 3'untranslated region (UTR) of each gene.
  • UTR 3'untranslated region
  • FIG. 5 shows the amount of transcript of each system as a relative value with respect to the amount of transcript of Empty-12 (value 1 on the vertical axis).
  • AO2- (number) refers to the NtAO2-RNAi line
  • Empty- (number) refers to the control line
  • error bars represent measurement error (standard error between three iterations).
  • AO1 expression Constant, relatively low levels of expression in each tissue.
  • AO2 expression High levels of expression specific in the roots, and very low levels in other tissues. That is, by quantifying the transcripts (AO and AO2) in the roots of Nicotiana tabacum, it is possible to determine the decrease in the amount of AO2 transcripts in Nicotiana tabacum.
  • Table 13 shows some of the measured values for creating the graph of FIG.
  • a sufficient reduction of AO2 transcripts in the roots of Nicotiana tabacum means a sufficient reduction of AO2 transcripts in the tobacco genus plant (overall) (lower right of FIG. 5).
  • maintenance of the AO1 transcript in the leaves of plants of the genus Tobacco is a parenchyma of the off-target effect (non-specific reduction of the AO1 transcript by the RNAi construct above). It can be seen that it means non-existence (upper right of FIG. 5).
  • determination of the amount of AO transcript (both AO1 and AO2 transcripts) in the roots and leaves can supplement the above meaning (lower left and upper left in FIG.
  • the AO transcript amount of the leaves substantially represents the AO1 transcript amount and the root (AO2 transcript). This is because the amount of AO transcript (which accounts for the majority) substantially represents the amount of AO2 transcript.
  • Non-Patent Document 9 in an individual in which the AO2 (AO1 in the notation of Non-Patent Document 9) transcript is reduced (hereinafter referred to as "D9_AO2-RNAi”), spots occur in the lower leaves and aging occurs. It is stated that it has been accelerated. However, it was confirmed that all NtAO2-RNAi strains and control individuals were growing normally (the phenomenon described in Non-Patent Document 9 was not observed).
  • the tobacco genus plant produced in this example showed a decrease in the amount of AO2 transcript and a maintenance of the amount of AO1 transcript.
  • the plant of the genus Nicotiana grew normally (it did not show the above-mentioned phenomenon described in Non-Patent Document 9).
  • the plant of the genus Nicotiana showed a significantly reduced alkaloid content compared to the control. That is, it was found that the plants of the genus Tobacco, in which AO2 expression is specifically suppressed, exhibit useful traits for tobacco cultivation (decreased alkaloid content and normal growth).
  • Example 6 Creation of a tobacco mutant in which the function of AO2 is suppressed
  • Tobacco variants with mutations in AO2-S or AO2-T were obtained.
  • the nucleotide sequences of the NtAO2-S and NtAO2-T gene regions were analyzed for 2000 strains of tobacco mutants, and the mutations were identified. Specifically, each strain in which the mutant self-fertilized progeny seeds (M2 seeds) obtained for each M1 generation of 2000 tobacco mutants produced by EMS treatment of the seeds of the tobacco variety Tsukuba No. 1 were sown and cultivated. DNA extracted from 8 seedlings per seedling was bulked (Tajima et al., 2011 Annual Meeting of the Japanese Society of Plant Pathology, P234, production of tobacco mutant panel), and the nucleotide sequence was analyzed. The genomic sequences of the NtAO2-S and NtAO2-T gene regions are shown in SEQ ID NOs: 36 and 37, respectively.
  • one splice mutation (the 5'side of the third intron of the NtAO2-S gene is not normally spliced due to nucleotide substitution (G ⁇ A; position 4178 of SEQ ID NO: 36)) is the NtAO2-S gene. Homozygous in (NtAO2-s-3).
  • NtAO2-t-1 three strains having mutations in the NtAO2-T gene were obtained.
  • one nonsense mutation the codon encoding the 42nd glutamine (Q) of the NtAO2-T protein becomes a stop codon by nucleotide substitution (C ⁇ T; position 3124 of SEQ ID NO: 37)).
  • (Transformed) occurred homozygously in the NtAO2-T gene (NtAO2-t-1).
  • one nonsense mutation (the codon encoding the 48th tryptophan (W) of the NtAO2-T protein has been converted to a stop codon by nucleotide substitution (G ⁇ A; position 3288 of SEQ ID NO: 37)). (Transformed) occurred in a homozygous form in the NtAO2-T gene (NtAO2-t-2).
  • one splice mutation (the 3'side of the third intron of the NtAO2-T gene is not normally spliced due to nucleotide substitution (G ⁇ A; position 4078 of SEQ ID NO: 37)) is the NtAO2-T gene. Homozygous in (NtAO2-t-3).
  • the nicotine content lowering effect was investigated for each of the mutants of NtAO2-S or NtAO2-T of tobacco (N. tabacum).
  • the plant (mutant) was grown in a greenhouse, and 3 true leaves during the flowering period were sampled. It was dried at 70 ° C. for 8 hours, then ground and subjected to minor alkaloid analysis.
  • the nicotine contents of the two tobacco mutants in which the AO2 gene was not disrupted were 0.34% and 0.41% (0.38% on average).
  • the nicotine content of the two AO2-S mutants (NtAO2-s-2, NtAO2-s-1) was 0.10 and 0.16% (average 0.13%, 34% control).
  • the nicotine content of the AO2-T mutant (NtAO2-t-2) was 0.18% (47% of the control).
  • the anatabine content was 0.012% to 0.016% in the tobacco mutant in which the AO2 gene was not disrupted.
  • the percentage was 0.004% to 0.009%, which was about half.
  • the F1 generation was obtained by growing NtAO2-s-1 and NtAO2-t-1 in a greenhouse (24 ° C.) and mating them (NtAO2-F1-1).
  • the F1 generation was obtained by growing NtAO2-s-2 and NtAO2-t-2 in a greenhouse and mating them (NtAO2-F1-2).
  • NtAO2-F2-1 and NtAO2-F2-2 By growing each F1 generation in a greenhouse and self-propagating, two F2 generations derived from different mutant lines were obtained (NtAO2-F2-1 and NtAO2-F2-2).
  • PCR was performed to add the sequences (P7 sequence, P5 sequence and individual barcode sequence) used in the sequencing of the amplification product using iSeq 100 (Illumina) to the amplification product. Then, the amplification product to which the above sequence was added was subjected to sequencing using iSeq 100 (Illumina), and the genotype of each individual was confirmed.
  • NtAO2-sstt two pairs of individuals having homozygous mutations in NtAO2-S and NtAO2-T
  • NtAO2-SSTT individuals having no mutations in both genes
  • Each individual was transplanted into a 1/5000 Wagner pot and kept in mind during the flowering period.
  • Two true leaves (without topdressing) were collected from each individual after 3 weeks. Of the individuals after collecting the two true leaves, three individuals showing relatively good growth were selected for each genotype, and these were subjected to topdressing treatment. Specifically, all the leaves were removed except for the top three leaves, and 50 g of organic fertilizer Burley S625 (Seiwa Fertilizer Industry Co., Ltd.) for tobacco was applied. After about 3 weeks, all 3 leaves (with top dressing) were collected from each individual. The collected true leaves (without top dressing) and leaves (with top dressing) were each dried at 70 ° C. for 16 hours after removal of the middle bone, crushed, and subjected to minor alkaloid analysis.
  • Nicotine content in leaves without topdressing was significantly different (t-test, 1% level) between all alleles of AO2 with mutation (NtAO2-sstat) and no mutation (NtAO2-SSTT) in each of the two sets. , There is a significant difference) was observed.
  • the nicotine content (mean ⁇ standard deviation) in group NtAO2-F2-1 was mutated: below the detection limit and unmutated: 0.18% ⁇ 0.099%. rice field.
  • the nicotine content (mean ⁇ standard deviation) in group NtAO2-F2-2 was mutated: 0.01% ⁇ 0.02% and unmutated: 0.56% ⁇ . It was 0.286%.
  • Table 19 shows the nicotine content and the total alkaloid content (total amount of nicotine, nornicotine, anatabine, anabasine and myosmine) in the leaves with topdressing.
  • the nicotine content was 2.07 to 3.62% for NtAO2-F2-1 and 1.05 to 1.05 for NtAO2-F2-2 in the control NtAO2-SSTT. It was 3.22%.
  • NtAO2-sstat NtAO2-F2-1 was 0.01 to 0.02% and NtAO2-F2-2 was 0.01% in all three individuals (Table 19).
  • the total alkaloid content (total amount of nicotine, nornicotine, anatabine, anabasine and myosmine) was 2.29 to 4.13% for the control NtAO2-F2-1 and 1.20 to 3.20 for the NtAO2-F2-2. It was 74%.
  • NtAO2-sstat NtAO2-F2-1 was 0.01 to 0.02% and NtAO2-F2-2 was 0.01% in all three individuals (Table 19).
  • NtAO2-sstt had a nicotine content of 0.01 to 0.02%.
  • the plants of the genus Tobacco of this example which had mutations in all alleles of AO2 and did not have mutations in all alleles of AO1, grew normally.
  • the plant of the genus Nicotiana showed a significantly reduced alkaloid content compared to the control. That is, it was found that plants of the genus Nicotiana that do not express the functional AO2 protein exhibit useful traits for tobacco cultivation (decreased alkaloid content and normal growth).
  • NtAO1-S mutants having mutations in NtAO1-S 15 strains
  • NtAO1-T mutants having mutations in NtAO1-T (12 strains).
  • the DNA was used as a template, and PCR using a primer set was used to determine that it had a homozygous mutation.
  • KOD One registered trademark
  • TOYOBO PCR Master Mix
  • Table 20 shows the names of the mutants (lines 1-3: NtAO1-S mutant lineage, 4-6 lines: NtAO1-T mutant lineage), mutation types, and mutation determination (PCR). Summarize the primers used.
  • NtAO1-s-1 homozygously generated one nonsense mutation (change of one codon in the ORF to a stop codon) in the NtAO1-S gene.
  • the nonsense mutation is a nucleotide substitution (C ⁇ T) occurring at the codon encoding glutamine (Q) at position 41 of the wild-type NtAO1-S protein.
  • NtAO1-s-2 had one nonsense mutation homozygous in the NtAO1-S gene.
  • the nonsense mutation is a nucleotide substitution (C ⁇ T) occurring at the codon encoding glutamine (Q) at position 146 of the wild-type NtAO1-S protein.
  • NtAO1-s-3 had one nonsense mutation homozygous in the NtAO1-S gene.
  • the nonsense mutation is a nucleotide substitution (G ⁇ T) occurring at the codon encoding glycine (G) at position 277 in the wild-type NtAO1-S protein.
  • NtAO1-t-1 had one nonsense mutation homozygous in the NtAO1-T gene.
  • the nonsense mutation is a nucleotide substitution (G ⁇ A) occurring at the codon encoding tryptophan (W) at position 44 of the wild-type NtAO1-T protein.
  • NtAO1-t-2 had one nonsense mutation homozygous in the NtAO1-T gene.
  • the nonsense mutation is a nucleotide substitution (C ⁇ T) occurring at the codon encoding glutamine (Q) at position 61 of the wild-type NtAO1-T protein.
  • NtAO1-t-3 homozygously generated one splice mutation (nucleotide substitution causing splice abnormality) in the NtAO1-T gene.
  • the splice mutation is a nucleotide substitution (G ⁇ A) occurring at the 3'end of the second exon of the NtAO1-T gene.
  • the above mutants were grown in a greenhouse.
  • the F1 generation was obtained by crossing NtAO1-s-1 and NtAO1-t-1 (NtAO1-F1-1).
  • the F1 generation was obtained by crossing NtAO1-s-2 and NtAO1-t-2 (NtAO1-F1-2).
  • NtAO1-F2-1 and NtAO1-F2-2 Two F2 generations derived from different mutant lines were obtained (NtAO1-F2-1 and NtAO1-F2-2).
  • NtAO1-F2-1 and NtAO1-F2-2 individuals showing the following genotypes (1) to (5) (multiple individuals for each genotype) were potted in No. 3 pot. After confirming the genotype by PCR and Sanger sequence, the cells were grown in a greenhouse (24 ° C.) (Table 20). Table 21 shows the genotype and the number of the raised individuals.
  • NtAO1-ssTT An individual having a mutation in the NtAO1-S gene homozygously and having no mutation in the NtAO1-T gene.
  • NtAO1-SStt An individual (NtAO1-SStt) that does not have a mutation in the NtAO1-S gene and has a mutation in the NtAO1-T gene in a homozygous manner.
  • NtAO1-SStT An individual that does not have a mutation in the NtAO1-S gene and has a mutation in the NtAO1-T gene in a heterozygous manner, and (5) has a mutation in the NtAO1-S gene and the NtAO1-T gene. Individuals that do not (NtAO1-SSTT).
  • the raised individuals (alkaloid content and growth status) were evaluated as follows.
  • AO1 is an enzyme gene that is involved in the biosynthesis of NAD +, which is essential for life activities, and plays an important role in plant life activities. The importance of this role is clear from the fact that mutants in which the function of AO1 is disrupted are lethal, as described above. Therefore, it is considered that one or more mutant alleles present in the AO1 gene adversely affect the physiological state of the plant and cause abnormalities (such as the development of spots on leaves) that are not observed in individuals without mutations.
  • D9_AO2-RNAi of Non-Patent Document 9 A phenomenon similar to the above abnormality is also observed in D9_AO2-RNAi of Non-Patent Document 9.
  • D9_AO2-RNAi a decrease in the amount of AO transcript in the leaves (as described above, it is considered to substantially represent a decrease in the amount of AO1 transcript) is observed.
  • D9_AO2-RNAi suppresses the functions of both AO2 and AO1.
  • a plant of the genus Nicotiana with a low alkaloid content is provided.

