CN115485386B

CN115485386B - 低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法

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Publication number: CN115485386B
Application number: CN202180028659.6A
Authority: CN
Inventors: 竹内贵规; 新井雅雄; 宇田川久史; 真笼洋; 西口辽; 高仓由光
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2021-04-19
Publication date: 2024-03-29
Anticipated expiration: 2041-04-19
Also published as: EP4136964A1; JPWO2021210688A1; JP7210806B2; CN115485386A; WO2021210688A1; BR112022021066A2; US20230120622A1

Abstract

本发明的一个实施方式提供低生物碱含量的烟草属植物体。在烟草属植物体中，编码天冬氨酸氧化酶AO2的基因的功能受到了抑制。

Description

低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法

技术领域

本发明涉及低生物碱含量的烟草属植物体及其制备方法。

背景技术

以往，作为对烟草(红花烟草(Nicotiana tabacum))带来低生物碱性的自然突变的基因座，已知有Nic1及Nic2基因座。在两个基因座分别存在与尼古丁生物合成相关的若干转录因子等的基因。在尼古丁减少的nic1突变体及nic2突变体中，在基因组中存在很大的缺失，它们的基因从基因组上消失。在两个基因座均以纯合方式具有突变的情况下，尼古丁含量达到一般的烟草品种(15～45mg/g)的10％左右(2-4.5mg/g干叶)(非专利文献1)。目前为止，报告了各种使烟草中的尼古丁等生物碱含量降低的研究。例如，非专利文献1中总结了基于尼古丁的生物合成体系的酶QPT、PMT、BBL的基因的功能抑制而得到低尼古丁烟草的制备例，这些基因的功能受到了抑制的烟草中的尼古丁含量分别为1.4mg/g干叶、0.6-2.2mg/g干叶、4.1-4.4mg/g干叶。在这些基因当中，也包括因抑制表达而发生畸形的基因(QPT)(非专利文献2)。另一方面，报告了在PMT的功能受到了抑制的烟草中，效果最好的品系中尼古丁含量较对照减少了96.7％，即降低至对照的3.3％(非专利文献3)，此外，还报告了在BBL的敲除品系中尼古丁含量减少至对照的0.3％(非专利文献4)。但是，在这些报告中，尽管尼古丁减少效果明显，但需要将烟草基因组中存在的5个PMT全部进行功能抑制，而且需要将烟草基因组中存在的6个BBL全部敲除，因此，在实际进行育种方面存在很大的障碍。

非专利文献5及非专利文献6中报告了对属于烟草属的植物中与生物碱的生物合成相关的各种基因及其表达进行研究的结果，表明在属于烟草属的植物中存在AO1及AO2这2个天冬氨酸氧化酶(AO)基因，AO1在植物体整体普遍性表达，AO2在根特异性地表达。AO是通过催化天冬氨酸的氧化而生成亚氨基天冬氨酸的酶。AO是参与烟酸及烟酰胺的代谢的生物体内的重要的酶。

专利文献1中记载了通过与NBB1或A622基因组合将尼古丁生物合成酶基因(包含AO基因)调节为较低水平，从而使生物碱含量减少。专利文献2中记载了通过利用基因组编辑技术使尼古丁生物合成基因(包含AO基因)的表达降低，从而减少尼古丁类似生物碱。但是，在专利文献1及2中，实际上没有对AO基因进行处理的实验结果，而且也没有区分AO1和AO2。

另外，最近，在烟草中，在作为对尼古丁生物合成酶基因簇进行正向调节的转录因子的ERF189及ERF199这2个基因的敲除品系中，显示出生物碱含量降低至对照的2～4％(非专利文献7)。在该品系中，处于ERF189及ERF199控制下的多个尼古丁生物合成系基因簇、例如PMT、AO2的表达量减少至对照的3％左右(不会变为零)。但是，转录因子的敲除会影响各种基因簇的转录，抑制多个基因的功能，存在对植物的代谢途径造成影响的隐患。实际上，该品系中显示出碳(C)/氮(N)比的平衡被破坏。

需要说明的是，已知在烟草以外的植物中，AO基因的功能破坏会导致对生物体的致死性(非专利文献8)。

非专利文献9中记载了将烟草AO2(非专利文献9中记载为AO1)的RNAi构建体导入烟草而减少了AO2的转录物量的转化烟草中，掐尖后2周上位叶的尼古丁含量减少至对照的0.5％以下～14％左右。非专利文献9中还记载了尼古丁含量低的个体在完全展开叶及下位叶(成熟叶)中显示出早期老化的表型(产生白色至红豆色的斑点)。红花烟草为双二倍体植物，其基因组包含来自于林烟草(S)的基因组和来自于绒毛状烟草(T)的基因组，多数情况下，红花烟草的基因存在来自于S基因组的基因和来自于T基因组的基因这2种。但是，非专利文献9中没有公开AO2-T基因的序列，也没有区分AO2-S及AO2-T基因。而且，没有记载作为非重组体的突变体，并且也没有除红花烟草以外的烟草属植物的实施例。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2006/109197号(2006年10月19日公开)

专利文献2：国际公开第2018/222667号(2018年12月6日公开)

非专利文献

非专利文献1：Lewis,R.S.(2018)Potential Mandated Lowering of NicotineLevels in Cigarettes：A Plant Perspective.Nicotine&Tobacco Research,1-5