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Abstract

本発明の一実施形態は、低アルカロイド含量のタバコ属植物体を提供する。タバコ属植物体では、アスパラギン酸オキシダーゼＡＯ２をコードする遺伝子の機能が抑制されている。

Description

低アルカロイド含量のタバコ属植物体およびその製造方法
　本発明は、低アルカロイド含量のタバコ属植物体およびその製造方法に関する。
　従来、タバコ（ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum））に低アルカロイド性をもたらす自然変異の遺伝子座として、Ｎｉｃ１およびＮｉｃ２遺伝子座が知られている。両遺伝子座にはそれぞれ、ニコチン生合成に関わる幾つかの転写因子等の遺伝子が存在する。ニコチンが低減するｎｉｃ１変異体およびｎｉｃ２変異体では、ゲノムに大きな欠失があり、それらの遺伝子がゲノム上から失われている。両遺伝子座の双方に変異をホモ接合で持つ場合、ニコチン含量は一般的なタバコ品種（１５～４５ｍｇ／ｇ）の１０％程度（２－４．５ｍｇ／ｇ乾葉）となる（非特許文献１）。これまでに、タバコにおけるニコチンなどのアルカロイド含量を低下させる種々の研究が報告されている。例えば非特許文献１には、ニコチンの生合成系の酵素ＱＰＴ、ＰＭＴ、ＢＢＬの遺伝子の機能抑制による低ニコチンタバコの作出例がまとめられており、これら遺伝子が機能抑制されたタバコにおけるニコチン含量はそれぞれ１．４ｍｇ／ｇ乾葉、０．６－２．２ｍｇ／ｇ乾葉、４．１－４．４ｍｇ／ｇ乾葉である。これらの遺伝子の中には、発現を抑制することによって奇形を生じる遺伝子（ＱＰＴ）も含まれている（非特許文献２）。一方、ＰＭＴが機能抑制されたタバコにおいては、最も効果の高い系統でニコチン含量が対照の９６．７％低減、即ち対照の３．３％まで低下するという報告もあり（非特許文献３）、さらにＢＢＬのノックアウト系統ではニコチン含量が対照の０．３％に低減するという報告もある（非特許文献４）。しかし、これらの報告ではニコチン低減効果は大きいものの、タバコゲノム中に５個存在するＰＭＴを全て機能抑制する必要があり、またタバコゲノム中に６個存在するＢＢＬを全てノックアウトする必要があることから、実際に育種を行う上では大きな障壁となる。
　非特許文献５および非特許文献６には、タバコ属に属する植物におけるアルカロイドの生合成に関与する様々な遺伝子とその発現を調べた結果が報告されており、タバコ属に属する植物には２つのアスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）遺伝子、ＡＯ１およびＡＯ２が存在すること、ＡＯ１は植物体全体に普遍的に発現し、ＡＯ２は根特異的に発現することが示唆されている。ＡＯは、アスパラギン酸の酸化を触媒することによってイミノアスパラギン酸を生成する酵素である。ＡＯは、ニコチン酸およびニコチンアミドの代謝に関与する生体内の重要酵素である。
　特許文献１には、ＮＢＢ１またはＡ６２２遺伝子と組み合わせてニコチン生合成酵素遺伝子(ＡＯ遺伝子を含む)を下方制御することによって、アルカロイド含量を低減させる記載がある。特許文献２には、ゲノム編集技術によってニコチン生合成遺伝子（ＡＯ遺伝子を含む）の発現を低下させることによって、ニコチン類縁アルカロイドを低減させる記載がある。しかし、特許文献１および２には、実際にＡＯ遺伝子を扱った実験結果はなく、またＡＯ１とＡＯ２は区別されていない。
　さらに最近タバコにおいて、ニコチン生合成酵素遺伝子群を正に制御する転写因子であるＥＲＦ１８９およびＥＲＦ１９９の２遺伝子のノックアウト系統では、アルカロイド含量が対照の２～４％に低下することが示された（非特許文献７）。この系統ではＥＲＦ１８９およびＥＲＦ１９９の制御下にある多数のニコチン生合成系遺伝子群、例えばＰＭＴやＡＯ２の発現量が、対照の３％程度にまで減少する（ゼロにはならない）。しかし、転写因子のノックアウトは様々な遺伝子群の転写に影響を及ぼし、多数の遺伝子の機能を抑制し、植物の代謝経路への影響が危惧される。実際この系統では炭素（C）/窒素（N）比のバランスが崩れることが示唆されている。
　なお、タバコ以外の植物では、ＡＯ遺伝子の機能破壊は、生体に対する致死性をもたらすことが知られている（非特許文献８）。
　非特許文献９には、タバコＡＯ２（非特許文献９ではＡＯ１と記載）のＲＮＡｉコンストラクトをタバコに導入し、ＡＯ２の転写物量が減少した形質転換タバコでは、心止め後２週間の上位葉のニコチン含量が対照の０．５％以下～１４％程度にまで減少したことが記載されている。非特許文献９には、ニコチン含量が低い個体は、完全展開葉および下位葉（成熟葉）に早期老化の表現型（白色からあずき色の斑点を生じる）を示すことも記載されている。ニコチアナ・タバカムは複二倍体植物でそのゲノムにはニコチアナ・シルベストリス（Ｓ）由来のゲノムと、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Ｔ）由来のゲノムが含まれ、多くの場合ニコチアナ・タバカムの遺伝子はＳゲノム由来の遺伝子とＴゲノム由来の遺伝子の２種類存在する。しかし非特許文献９では、ＡＯ２－Ｔ遺伝子の配列が開示されておらず、ＡＯ２－ＳおよびＡＯ２－Ｔ遺伝子も区別されていない。また非組換え体である変異体についての記載はなく、またニコチアナ・タバカム以外のタバコ属植物の実施例もない。
国際公開第２００６／１０９１９７号（２００６年１０月１９日公開） 国際公開第２０１８／２２２６６７号（２０１８年１２月６日公開）
Lewis, R.S. (2018) Potential Mandated Lowering of Nicotine Levels in Cigarettes: A Plant Perspective. Nicotine & Tobacco Research, 1-5 Khan, S. et al. (2017) Cloning and functional characterization of quinolinic acid phosphoribosyl transferase (QPT) gene of Nicotiana tabacum, Physiol. Plant. 160: 253-265 Wang et al. (2008) Generation of tobacco lines with widely different reduction in nicotine levels via RNA silencing approaches, J. Biosci. 33: 177-184 Schachtsiek and Stehle (2019) Nicotine-free, nontransgenic tobacco (Nicotiana tabacum L.) edited by CRISPR-Cas9, Plant Biotechnol. J. 17: 2228-2230 Kajikawa, M. et al. (2017) Genomic insights into the evolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco, Plant physiology, 174: 999-1011 Xu, S. et al. (2017) Wild tobacco genomes reveal the evolution of nicotine biosynthesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114: 6133-6138 Hayashi, S. et al. (2020) Genetic manipulation of transcriptional regulators alters nicotine biosynthesis in tobacco, Plant Cell Physiol. pcaa036 (DOI: 10.1093/pcp/pcaa036) Katoh, A. et al. (2006) Early Steps in the Biosynthesis of NAD in Arabidopsis Start with Aspartate and Occur in the Plastid, Plant Physiology 141: 851-857 Martinez et al. (2020) Genetic attenuation of alkaloids and nicotine content in tobacco (Nicotiana tabacum), Planta 251:92、doi.org/10.1007/s00425-020-03387-1
　従来、低アルカロイド含量のタバコは知られていたが、極めて低い（例えば野生型の５％以下）ニコチン含量を達成するためには多数の遺伝子の変異または発現抑制が必要であった。また、遺伝子の機能を抑制する限り、所望されない形質（例えば奇形および早期老化などの障害）が生じる問題を伴うことがあった。すなわち、一つまたは二つという少数の酵素遺伝子の変異によって、極めて低いニコチン含量のタバコ属植物体を作出した例はこれまでになかった。
　本発明の一実施形態は、上記課題に鑑みてなされたものであり、少数（１つまたは２つ）の遺伝子が、その遺伝子に内在する変異によって機能抑制された低いアルカロイド含量を有するタバコおよびその製造方法を提供することを主たる目的とする。
　上記の課題を解決するために、本願発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、タバコ属植物体において根特異的アスパラギン酸オキシダーゼであるＡＯ２をコードする遺伝子の機能を、ＡＯ２遺伝子に内在する変異によって抑制することにより、そのタバコ属植物体のアルカロイド含量が低下することを初めて見出した。すなわち、二倍体であるタバコ属植物（ニコチアナ・シルベストリス）では１つのＡＯ２遺伝子の変異、複二倍体であるタバコ属植物（ニコチアナ・タバカム）では２つのＡＯ２遺伝子（ＡＯ２－ＳとＡＯ２－Ｔ）の変異によって、アルカロイド含量が極めて低くなる（対照の５％未満）こと、また複二倍体であるタバコ属植物（ニコチアナ・タバカム）ではＡＯ２－Ｓ遺伝子またはＡＯ２－Ｔ遺伝子の変異、つまり一つのＡＯ２遺伝子の変異によって、ニコチン含量が半分以下になることを見出して、本発明を完成するに至った。
　すなわち本発明に係るタバコ属植物体は、（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている。
　本発明に係る低アルカロイド含量のタバコ属植物体の製造方法は、（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含み、上記導入する工程が、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる。
　本発明によれば、アルカロイド含量が低下したタバコを提供することができる。
ＳＮＩＣ系統のＦ１個体のノルニコチン検定結果を示す図である。 ニコチアナ・シルベストリス（N. sylvestris）の２つのＡＯ遺伝子（ＮｓＡＯ１、ＮｓＡＯ２）の発現プロファイルを示す図である(RNA-seqデータ。単位はFPKM: Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped reads)。 タバコ（Nicotiana）属ＡＯのアミノ酸配列の分子系統樹を示す図である。クラスタリングはＵＰＧＭＡ法による。Ｎｓｙｌ　ＡＯ２＿ｐｔｎ、Ｎｔａｂ　ＡＯ２－Ｓ　ｐｔｎ、Ｎｔａｂ　ＡＯ２＿Ｔ＿ｐｔｎは、それぞれ本発明で同定したＮｓＡＯ２、ＮｔＡＯ２－Ｓ、ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子から翻訳されるアミノ酸配列を示す。Ｎｓｙｌはニコチアナ・シルベストリス（N. sylvestris）、Ｎｔａｂはニコチアナ・タバカム（N. tabacum）、Ｎｔｏｍはニコチアナ・トメントシフォルミス（N. tomentosiformis）、Ｎａｔｔはニコチアナ・アテヌアタ（N. attenuata）を示す。ＸＰで始まる番号はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号である。 ニコチアナ・タバカム（N. tabacum）のＡＯ遺伝子ＮｔＡＯ２－Ｓ、ＮｔＡＯ２－Ｔ、ＮｔＡＯ１－Ｓ、ＮｔＡＯ１－Ｔの発現プロファイルを示す図である(RNA-seqデータ。単位はFPKM: Fragments Per Kilobase of exon per Million mapped reads)。 ＡＯ１、ＡＯ２、またはＡＯ（ＡＯ１およびＡＯ２の両方）の、根および葉における転写物量を示す図である。 ＡＯ２遺伝子を機能抑制したタバコ属植物体におけるニコチン含量を示す図である。 ＡＯ１遺伝子を機能抑制したタバコ属植物体におけるニコチン含量を示す図である。 ＡＯ１遺伝子を機能抑制したタバコ属植物体の葉の状態（（ａ）ＮｔＡＯ１－ｓｓＴＴおよび（ｂ）ＮｔＡＯ１－ＳＳＴＴ）を示す図である。
　〔１．タバコ属植物体〕
　本発明の一実施形態は、（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体を提供する。
　本明細書において、配列表に記載したアミノ酸配列を用いてポリペプチドを特定する記載「～に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチド」は、野生型ポリペプチドを意味する。当該野生型ポリペプチドは、後述のタバコ属植物に通常存在しているポリペプチドを意味する。野生型ポリペプチドは、例えば、配列番号２、５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質、または当該タンパク質の、タバコ属植物における相同分子種である。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、実質的に同一の意味を有しており、交換可能に使用され得る。したがって、本明細書において、上記内在性遺伝子に存在する、ポリペプチドをコードする領域を、コード領域（ＣＤＳ）と記載する。
　上記一実施形態は、以下の条件の１つ以上またはすべてを満たし得る。（ａ）の内在性遺伝子には、（ａ）の内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が存在する。（ａ）の内在性遺伝子には、（ｂ）の内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす変異は存在しない。（ｂ）の内在性遺伝子には、（ｂ）の内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が存在する。（ｂ）の内在性遺伝子には、（ａ）の内在性遺伝子の機能抑制を引き起こす変異は存在しない。
　本明細書において使用される用語「タバコ属植物体」は、個体全体（例えば、成体、苗および種子）、組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびこれらの一部など）、およびこれらの乾燥物を包含する。
　上記タバコ属植物体は、タバコ（Nicotiana）属に属する植物であれば特に限定されず、例えば、ニコチアナ・アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ・アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ・アカミナタ・ヴァリエーション・ムルツユロラ（Nicotiana acuminata var. multzjlora）、ニコチアナ・アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ・アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ・ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ・ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ・カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ・クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ・コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ・コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・フォゲッチアナ（Nicotiana forgetiana）、ニコチアナ・フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa），ニコチアナ・グッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ・ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ・イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ・カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ・リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ・メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ・ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ・ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ・オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ・オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ・オクシデンタリス・サブスピーシーズ・ヘスペリス（Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis）、ニコチアナ・オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ・パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ・パウクツユロラ（Nicotiana pauczjlora）、ニコチアナ・ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ・プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ・クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ・レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ・ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ・ロズラタ・サブスピーシーズ・イングルバ（Nicotiana rosulata subsp. Ingulba）、ニコチアナ・ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）（マルバタバコ）、ニコチアナ・セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ・シムランス（Nicotiana simulans），ニコチアナ・ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ・スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ・ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ・スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）、ニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ・アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ・アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ・ベルンチナ（Nicotiana velutina）、ニコチアナ・ウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）、およびタバコ属植物のハイブリッドなどが挙げられる。中でも葉たばこ生産の原料として用いられるニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・ルスチカが特に好ましい。また、ニコチアナ・シルベストリスも好ましく用いることができる。
　本発明の一実施形態に係るタバコ属植物体におけるアルカロイド含量は、野生型のタバコ属植物体と比較して低下している。特定の実施形態において、「野生型のタバコ属植物体」は、そのゲノムに存在するＡＯ２遺伝子が正常に機能しているタバコ属植物体である。上記特定の実施形態において、「野生型のタバコ属植物体」は、そのゲノムに存在するＡＯ２遺伝子およびＡＯ１遺伝子が正常に機能しているタバコ属植物体であることが好ましい。「ＡＯ２遺伝子（およびＡＯ１遺伝子）が正常に機能している」は、ＡＯ２遺伝子（およびＡＯ１遺伝子）の発現を抑制させる因子がゲノムに導入されておらず、かつＡＯ２遺伝子（およびＡＯ１遺伝子）に変異を有していないことを意味する。上記特定の実施形態において、「野生型のタバコ属植物体」は、例えば、ポリヌクレオチド１をＡＯ２遺伝子の一部（コード領域）としてゲノムに含むニコチアナ・シルベストリス、またはポリヌクレオチド２ａおよびポリヌクレオチド２ｂのそれぞれを、ＡＯ２遺伝子の一部としてゲノムに含むニコチアナ・タバカムである。上記ニコチアナ・シルベストリスは、ポリヌクレオチド３をＡＯ１遺伝子の一部としてゲノムに含むことが好ましい。上記ニコチアナ・タバカムは、ポリヌクレオチド４ａおよびポリヌクレオチド４ｂのそれぞれをＡＯ１遺伝子の一部としてゲノムに含むことが好ましい。