非专利文献2：Khan,S.et al.(2017)Cloning and functionalcharacterization of quinolinic acid phosphoribosyl transferase(QPT)gene ofNicotiana tabacum,Physiol.Plant.160：253-265

非专利文献3：Wang et al.(2008)Generation of tobacco lines with widelydifferent reduction in nicotine levels via RNA silencing approaches,J.Biosci.33：177-184

非专利文献4：Schachtsiek and Stehle(2019)Nicotine-free,nontransgenictobacco(Nicotiana tabacum L.)edited by CRISPR-Cas9,Plant Biotechnol.J.17：2228-2230

非专利文献5：Kajikawa,M.et al.(2017)Genomic insights into theevolution of the nicotine biosynthesis pathway in tobacco,Plant physiology,174：999-1011

非专利文献6：Xu,S.et al.(2017)Wild tobacco genomes reveal theevolution of nicotine biosynthesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 114：6133-6138非专利文献7：Hayashi,S.et al.(2020)Genetic manipulation of transcriptionalregulators alters nicotine biosynthesis in tobacco,Plant Cell Physiol.pcaa036(DOI：10.1093/pcp/pcaa036)

非专利文献8：Katoh,A.et al.(2006)Early Steps in the Biosynthesis ofNAD in Arabidopsis Start with Aspartate and Occur in the Plastid,PlantPhysiology 141：851-857

非专利文献9：Martinez et al.(2020)Genetic attenuation of alkaloids andnicotine content in tobacco(Nicotiana tabacum),Planta 251：92,doi.org/10.1007/s00425-020-03387-1

发明内容

发明要解决的课题

以往，虽然已知低生物碱含量的烟草，但为了实现极低(例如野生型的5％以下)的尼古丁含量，需要多个基因的突变或表达抑制。另外，只要抑制基因的功能，有时就会伴有产生不期望的性状(例如，畸形及早期老化等障碍)的问题。即，迄今为止，还没有通过一个或两个的少量酶基因的突变而制备出尼古丁含量极低的烟草属植物体的例子。

本发明的一个实施方式是鉴于上述课题而完成的，其主要目的在于提供少量(一个或两个)的基因通过该基因中的内源性突变而使功能受到了抑制的具有低生物碱含量的烟草及其制造方法。

解决课题的方法

为了解决上述的课题，本申请发明人等进行了深入研究，结果首次发现，通过在烟草属植物体中利用AO2基因中的内源性突变抑制编码AO2的基因的功能，该烟草属植物体的生物碱含量降低，所述AO2为根特异性天冬氨酸氧化酶。即，发现了：在作为二倍体的烟草属植物(林烟草)中通过1个AO2基因的突变、在作为双二倍体的烟草属植物(红花烟草)中通过2个AO2基因(AO2-S和AO2-T)的突变，生物碱含量变得极低(低于对照的5％)；另外，在作为双二倍体的烟草属植物(红花烟草)中，通过AO2-S基因或AO2-T基因的突变、即一个AO2基因的突变，尼古丁含量变为一半以下，从而完成了本发明。

即，本发明的烟草属植物体在基因组中的以下至少一个内源基因中导入了特异性地引起该内源基因的功能抑制的突变，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。

本发明的低生物碱含量的烟草属植物体的制备方法包括：在烟草属植物体的基因组中导入特异性地引起以下至少一个内源基因的功能抑制的突变的工序，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因，上述进行导入的工序包括在上述内源基因中导入上述突变。

发明的效果

根据本发明，可以提供生物碱含量降低的烟草。

附图说明

图1是示出SNIC品系的F1个体的降烟碱检测结果的图。

图2是示出林烟草(N.sylvestris)的2个AO基因(NsAO1、NsAO2)的表达曲线的图(RNA-seq数据。单位为FPKM：Fragments Per Kilobase of exon per Million mappedreads)。

图3是示出烟草(Nicotiana)属AO的氨基酸序列的分子系统树的图。收集基于UPGMA法。Nsyl AO2_ptn、Ntab AO2-S ptn、Ntab AO2_T_ptn分别表示由本发明中确定的NsAO2、NtAO2-S、NtAO2-T基因翻译的氨基酸序列。Nsyl表示林烟草(N.sylvestris)，Ntab表示红花烟草(N.tabacum)，Ntom表示绒毛状烟草(N.tomentosiformis)，Natt表示渐狭叶烟草(N.attenuata)。以XP开始的编号为GenBank Accession编号。

图4是示出红花烟草(N.tabacum)的AO基因NtAO2-S、NtAO2-T、NtAO1-S、NtAO1-T的表达曲线的图(RNA-seq数据。单位为FPKM：Fragments Per Kilobase of exon perMillion mapped reads)。

图5是示出AO1、AO2、或AO(AO1及AO2这两者)在根及叶中的转录物量的图。

图6是示出抑制了AO2基因的功能的烟草属植物体中的尼古丁含量的图。

图7是示出抑制了AO1基因的功能的烟草属植物体中的尼古丁含量的图。

图8是示出抑制了AO1基因的功能的烟草属植物体的叶的状态((a)NtAO1-ssTT及(b)NtAO1-SSTT)的图。

具体实施方式

〔1.烟草属植物体〕

本发明的一个实施方式提供一种烟草属植物体，其在基因组中的以下至少一个内源基因中导入了特异性地引起该内源基因的功能抑制的突变，所述内源基因为：(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。