ポリヌクレオチド１：配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド２ａ：配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド２ｂ：配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド３：配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド４ａ：配列番号６３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチド４ｂ：配列番号６４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。
　用語「アルカロイド」は、一般に窒素原子を含む塩基性有機化合物を指す。本発明の目的のために、アルカロイドは、タバコ属植物体において産生されるアルカロイドを指し、具体的には、アルカロイドは、ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシンおよびミオスミンを含む。ニコチアナ・タバカムにおいては、ニコチンが主要なアルカロイドとして蓄積される。一方、一部のニコチアナ・タバカムおよびニコチアナ・シルベストリスについては、生育中にニコチンが蓄積されるが、葉の老化や乾燥過程でニコチンがノルニコチンに変換される。本明細書において、アルカロイドは、主要なアルカロイドであるニコチンおよびノルニコチンを指すことがある。用語「アルカロイド含量」は、タバコ属植物体中のアルカロイドの含量を指す。アルカロイド含量は、通常、乾燥させた葉（乾葉）に対する重量％で表される。「低アルカロイド含量」は、野生型タバコ属植物体におけるアルカロイド含量と比較して低下したアルカロイド含量を意味する。低アルカロイド含量または低下したアルカロイド含量は、野生型タバコ属植物体におけるアルカロイド含量の、例えば、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下であり、好ましくは５％以下、４％以下、より好ましくは３％以下、２％以下、１％以下、０．８％以下、０．６％以下、０．４％以下、０．２％以下、または、０．１％以下である。低アルカロイド含量または低下したアルカロイド含量は、タバコ属植物体の乾葉重量の、例えば、２．５％以下、２％以下、１．５％以下、１％以下、好ましくは０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下、０．０８％以下、０．０６％以下、０．０４％以下、０．０２％以下、０．０１％以下である。
　アルカロイドのうちノルニコチンは、例えば、葉の抽出物をブロットしたろ紙に２，３－インドリンジオンを含有するイサチン溶液を噴霧した後に加熱することによって簡便に測定することができる。あるいは、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）分析などによって個々のアルカロイドを定量することができる。
　タバコ（Nicotiana）属に属する植物には２つのアスパラギン酸オキシダーゼ（ＡＯ）遺伝子、ＡＯ１およびＡＯ２が存在する場合があることが知られており、このうちＡＯ２については根特異的に発現することが明らかにされ、そしてニコチン生合成への関与が示唆されていた（Xu, S. et al. (2017) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 114: 6133-6138；Kajikawa, M. et al. (2017) Plant physiology, 174: 999-1011）。一方、ＡＯ１は植物全体で構成的に発現している。
　本明細書において使用する用語「アスパラギン酸オキシダーゼ」（本明細書において「ＡＯ」ともいう）は、アスパラギン酸を酸化してイミノアスパラギン酸を生成する活性を有する酵素を指す。当該酵素活性は、公知の方法によって測定することができる（Hao et al. (2008) Plant Science 271: 133-142）。ＡＯは、ニコチン酸およびニコチンアミドの代謝に関与する生体内の重要酵素であり、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）においてＡＯ遺伝子を破壊すると、胚致死性を示すことが知られている（Katoh, A. et al. (2006) Plant Physiology 141: 851-857）。
　本実施形態に係るタバコ属植物体は、ＡＯ２遺伝子の機能抑制によってニコチンおよびノルニコチンをはじめとするアルカロイドの含量が低下するとの本発明者らによる知見に基づいて実現されている。上記のようにＡＯ遺伝子の機能抑制は、植物体にさまざまな異常または致死性をもたらす可能性があったため、ＡＯ遺伝子の変異によるニコチンなどのアルカロイドの産生に対する影響はこれまでに研究されていなかった。
　本明細書において使用する用語「内在性遺伝子の機能抑制」は、ゲノム上にある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態を意味する。したがって、「内在性遺伝子の機能抑制」は、「内在性遺伝子の変異」、「内在性遺伝子の破壊」、および当該内在性遺伝子以外（外来遺伝子を包含する）による当該「内在性遺伝子の発現抑制」を包含する用語である。また、機能抑制を特異的に引き起こすとは、目的遺伝子以外の機能を抑制することなく目的遺伝子の機能のみを抑制することをいう。例えば、ＡＯ１遺伝子の機能抑制を引き起こすこと、または、同一の転写因子の制御下にある複数の遺伝子の機能抑制によって代謝異常を引き起こすことなどは回避することが望ましい。
　以下で記載するように、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）は、複二倍体であり、親植物であるニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）由来のゲノム（「Ｓゲノム」ともいう）およびニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）由来のゲノム（「Ｔゲノム」ともいう）を有する。タバコ属植物がニコチアナ・タバカムである場合、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれか一方のみの上のアスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子の機能を特異的に抑制することによってアルカロイド含量が低下する。したがって、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方の上のアスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子の機能が特異的に抑制されていてもよいが、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれか一方の上のアスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子の機能が特異的に抑制されていてもよい。この場合、特異的な機能抑制は、他方のゲノム上のアスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子の機能を抑制することなく、ＳゲノムおよびＴゲノムの一方のゲノム上のアスパラギン酸オキシダーゼ遺伝子の機能のみを抑制することをいう。ＳゲノムまたはＴゲノムにある一方のＡＯ２遺伝子のみを特異的に機能抑制するには、当該一方のＡＯ２遺伝子のみに、ヌクレオチド配列の変化を導入することが、好ましい。
　「内在性遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異（機能の低下もしくは欠損）、機能的なポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、または機能的なポリペプチドが生成されるものの、当該ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異などを意味している。「内在性遺伝子の破壊」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が存在しないこと、またはゲノム上にある遺伝子から転写産物が生成されないことを意味する。「内在性遺伝子の発現抑制」は、当該内在性遺伝子の塩基には変化を生じていないが、遺伝子の転写もしくは翻訳機能（ｍＲＮＡへの転写からそれに続くポリペプチドへの翻訳まで）が他の因子を介して修飾されて、ポリペプチドの生成量が低下しているか、またはポリペプチドの生成が生じていない状態などを意味する。「内在性遺伝子の発現抑制」は、例えば、当該内在性遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解によって生じ得る。
　本明細書に使用される場合、「変異」は、本願の属する技術分野において通常に理解される意味を有しており、例えば、野生型のゲノム上にある塩基、または野生型ポリペプチドにあるアミノ酸残基の、任意の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加、重複、逆位または転座など）を意味する。したがって、「内在性遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異（機能の低下または欠損しているポリペプチドが生成される変異を含む）、ポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、ポリペプチドが生成されるものの、ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異、遺伝子（コード領域、または非翻訳領域を含んでいるゲノムＤＮＡ配列）の喪失、または遺伝子からの転写が抑制される変異（転写制御領域または転写開始領域の欠失など）などを意味している。
　置換によって機能を欠損させる場合、プロモーター配列（コード領域を基準にして上流（５’側）にある配列が挙げられる）、およびターミネーター配列（コード領域を基準にして下流（３’側）にある配列が挙げられる）、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンの両端にある保存配列（例えば５’末端のＧＴおよび３’末端のＡＧ）、ならびにコード領域の少なくとも１つに、当該置換が存在し得る。
　例えば、ある遺伝子のプロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域にある、遺伝子発現調節に重要なヌクレオチド配列における置換は、当該遺伝子の転写活性の低下または当該遺伝子からの転写産物の安定性の低下を生じる。これらの低下はいずれも、上記遺伝子からの転写産物の減少にともなって、翻訳産物の減少を生じ得る。イントロンの上記保存配列における置換（スプライス変異）は、ｍＲＮＡのスプライシング異常を引き起こすことによって、不要なイントロンが付加または挿入されている異常なｍＲＮＡを生じる。異常なｍＲＮＡは、例えばフレームシフトによって、異常な翻訳産物を生じさせるか、または翻訳終結しない。
　コード領域にあるヌクレオチド置換がミスセンス変異である（野生型ポリペプチドの存在量の低下を生じる）場合、当該置換により本来のアミノ酸と異なるアミノ酸が生じるため、本来の機能が低下または欠損したポリペプチドを生じ得る。
　また、コード領域にある置換は、不完全長の翻訳産物または本来の機能を維持していない翻訳産物を生じ得る。不完全長の翻訳産物は、アミノ酸をコードしているコドンのストップコドンへの、当該置換による変換（ナンセンス変異）に起因して生じる。不完全長の翻訳産物は、本来の翻訳産物と比べて、Ｃ末端のアミノ酸残基を含んでいる連続する１アミノ酸残基以上を欠失している。ナンセンス変異は、本来のストップコドンの上流にある任意のコドンに生じており、本来のストップコドンから、１コドン以上を挟んだ上流にあることが好ましい。したがって、ナンセンス変異を有する遺伝子からの翻訳産物は不完全長である。本来の機能を損なっている翻訳産物は、アミノ酸置換によって生じる。この場合、転写物の量は野生型植物と比較して同等であってもよい。当該翻訳産物は、立体構造の変化、または機能ドメインとしての機能の低下などを起こしている。本発明の変異の好ましい態様の一つは、このような本来の機能を損なう翻訳産物を生じるアミノ酸置換である。上記アミノ酸置換は、翻訳産物の機能を変化させる高い可能性を有している非保存的置換であることが好ましい。非保存的置換は、電荷または疎水性が異なるアミノ酸への置換（例えば、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸、塩基性または酸性アミノ酸から中性アミノ酸、中性アミノ酸から塩基性または酸性アミノ酸、極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換）、ならびにかさ（立体的な大きさ）の異なる側鎖を有しているアミノ酸への置換などが挙げられる。
　ナンセンス変異によって生じる現象の他の例として、ＡＯ２遺伝子のタンパク質コード領域にナンセンス変異を有している場合、nonsense-mediated mRNA decay（Brogna and Wen (2009) Nat. Structural Mol. Biol. 16: 107-113）が生じ得る。nonsense-mediated mRNA decayは、転写物の分解を引き起こすため、ナンセンス変異は、転写物量の低下を生じさせることがある。nonsense-mediated mRNA decayを生じるには、ナンセンス変異を有しているエキソンが、ＡＯ２遺伝子に少なくとも１つ存在することが好ましい。特に、当該ナンセンス変異を有しているエキソンが、ＡＯ２遺伝子を構成する最も下流（３’側）のエキソンでないことがより好ましい。野生型のタバコ属植物体のＡＯ２遺伝子は、７つのエキソンと６つのイントロンから成る。したがって、nonsense-mediated mRNA decayを生じるナンセンス変異の好ましい実施形態は、少なくとも１つのナンセンス変異が、ＡＯ２遺伝子の第１エキソンから第６エキソンに存在することである。
　置換以外の変異（欠失および挿入など）が、プロモーター配列、５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域内に生じていると、置換と同様に、転写活性または安定性の低下による転写産物量の低減、およびポリペプチドの量の低減が、結果として起こり得る。イントロンの保存配列への置換以外の変異はまた、置換と同様に、本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。コード領域への置換以外の変異はまた、アミノ酸残基の欠失もしくは挿入（３の倍数の、連続する塩基の欠失または挿入によって生じる）、またはフレームシフトによって本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。また、その遺伝子全体を含んでいる大きな欠失または当該遺伝子への大きな断片の挿入は、当該遺伝子の発現自体を喪失させ得る。
　上記タバコ属植物体において、上記遺伝子の変異または破壊は、例えば、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトの結果として生じている。上記遺伝子の自然突然変異は、複製エラーおよび遺伝子の損傷によって一般的に生じる。当該損傷の原因は、天然に存在する公知の変異原（例えば、放射線や紫外線など）への暴露などである。上記遺伝子の変異原処理は、上記変異原をタバコ属植物体に対して人為的に作用させること（および必要に応じて遺伝子修復機能の抑制との組合せ）によって、実施され得る。変異原の種類として、例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、アジ化ナトリウム、エチジウムブロマイド、および亜硝酸等の化学薬剤を用いることができるが、タバコ属植物体のゲノムＤＮＡに変異を生じさせる化学薬剤であればこれらに限定されない。また、変異原として、例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、またはＵＶ等が挙げられるが、タバコ属植物体のゲノムＤＮＡに変異を生じさせる放射線等であれば、これらに限定されない。変異原として、好ましくはＥＭＳである。これらの手法は、対象植物に外在性の因子を加える必要がないという観点から好ましい。上記遺伝子の組換えは、公知の遺伝子組換え手法にしたがって、標的遺伝子の一部または全部を組換え配列によって相同的に組み換えることによって実施され得る。上記遺伝子のゲノム編集は、公知の技術（例えば、zinc-finger nucleases：ＺＦＮ、transcription activator-like effector nucleases：ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍなど）によって実施され得る。上記遺伝子ノックアウトは、公知のトランスポゾン（可動性遺伝因子）、またはＴ－ＤＮＡの挿入などによって、実施され得る。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍでは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮでは、融合タンパク質（ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼが融合されている）が、標的細胞内に存在すれば、ゲノム編集可能である。したがって、上記ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、ならびに上記融合タンパク質はいずれも、標的細胞に直接的に導入され得る。これらを標的細胞に直接的に導入する方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、およびパーティクルボンバードメント法などが挙げられる。また、コンストラクト（ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびに任意のプロモーターおよび／またはターミネーターを含む）が挿入されているベクターを、アグロバクテリウム等を介して、標的細胞および組織に導入してもよい。
　ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９　ｓｙｓｔｅｍでは、ゲノム上のＸＧＧのすぐ上流にあるヌクレオチド配列の相補的な配列が、ガイドＲＮＡの一部と塩基対を形成し、当該ヌクレオチド配列内において２本鎖のゲノムＤＮＡがＣａｓ９によって切断を受ける。
　ＴＡＬＥＮでは、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在するヌクレオチド配列と結合する。当該ヌクレオチド配列は、２本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖および他方の鎖に存在し、したがって、上記一対のＤＮＡ結合ドメインの一方は当該一方の鎖に、他方は、当該他方の鎖に結合する。上記ＤＮＡ結合ドメインは、３３～３４アミノ酸残基を繰り返し単位（モジュール）として、結合する塩基数と対応する数のモジュールから構成されている。
　ＺＦＮでは、ＴＡＬＥＮと同様に、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に５～２０塩基のスペーサを介して存在するヌクレオチド配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガーモジュールから構成されている。
　一実施形態において、ＡＯ２遺伝子におけるヌクレオチドの、ＥＭＳ処理による置換は、例えば、（Ｉ）フレームシフト変異、（ＩＩ）トランケーション変異（Ｎ末端アミノ酸残基が必須に欠失する）、（ＩＩＩ）スプライス変異または（ＩＶ）ナンセンス変異を生じる。ＥＭＳ処理は、特定のヌクレオチド変化（Ｃ→Ｔ置換およびＧ→Ａ置換）をＤＮＡに生じさせる傾向を有しているからである。
　上記（Ｉ）および（ＩＩ）は、例えば、１ｓｔメチオニンをコードする開始コドンＡＴＧのＧ→Ａ置換（開始コドンの消失）の結果として生じる。当該Ｇ→Ａ置換は、例えば、配列番号３５～３７における３００３位（いずれもＧ）に起こり得る。上記開始コドンの消失は、当該コード領域の３ｎ＋０または２位（ｎは整数）から始まるＡＴＧがあるとき、（Ｉ）を生じる。上記開始コドンの消失は、当該コード領域の３ｎ＋１位（ｎは整数）から始まるＡＴＧがあるとき、（ＩＩ）を生じる。
　上記（ＩＩＩ）は、例えば、配列番号３５における３１３５位、３４７７位、３８４２位、３９３３位、４１７７位、４２６６位、４３２４位、４４０８位、４４９０位、４７７８位、４８４１および５０６９位；
配列番号３６における３１３５位、３４７８位、３８４３位、３９３４位、４１７８位、４２６７位、４３２５位、４４０９位、４４９１位、４７７９位、４８４２位および５０７１位；ならびに
配列番号３７における３１３５位、３２７８位、３６４３位、３７３３位、３９７７位、４０７８位、４１３６位、４２３６位、４３１８位、４７４７位、４８１０および５０３２位
のうちいずれか１つ（いずれも上述のイントロンの保存配列である）にＧ→Ａ置換を生じているＡＯ２遺伝子において、生じる。
　上記（ＩＶ）は、例えば、（ＩＶａ）～（ＩＶｆ）に示されている１つ以上の位置に生じているＣ→Ｔ置換またはＧ→Ａ置換を生じているＡＯ２遺伝子において、生じる。配列番号３５～３７においてインフレームに存在するＣＡＡ、ＣＡＧ、ＣＧＡおよびＴＧＧのみが、ＥＭＳ処理によってストップコドン（ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ）に変化し得るからである。以下の例示において、「Ｃ」は、置換される前のヌクレオチド（つまりＣ→Ｔ置換）を表し、「Ｇ」は、置換される前のヌクレオチド（つまりＧ→Ａ置換）を表す。
・配列番号３５における（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）：