在本说明书中，使用序列表中记载的氨基酸序列确定多肽的记载“相对于～所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽”是指野生型多肽。该野生型多肽是指在后述的烟草属植物中通常存在的多肽。野生型多肽例如为具有序列号2、5或6中记载的氨基酸序列的蛋白质、或者该蛋白质在烟草属植物中的同源分子种。在本说明书中，“多肽”及“蛋白质”实质上具有相同的含义，可以交换使用。因此，在本说明书中，将上述内源基因中存在的编码多肽的区域记载为编码区域(CDS)。

上述一个实施方式可以满足以下的1个以上或全部的条件。(a)的内源基因中存在引起(a)的内源基因的功能抑制的突变。(a)的内源基因中不存在引起(b)的内源基因的功能抑制的突变。(b)的内源基因中存在引起(b)的内源基因的功能抑制的突变。(b)的内源基因中不存在引起(a)的内源基因的功能抑制的突变。

本说明书中使用的用语“烟草属植物体”包括所有个体(例如，成熟体、苗及种子)、组织(例如，叶、茎、花、根、生殖器官、胚及它们的一部分等)、以及它们的干燥物。

上述烟草属植物体只要是属于烟草(Nicotiana)属的植物即可，没有特别限定，可以列举例如：无茎烟草(Nicotiana acaulis)、渐尖叶烟草(Nicotiana acuminata)、渐尖叶烟草多花型变种(Nicotiana acuminata var.multzjlora)、非洲烟草(Nicotianaafricana)、花烟草(Nicotiana alata)、抱茎烟草(Nicotiana amplexicaulis)、阿伦特氏烟草(Nicotiana arentsii)、渐狭叶烟草(Nicotiana attenuata)、贝纳米特氏烟草(Nicotiana benavidesii)、本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、毕基劳氏烟草(Nicotiana bigelovii)、博内里烟草(Nicotiana bonariensis)、洞生烟草(Nicotianacavicola)、克利夫兰式烟草(Nicotiana clevelandii)、心叶烟草(Nicotianacordifolia)、伞状烟草(Nicotiana corymbosa)、迪勃纳氏烟草(Nicotiana debneyi)、高烟草(Nicotiana excelsior)、福尔吉特氏烟草(Nicotiana forgetiana)、香烟草(Nicotiana fragrans)、粉蓝烟草(Nicotiana glauca)、粘毛烟草(Nicotianaglutinosa)，古特斯皮德氏烟草(Nicotiana goodspeedii)、哥西氏烟草(Nicotianagossei)、因古儿巴烟草(Nicotiana ingulba)、川上烟草(Nicotiana kawakamii)、奈特氏烟草(Nicotiana knightiana)、蓝格斯多夫烟草(Nicotiana langsdorfi)、狭叶烟草(Nicotiana linearis)、长花烟草(Nicotiana longiflora)、海滨烟草(Nicotianamaritima)、特大管烟草(Nicotiana megalosiphon)、摩西烟草(Nicotiana miersii)、夜花烟草(Nicotiana noctiflora)、裸茎烟草(Nicotiana nudicaulis)、欧布特斯烟草(Nicotiana obtusifolia)、西方烟草(Nicotiana occidentalis)、西方烟草Hesperis亚种(Nicotiana occidentalis subsp.Hesperis)、耳状烟草(Nicotiana otophora)、圆锥烟草(Nicotiana paniculata)、少花烟草(Nicotiana pauczjlora)、矮牵牛状烟草(Nicotianapetunioides)、蓝茉莉叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)、四科烟草(Nicotianaquadrivalvis)、雷蒙德氏烟草(Nicotiana raimondii)、残波烟草(Nicotiana repanda)、莲座叶烟草(Nicotiana rosulata)、莲座叶烟草因古儿巴亚种(Nicotiana rosulatasubsp.Ingulba)、圆叶烟草(Nicotiana rotundifolia)、黄花烟草(Nicotiana rustica)(黄花烟)、赛特氏烟草(Nicotiana setchellii)、拟似烟草(Nicotiana simulans)，茄叶烟草(Nicotiana solanifolia)、斯佩格茨烟草(Nicotiana spegauinii)、斯托克通氏烟草(Nicotiana stocktonii)、香甜烟草(Nicotiana suaveolens)、林烟草(Nicotianasylvestris)、红花烟草(Nicotiana tabacum)、蓝烟草(Nicotiana thyrsiflora)、绒毛烟草(Nicotiana tomentosa)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosifomis)、三角叶烟草(Nicotiana trigonophylla)、荫生烟草(Nicotiana umbratica)、波叶烟草(Nicotianaundulata)、颤毛烟草(Nicotiana velutina)、芹叶烟草(Nicotiana wigandioides)、以及烟草属植物的杂交种等。其中，特别优选为作为烟叶生产的原料而使用的红花烟草、黄花烟草。另外，也可以优选使用林烟草。

本发明的一个实施方式的烟草属植物体中的生物碱含量低于野生型的烟草属植物体。在特定的实施方式中，“野生型的烟草属植物体”为其基因组中存在的AO2基因正常发挥功能的烟草属植物体。在上述特定的实施方式中，“野生型的烟草属植物体”优选为其基因组中存在的AO2基因及AO1基因正常发挥功能的烟草属植物体。“AO2基因(及AO1基因)正常发挥功能”是指，未在基因组中导入抑制AO2基因(及AO1基因)的表达的因子、且AO2基因(及AO1基因)中不具有突变。在上述特定的实施方式中，“野生型的烟草属植物体”例如为基因组中包含多核苷酸1作为AO2基因的一部分(编码区域)的林烟草、或者基因组中包含多核苷酸2a及多核苷酸2b分别作为AO2基因的一部分的红花烟草。上述林烟草优选在基因组中包含多核苷酸3作为AO1基因的一部分。上述红花烟草优选在基因组中包含多核苷酸4a及多核苷酸4b分别作为AO1基因的一部分。

多核苷酸1：编码具有序列号2中记载的氨基酸序列的多肽

多核苷酸2a：编码具有序列号5中记载的氨基酸序列的多肽

多核苷酸2b：编码具有序列号6中记载的氨基酸序列的多肽

多核苷酸3：编码具有序列号62中记载的氨基酸序列的多肽

多核苷酸4a：编码具有序列号63中记载的氨基酸序列的多肽

多核苷酸4b：编码具有序列号64中记载的氨基酸序列的多肽用语“生物碱”通常是指包含氮原子的碱性有机化合物。为了本发明的目的，生物碱是指在烟草属植物体中产生的生物碱，具体而言，生物碱包含尼古丁、降烟碱、新烟草碱(anatabine)、毒藜碱(anabasine)及麦司明(myosmine)。在红花烟草中，尼古丁作为主要的生物碱而蓄积。另一方面，对于一部分红花烟草及林烟草，在生长中蓄积尼古丁，但在叶的老化、干燥过程中尼古丁被转变为降烟碱。在本说明书中，生物碱有时是指作为主要的生物碱的尼古丁及降烟碱。用语“生物碱含量”是指烟草属植物体中的生物碱的含量。生物碱含量通常以相对于干燥的叶(干叶)的重量％表示。“低生物碱含量”是指与野生型烟草属植物体中的生物碱含量相比降低了的生物碱含量。低生物碱含量或降低的生物碱含量为野生型烟草属植物体中的生物碱含量的例如50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、优选为5％以下、4％以下、更优选为3％以下、2％以下、1％以下、0.8％以下、0.6％以下、0.4％以下、0.2％以下、或0.1％以下。低生物碱含量或降低的生物碱含量为烟草属植物体的干叶重量的例如2.5％以下、2％以下、1.5％以下、1％以下、优选为0.5％以下、0.4％以下、0.3％以下、0.2％以下、0.1％以下、0.08％以下、0.06％以下、0.04％以下、0.02％以下、0.01％以下。

生物碱中的降烟碱例如可以通过将含有吲哚-2,3-二酮的靛红溶液喷雾于负载有叶的提取物的滤纸之后进行加热而简便地测定。或者，可以通过气相色谱/质谱分析法(GC-MS)分析等对各个生物碱进行定量。

已知属于烟草(Nicotiana)属的植物中有时存在AO1及AO2这2个天冬氨酸氧化酶(AO)基因，其中，关于AO2，已经明确其根特异性地表达，因此表明与尼古丁生物合成相关(Xu,S.et al.(2017)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 114：6133-6138；Kajikawa,M.et al.(2017)Plant physiology,174：999-1011)。另一方面，AO1在整个植物中构成性地表达。

本说明书中使用的用语“天冬氨酸氧化酶”(本说明书中也称为“AO”)是指具有将天冬氨酸氧化而生成亚氨基天冬氨酸的活性的酶。该酶活性可以通过公知的方法测定(Haoet al.(2008)Plant Science 271：133-142)。AO是参与烟酸及烟酰胺的代谢的生物体内的重要的酶，已知在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，如果破坏AO基因，则显示出胚致死性(Katoh,A.et al.(2006)Plant Physiology 141：851-857)。

本实施方式的烟草属植物体是基于通过AO2基因的功能抑制可降低以尼古丁及降烟碱为代表的生物碱的含量这样的本发明人等所获得的见解而实现的。如上所述，AO基因的功能抑制可能会给植物体带来各种异常或致死性，因此，迄今尚未研究AO基因的突变对尼古丁等生物碱的产生的影响。

本说明书中使用的用语“内源基因的功能抑制”是指位于基因组上的基因不发挥原本的功能的状态。因此，“内源基因的功能抑制”是包括“内源基因的突变”、“内源基因的破坏”、以及基于该内源基因以外(包含外来基因的)的该“内源基因的表达抑制”的用语。另外，特异性地引起功能抑制是指仅抑制目标基因的功能而不抑制目标基因以外的功能。例如，优选避免引起AO1基因的功能抑制、或者因处于同一转录因子控制下的多个基因的功能抑制而引起代谢异常等。

如以下所述，红花烟草(Nicotiana tabacum)为双二倍体，具有来自于作为亲本植物的林烟草(Nicotiana sylvestris)的基因组(也称为“S基因组”)及来自于绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)的基因组(也称为“T基因组”)。在烟草属植物为红花烟草的情况下，通过特异性地仅抑制S基因组及T基因组中任一者上的天冬氨酸氧化酶基因的功能，生物碱含量降低。因此，可以特异性地抑制S基因组及T基因组这两者上的天冬氨酸氧化酶基因的功能，也可以特异性地抑制S基因组及T基因组中任一者上的天冬氨酸氧化酶基因的功能。在该情况下，特异性的功能抑制是指仅抑制S基因组及T基因组中一个基因组上的天冬氨酸氧化酶基因的功能，而不抑制另一个基因组上的天冬氨酸氧化酶基因的功能。为了仅对位于S基因组或T基因组中的一个AO2基因特异性地进行功能抑制，优选仅在该一个AO2基因中导入核苷酸序列的改变。