（ＩＶａ）３０３１位のＣ、３１１８位のＣ、３１２４位のＣ、３１３４位のＧ、３４７８位のＧ、３４８６位のＧ、３４８７位のＧ、３５０３位のＣ、３５２７位のＣ、３５３３位のＣ、３５５２位のＧ、３５５３位のＧ、３５６３位のＣ、３５８４位のＣ、３５８７位のＣ、３６５３位のＣ、３７３７位のＣ、３７９１位のＣ、４０５１位のＣ、４１４１位のＣ、４１７４位のＣ、４８１２位のＣ、４８１８位のＣ、５０７７位のＣ、５２７５位のＣ、５３９８位のＣ、５４０１位のＣ、５４７９位のＣ、５５３３位のＣ、５５７５位のＣ、５５８７位のＣ、５６４２位のＧ、５６４３位のＧ、５６４５位のＧ、５６４６位のＧ、５７３１位のＣ、５７４４位のＧ、５７４５位のＧ、５８２２位のＧ、５８２３位のＧ、５８３９位のＣ、５８４９位のＧ、５８５０位のＧ、５９３５位のＣ、および５９３８位のＣ、
（ＩＶｂ）６０２２位のＣ、６０２５位のＣ、６０３８位のＧ、６０３９位のＧ、６０４９位のＣ、および６０６１位のＣ；
・配列番号３６における（ＩＶｃ）および（ＩＶｄ）：
（ＩＶｃ）３０３１位のＣ、３１１８位のＣ、３１２４位のＣ、３１３４位のＧ、３４７９位のＧ、３４８７位のＧ、３４８８位のＧ、３５０４位のＣ、３５２８位のＣ、３５３４位のＣ、３５５３位のＧ、３５５４位のＧ、３５６４位のＣ、３５８５位のＣ、３５８８位のＣ、３６５４位のＣ、３７３８位のＣ、３７９２位のＣ、４０５２位のＣ、４１４２位のＣ、４１７５位のＣ、４８１３位のＣ、４８１９位のＣ、５０７９位のＣ、５２７７位のＣ、５４００位のＣ、５４０３位のＣ、５４８１位のＣ、５５３５位のＣ、５５７７位のＣ、５５８９位のＣ、５６４４位のＧ、５６４５位のＧ、５６４７位のＧ、５６４８位のＧ、５７３３位のＣ、５７４６位のＧ、５７４７位のＧ、５８２４位のＧ、５８２５位のＧ、５８４１位のＣ、５８５１位のＧ、５８５２位のＧ、５９３７位のＣ、および５９４０位のＣ、
（ＩＶｄ）、６０２４位のＣ、６０２７位のＣ、６０４０位のＧ、６０４１位のＧ、６０５１位のＣ、および（５１）６０６３位のＣ；ならびに
・配列番号３７における（ＩＶｅ）および（ＩＶｆ）：
（ＩＶｅ）３０３１位のＣ、３１１８位のＣ、３１２４位のＣ、３１３４位のＧ、３２７９位のＧ、３２８７位のＧ、３２８８位のＧ、３３０４位のＣ、３３３４位のＣ、３３５３位のＧ、３３５４位のＧ、３３６４位のＣ、３３８５位のＣ、３３８８位のＣ、３４５４位のＣ、３５３８位のＣ、３５９２位のＣ、３８５１位のＣ、３９４１位のＣ、３９７４位のＣ、４７８１位のＣ、４７８７位のＣ、５０４０位のＣ、５２３８位のＣ、５３６１位のＣ、５３６４位のＣ、５４４２位のＣ、５４９６位のＣ、５５３８位のＣ、５５５０位のＣ、５６０５位のＧ、５６０６位のＧ、５６０８位のＧ、５６０９位のＧ、５６９４位のＣ、５７０７位のＧ、５７０８位のＧ、５７８５位のＧ、５７８６位のＧ、５８０２位のＣ、５８１２位のＧ、５８１３位のＧ、および５８９８位のＣ、
（ＩＶｆ）５９８５位のＣ、５９８８位のＣ、６００１位のＧ、６００２位のＧ、６０１２位のＣ、および６０２４位のＣ。
　好ましい実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶａ）、（ＩＶｃ）および（ＩＶｅ）に示されている１つ以上の位置である。
　特定の実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶａ）および（ＩＶｂ）に示されている１つ以上の位置である。特定の実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶａ）に示されている１つ以上の位置であることが好ましい。
　他の特定の実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶｃ）および（ＩＶｄ）に示されている１つ以上の位置である。当該他の特定の実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶｃ）に示されている１つ以上の位置であることが好ましい。
　さらなる他の特定の実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶｅ）および（ＩＶｆ）に示されている１つ以上の位置である。当該さらなる他の特定の実施形態において、上記（ＩＶ）が生じている上記位置は、（ＩＶｅ）に示されている１つ以上の位置であることが好ましい。
　代替的に、上記変異は、野生型タバコ属植物体のゲノム上のＡＯ２遺伝子におけるコード領域に存在する以下の変異のうち、１種以上であり得る。
（１）コドンＣＡＡにおけるＣ→Ｔ置換、（２）コドンＣＡＧにおけるＣ→Ｔ置換、（３）コドンＣＧＡにおけるＣ→Ｔに置換、（４）コドンＴＧＧにおける１つまたは２つのＧ→Ａ置換、（５）翻訳開始コドンＡＴＧにおけるＧ→Ａ置換。
上記コード領域は、配列番号２、配列番号５もしくは配列番号６に示すアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するＡＯ２タンパク質をコードする領域である。上記ＡＯ２タンパク質は、アスパラギン酸オキシダーゼ活性を有している。
　以上において説明した種々の変異は、当業者によって、タバコ属植物体に対して容易に導入され得る。すなわち、これらの配列情報に基づいて、本発明の概念に包含される種々のタバコ属植物体のゲノムに存在する、変異を導入すべき領域が適宜決定され得る。
　遺伝子の変異または破壊は、当該遺伝子における変異の有無の検出によって決定され得る。遺伝子における変異を検出する方法としては、（１）当該変異を含むＤＮＡ配列をＰＣＲ等によって増幅後に、市販のシーケンサー等を利用して、ＤＮＡ塩基配列を直接解読する方法、（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて配列の違いを電気泳動の距離の違いで検出する方法、（３）ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ法を用いて、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）を検出する方法、（４）Ｔ７　ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＩなどを用いてミスマッチ部位を切断することにより変異の有無を検出する方法、（５）制限酵素処理による切断の有無から変異の有無が判別できるＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法、（６）意図的にミスマッチを含むプライマーセットを用いることにより、制限酵素による切断の有無から変異の有無が判別できるｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法、（７）変異配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてプローブがハイブリダイズされたか否かを検出することにより変異の有無を判別する方法（ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲ法）、（８）変異に隣接するプライマーを用いて一塩基伸長を行い、取り込まれた塩基の質量差によって変異の有無を検出する方法（ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析法）、（９）欠失や挿入の場合には、電気泳動の移動度の差から変異を検出する方法などがあるが、変異の有無が判別できる方法であればよい。代替的に、遺伝子の変異または破壊は、遺伝子の改変の結果として生じるタンパク質のサイズや発現量を、野生型タンパク質のそれらと比較することによって決定され得る。具体的には、例えばウェスタンブロット法を行うことにより、このような比較を行うことができる。
　あるいは、変異または破壊を、「ＭｕｔＭａｐ法」によって解析することができる。ＭｕｔＭａｐ法は、バルク分離分析（bulked segregant analysis、ＢＳＡ）と全ゲノムシーケンシング（whole genome sequencing、ＷＧＳ）とを組み合わせて、変異体の原因遺伝子領域を同定する手法である（Abe, A. et al., Nat. Biotechnol., 30(2): 174-178 (2012)）。この方法は、従来から行われているマップベースクローニング（map-based cloning）に比較して、マーカー作出の必要がなく、また、大量の個体を用いる必要もないことから、労力および時間が大幅に削減でき、より迅速な遺伝子同定が可能となる。
　ＭｕｔＭａｐ法においては、まず、所望の形質を有する変異体系統（＞Ｍ２）を、変異原処理に用いた親品種（原系統）と交配してＦ１世代を得、さらに、Ｆ１個体を自殖してＦ２世代を得る。突然変異により得られた形質は、多くの場合劣性と考えられる。従って、Ｆ１世代の表現型は野生型となり、Ｆ２世代の表現型は野生型：変異型が３：１に分離するはずである。
　Ｆ２世代において、遺伝的組換えにより、野生型のゲノムと変異体に由来する変異の入ったゲノムとがランダムに組み合わさり、個体ごとに固有の組み合わせを有するゲノムが生じる。そのため、変異型の表現型を示すＦ２個体由来のゲノムＤＮＡを混合（バルク）してＷＧＳに供した場合、染色体上の大部分の領域については変異を有するリードの出現頻度の期待値は０．５であるが、一方、変異体が示す表現型の原因となる変異およびその周辺領域における変異を有するリードの出現頻度は１となる。ＭｕｔＭａｐ法では、この変異を有するリードの出現頻度を「ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘ」とし、ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘ＝１が連続する領域に原因となる遺伝子（もしくは因子）が存在すると決定される。
　なお、ＭｕｔＭａｐ法は、これまでに主に比較的ゲノムサイズが小さなイネの遺伝子解析に使用されていた。本発明により、タバコ属植物のように比較的ゲノムサイズが大きな生物の遺伝子解析にもＭｕｔＭａｐ法を適用できることが示された。
　上記遺伝子の変異または破壊の結果として生じた個体は、本明細書においてタバコ属植物体の変異体（単に変異体とも記載する）と呼ばれる。タバコ属植物のうち、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）は、複二倍体であり、親植物であるニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）由来のゲノム（「Ｓゲノム」ともいう）およびニコチアナ・トメントシフォルミス（Nicotiana tomentosiformis）由来のゲノム（「Ｔゲノム」ともいう）の両方を有する。ニコチアナ・タバカムにおいて、同一の名称によって表される遺伝子は、ほとんどの場合、ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれに存在している。ニコチアナ・タバカムの場合、上記変異体は、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれかに上述の変異を有し得る。ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に上述の変異を有していてもよい。なお、機能を欠損させるための変異は１遺伝子に１種の変異を有しても良いし、複数の変異を有していても良く、変異の種類は問わない。ニコチアナ・タバカムの場合、ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれに２つずつある計４つの対立遺伝子のいずれかまたはすべてに変異を有してもよく、複数の対立遺伝子に変異が存在する場合、これらの変異は、同じでも良いし、異なっていても良い。
　上記遺伝子の発現抑制は、当該遺伝子からｍＲＮＡへの転写の抑制、当該遺伝子からｍＲＮＡを介したポリペプチドへの翻訳の抑制（例えば、当該ｍＲＮＡの分解）、および翻訳されたポリペプチドの機能の抑制を包含している。ｍＲＮＡの分解は、上記nonsense-mediated mRNA decayから生じ得る。転写の抑制は、上記遺伝子からの転写を促進する転写因子の阻害、および転写開始因子の上記遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。翻訳の抑制は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、または共抑制分子を用いて実現され得る。ポリペプチドの機能の抑制は、機能的なポリペプチドとの結合によって当該ポリペプチドの機能を阻害する分子（例えば、デコイ核酸、リボザイム、抗体および阻害ペプチド）によって実現され得る。
　遺伝子の発現抑制または遺伝子への変異の導入を目的としたタバコ属植物体の形質転換に使用されるベクターとしては、ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドを植物細胞内で発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。当該ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に目的のポリヌクレオチドを導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、およびｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、およびｐＰＺＰ２０２など）のプラスミドが好ましい。
　遺伝子の発現抑制をＲＮＡｉによって実現する場合、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制するために使用されるトリガー配列が、上記ベクターに挿入される。当該トリガー配列は、例えば、配列番号２、５もしくは６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部、または配列番号１、３、４、３５、３６もしくは３７を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部である、連続する少なくとも２１～３０塩基（例えば、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、および３０塩基以上）の塩基配列に示されるポリヌクレオチド（センスＲＮＡ部分）、ならびに当該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列に示されるポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ部分）である。上述の「連続する少なくとも２１～３０塩基」の塩基配列は、より詳細には、連続する２１塩基以上、２３塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、または１００塩基以上の塩基配列を意味する。好ましい実施形態において、上記「トリガー配列」は、配列番号６８～７０を有しているポリヌクレオチドの一部またはその相補鎖ではない。
　上記（転写、翻訳またはポリペプチドの機能の）抑制は、例えば、当該抑制を実現するための分子を植物体に直接に導入すること、または当該分子をコードする核酸分子を植物体に導入すること（植物体の形質転換）によって、実現され得る。ここで、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子は、当該植物体のゲノムにおける１つ以上の任意の領域に組み込まれる。複二倍体であるニコチアナ・タバカムの場合、上記抑制が実現される限り、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子が、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に組み込まれている必要はない。
　上記タバコ属植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記遺伝子の発現産物であるポリペプチドの翻訳量の減少であってもよい。ポリペプチドの翻訳は、ｍＲＮＡの減少（ｍＲＮＡ自身の不安定性、ｍＲＮＡの分解促進もしくはｍＲＮＡの転写の抑制などのｍＲＮＡの存在量などに起因する）またはｍＲＮＡからの翻訳量の減少（翻訳構成要素（ｔＲＮＡおよびリボソーム）の欠乏、リクルートの阻害、または機能的な欠損などに起因する）に基づいて生じる。
　上記タバコ属植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少であってもよい。ｍＲＮＡの転写量の減少は、例えば、内在性遺伝子からのｍＲＮＡへの転写の抑制によって生じる。転写の抑制は、上記内在性遺伝子に対する変異の導入の結果として生じる、転写開始因子の当該内在性遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。
　上記タバコ属植物体において、上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進であってもよい。ｍＲＮＡの分解は、異常なｍＲＮＡの生成（nonsense-mediated mRNA decayを起こす）、ｍＲＮＡを分解する外来因子の存在、ｍＲＮＡを分解する内因性の構成要素の活性化、またはｍＲＮＡにおける分解促進配列の存在などによって引き起こされ得る。タバコ属植物体において、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解が促進されると、上記タバコ属植物体内の上記ｍＲＮＡは減少することになる。すなわち、上記タバコ属植物体において、上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡ量の減少であってもよい。ここで「内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの存在量の減少」は、野生型植物における当該内在性遺伝子の転写物の存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該転写物の存在を意味する。
　上記タバコ属植物体において、上記変異は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入であってもよい。上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であってもよい。
　上記変異が、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入されるタバコ属植物体の実施形態は、実施例の直前にある項目（まとめ）にある２つの（８）と置き換え可能である。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、配列番号２、５または６に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。配列番号２は、ニコチアナ・シルベストリスのＡＯ２（本明細書において「ＮｓＡＯ２」ともいう）のアミノ酸配列を、配列番号５はニコチアナ・タバカムのＳゲノムにコードされるＡＯ２（本明細書において「ＮｔＡＯ２－Ｓ」ともいう）のアミノ酸配列を、そして配列番号６はニコチアナ・タバカムのＴゲノムにコードされるＡＯ２（本明細書において「ＮｔＡＯ２－Ｔ」ともいう）のアミノ酸配列をそれぞれ示す。
　配列番号１は、ＮｓＡＯ２遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号２に示されるアミノ酸をコードする）を示す。配列番号３５は、配列番号１に示される塩基配列をコード領域に含む、ＮｓＡＯ２遺伝子のゲノムＤＮＡ配列である。配列番号３は、ＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号５に示されるアミノ酸をコードする）を示す。配列番号３６は、配列番号３に示される塩基配列をコード領域に含む、ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列である。配列番号４は、ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号６に示されるアミノ酸をコードする）を示す。配列番号３７は、配列番号４に示される塩基配列をコード領域に含む、ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列である。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、配列番号２、５または６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有し、かつアスパラギン酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。
　好ましい実施形態において、上記タバコ属植物体は、配列番号６２、６３または６４に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上（９６％、９７％、９８％、９９％および１００％）の配列同一性を有し、かつアスパラギン酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されていない。上記タバコ属植物体に上記内在性遺伝子が２つ存在するとき、一方の内在性遺伝子における上記コード領域は、配列番号６２または６３に示されるアミノ酸配列に対する上記配列同一性を有するポリペプチドをコードする。上記タバコ属植物体に上記内在性遺伝子が２つ存在するとき、他方の内在性遺伝子における上記コード領域は、配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対する上記配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