“内源基因的突变”是指，不生成原本的功能性多肽的基因的突变(功能的降低或缺损)、尽管生成功能性多肽但生成的量降低的基因的突变、或者尽管生成功能性多肽但该多肽的稳定性降低的基因的突变等。“内源基因的破坏”是指，原本位于基因组上的基因不存在、或者不能由位于基因组上的基因生成转录产物。“内源基因的表达抑制”是指，该内源基因的碱基虽然没有发生变化，但借助其它因子对基因的转录或翻译功能(从向mRNA的转录至随后的向多肽的翻译)进行修饰而使多肽的生成量降低、或不发生多肽的生成的状态等。“内源基因的表达抑制”例如可以通过由该内源基因转录的mRNA的分解而实现。

在本说明书中使用的情况下，“突变”具有本申请所属的技术领域中通常理解的含义，例如，是指位于野生型的基因组上的碱基、或位于野生型多肽的氨基酸残基的任意变化(例如，置换、缺失、插入、添加、重复、倒位或易位等)。因此，“内源基因的突变”是指，不生成原本的功能性多肽的基因的突变(包含生成功能降低或缺损的多肽的突变)、尽管生成多肽但生成的量降低的基因的突变、尽管生成多肽但多肽的稳定性降低的基因的突变、基因(包含编码区域或非翻译区域的基因组DNA序列)的丧失、或者来自基因的转录受到抑制的突变(转录控制区域或转录起始区域的缺失等)等。

在通过置换而使功能缺损的情况下，该置换可以存在于启动子序列(可举出以编码区域为基准位于上游(5’侧)的序列)、以及终止子序列(可举出以编码区域为基准位于下游(3’侧)的序列)、5’非翻译区域及3’非翻译区域、位于内含子的两端的保守序列(例如5’末端的GT及3’末端的AG)、以及至少一个编码区域中。

例如，位于某个基因的启动子序列、5’非翻译区域及3’非翻译区域的对基因表达调节非常重要的核苷酸序列的置换会降低该基因的转录活性或降低来自该基因的转录产物的稳定性。这些降低均会导致来自上述基因的转录产物的减少，会发生翻译产物的减少。内含子的上述保守序列的置换(剪接突变)通过引起mRNA的剪接异常而产生添加或插入了不需要的内含子的异常mRNA。异常mRNA例如通过移码而产生异常的翻译产物或不终止翻译。

在位于编码区域的核苷酸置换为错义突变(发生野生型多肽的存在量降低)的情况下，由于通过该置换而生成与原本的氨基酸不同的氨基酸，因此会产生原本的功能降低或缺损的多肽。

另外，位于编码区域的置换会产生不完整长度的翻译产物或没有保持原本功能的翻译产物。不完整长度的翻译产物是由于编码氨基酸的密码子向终止密码子的由该置换导致的转变(无义突变)而产生的。与原本的翻译产物相比，不完整长度的翻译产物缺失了包含C末端的氨基酸残基的连续1个以上的氨基酸残基。无义突变发生于位于原本的终止密码子的上游的任意密码子，优选位于从原本的终止密码子起夹隔1个以上密码子的上游。因此，来自具有无义突变的基因的翻译产物为不完整长度。原本功能受损的翻译产物通过氨基酸置换而产生。在该情况下，转录物的量与野生型植物相比可以为同等水平。该翻译产物发生了立体结构的变化、或作为功能域的功能的降低等。本发明的突变的优选方式之一为产生这样的原本功能受损的翻译产物的氨基酸置换。上述氨基酸置换优选为具有使翻译产物的功能发生改变的可能性高的非保守置换。非保守置换可以列举向电荷或疏水性不同的氨基酸的置换(例如，由碱性氨基酸向酸性氨基酸的置换、由碱性或酸性氨基酸向中性氨基酸的置换、由中性氨基酸向碱性或酸性氨基酸的置换、由极性氨基酸向非极性氨基酸的置换)、以及向具有不同体积(立体大小)的侧链的氨基酸的置换等。

作为由无义突变产生的现象的其它例子，在AO2基因的蛋白质编码区域具有无义突变的情况下，会发生无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay)(Brognaand Wen(2009)Nat.Structural Mol.Biol.16：107-113)。由于无义介导的mRNA降解会引起转录物的分解，因此，有时无义突变会使转录物量降低。为了发生无义介导的mRNA降解，优选在AO2基因至少存在一个具有无义突变的外显子。特别是更优选该具有无义突变的外显子不是构成AO2基因的最下游(3’侧)的外显子。野生型的烟草属植物体的AO2基因由7个外显子和6个内含子构成。因此，发生无义介导的mRNA降解的无义突变的优选实施方式为在AO2基因的第1外显子至第6外显子存在至少一个无义突变。

置换以外的突变(缺失及插入等)发生在启动子序列、5’非翻译区域和/或3’非翻译区域内时，结果是与置换同样地会发生转录活性或稳定性的降低所导致的转录产物量的减少、以及多肽的量的减少。另外，对内含子的保守序列的置换以外的突变也与置换同样，会发生具有与原本不同的氨基酸序列的多肽的翻译。另外，对编码区域的置换以外的突变会发生氨基酸残基的缺失或插入(通过3的倍数的连续的碱基的缺失或插入而产生)、或者因移码而发生具有与原本不同的氨基酸序列的多肽的翻译。另外，包含该基因整体的大幅的缺失或向该基因插入很大的片段会使该基因的表达本身丧失。