　配列番号６２は、ニコチアナ・シルベストリスのＡＯ１（ＮｓＡＯ１）のアミノ酸配列を示す。配列番号６５は、ＮｓＡＯ１遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号６２に示されるアミノ酸をコードする）を示す。配列番号６８は、配列番号６５に示される塩基配列をコード領域に含む、ＮｓＡＯ１遺伝子のゲノムＤＮＡ配列である。配列番号６３は、ニコチアナ・タバカムのＳゲノムにコードされるＡＯ１（ＮｔＡＯ１－Ｓ）のアミノ酸配列を示す。配列番号６６は、ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号６３に示されるアミノ酸をコードする）を示す。配列番号６９は、配列番号６６に示される塩基配列をコード領域に含む、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列である。配列番号６４は、ニコチアナ・タバカムのＴゲノムにコードされるＡＯ１（ＮｔＡＯ１－Ｔ）のアミノ酸配列を示す。配列番号６７は、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子のＣＤＳ配列（配列番号６４に示されるアミノ酸をコードする）を示す。配列番号７０は、配列番号６７に示される塩基配列をコード領域に含む、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列である。
　本明細書に使用される用語「（アミノ酸配列の）配列同一性」は、基準となる（アミノ酸）配列に対して、言及されている（アミノ酸）配列が一致している割合を意味する。ここで、配列の一致していない部分は、（アミノ酸残基の）置換、付加、欠失または挿入が存在している部分である。
　ここで、配列表に記載したアミノ酸配列を用いてポリペプチドを特定する記載「～に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチド」は、タバコ属植物体に通常存在しているポリペプチドであってもよい。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、実質的に同一の意味を有しており、交換可能に使用され得る。
　したがって、本発明に係るタバコ属植物体において存在量の減少している上記特定のポリペプチドは、配列表に示したそれぞれのアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドであればよく、当該配列同一性は、より高い割合（例えば、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）であることが好ましい。
　ポリペプチドの「存在量の減少」は、野生型ポリペプチドの存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該ポリペプチドの存在を意味する。上記野生型ポリペプチドの存在量を基準にした上記ポリペプチドの存在量は、タバコ属植物体における低アルカロイド含量をもたらす上述の値から、適宜選択され得る。
　なお、本発明に係るタバコ属植物体における上述のポリペプチドの存在量の減少は、当該タバコ属植物体から得られる、培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫において、遺伝的に安定して受け継がれていることが好ましい。したがって、本発明に係るタバコ属植物体は、人為的な操作を介して生成された培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫から発生した個体であり得、当該個体を得るためのこれらの材料は、本発明の範囲に包含される。
　本発明に係るタバコ属植物体は、交配によって得られた育種後代をさらに包含し得る。イネ、コムギ、オオムギ、ダイズをはじめ、多くの植物種で変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原で処理した変異体集団から単離した変異体の場合、目的の遺伝子以外にも多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この時、優良形質を持つ栽培品種と交配することにより、変異体の持つ形質を栽培品種に導入することで、より高付加価値を持つ栽培品種を得ることができる。変異体の持つ形質は変異に由来するため、戻し交雑を進めるためには、変異を持つ個体を選抜することが必要である。その際、目的形質（本発明においては低アルカロイド）をもたらす変異の数が少なければ少ないほど、着目すべき変異の数が減るので、戻し交雑に係る労力は軽減される。効率的な戻し交雑を進めるためには、変異の有無と変異がホモ接合型かヘテロ接合型かを簡便に検出する方法が必要である。この方法は後述する変異を検出する方法を用いて行うことができる。加えて、変異体と栽培品種間で多型を示すバックグラウンドマーカーを用いてＭＡＳ（Marker Assisted Selection）を行うことにより、栽培品種への戻り率が高い系統を少ない交雑回数で効率的に得ることができる。多形マーカーとしては、タバコで公知のＳＮＰ、ＳＳＲ（Simple Sequence Repeat）を利用することができる。必要であれば、用いるタバコのゲノム配列を解読して塩基配列の違い、反復配列数の違いを特定することにより、新たに多型マーカーを獲得、利用できる。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、配列番号２、５または６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつアスパラギン酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。ここで、それぞれのアミノ酸配列において欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は、例えば、１～３０個、１～２５個、１～２０個、１～１５個、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３個、１～２個、または１個である。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、配列番号１、３または４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。ここで配列番号１、３および４は、それぞれニコチアナ・シルベストリスのＡＯ２（ＮｓＡＯ２）、ニコチアナ・タバカムのＳゲノムにコードされるＡＯ２（ＮｔＡＯ２－Ｓ）、およびニコチアナ・タバカムのＴゲノムにコードされるＡＯ２（ＮｔＡＯ２－Ｔ）のコード領域ヌクレオチド配列を示す。
　本発明の一態様に係るタバコ属植物体は、配列番号１、３または４に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパラギン酸オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる内在性遺伝子の機能が抑制されている。
　ストリンジェントな条件は、いわゆるヌクレオチド配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成されるが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドの形成が著しく抑制される条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士のハイブリッド、例えばプローブと完全一致した２本鎖ポリヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。一例を示すと、０．２５Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。例えば、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができる。
　〔２．タバコ属植物体の製造方法〕
　本発明の一実施形態は、上記（ａ）および（ｂ）の内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノム中の当該内在性遺伝子に導入する工程を含む、タバコ属植物体の製造方法を提供する。タバコ属植物体に導入される変異の詳細は、項目〔１．タバコ属植物体〕に記載されている。
　上記製造方法において、変異を有している植物体の変異体集団から、所望の表現型を示す個体をさらに選抜してもよい。個体を選抜することの例として、変異原を用いて処理した場合に得られる変異体集団（パネル）から所望の個体を選抜する手順を説明する。
　２つの対立遺伝子（ニコチアナ・タバカムの場合はＴゲノム、Ｓゲノム両方の対立遺伝子を含む合計４個の対立遺伝子）に変異を有した機能欠損したタバコ属植物体の変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。上述のようにタバコ属植物体を変異原で処理し、ゲノム全体に変異を生じさせた変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。それぞれの遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡから標的遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、ホモ接合型の変異を有する系統を選抜する。例えば、ニコチアナ・タバカムの場合、まず、Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれにホモ接合型変異を有する系統（Ｍ２）を取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する系統を取得する。なお、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれか一方のみに変異を有する機能欠損したタバコ属植物体の変異体の獲得については、取得したＭ２において対象でない方のゲノム上の遺伝子に変異が生じていないことを確認すればよい。
　所望の表現型を示す個体の選抜は、アルカロイド含量の測定、またはアスパラギン酸オキシダーゼ活性の測定によって行ってもよい。
　ＡＯ２遺伝子に変異を有するタバコの作出方法の一例として、上述のようにタバコをＥＭＳなどの変異原で処理し、タバコのゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。遺伝子に対して特異的なプライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡそれぞれから、またはそれらをプールしたものから、ＡＯ２遺伝子を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、ホモ接合型の変異の入った系統を選抜する。まず、Ｓ型ゲノムにホモ接合型の変異の入った系統およびＴ型ゲノムにホモ接合変異の入った系統をそれぞれ取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ型ゲノムおよびＴ型ゲノムの両方にホモ接合型の変異の入った系統を取得する（二因子劣性ゆえ１／１６の確率で得られる）。
　したがって、上記一実施形態の方法は、１つ以上の工程を、さらに含んでいてもよい。・タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコ変異体集団（パネル）を作製する工程、
・上記パネルに含まれている系統からゲノムＤＮＡを抽出する工程、
・ゲノムＤＮＡにおけるＡＯ２遺伝子の塩基配列を決定する工程、
・ホモ接合型の変異の入った系統を、上記パネルから選抜する工程、および
・上記系統におけるアルカロイド含量を確認する工程。
　上記系統は、アルカロイド含量を確認する工程を実施する前の任意の時点に、変異処理を施されていない系統と交配され得る。交配は、ＡＯ２遺伝子以外に存在し得る変異の排除を可能にする。特定の実施形態において、ＡＯ２遺伝子に変異を有している上記系統は、変異処理を施されていない系統（上記パネルを作製するために用いた元の系統）と、複数回戻し交配され得る。
　タバコ変異体からのゲノムＤＮＡの抽出は、公知の方法に基づいて行えばよく、市販の抽出キットを用いてもよい。また、ゲノムＤＮＡは、粗精製物であってもよいし、いくつかの精製工程を経た精製品であってもよい。
　ポリヌクレオチドの増幅は、例えばＰＣＲ法によって行うことができるが、他の公知の遺伝子増幅方法、例えば、ＬＣＲ（ligase chain reaction）法またはＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法等によって行ってもよい。
　各ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマー配列は、例えば塩基配列から設計することが可能である。配列番号３６（Ｓ型のＡＯ２遺伝子のゲノム配列）の塩基配列と配列番号３７（Ｔ型のＡＯ２遺伝子のゲノム配列）の塩基配列との相同性解析結果から、まずＳ型特異的な領域およびＴ型特異的な領域を見つける。その領域にプライマーを設計することで、抽出されたゲノムＤＮＡ（Ｓ型およびＴ型を含む）から、Ｓ型およびＴ型のＡＯ２遺伝子をそれぞれ特異的に増幅することができる。設計する部位としては、Ｓ型またはＴ型特異的な領域から選択することができるが、好ましくはイントロン、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域である。プライマーの長さは、好ましくは１５塩基～３０塩基、特に好ましくは１７塩基～２５塩基である。プライマー配列は、塩基配列に特異的な領域、または両塩基配列に共通する領域の配列に基づき設計してもよい。また、変異箇所を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１またはそれ以上の置換、欠失、および／または付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質または放射性物質等で標識されていてもよい。
　増幅する各ポリヌクレオチドの長さは、後述する各種検出方法が利用可能な長さであれば特に限定されないが、例えば、２０塩基～５０００塩基、より好ましくは５０塩基～２０００塩基、さらに好ましくは１００塩基～７００塩基、よりさらに好ましくは１００塩基～５００塩基である。
　〔３．その他〕
　本発明の一実施形態は、低アルカロイド含量のタバコ属植物体の決定方法を提供する。当該決定方法は以下の工程を包含する：
　タバコ属植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程；
　当該サンプルに含まれているゲノム上にある上記内在性遺伝子の機能抑制を特異的に引き起こす変異を検出する工程；および
　上記変異が検出されたタバコ属植物体を、低アルカロイド含量のタバコ属植物体として決定する工程。
　ここで、当該機能抑制は、タバコ属植物体において低アルカロイド含量をもたらす。つまり、上記決定方法は、タバコ属植物体の製造方法などに利用される。
　本発明の一実施形態は、タバコ属植物体の育種方法を提供する。当該方法は、上記決定方法によって決定された、低アルカロイド含量のタバコ属植物体を交配させる工程を包含する。
　本発明の一実施形態は、上記タバコ属植物体、上記製造方法によって得られたタバコ属植物体、上記決定方法によって決定されたタバコ属植物体、または上記育種方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代を提供する。本実施形態において、例えばニコチアナ・シルベストリスの場合、一つのＡＯ２遺伝子の機能抑制のみで極めて低いニコチン含量がもたらされる。そのため、ＡＯ２遺伝子上にある変異を目印にした単因子劣性の遺伝様式による育種が可能となり、育種に係る労力が従来よりも大幅に軽減される。また例えばニコチアナ・タバカムの場合、二つのＡＯ２遺伝子の機能抑制で極めて低いニコチン含量がもたらされる。そのため、ＡＯ２－Ｓ遺伝子上にある変異およびＡＯ２－Ｔ遺伝子上にある変異を目印にした二因子劣性の遺伝様式による育種が可能となり、育種に係る労力が従来よりも軽減される。さらに、一つのＡＯ２遺伝子の機能抑制でも低ニコチン性がもたらされるので、ＡＯ２－Ｓ遺伝子上またはＡＯ２－Ｔ遺伝子上にある変異を目印にした単因子劣性の遺伝様式による育種が可能となり、育種に係る労力が従来よりも大幅に軽減される。
　多くの植物種において変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原を用いて処理した変異体集団から単離した変異体は、対象とする遺伝子以外に多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この交雑において、優良な形質を保有している栽培品種と、上記変異体を交配させることによって、当該変異体の有している所望の形質を、既存の栽培品種に導入することができる。このようにして得られた育種後代は、既存の栽培品種に高い付加価値を付与した品種であり得る。その際、低アルカロイドをもたらす目的変異の数が少なければ少ないほど、着目すべき変異の数が減るので、戻し交雑に係る労力は軽減される。
　本発明の一実施形態は、上記タバコ属植物体、上記製造方法によって得られたタバコ属植物体、上記決定方法によって決定されたタバコ属植物体、上記育種方法によって得られたタバコ属植物体、または上記子孫もしくは育種後代から収穫された葉たばこを提供する。葉たばこは、タバコ属植物体から収穫されて、たばこ製品の製造に用いられる葉を指す。
　本発明の一実施形態は、上記葉たばこから得られた乾燥葉（乾燥たばこ）を提供する。乾燥葉は、葉たばこを乾燥することによって得られる。乾燥方法としては、任意の方法を用いることができ、例としては自然乾燥、温風乾燥、熱風乾燥などが挙げられるが、これらに限定されない。なお、本明細書において、乾燥葉は、乾燥葉から得られるカットフィラー、粉末、シート、中骨、顆粒、および抽出物を含む。
　本発明の一実施形態は、上記乾燥葉から得られたたばこ製品を提供する。たばこ製品は、任意の形態であり得、例としては、刻みたばこ、葉巻きたばこ、パイプたばこ、紙巻きたばこ、電子たばこ、無煙たばこ、嗅ぎたばこ（スヌース、スナッフを含む）、水たばこ、たばこを加熱し発生するエアロゾルをエアロゾル源として用いた非燃焼加熱型たばこ製品、たばこを加熱せずにその香味を吸引する非加熱型たばこ製品などが挙げられるが、これらに限定されない。
　これらの詳細については、タバコ属植物体およびその製造方法に関して上記した事項を参照のこと。
　（まとめ）
　以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
　すなわち、
　（１）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノムに導入されている、タバコ属植物体。
　（２）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１）に記載のタバコ属植物体。
　（３）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（２）に記載のタバコ属植物体。
　（４）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、（２）に記載のタバコ属植物体。
　（５）上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、（２）に記載のタバコ属植物体。
　（６）上記変異は、上記内在性遺伝子に導入されている、（１）～（５）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（７）上記変異は、自然突然変異、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、（６）に記載のタバコ属植物体。
　（８）上記変異は、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記内在性遺伝子の存在する領域外への挿入である、（５）に記載のタバコ属植物体。
　（９）上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、（８）に記載のタバコ属植物体。
　（１０）ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ルスチカに属する、（１）～（９）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（１１）タバコ属植物体の製造方法であって、
　配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含む、タバコ属植物体の製造方法。
　（１２）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１１）に記載の製造方法。
　（１３）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（１２）に記載の製造方法。
　（１４）上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、（１２）に記載のタバコ属植物体。
　（１５）上記機能抑制は、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、（１２）に記載のタバコ属植物体。
　（１６）上記導入する工程が、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、（１１）～（１５）のいずれかに記載の製造方法。
　（１７）上記導入する工程が、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、（１６）に記載の製造方法。
　（１８）上記導入する工程が、上記内在性遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、当該内在性遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、（１２）～（１５）のいずれかに記載の製造方法。
　（１９）上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、（１８）に記載の製造方法。