在上述烟草属植物体中，上述基因的突变或破坏是作为例如自然突变、突变原处理、基因重组、基因组编辑或基因敲除的结果而产生的。上述基因的自然突变通常因复制错误和基因损伤而产生。该损伤的原因为暴露于天然存在的公知的突变原(例如，放射线、紫外线等)等。上述基因的突变原处理可以通过使上述突变原人工地作用于烟草属植物体(并且根据需要与基因修复功能的抑制组合)而实施。作为突变原的种类，可以使用例如甲基磺酸乙酯(EMS)、叠氮化钠、溴化乙锭、以及亚硝酸等化学药剂，只要是使烟草属植物体的基因组DNA发生突变的化学药剂即可，并不限定于此。另外，作为突变原，可以列举例如：γ射线、重离子束、X射线、中子射线、或UV等，只要是使烟草属植物体的基因组DNA发生突变的放射线等即可，并不限定于此。作为突变原，优选为EMS。这些手法不需要对对象植物添加外源性的因子，从这样的观点考虑是优选的。上述基因重组可以按照公知的基因重组方法，通过利用重组序列将靶基因的一部分或全部进行同源重组而实施。上述基因的基因组编辑可以通过公知的技术(例如，zinc-finger nucleases：ZFN、transcription activator-likeeffector nucleases：TALEN及CRISPR/Cas9 system等)而实施。上述基因敲除可以通过公知的转座子(可移动遗传因子)或T-DNA的插入等而实施。

在CRISPR/Cas9 system的情况下，如果靶细胞内存在向导RNA及Cas9蛋白质，就可以进行基因组编辑，在TALEN及ZFN的情况下，如果靶细胞内存在融合蛋白(DNA结合域及核酸酶融合)，就可以进行基因组编辑。因此，上述向导RNA及Cas9蛋白质、以及上述融合蛋白均可以直接导入靶细胞。作为将它们直接导入靶细胞的方法，可以列举：PEG法、电穿孔法、以及粒子轰击法等。另外，可以借助土壤杆菌等将插入了构建体(包括向导RNA及编码Cas9蛋白的多核苷酸、以及任意的启动子和/或终止子)的载体导入靶细胞及组织。

在CRISPR/Cas9 system中，位于基因组上紧邻XGG的上游的核苷酸序列的互补序列与向导RNA的一部分形成碱基对，在该核苷酸序列内双链的基因组DNA被Cas9切断。

在TALEN中，形成二聚体的人工核酸酶的一对DNA结合域分别与夹隔5～20个碱基间隔存在于FokI切断结构域的两端的核苷酸序列结合。该核苷酸序列存在于双链基因组DNA的一条链及另一条链，因此，上述一对DNA结合域的一者与该一条链结合，另一者与另一条链结合。上述DNA结合域以33～34个氨基酸残基作为重复单元(模块)，由与结合的碱基数相对应的数量的模块构成。

在ZFN中，与TALEN同样，形成二聚体的人工核酸酶的一对DNA结合域分别与夹隔5～20个碱基间隔存在于FokI切断结构域的两端的核苷酸序列结合。该DNA结合域由多个锌指模块构成。

在一个实施方式中，AO2基因中的核苷酸的基于EMS处理的置换例如发生(I)移码突变、(II)截断突变(N末端氨基酸残基必需缺失)、(III)剪接突变、或(IV)无义突变。这是由于EMS处理具有在DNA中发生特定的核苷酸变化(C→T置换及G→A置换)的倾向。

上述(I)及(II)例如是作为编码1st甲硫氨酸的起始密码子ATG的G→A置换(起始密码子的消失)的结果而发生的。该G→A置换例如可以发生在序列号35～37中的3003位(均为G)。在存在从该编码区域的3n+0或2位(n为整数)开始的ATG时，上述起始密码子的消失发生(I)。在存在从该编码区域的3n+1位(n为整数)开始的ATG时，上述起始密码子的消失发生(II)。

上述(III)例如在如下AO2基因中发生，所述AO2基因在下述中的任一者(均为上述的内含子的保守序列)中发生了G→A置换：

序列号35中的3135位、3477位、3842位、3933位、4177位、4266位、4324位、4408位、4490位、4778位、4841及5069位；

序列号36中的3135位、3478位、3843位、3934位、4178位、4267位、4325位、4409位、4491位、4779位、4842位及5071位；以及

序列号37中的3135位、3278位、3643位、3733位、3977位、4078位、4136位、4236位、4318位、4747位、4810及5032位。

上述(IV)例如在如下AO2基因中发生，所述AO2基因发生了在(IVa)～(IVf)所示的1个以上位置发生的C→T置换或G→A置换。这是由于，在序列号35～37中，仅存在于框内的CAA、CAG、CGA及TGG可以通过EMS处理而改变为终止密码子(TAA、TAG及TGA)。在以下的示例中，“C”表示被置换前的核苷酸(即C→T置换)，“G”表示被置换前的核苷酸(即G→A置换)。

·序列号35中的(IVa)及(IVb)：

(IVa)3031位的C、3118位的C、3124位的C、3134位的G、3478位的G、3486位的G、3487位的G、3503位的C、3527位的C、3533位的C、3552位的G、3553位的G、3563位的C、3584位的C、3587位的C、3653位的C、3737位的C、3791位的C、4051位的C、4141位的C、4174位的C、4812位的C、4818位的C、5077位的C、5275位的C、5398位的C、5401位的C、5479位的C、5533位的C、5575位的C、5587位的C、5642位的G、5643位的G、5645位的G、5646位的G、5731位的C、5744位的G、5745位的G、5822位的G、5823位的G、5839位的C、5849位的G、5850位的G、5935位的C、及5938位的C、

(IVb)6022位的C、6025位的C、6038位的G、6039位的G、6049位的C、及6061位的C；

·序列号36中的(IVc)及(IVd)：

(IVc)3031位的C、3118位的C、3124位的C、3134位的G、3479位的G、3487位的G、3488位的G、3504位的C、3528位的C、3534位的C、3553位的G、3554位的G、3564位的C、3585位的C、3588位的C、3654位的C、3738位的C、3792位的C、4052位的C、4142位的C、4175位的C、4813位的C、4819位的C、5079位的C、5277位的C、5400位的C、5403位的C、5481位的C、5535位的C、5577位的C、5589位的C、5644位的G、5645位的G、5647位的G、5648位的G、5733位的C、5746位的G、5747位的G、5824位的G、5825位的G、5841位的C、5851位的G、5852位的G、5937位的C、及5940位的C、

(IVd)6024位的C、6027位的C、6040位的G、6041位的G、6051位的C、及(51)6063位的C；以及

·序列号37中的(IVe)及(IVf)：

(IVe)3031位的C、3118位的C、3124位的C、3134位的G、3279位的G、3287位的G、3288位的G、3304位的C、3334位的C、3353位的G、3354位的G、3364位的C、3385位的C、3388位的C、3454位的C、3538位的C、3592位的C、3851位的C、3941位的C、3974位的C、4781位的C、4787位的C、5040位的C、5238位的C、5361位的C、5364位的C、5442位的C、5496位的C、5538位的C、5550位的C、5605位的G、5606位的G、5608位的G、5609位的G、5694位的C、5707位的G、5708位的G、5785位的G、5786位的G、5802位的C、5812位的G、5813位的G、及5898位的C、

(IVf)5985位的C、5988位的C、6001位的G、6002位的G、6012位的C、及6024位的C。

在优选的实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置为(IVa)、(IVc)及(IVe)所示的1个以上的位置。

在特定的实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置为(IVa)及(IVb)所示的1个以上的位置。在特定的实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置优选为(IVa)所示的1个以上的位置。

在其它的特定的实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置为(IVc)及(IVd)所示的1个以上的位置。在该其它的特定的实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置优选为(IVc)所示的1个以上的位置。

在另外的其它特定实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置为(IVe)及(IVf)所示的1个以上的位置。在该另外的其它特定实施方式中，发生了上述(IV)的上述位置优选为(IVe)所示的1个以上的位置。

或者，上述突变可以是野生型烟草属植物体的基因组上的AO2基因中的编码区域中存在的以下突变中的1种以上。

(1)密码子CAA中的C→T置换、(2)密码子CAG中的C→T置换、(3)密码子CGA中的C→T置换、(4)密码子TGG中的一个或两个G→A置换、(5)翻译起始密码子ATG中的G→A置换。

上述编码区域为编码与序列号2、序列号5或序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上序列同一性的AO2蛋白质的区域。上述AO2蛋白质具有天冬氨酸氧化酶活性。

以上说明的各种突变可以由本领域技术人员容易地导入烟草属植物体。即，基于这些序列信息，可以适当确定本发明的概念所包含的各种烟草属植物体的基因组中存在的应导入突变的区域。

基因的突变或破坏可以通过检测该基因中有无突变来确定。作为检测基因中的突变的方法，只要是能够判断有无突变的方法即可，可以是以下方法：(1)通过PCR等将该包含突变的DNA序列进行扩增后，利用市售的测序仪等直接解读DNA碱基序列的方法；(2)使用SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)法根据电泳距离的不同检测序列中的不同的方法；(3)使用CycleavePCR法检测SNP(Single Nucleotide Polymorphism)的方法；(4)通过使用T7 EndonucleaseI等切断错配部位而检测有无突变的方法；(5)根据基于限制酶处理的切断的有无可以判断有无突变的CAPS(Cleaved Amplified PolymorphicSequence)法；(6)通过使用有意包含错配的引物组，从而根据有无利用限制酶进行的切断来判断有无突变的dCAPS(derived CAPS)法；(7)根据使用对突变序列特异性杂交的探针检测探针是否杂交，从而判断有无突变的方法(使用了TaqMan探针的PCR法)；(8)使用与突变相邻的引物进行单碱基伸长，根据导入的碱基的质量差来检测有无突变的方法(MassARRAY分析法)；(9)在缺失、插入的情况下，根据电泳的移动程度的差别来检测突变的方法等。或者，基因的突变或破坏可以通过将作为基因的改变结果而产生的大小、表达量与野生型蛋白质的大小、表达量进行比较而确定。具体而言，例如可以通过进行蛋白质印迹法(westernblotting)来进行这样的比较。