　（２０）（１）～（１０）のいずれかに記載のタバコ属植物体、または（１１）～（１９）のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
　（２１）（１）～（１０）のいずれかに記載のタバコ属植物体、（１１）～（１９）のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体、または（２０）に記載の子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
　（２２）（２１）に記載の葉たばこから生成された、乾燥葉。
　（２３）（２２）に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
　以上の各実施形態は、代替的に以下のようにも要約され得る。
　（１）
　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
　（２）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの存在量の減少である、（１）に記載のタバコ属植物体。
　（３）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの分解の促進である、（２）に記載のタバコ属植物体。
　（４）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、（２）に記載のタバコ属植物体。
　（５）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１）～（４）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（６）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（５）に記載のタバコ属植物体。
　（７）
　上記変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、（１）～（６）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（８）
　ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ルスチカに属する、（１）～（７）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（９）
　（ｃ）配列番号６２または配列番号６３に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｄ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていない、（１）～（８）のいずれかに記載のタバコ属植物体。
　（１０）
　タバコ属植物体の製造方法であって、
　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含み、
　上記導入する工程が、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、タバコ属植物体の製造方法。
　（１１）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの存在量の減少である、（１０）に記載の製造方法。
　（１２）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの分解の促進である、（１１）に記載の製造方法。
　（１３）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、（１１）に記載の製造方法。
　（１４）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、（１０）～（１３）のいずれか１項に記載の製造方法。
　（１５）
　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、（１４）に記載の製造方法。
　（１６）
　上記導入する工程が、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、（１０）～（１５）のいずれかに記載の製造方法。
　（１７）
　（ｃ）配列番号６２または配列番号６３に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
　（ｄ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されないことを、さらに含んでいる、（１０）～（１６）のいずれかに記載の製造方法。
　（１８）
　（１）～（９）のいずれかに記載のタバコ属植物体、または（１０）～（１７）のいずれかに記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
　（１９）
　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および／または
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
　野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこと比べて、低いアルカロイド含量を示す、葉たばこ。
　（２０）
　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および／または
　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
　野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこから生成された乾燥葉と比べて、低いアルカロイド含量を示す、乾燥葉。
　（２１）
　（２０）に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
　以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
　〔実施例１：ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）低ニコチン産生変異系統（ＳＮＩＣ系統）の単離〕
　栽培タバコ、ニコチアナ・タバカム（染色体数：２ｎ＝４ｘ＝４８）は二倍体のタバコ野生種ニコチアナ・シルベストリス（染色体数：２ｎ＝２ｘ＝２４）およびこれもまた二倍体のタバコ野生種ニコチアナ・トメントシフォルミス（染色体数：２ｎ＝２ｘ＝２４）の交雑に由来する複二倍体であり、それぞれの親に由来する２つのサブゲノム（ニコチアナ・シルベストリス由来のサブゲノムおよびニコチアナ・トメントシフォルミス由来のサブゲノムをそれぞれ「Ｓ」または「Ｓゲノム」および「Ｔ」または「Ｔゲノム」と称する）を有する。そのため、ニコチアナ・タバカムにおいて、対立遺伝子の存在も考慮すれば、多くの遺伝子について同じ機能を有する遺伝子が各々２ペア（Ｓ型ゲノムに１ペア＝２対立遺伝子およびＴ型ゲノムに１ペア＝２対立遺伝子）存在する。したがって、ニコチアナ・タバカムでは、標的とする遺伝子の機能喪失変異を表現型として観察するためには、機能の重複する４つすべての対立遺伝子の両方を変異させる必要がある。
　一方で、ニコチアナ・シルベストリスは二倍体であるので、変異を起こした当初の世代（Ｍ１世代）の次のＭ２世代で一つの遺伝子の変異に起因する表現型を観察することができる。そこでニコチアナ・シルベストリス変異体ライブラリーを作製し、低ニコチン産生変異体の取得を試みた。
　ニコチアナ・シルベストリスの種子を０．６％ＥＭＳで１６時間処理し、その後蒸留水で３０分ずつ８回洗浄した。処理した種子を播種し、処理当代（Ｍ１世代）の植物を栽培した。それぞれの系統から自殖種子（Ｍ２世代）を得た。４，９４５個のＥＭＳ変異ニコチアナ・シルベストリス系統からそれぞれ約２００粒以上の種子を得ることができた。
　ニコチアナ・シルベストリスの主アルカロイドはノルニコチンである。ニコチアナ・シルベストリスの葉においてニコチンは老化・乾燥中にノルニコチンに変換される。従って、老化・乾燥後にノルニコチン産生能が低下したニコチアナ・シルベストリス変異体を選別すれば、ノルニコチンの前駆体であるニコチンが低下した変異体が得られると考えられた。
　６～７葉期の温室育成苗の葉を３７℃、湿度８５％で３日間乾燥（老化）処理し、ニコチンからノルニコチンへの変換を促した。処理葉の一部（先端部２ｃｍ×２ｃｍ）を、１％のＴｗｅｅｎ－２０を含む３０％のＮａＯＨに数秒浸漬して組織を破壊後、０．４ｍＬクロロホルムに１時間浸漬し内容成分を抽出した。クロロホルム層２０μＬをろ紙上（Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ　ｐａｐｅｒ　ＣＢ－０９Ａ、アトー社製）にブロットし、イサチン溶液（酢酸２．５ｍＬとエタノール５０ｍＬとの混合液に０．１ｇの２，３－インドリンジオン（富士フィルム和光純薬社製）を溶解したもの）を噴霧器で一様に噴霧し、１２０℃で４分間処理した。ノルニコチンが存在すると、ノルニコチンとイサチンとが反応して青色を呈する。これを指標にノルニコチン濃度を簡易判別した。具体的には、発色の指標として標準品ノルニコチン含量０．０５％、０．１％、０．２５％、０．５％、０．７５％の５段階に分けたインディケーターを作製して発色程度の基準とした。これらの発色をそれぞれノルニコチン指標値（またはノルニコチン指数）１、２、３、４、５とした。指標値１を示すものを選抜対象とした。
　ノルニコチン含量が低下していた個体を、４号鉢に移植してさらに２週間生育させ、生葉を刻んでニコチンをメタノールで抽出し、ガスクロマトグラフィー／質量分析法（ＧＣ－ＭＳ）分析によりニコチンを測定した。ニコチン量を、対照（野生型のニコチアナ・シルベストリス）に対するピーク面積比として算出した。以上のアッセイ系を用いて、総計４，２０２のＥＭＳ変異ニコチアナ・シルベストリス系統のＭ２世代を選抜に供して、ニコチンをほぼ含まない変異体もしくはニコチン含量が対照（変異処理をしていない野生型ニコチアナ・シルベストリス）の数％にまで低下した変異体を、８系統から１５個体取得した（表１）。
　全ての個体に関して自殖種子（Ｍ３世代）を得ることが出来た。Ｍ３世代を育成し、４号鉢に移植して２か月後に心止め（摘芯）を行い、その２週間後に根を採取して刻んでメタノール抽出し、ＧＣ－ＭＳ分析したところ全ての系統においてニコチン含量が対照の０～数％であった。このことから、低ニコチン産生変異体は、ニコチンの根から地上部への転流の不全ではなく、根におけるニコチン生合成の不全が原因であることが示唆された（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　さらに、一部の低ニコチン産生変異体については、圃場で育成し、心止め後１か月の成熟葉を１か月間空気乾燥した後に、葉の刻みをマイナーアルカロイド分析に供して（Beitr. Tabakforsch. Int., 21: 369-379 (2005)を参照のこと）、ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシンおよびミオスミンを測定した。結果を表２に示す。
　野生型のニコチアナ・シルベストリス（ＷＴ）においては、ニコチンとノルニコチンの合計量が乾燥した葉の重量当たり１．２％～１．３％（１２～１３ｍｇ／ｇ乾葉）であったのに対し、低ニコチン産生変異体のニコチンとノルニコチンの合計量は定量限界以下～０．０２４％（０．２４ｍｇ／ｇ乾葉）と極めて低かった。またいずれの低ニコチン系統においても、総アルカロイド量は０．０４％（０．４ｍｇ／ｇ乾葉）未満であった（表２）。表３に示すように、８個の系統の各々にＳＮＩＣ系統のＩＤを付与した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　〔実施例２：ＳＮＩＣ系統の特徴付け〕
　実施例１で得られた８個のうち６個のＳＮＩＣ系統および対照のニコチアナ・シルベストリスを圃場で栽培した。各系統について１２個体を試験に供した。開花期に心止めし、約６週間後に上から２枚目の葉を各系統について３個体からサンプリングした。空気乾燥（２４時間の１サイクル（３０℃、湿度７５％、１６時間→２２℃、湿度８５％、８時間）を３０日間（３０サイクル）繰り返し）を実施した。次いで、中骨を除いて凍結乾燥後、マイナーアルカロイド分析に供した。その結果、すべてのＳＮＩＣ系統のニコチン含量とノルニコチン含量との合計は０．０４％（０．４ｍｇ／ｇ乾葉）以下であった。これは、対照であるニコチアナ・シルベストリスにおける含量（１００％）に対して２．６％以下であった（表４）。また、ＳＮＩＣ系統のニコチン含量、ノルニコチン含量、アナタビン含量、アナバシン含量を合計した総アルカロイドは０．１％（１ｍｇ／ｇ乾葉）程度以下であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次に８個全てのＳＮＩＣ系統を相互に交雑してＦ１系統を作製し、低ニコチン性を示す遺伝子座の対立性検定を実施した。
　Ｆ１系統は、ＳＮＩＣ６を花粉親とする組み合わせを除いた全ての組合せの正逆交配によって作出した（図１）。各系統について４個体を温室にて育成した。播種後５週目に３号鉢へ移植後、さらに約２週間経過した個体の下位葉をサンプリングし、上記の簡易ノルニコチン検定に供した。
　その結果、ＳＮＩＣ３とＳＮＩＣ８については他系統とのＦ１系統でノルニコチン蓄積が見られたことから、この２系統は他とは異なる遺伝子座の変異に起因して低ニコチン化していると考えられた。一方、その他の６系統（ＳＮＩＣ１、ＳＮＩＣ２、ＳＮＩＣ４、ＳＮＩＣ５、ＳＮＩＣ６、ＳＮＩＣ７）を相互に組み合わせた全てのＦ１個体のノルニコチン指数は１となり、低ニコチン性が維持されていることが示された（図１）。すなわち、これら６系統の低ニコチン性は、同一の遺伝子座の変異によって支配されていることが明らかとなった。
　ＳＮＩＣ４およびＳＮＩＣ７の２系統をそれぞれニコチアナ・シルベストリスと交配したＦ１世代を作製し、さらに自殖してＦ２世代を得た。両系統のそれぞれについて９６個のＦ２個体を育成し、低アルカロイド性の分離比を確認した（ここで、「アルカロイド」はニコチンとノルニコチンを合わせた総称）。播種後約２カ月の個体の下位葉をサンプリングして簡易ノルニコチン検定に供し、ノルニコチン指数が２以下の個体を４号鉢へ移植した。４号鉢へ移植して約１週間後に心止めを実施し、さらに下位葉を除去して上位葉３枚のみを残した。心止め１０日後に追肥を実施し、３０日後に全葉を収穫した。次いで、中骨を除いて凍結乾燥し、マイナーアルカロイド分析に供した。ニコチン濃度が低い場合は、ＣＯＲＥＳＴＡ推奨方法Ｎｏ．６２に従い、葉の刻みからニコチンを抽出した後、ＧＣ－ＭＳを用いて測定した。
　その結果、ニコチン含量とノルニコチン含量との合計（以下、「アルカロイド含量」ともいう）が０．０４％以下の個体が、ＳＮＩＣ４由来のＦ２世代について２５個、ＳＮＩＣ７由来のＦ２世代について１８個存在した（表５、表５中「Ｎｓｙ１－１」～「Ｎｓｙ１－５」は、対照として用いた野生型のニコチアナ・シルベストリス系統についての結果を示す）。その他の個体では最低でも２．３％のアルカロイド含量を示した。このことから、アルカロイド含量の明確な分離が確認された。アルカロイド含量が２．３％以上の個体数：アルカロイド含量が０．０４％以下の個体数の分離比は、ＳＮＩＣ４については７１：２５であり、ＳＮＩＣ７については、枯死した１２個体を除いて、６６：１８であった。これは、劣性一因子支配を想定した期待分離比（３：１）から外れておらず（χ２検定、ＳＮＩＣ４：ｐ＝０．８１、ＳＮＩＣ７：ｐ＝０．４５）、低アルカロイド性が劣性一因子に支配されていることが示唆された。また、同条件で栽培した野生型のニコチアナ・シルベストリスのアルカロイド含量は、３．１１～５．０３％であった。すなわち、低アルカロイド性を示すＦ２個体のアルカロイド含量は、野生型ニコチアナ・シルベストリスの０．８～１．３％以下であった。なお低アルカロイド性を示したＦ２系統は野生型のニコチアナ・シルベストリスと同様に正常に生育した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　〔実施例３：ＭｕｔＭａｐ解析による原因遺伝子の同定〕
　「ＭｕｔＭａｐ法」は、バルク分離分析（bulked segregant analysis、ＢＳＡ）と全ゲノムシーケンシング（whole genome sequencing、ＷＧＳ）とを組み合わせて、変異体の原因遺伝子領域を同定する手法である（Abe, A. et al., Nat. Biotechnol., 30(2): 174-178 (2012)）。この方法は、従来、行われているマップベースクローニング（map-based cloning）に比較して、マーカー作出の必要がなく、また、大量の個体を用いる必要もないことから、労力および時間が大幅に削減でき、より迅速な遺伝子同定が可能となる。
　ＭｕｔＭａｐ法においては、まず、所望の形質を有する変異体系統を、変異原処理に用いた親品種と交配してＦ１世代を得、さらに、Ｆ１個体を自殖してＦ２世代を得る。突然変異により得られた形質は、多くの場合劣性変異が原因と考えられる。従って、Ｆ１世代の表現型は野生型となり、Ｆ２世代の表現型は野生型：変異型が３：１に分離するはずである。
　Ｆ２世代において、遺伝的組換えにより、野生型のゲノムと変異体に由来する変異の入ったゲノムとがランダムに組み合わさり、個体ごとに固有の組み合わせを有するゲノムが生じる。そのため、変異型の表現型を示すＦ２個体由来のゲノムＤＮＡを混合（バルク）してＷＧＳに供した場合、染色体上の大部分の領域については変異を有するリードの出現頻度の期待値は０．５であるが、一方、変異体が示す表現型の原因となる変異およびその周辺領域における変異を有するリードの出現頻度は１となる。ＭｕｔＭａｐ法では、この変異を有するリードの出現頻度を「ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘ」とし、ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘ＝１が連続する領域に原因となる遺伝子（もしくは因子）が存在すると決定される。
　３－１．リファレンスゲノムの構築
　ニコチアナ・シルベストリスのエチオレート（Ethiolate）処理した葉からＣＴＡＢ法に従ってゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを、次世代シーケンサーを用いたヌクレオチド配列解析に供して、ゲノム配列を構築し、これをリファレンスゲノムとして使用した。構築したリファレンスゲノムは、３，５１８本のスカフォールド（scaffold）から構成され、Ｎ５０は４８．７Ｍｂであった。
　リファレンスゲノム中の遺伝子領域予測のために、ニコチアナ・シルベストリスから根（播種後６週間：根１、心止め後１週間：根２）、茎（開花後１週間）、葉（播種後６週間：葉１、開花後１週間：葉２、成熟期（心止め後４０日）：葉３、黄色乾燥２日目：葉４、空気乾燥３日目：葉５）、わき芽、花（茎頂：花１、蕾：花２、開花後１日：花３、開花後４日：花４）、発芽種子、カルス（根由来：カルス１、葉由来：カルス２）の総計１６種類の器官（ｎ＝３）からＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出して、ＮｅｘｔＳｅｑ５００（イルミナ社）によるＲＮＡ－ｓｅｑに供した。
　遺伝子領域の予測は、ＲＮＡ－ｓｅｑリードをリファレンスゲノムにマッピングし、機械予測と近縁植物のタンパク質配列に基づくＣＤＳ領域予測とを組合せることによって行った。
　３－２．ＭｕｔＭＡＰ解析
　ＳＮＩＣ４およびＳＮＩＣ７由来のＦ２個体のうち、低アルカロイド性を示したそれぞれ２５個体および１８個体のゲノムＤＮＡを、系統毎に等量混合し、異なる系統に由来する２種類のバルクＤＮＡを調製した。バルクＤＮＡを、Ｈｉｓｅｑ　Ｘ　ｔｅｎ（イルミナ社）を用いたペアエンドシーケンスに供し、それぞれ１３１Ｇｂおよび１３２Ｇｂのシーケンスデータを得た。得られたシーケンスデータを用いてＭｕｔＭａｐ解析を実施した。
　リファレンスゲノムとして、上記で構築したニコチアナ・シルベストリスゲノム配列を用いた。シーケンスリードのクオリティコントロール、シーケンスリードのリファレンスゲノムへのマッピング、および変異の抽出にはＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（キアゲン社）を用いた。解析の結果から、両系統に共通する候補領域を抽出し、さらにその領域内で両系統に共通して変異（ＳＮＰ－ｉｎｄｅｘ＝１）を有する遺伝子を探索した。
　その結果、Ｌ－アスパラギン酸オキシダーゼ（L-aspartate oxidase、ＡＯ）をコードする遺伝子（CDS ID：nsv1s000268m03938）が唯一の遺伝子として抽出された。ニコチアナ・シルベストリスのＡＯ遺伝子領域のゲノム配列を配列番号３５に示す。
　表６に示すプライマーを用いたＰＣＲおよびサンガーシーケンスにより、ＳＮＩＣ４については第２エキソンにストップコドンを生じるナンセンス変異（配列番号３５の３５６３位におけるＣ→Ｔ）が、ＳＮＩＣ７については第７エキソンにフレームシフト変異（配列番号３５の５１４１位におけるＣの欠失）が見いだされた。
　さらに、ＭｕｔＭＡＰ解析に供しなかった残りの４系統のＡＯ遺伝子の配列を確認したところ、当該４系統のＡＯ遺伝子では、以下の変異：
・ＳＮＩＣ１：第２エキソンにおける、中性アミノ酸から酸性アミノ酸への非保存的なアミノ酸置換（Ｖａｌ→Ｇｌｕ）を起こす置換（配列番号３５の３７５６位におけるＴ→Ａ）；
・ＳＮＩＣ２：第７エキソンにおけるナンセンス変異（配列番号３５の５５３３位におけるＣ→Ｔ）；
・ＳＮＩＣ５：第４エキソンの開始点におけるスプライス変異（配列番号３５の４２６６位におけるＧ→Ａ）；
・ＳＮＩＣ６：第３エキソンにおける、中性アミノ酸から塩基性アミノ酸への非保存的なアミノ酸置換（Ｇｌｙ→Ａｒｇ）を起こす置換（配列番号３５の４０３３位におけるＧ→Ａ）
が見いだされた。以上から、ＡＯ遺伝子における変異が低アルカロイド性の原因であると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　〔実施例４：タバコ（Nicotiana）属ＡＯ配列の特徴付け〕
　タバコ属には２つのＡＯ遺伝子、ＡＯ１およびＡＯ２が存在することが知られている。Kajikawaらの文献（2017, Plant physiology, 174:999-1011）では、ニコチアナ・タバカムＳゲノム上のＡＯ２遺伝子を「ＡＯ２．１」（Sol Genomicsのgene no. 19078）とし、ニコチアナ・タバカムＴゲノム上のＡＯ２遺伝子を「ＡＯ２．２」（Sol Genomicsのgene no. 71591）としている。また、ＡＯ１遺伝子は「ＡＯ１」（Sol Genomicsのgene no. 57190）としている。
　実施例３においてニコチアナ・シルベストリスの低アルカロイド性変異の原因遺伝子として同定したＡＯ（ID：nsv1s000268m03938）は、ＡＯ２．１と９９．９％の配列同一性、ＡＯ２．２と９７．６％の配列同一性、ＡＯ１と９３．１～９３．５％の配列同一性（複数のスプライシングバリアント有り）を示したことからＡＯ２遺伝子であると考えられたため、「ＮｓＡＯ２」と表記する。ただしＡＯ２．１の配列の長さは１１０７ｂｐしかなく、一方、上記ＮｓＡＯ２のＣＤＳの長さは１９４７ｂｐと長いため、ＡＯ２．１は不完全な配列で、上記ＮｓＡＯ２は完全な配列であると考えられた。また本願実施例で使用したニコチアナ・シルベストリスのゲノム配列には、上述の通り、もう一つのＡＯ（ID：nsv1s000268m03841）が存在し、これはKajikawaらによるＡＯ１と高い配列同一性（９８％）を示したため、「ＮｓＡＯ１」と表記する。
　ニコチアナ・シルベストリスの種々の器官及びステージで得られたＲＮＡを用いて行ったＲＮＡ－ｓｅｑ解析の結果により、ＮｓＡＯ１はいずれの器官でも低レベルに発現しているのに対して、ＮｓＡＯ２は根特異的に強く発現していることが示された（図２）。ニコチンの生合成は根で行われることから、ＮｓＡＯ２はニコチン生合成に寄与することが示唆された。
　ＮｓＡＯ２遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列（ＣＤＳ）を配列番号１に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。ＮｓＡＯ２遺伝子のＣＤＳをＮＣＢＩのデータベースに対する類似配列検索（BLAST、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）に供したところ、表７に示す遺伝子が９７％以上の配列同一性を示す遺伝子としてヒットした。これらはＡＯ２遺伝子であると考えられた。なおこれらの他に配列同一性が９３％台の遺伝子がヒットしたが、これらはＡＯ１であると考えられた。また、ＮｓＡＯ２のアミノ酸配列を同様に検索に供したところ、表８に示すアミノ酸が９７％以上の配列同一性を示すアミノ酸としてヒットした。これらはＡＯ２のアミノ酸配列であると考えられた。これらの他に配列同一性が９０％台のアミノ酸配列がヒットしたが、これらはＡＯ１のアミノ酸配列であると考えられた。
　タバコ（N. tabacum）品種「つくば１号」のゲノム配列を解析し、Ｓゲノムに由来すると考えられるＡＯ２（ＮｔＡＯ２－Ｓ、ID：nttv1s110m00779、配列番号３）およびＴゲノムに由来すると考えられるＡＯ２（ＮｔＡＯ２－Ｔ、ID：nttv1s507m02461、配列番号４）を同定した。ＮｔＡＯ２－ＳおよびＮｔＡＯ２－ＴのＣＤＳ配列をＮＣＢＩのデータベースに対する相同性検索に供したところ、表９に示す遺伝子がヒットした。相同性はいずれも９７％以上と高く、これらはＡＯ２遺伝子であると考えられた。なおこれらの他に相同性が９２～９３％台の遺伝子がヒットしたが、これらはＡＯ１遺伝子であると考えられた。また、ＮｔＡＯ２－ＳおよびＮｔＡＯ２－Ｔのアミノ酸配列（それぞれ配列番号５、配列番号６）を同様に検索に供したところ、表１０に示すアミノ酸がヒットした。相同性はいずれも９６％以上と高く、これらはＡＯ２のアミノ酸配列であると考えられた。なおこれらの他に相同性が９０～９２％台の遺伝子がヒットしたが、これらはＡＯ１のアミノ酸配列であると考えられた。
　遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ゼネティックス社）を用いて描いたタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属植物のＡＯアミノ酸配列の分子系統樹を図３に示す。さらに、タバコ（N. tabacum）「つくば１号」の種々の器官から調製したＲＮＡのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた、ＡＯ遺伝子（ＮｔＡＯ２－Ｓ、ＮｔＡＯ２－Ｔ、ＮｔＡＯ１－Ｓ、ＮｔＡＯ１－Ｔ）の発現プロファイルを図４に示す。ニコチアナ・シルベストリスと同様に、タバコのＡＯ１（ＮｔＡＯ１－Ｓ、ＮｔＡＯ１－Ｔ）は植物全体で構成的に弱く発現しており、一方、ＡＯ２（ＮｔＡＯ２－Ｓ、ＮｔＡＯ２－Ｔ）は根特異的に強く発現していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　以上の結果から、得られた植物体が示す表現型（アルカロイド量の低下）を、ＮｓＡＯ２における変異のみ（ＮｓＡＯ１には変異なし）が担っていることが、明らかになった。上記バルクＤＮＡのシーケンスデータも、以上の結果をさらに裏付けていた（すなわちＳＮＩＣ４およびＳＮＩＣ７のゲノムにあるＮｓＡＯ１に変異は存在しなかった）。
　〔実施例５：ＡＯ２の機能が抑制されたニコチアナ・タバカムおよびニコチアナ・シルベストリス組換え体の作出およびそのアルカロイド量の分析〕
　（５－１）植物体の組換え操作
　ニコチアナ・シルベストリスの幼苗の根からＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型にして、表１１に示すプライマーを使用して、２種類のＮｓＡＯ２の遺伝子断片（ＲＮＡｉのｔｒｉｇｇｅｒ配列）を増幅した。この遺伝子断片は、ニコチアナ・シルベストリスではＮｓＡＯ２を、ニコチアナ・タバカムではＮｔＡＯ２－ＳとＮｔＡＯ２－Ｔの双方を特異的に標的とするように設計したＲＮＡｉ用のトリガー配列である。ＰＣＲにはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）を用いた。プライマーの５’末端には後述のクローニングに使用するためのＣＡＣＣ配列が付加されている。
　ＰＣＲ産物をＭｉｎｉＥｌｕｔｅ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて精製した後、ベクターｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ－ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）にクローニングした。インサートのヌクレオチド配列を確認した後、ＧＡＴＥＷＡＹ（登録商標）ＬＲ　Ｃｌｏｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＲＮＡｉベクターｐＳＰ２３１（国際公開第２０１１／１０２３９４号公報を参照のこと）にインサートをクローニングした。ｐＳＰ２３１は、ｐＨｅｌｌｓｇａｔｅｓ１２（Wesley et al., Plant J., 27:581-590 (2001)を参照のこと）を基礎としたバイナリーベクターであり、Green Fluorescence protein (ＧＦＰ)遺伝子を含む。ｐＳＰ２３１では、ＲＮＡｉ配列（トリガー配列の逆位反復配列に挟まれているｐｄｋ／ｃａｔイントロンを有している）は、カリフラワーモザイクウイルス３５ＳＲＮＡ遺伝子プロモーターによって駆動される。ｐＳＰ２３１へのクローニング後、ＲＮＡｉトリガー配列とその向きを確認し、最終的なＲＮＡｉ構築物とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　得られたＲＮＡｉ構築物をニコチアナ・タバカムおよびニコチアナ・シルベストリスに導入することによって、ニコチアナ・タバカムのＡＯ２遺伝子（ＮｔＡＯ２－ＳおよびＮｔＡＯ２－Ｔ）またはニコチアナ・シルベストリス中のＡＯ２遺伝子の機能を抑制することができる。
　プライマーセット（配列番号２１および２２）を用いて増幅したトリガー配列を有するＲＮＡｉ構築物を、エレクトロポレーションによりアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４に導入した。得られた形質転換体アグロバクテリウムにおいて、ＲＮＡｉトリガー配列の存在をＰＣＲによって確認した後に、当該アグロバクテリウムを用いて品種「つくば１号」（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）の形質転換を実施した（以下、「ＮｔＡＯ２－ＲＮＡｉ系統」と記載する）。対照として、トリガー配列を含まないｐＳＰ２３１ベクターを導入したアグロバクテリウムによるつくば１号の形質転換体（以下、「Ｅｍｐｔｙ系統」と記載する）を作出した。
　アグロバクテリウムを葉切片に感染させ、かつカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬｉｎｓｍａｉｅｒ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ（ＬＳ）培地上で培養することによって得られたカルスから、カナマイシン耐性の再分化個体を得た。当該再分化個体のうち、葉全体にＧＦＰ蛍光を確認できた個体を、プラントボックスで育成し、プラントボックス内で十分に生長した時点で３号鉢に移植した。移植の際に、各個体の葉および根の一部をサンプリングし、液体窒素で凍結後に－８０℃で保管した。
　（５－２）所望の組換え体の選抜
　次に、移植された個体のうち、ＲＮＡｉによってＮｓＡＯ２が機能抑制されている個体を決定した。決定のために、サンプリングした葉および根におけるＮｓＡＯ２　ｍＲＮＡを、以下のように、リアルタイムＰＣＲによって定量した。
　サンプリングした葉および根から、ＲＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡの、０．５μｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｅｒａｓｅｒ（タカラバイオ社）を用いた逆転写によって、ゲノムＤＮＡの除去およびｃＤＮＡの合成を行った。合成したｃＤＮＡ　１μＬを鋳型に、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（サーモフィッシャー社）を使用して１０μＬの反応系でリアルタイムＰＣＲを実施した。ｅｌｆα（elongation Factor-1 α）を基準遺伝子として用いたΔΔＣｔ法によって、ターゲット遺伝子の転写物量を確認した。
　各遺伝子の検出に用いたプライマーおよびプローブの配列を表１２に示した。なお、ＡＯ１およびＡＯ２の検出に用いたプライマーおよびプローブの一部は、各遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列に対して設計されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　リアルタイムＰＣＲの結果（図５）に基づいて以下のような転写物の存在量を示す６個体を決定した。図５は、各系統の転写物量を、Ｅｍｐｔｙ－１２の転写物量（縦軸の値１）に対する相対値として表している。図５では、「ＡＯ２－（数字）」はＮｔＡＯ２－ＲＮＡｉ系統、「Ｅｍｐｔｙ－（数字）」は対照系統を指し、エラーバーは測定誤差（３反復試験間の標準誤差）を表す。
・根：対照と比べて非常に少ない量の、ＡＯ（ＡＯ１およびＡＯ２の両方）およびＡＯ２転写物
・葉：対照と同等の量の、ＡＯおよびＡＯ１転写物
上記６個体を、ＡＯ２転写物のみが減少しており、ＡＯ１転写物が減少していない個体として、選抜した。上記６個体におけるＡＯ１およびＡＯ２の転写プロファイルを、このように決定した理由を、以下に述べる。これ以降、特に断りがなければ、「ＡＯ」は「ＡＯ１およびＡＯ２の両方」、「ＡＯ１」は「ＡＯ１のみ」、「ＡＯ２」は「ＡＯ２のみ」を表す。
　まず、タバコ属植物体におけるＡＯ発現プロファイルは、以下の通り（図４および非特許文献６を参照）。
ＡＯ１の発現：各組織において恒常的な、比較的に低レベルの発現。
ＡＯ２の発現：根において特異的な、高レベルの発現、および他の組織において極めて低レベルの発現。
つまり、タバコ属植物体の根における転写物（ＡＯおよびＡＯ２）を定量すれば、タバコ属植物体におけるＡＯ２転写物量の減少を判定できる。
　図４のグラフを作成するための実測値の一部を表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１３から、タバコ属植物体の根におけるＡＯ２転写物の十分な減少は、タバコ属植物体（全体）におけるＡＯ２転写物の十分な減少を意味することが分かる（図５の右下）。また、表１３から、タバコ属植物体の葉におけるＡＯ１転写物の維持（対照と比べた組換え体における）は、オフターゲット効果（上記ＲＮＡｉ構築物によるＡＯ１転写物の非特異的な減少）の実質的な非存在を意味することが分かる（図５の右上）。また、根および葉におけるＡＯ転写物量（ＡＯ１転写物およびＡＯ２転写物の両方）の決定は、上記意味を補足し得る（図５の左下および左上）。表１３に示されている、組織ごとに異なるＡＯ１およびＡＯ２転写パターンに基づいて、葉（ＡＯ２転写物がほぼない）のＡＯ転写物量は、ＡＯ１転写物量を実質的に表し、根（ＡＯ２転写物が大部分を占める）のＡＯ転写物量は、ＡＯ２転写物量を実質的に表すからである。
　（５－３）選抜した組換え体および対照におけるアルカロイド含量の評価
　得られた６個体のＮｔＡＯ２－ＲＮＡｉ系統および３個体のＥｍｐｔｙ系統を、３号鉢に鉢上げ後、およそ１カ月間、人工気象室（２８℃で１６ｈ明期、２２℃で８ｈ暗期）で育成した。その後、人工気象室を低温短日条件（１８℃、８ｈ日長）に切り替え、育成した。低温短日条件で育成後、２～４枚の中位葉を、開花期に採取し、７０℃で１６時間乾燥し、粉砕し、マイナーアルカロイド分析試験に供した。試験の結果を、表１４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　表１４に示す通り、対照の試料では、０．０８～０．２３％（０．８～２．３ｍｇ／ｇ乾燥葉）のニコチンおよびノルニコチンが検出された。ＮｔＡＯ２－ＲＮＡｉ系統の試料では、ニコチンは検出限界以下（ＮＤ）であり、６個体のうち２個体から、ノルニコチンが検出された（０．００８％、０．００７％）。以上の通り、ニコチアナ植物におけるＡＯ２の機能抑制は、アルカロイド量の低下を示すことが、証明された。
　ここで、非特許文献９では、ＡＯ２（非特許文献９の表記ではＡＯ１）転写物を減少させた個体（以下「Ｄ９＿ＡＯ２－ＲＮＡｉ」と記載する）において、下位葉に斑が発生し、老化が早まったと記載されている。しかし、ＮｔＡＯ２－ＲＮＡｉ系統および対照の全個体は、正常に生育していることを確認した（非特許文献９に記載の現象は認められなかった）。
　Ｄ９＿ＡＯ２－ＲＮＡｉの葉では、ＡＯの転写物量が野生型植物と比べて低下（最大で１．４、最小で１０．９まで）している（非特許文献９のFig. 5）。しかし、表１３に証明されている通り、葉におけるＡＯ転写物はＡＯ２転写物をほぼ含まない（ＡＯ２の転写物をほぼ生じていない）。したがって、Ｄ９＿ＡＯ２－ＲＮＡｉにおけるＡＯ転写物量の低下は、ＡＯ１の転写物量の低下を実質的に反映している。
　本実施例で作出されたタバコ属植物体は、ＡＯ２転写物量の低下およびＡＯ１転写物量の維持を示した。当該タバコ属植物体は、正常に生育した（非特許文献９に記載の上述の現象を示さなかった）。当該タバコ属植物体は、対照と比べて大幅に低下したアルカロイド含量を示した。つまり、ＡＯ２発現が特異的に抑制されているタバコ属植物体は、たばこ栽培にとって有用な形質（アルカロイド含量の低下および正常な成育）を示すことが、わかった。
　〔実施例６：ＡＯ２の機能が抑制されたタバコ変異体の作出〕
　ＡＯ２－ＳまたはＡＯ２－Ｔに変異を有するタバコ変異体を取得した。
　２０００系統のタバコ変異体についてＮｔＡＯ２－ＳとＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子領域のヌクレオチド配列を解析し、変異を同定した。詳細には、タバコ品種つくば１号の種子にＥＭＳ処理を行って作製したタバコ変異体２０００個体のＭ１世代ごとに得られた変異体自殖後代種子（Ｍ２種子）を播種し、育成した各系統当たり８個体の幼苗から抽出したＤＮＡをバルクにし（田島ら、平成２３年度日本植物病理学会大会、Ｐ２３４、タバコ変異体パネルの作出）、ヌクレオチド配列を解析した。ＮｔＡＯ２－ＳとＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子領域のゲノム配列をそれぞれ配列番号３６および３７に示す。
　その結果、ＮｔＡＯ２－ＳまたはＮｔＡＯ２－Ｔにナンセンス変異、フレームシフト変異またはスプライス変異のいずれかを有する系統が、それぞれ１１系統（計２２系統）見出された（表１５および表１６）。これら全ての系統において、もう片方のゲノム（Ｓゲノム上に変異があるときにはＴゲノム、またはＴゲノム上に変異があるときにはＳゲノム）上にあるＡＯ２遺伝子には変異がなく野生型のままであった。すなわち、ＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子に変異を有する系統でＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子に変異はなく、ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子に変異を有する系統ではＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子に変異はなかった。両遺伝子について３つずつ変異体を選択し、それらの系統の種子を播種して幼苗時にＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として表１７に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、変異をホモ接合で有する個体を選抜した。ＰＣＲにはＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　その結果、ＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子中に変異を有する３つの系統が得られた。そのうち２つの系統においては、１つのナンセンス変異（ＮｔＡＯ２－Ｓタンパク質の１５０番目のグルタミン（Ｑ）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換（Ｃ→Ｔ；配列番号３６の３７９２位）によって終止コドンに変化している）がＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子についてホモ接合型に生じていた（ＮｔＡＯ２－ｓ－１、およびＮｔＡＯ２－ｓ－２）。
　もう１つの系統においては、１つのスプライス変異（ＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子の第三イントロンの５’側が、ヌクレオチド置換（Ｇ→Ａ；配列番号３６の４１７８位）により正常にスプライスされない）がＮｔＡＯ２－Ｓ遺伝子においてホモ接合型に生じていた（ＮｔＡＯ２－ｓ－３）。
　また、ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子中に変異を有する３つの系統が得られた。第一の系統においては、１つのナンセンス変異（ＮｔＡＯ２－Ｔタンパク質の４２番目のグルタミン（Ｑ）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換（Ｃ→Ｔ；配列番号３７の３１２４位）によって終止コドンに変化している）がＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子においてホモ接合型に生じていた（ＮｔＡＯ２－ｔ－１）。
　第二の系統においては、１つのナンセンス変異（ＮｔＡＯ２－Ｔタンパク質の４８番目のトリプトファン（Ｗ）をコードしているコドンが、ヌクレオチド置換（Ｇ→Ａ；配列番号３７の３２８８位）によって終止コドンに変化している）がＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子においてホモ接合型に生じていた（ＮｔＡＯ２－ｔ－２）。
　第三の系統においては、１つのスプライス変異（ＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子の第三イントロンの３’側が、ヌクレオチド置換（Ｇ→Ａ；配列番号３７の４０７８位）により正常にスプライスされない）がＮｔＡＯ２－Ｔ遺伝子においてホモ接合型に生じていた（ＮｔＡＯ２－ｔ－３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）のＮｔＡＯ２－ＳまたはＮｔＡＯ２－Ｔの変異体それぞれについて、ニコチン含量低下効果を調査した。
　植物（変異体）を温室にて育成し、開花期の本葉３枚をサンプリングした。７０℃で８時間乾燥させ後に粉砕し、マイナーアルカロイド分析に供した。
　その結果、ＡＯ２遺伝子が破壊されていないタバコ変異体２系統のニコチン含量は０．３４％および０．４１％であった（平均で０．３８％）。一方、ＡＯ２－Ｓの変異体２系統（ＮｔＡＯ２－ｓ－２、ＮｔＡＯ２－ｓ－１）のニコチン含量は０．１０および０．１６％であり（平均で０．１３％、対照の３４％）、ＡＯ２－Ｔの変異体（ＮｔＡＯ２－ｔ－２）のニコチン含量は０．１８％（対照の４７％）であった。また、アナタビン含量は、ＡＯ２遺伝子が破壊されていないタバコ変異体では０．０１２％～０．０１６％であった。一方、ＡＯ２－ＳおよびＡＯ２－Ｔ単独変異体では０．００４％～０．００９％とおよそ半減していた。ノルニコチンおよびアナバシンの含量はいずれも定量限界以下であった。通常、ニコチアナ・タバカムの遺伝子に変異を生起させて表現型を得るためには、Ｓゲノム由来の遺伝子およびＴゲノム由来の遺伝子の両方に変異を生じさせる必要がある（例えば、Liedschulteら(2017) Plant Cell Environ. 40:364-377) 。しかし本発明においては、単一の遺伝子（ＮｔＡＯ２－Ｓ、またはＮｔＡＯ２－Ｔ）の変異でもニコチン低減効果があることが示された。
　このことから、タバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）中に２つ存在するＡＯ２遺伝子であるＡＯ２－ＳおよびＡＯ２－Ｔのいずれか一方単独の変異によってニコチン含量がほぼ半減することが示された。また、ＡＯ２－ＳとＡＯ２－Ｔの両方の変異を有する変異体においてはニコチンをはじめとするアルカロイドの含量が極めて低くなる可能性が高いことが示された。
　ＮｔＡＯ２－ｓ－１およびＮｔＡＯ２－ｔ－１を温室（２４℃）で育成し、交配することによって、Ｆ１世代を得た（ＮｔＡＯ２－Ｆ１－１）。ＮｔＡＯ２－ｓ－２およびＮｔＡＯ２－ｔ－２を温室で育成し、交配することによって、Ｆ１世代を得た（ＮｔＡＯ２－Ｆ１－２）。各Ｆ１世代を温室で育成し、自殖することによって、異なる変異体系統に由来する２系統のＦ２世代を得た（ＮｔＡＯ２－Ｆ２－１およびＮｔＡＯ２－Ｆ２－２）。
　２系統のＦ２世代を播種し、仮植苗からＤＮＡを抽出し、かつ表１７のプライマーを用いたＰＣＲによって、変異周辺の配列を増幅した。ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いた増幅産物のシークエンシングにおいて利用される配列（Ｐ７配列、Ｐ５配列および個体ごとのバーコード配列）を、当該増幅産物に付加するＰＣＲを行った。それから、上記配列が付加されている上記増幅産物を、ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いたシークエンシングに供試し、各個体の遺伝子型を確認した。
　その結果、ＮｔＡＯ２－ＳおよびＮｔＡＯ２－Ｔに変異をホモ接合型で有する個体（ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔ）および両遺伝子に変異を有さない個体（ＮｔＡＯ２－ＳＳＴＴ）の組を、２組、得た。これらの個体について、３号鉢に鉢上げ後、ＰＣＲおよびサンガーシークエンスによって配列決定を行い、遺伝子型を確定した（表１８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　各個体を１／５０００ワグネルポットに移植し、開花期に心止めした。３週間後に各個体から２枚の本葉（追肥なし）を採取した。２枚の本葉を採取した後の個体のうち、比較的良好な成育を示す３個体を各遺伝子型ごとに選び、これらに追肥処理を行った。具体的には、上から３枚の葉を残して葉をすべて除去し、たばこ用有機入り化成肥料バーレーＳ６２５（清和肥料工業株式会社）を５０ｇ施用した。約３週間後に各個体から３枚すべての葉（追肥あり）を採取した。採取した本葉（追肥なし）、および葉（追肥あり）をそれぞれ、中骨を除去した後に７０℃で１６時間乾燥して粉砕し、マイナーアルカロイド分析に供した。
　分析の結果として、ＡＯ２の４対立遺伝子に変異を有している個体（ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔ）は、当該４対立遺伝子に変異を有していない個体（ＮｔＡＯ２－ＳＳＴＴ）と比べて、大幅に低下したニコチン含量（図６および表１９）および総アルカロイド含量（表１９）を示した。
　追肥なしの葉におけるニコチン含量には、２組のそれぞれにおいて、ＡＯ２の全対立遺伝子に変異あり（ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔ）および変異なし（ＮｔＡＯ２－ＳＳＴＴ）の間に大きな差（ｔ検定、１％の水準、有意差あり）が認められた。図６の左パネルに示すように、組ＮｔＡＯ２－Ｆ２－１におけるニコチン含量（平均値±標準偏差）は、変異あり：検出限界以下、および変異なし：０．１８％±０．０９９％であった。図６の右パネルに示すように、組ＮｔＡＯ２－Ｆ２－２におけるニコチン含量（平均値±標準偏差）は、変異あり：０．０１％±０．０２％、および変異なし：０．５６％±０．２８６％であった。
　追肥ありの葉におけるニコチン含量および総アルカロイド含量（ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシンおよびミオスミン量の総和）を、表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　また、詳細には、追肥処理後のサンプルについて、ニコチン含量は、対照のＮｔＡＯ２－ＳＳＴＴにおいては、ＮｔＡＯ２－Ｆ２－１で２．０７～３．６２％およびＮｔＡＯ２－Ｆ２－２で１．０５～３．２２％であった。一方、ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔにおいては、ＮｔＡＯ２－Ｆ２－１で０．０１～０．０２％およびＮｔＡＯ２－Ｆ２－２で３個体とも０．０１％であった（表１９）。また、総アルカロイド含量（ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシンおよびミオスミン量の総和）は、対照のＮｔＡＯ２－Ｆ２－１で２．２９～４．１３％およびＮｔＡＯ２－Ｆ２－２で１．２０～３．７４％であった。一方、ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔにおいては、ＮｔＡＯ２－Ｆ２－１で０．０１～０．０２％およびＮｔＡＯ２－Ｆ２－２で３個体とも０．０１％であった（表１９）。
　表１９に示すように、ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔにおける追肥ありの葉は、０．０１～０．０２％のニコチン含量を有していた。ＮｔＡＯ２－ＳＳＴＴにおける追肥ありの葉は、１．０５～３．６２％のニコチン含量を有していた。この値は、一般的な圃場栽培個体のニコチン含量である１．５～４．５％（非特許文献１を参照）と同程度である。したがって、ＮｔＡＯ２－ｓｓｔｔは、極めて低いニコチン含量および総アルカロイド含量（いずれも遺伝子型ＳＳＴＴの含量に対する１％未満の含量）を示した。
　なお、全個体は、草丈または着葉数にばらつき（遺伝子型に基づく差異はなし）を有していたが、おおむね正常に生育した。以下の通り、ＡＯ２遺伝子の変異に基づかない斑の発生が、一部の個体において認められた。
　ＮｔＡＯ２－Ｆ２－１では、葉における斑の発生または早期の老化は認められなかった。ＮｔＡＯ２－Ｆ２－２では、ｓｓｔｔおよびＳＳＴＴの両方に（ＡＯ２遺伝子の変異と無関係に）、外観の類似する斑の発生が葉に認められた。したがって、斑の発生は、系統ＮｔＡＯ２－Ｆ２－２に共通する、ＡＯ２遺伝子以外の変異に起因すると考えられる。また、上記斑の外観は、後述する比較例の変異体（ＡＯ１の機能が抑制されている）に認められる斑の外観と、明らかに異なっていた。
　ＡＯ２の全対立遺伝子に変異を有しており、ＡＯ１の全対立遺伝子に変異を有していない、本実施例のタバコ属植物体は、正常に生育した。当該タバコ属植物体は、対照と比べて大幅に低下したアルカロイド含量を示した。つまり、機能的なＡＯ２タンパク質を発現しないタバコ属植物体は、たばこ栽培にとって有用な形質（アルカロイド含量の低下および正常な成育）を示すことが、わかった。
　〔比較例１：ＡＯ１の機能が抑制されたタバコ変異体〕
　ＡＯ１－ＳまたはＡＯ１－Ｔに変異を有するタバコ変異体を、以下のように作出した。
　２０００系統のタバコ変異体を実施例６と同様に解析することによって、ＮｔＡＯ１－Ｓに変異を有するＮｔＡＯ１－Ｓ変異体（１５系統）およびＮｔＡＯ１－Ｔに変異を有するＮｔＡＯ１－Ｔ変異体（１２系統）を同定した。ＮｔＡＯ１－Ｓ変異体がＮｔＡＯ１－Ｔに変異を有していなこと、およびＮｔＡＯ１－Ｔ変異体がＮｔＡＯ１－Ｓに変異を有していないことを確認した。３系統のＮｔＡＯ１－Ｓ変異体（表１８における１行目～３行目）および３系統のＮｔＡＯ１－Ｔ変異体を、選択し、それらの種子を播種し、それらの幼苗からＤＮＡを抽出した。当該ＤＮＡを鋳型に用い、かつプライマーセットを用いたＰＣＲによって、ホモ接合型の変異を有する決定した。ＰＣＲでは、ＫＯＤ　Ｏｎｅ（登録商標）ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ社）を使用した。表２０に、変異体の名称（１～３行目：ＮｔＡＯ１－Ｓ変異体の系統、４～６行目：ＮｔＡＯ１－Ｔ変異体の系統）、変異の種類、および変異の決定（ＰＣＲ）に用いたプライマーをまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　ＮｔＡＯ１－ｓ－１は、ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子において、１つのナンセンス変異（ＯＲＦ内の１コドンの、終始コドンへの変化）をホモ接合型に生じていた。当該ナンセンス変異は、野生型ＮｔＡＯ１－Ｓタンパク質の４１番目にあるグルタミン（Ｑ）をコードしているコドンに生じている、ヌクレオチド置換（Ｃ→Ｔ）である。
　ＮｔＡＯ１－ｓ－２は、ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子において、１つのナンセンス変異をホモ接合型に生じていた。当該ナンセンス変異は、野生型ＮｔＡＯ１－Ｓタンパク質の１４６番目にあるグルタミン（Ｑ）をコードしているコドンに生じている、ヌクレオチド置換（Ｃ→Ｔ）である。
　ＮｔＡＯ１－ｓ－３は、ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子において、１つのナンセンス変異をホモ接合型に生じていた。当該ナンセンス変異は、野生型ＮｔＡＯ１－Ｓタンパク質における２７７番目にあるグリシン（Ｇ）をコードしているコドンに生じている、ヌクレオチド置換（Ｇ→Ｔ）である。
　ＮｔＡＯ１－ｔ－１は、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子において、１つのナンセンス変異をホモ接合型に生じていた。当該ナンセンス変異は、野生型ＮｔＡＯ１－Ｔタンパク質の４４番目にあるトリプトファン（Ｗ）をコードしているコドンに生じている、ヌクレオチド置換（Ｇ→Ａ）である。
　ＮｔＡＯ１－ｔ－２は、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子において、１つのナンセンス変異をホモ接合型に生じていた。当該ナンセンス変異は、野生型ＮｔＡＯ１－Ｔタンパク質の６１番目にあるグルタミン（Ｑ）をコードしているコドンに生じている、ヌクレオチド置換（Ｃ→Ｔ）である。
　ＮｔＡＯ１－ｔ－３は、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子において、１つのスプライス変異（スプライス異常を起こすヌクレオチド置換）をホモ接合型に生じていた。当該スプライス変異は、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子の第２エキソンの３’側の末端に生じているヌクレオチド置換（Ｇ→Ａ）である。
　以上の変異体を温室で育成した。ＮｔＡＯ１－ｓ－１とＮｔＡＯ１－ｔ－１を交配することによって、Ｆ１世代を得た（ＮｔＡＯ１－Ｆ１－１）。ＮｔＡＯ１－ｓ－２とＮｔＡＯ１－ｔ－２を交配することによって、Ｆ１世代を得た（ＮｔＡＯ１－Ｆ１－２）。各Ｆ１世代を育成し、自殖することによって、異なる変異体系統に由来する２系統のＦ２世代を得た（ＮｔＡＯ１－Ｆ２－１およびＮｔＡＯ１－Ｆ２－２）。
　２系統のＦ２世代を播種し、各１９２個体の仮植苗からＤＮＡを抽出し、表２０のプライマーを用いたＰＣＲによって、変異周辺の配列を増幅した。ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いた増幅産物のシークエンシングにおいて利用される配列（Ｐ７配列、Ｐ５配列および個体ごとのバーコード配列）を、当該増幅産物に付加するＰＣＲを行った。それから、上記配列が付加されている上記増幅産物を、ｉＳｅｑ　１００（イルミナ社）を用いたシークエンシングに供試し、各個体の遺伝子型を確認した。
　その結果、ＮｔＡＯ１－Ｆ２－１およびＮｔＡＯ１－Ｆ２－２の全個体のなかには、ＮｔＡＯ１－ＳおよびＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子に上述の変異をホモ接合型に有する遺伝子型の個体は存在しなかった。シロイヌナズナのＡＯ（タバコ属植物におけるＡＯ１に相当）の機能破壊変異体は、胚性致死であると報告されている（Katoh, A. et al. (2006) Plant Physiology 141: 851-857）。したがって、タバコでもＡＯ１（ＡＯ１－ＳおよびＡＯ１－Ｔ）の変異体は、致死性を示すと考えられる。
　次いで、ＮｔＡＯ１－Ｆ２－１およびＮｔＡＯ１－Ｆ２－２のうち、以下の（１）～（５）の遺伝子型を示す個体（１遺伝子型ごとに複数の個体）を、３号鉢に鉢上げし、ＰＣＲおよびサンガーシークエンスによる遺伝子型確認後、温室（２４℃）にて育成した（表２０）。育成した個体の遺伝子型および個体数を表２１に示す。
　（１）ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子に変異をホモ接合型に有し、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子に変異を有さない個体（ＮｔＡＯ１－ｓｓＴＴ）、
　（２）ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子に変異を有さず、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子に変異をホモ接合型に有する個体（ＮｔＡＯ１－ＳＳｔｔ）、
　（３）ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子に変異をヘテロ接合型に有し、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子に変異をホモ接合型に有する個体（ＮｔＡＯ１－Ｓｓｔｔ）、
　（４）ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子に変異を有さず、ＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子に変異をヘテロ接合型に有する個体（ＮｔＡＯ１－ＳＳｔＴ）、ならびに
　（５）ＮｔＡＯ１－Ｓ遺伝子およびＮｔＡＯ１－Ｔ遺伝子に変異を有さない個体（ＮｔＡＯ１－ＳＳＴＴ）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　育成した個体（アルカロイド含量および成育状態）を、以下のように評価した。
　開花期に２～４枚の中位葉を採取し、７０℃で１６時間乾燥後、粉砕した葉をマイナーアルカロイド分析に供した。その結果、（１）～（４）および（５）の間に、遺伝子型によるアルカロイド含量に差異は認められなかった（図７）。個体（１）～（４）の生育はおおむね正常であった。しかし、１つ以上の変異アレルを含んでいる個体（１）～（４）の半数では、下位葉に斑が認められた（表２１、図８）。個体（５）には、斑が認められなかった。以上の結果を表２２にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　ＡＯ１は、生命活動に必須のＮＡＤ＋の生合成に関わり、植物の生命活動に重要な役割を果たす酵素遺伝子である。当該役割の重要性は、上述の通り、ＡＯ１の機能が破壊されている変異体が致死を示すことからも明らかである。したがって、ＡＯ１遺伝子に存在する１つ以上の変異アレルは、植物の生理状態に悪影響を及ぼし、変異のない個体に認められない異常（葉における斑の発生など）を生じさせると考えられる。
　非特許文献９のＤ９＿ＡＯ２－ＲＮＡｉにも、上記異常と類似の現象が認められている。Ｄ９＿ＡＯ２－ＲＮＡｉでは、葉におけるＡＯ転写物量の低下（上述の通り、ＡＯ１の転写物量の低下を実質的に表すと考えられる）が認められている。上記現象および上記低下に、本比較例の結果を考え合わせると、Ｄ９＿ＡＯ２－ＲＮＡｉでは、ＡＯ２およびＡＯ１の両方の機能が抑制されているとの予想は合理的である。
　以上のことから、正常な成育および葉におけるアルカロイドの含量の低下を両立するには、ＡＯ２遺伝子の機能抑制およびＡＯ１遺伝子の機能維持の両方が、少なくとも必要であることが分かる。
　本発明によれば、低アルカロイド含量のタバコ属植物体が提供される。

Claims (21)

  1. 　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異がゲノム中の当該内在性遺伝子に導入されている、タバコ属植物体。
  2. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの存在量の減少である、請求項１に記載のタバコ属植物体。
  3. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項２に記載のタバコ属植物体。
  4. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、請求項２に記載のタバコ属植物体。
  5. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項１～４のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  6. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項５に記載のタバコ属植物体。
  7. 　上記変異は、変異原処理、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項１～６のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  8. 　ニコチアナ・タバカム、ニコチアナ・シルベストリスまたはニコチアナ・ルスチカに属する、請求項１～７のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  9. 　（ｃ）配列番号６２または配列番号６３に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｄ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されていない、請求項１～８のいずれか１項に記載のタバコ属植物体。
  10. 　タバコ属植物体の製造方法であって、
    　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子の少なくとも一方の機能抑制を特異的に引き起こす変異を、タバコ属植物体のゲノムに導入する工程を含み、
    　上記導入する工程が、上記内在性遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、タバコ属植物体の製造方法。
  11. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの存在量の減少である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子から生成されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記内在性遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、請求項１１に記載の製造方法。
  14. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの存在量の減少である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　上記機能抑制は、野生型植物と比べたときの、上記ポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　上記導入する工程が、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、請求項１０～１５のいずれか１項に記載の製造方法。
  17. 　（ｃ）配列番号６２または配列番号６３に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子、および
    　（ｄ）配列番号６４に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる内在性遺伝子が機能抑制されないことを、さらに含んでいる、請求項１０～１６のいずれか１項に記載の製造方法。
  18. 　請求項１～９のいずれか１項に記載のタバコ属植物体、または請求項１０～１７のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ属植物体の、子孫または当該タバコ属植物体の交配によって得られた育種後代。
  19. 　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および／または
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
    　野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこと比べて、低いアルカロイド含量を示す、葉たばこ。
  20. 　（ａ）配列番号２または配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、および／または
    　（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９５％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをコード領域として含んでいる、ゲノム上の内在性遺伝子に、当該内在性遺伝子の機能を抑制する変異を有しており、
    　野生型タバコ属植物体から収穫された葉たばこから生成された乾燥葉と比べて、低いアルカロイド含量を示す、乾燥葉。
  21. 　請求項２０に記載の乾燥葉を含んでいる、たばこ製品。
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