或者，可以通过“MutMap法”分析突变或破坏。MutMap法是将集团分离分析(bulkedsegregant analysis、BSA)和全基因组测序(whole genome sequencing、WGS)组合对突变体的原因基因(causal gene)区域进行鉴定的方法(Abe,A.et al.,Nat.Biotechnol.,30(2)：174-178(2012))。与一直以来进行的图位克隆(map-based cloning)相比，该方法不需要制作标记，而且也不需要使用大量的个体，因此可以大幅削减劳力和时间，能够更迅速地进行基因鉴定。

在MutMap法中，首先，使具有期望性状的突变体品系(＞M2)与突变原处理中使用的亲本品种(原品系)进行交配而得到F1代，进一步使F1个体进行自体繁殖而得到F2代。可以认为，在多数情况下，由突变得到的性状是隐性的。因此，F1代的表型为野生型，F2代的表型应分离成野生型∶突变型为3∶1。

在F2代中，通过遗传重组，野生型的基因组与导入了来自于突变体的突变的基因组随机进行组合，产生各个个体具有固有的组合的基因组。因此，在将显示出突变型的表型的来自于F2个体的基因组DNA混合(bulk)而供于WGS的情况下，对于染色体上的大部分区域，具有突变的read的出现频率的期望值为0.5，另一方面，具有成为突变体显示出的表型的原因的突变及其周边区域的突变的read的出现频率为1。在MutMap法中，将具有该突变的read的出现频率设为“SNP-index”，确定在SNP-index＝1连续的区域存在成为原因的基因(或因子)。

需要说明的是，迄今为止，MutMap法主要用于基因组尺寸较小的稻的基因分析。根据本发明表明，也可以将MutMap法应用于烟草属植物这样基因组尺寸较大的生物的基因分析。

作为上述基因的突变或破坏的结果而产生的个体在本说明书中被称为烟草属植物体的突变体(有时也简称为突变体)。在烟草属植物中，红花烟草(Nicotiana tabacum)为双二倍体，具有来自于作为亲本植物的林烟草(Nicotiana sylvestris)的基因组(也称为“S基因组”)及来自于绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)的基因组(也称为“T基因组”)这两者。在红花烟草中，由同一名称表示的基因在大多数情况下分别存在于S基因组及T基因组。在红花烟草的情况下，上述突变体可以在S基因组及T基因组的任一者中具有上述的突变。也可以在S基因组及T基因组这两者具有上述的突变。需要说明的是，用于使功能缺损的突变可以在1个基因中具有1种突变，也可以具有多个突变，突变的种类没有限定。在红花烟草的情况下，在S基因组及T基因组分别各具有2个且总计为4个的等位基因的任一者或全部可以具有突变，在多个等位基因存在突变的情况下，这些突变可以相同，也可以不同。

上述基因的表达抑制包括由该基因向mRNA的转录的抑制、mRNA介导的由该基因向多肽的翻译的抑制(例如，该mRNA的分解)、以及翻译得到的多肽的功能的抑制。mRNA的分解可以由上述无义介导的mRNA降解发生。转录的抑制可以通过促进来自上述基因的转录的转录因子的抑制、以及转录起始因子与上述基因连接的抑制等而实现。翻译的抑制可以使用反义RNA分子、RNAi分子、或共抑制分子而实现。多肽的功能的抑制可以通过利用与功能性多肽的结合而抑制该多肽的功能的分子(例如，诱饵(decoy)核酸、核酶、抗体及阻害肽)来实现。

作为以基因的表达抑制或将突变导入基因为目的的用于烟草属植物体的转化的载体，只要是能够使载体内插入的多核苷酸在植物细胞内表达的载体即可，没有特别限定。作为该载体，例如，可以优选使用能够借助土壤杆菌向植物细胞导入目标的多核苷酸的pBI系、pPZP系及pSMA系的载体等。特别优选为双元载体系(pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121及pPZP202等)的质粒。

在通过RNAi实现基因的表达抑制的情况下，用于通过RNAi抑制靶基因的表达所使用的触发器(trigger)序列可插入上述载体。该触发器序列例如为：作为编码具有序列号2、5或6所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸(可以具有0.1～1％的置换)的一部分、或具有序列号1、3、4、35、36或37的多核苷酸(可以具有0.1～1％的置换)的一部分的、连续至少21～30个碱基(例如，21个碱基以上、22个碱基以上、23个碱基以上、24个碱基以上、25个碱基以上、26个碱基以上、27个碱基以上、28个碱基以上、29个碱基以上及30个碱基以上)的碱基序列所示的多核苷酸(正义RNA部分)、以及与该多核苷酸互补的碱基序列所示的多核苷酸(反义RNA部分)。更具体而言，上述的“连续的至少21～30个碱基”的碱基序列是指连续的21个碱基以上、23个碱基以上、25个碱基以上、30个碱基以上、35个碱基以上、40个碱基以上、45个碱基以上、50个碱基以上、60个碱基以上、70个碱基以上、80个碱基以上、90个碱基以上、或100个碱基以上的碱基序列。在优选的实施方式中，上述“触发器序列”不是具有序列号68～70的多核苷酸的一部分或其互补链。

上述(转录、翻译或多肽的功能的)抑制例如可以通过将用于实现该抑制的分子直接导入植物体、或将编码该分子的核酸分子导入植物体(植物体的转化)而实现。这里，作为植物体的转化的结果，上述核酸分子可被导入该植物体的基因组中的1个以上的任意区域。在作为双二倍体的红花烟草的情况下，只要能够实现上述抑制，作为植物体的转化的结果，上述核酸分子并不需要导入S基因组及T基因组这两者。

在上述烟草属植物体中，上述功能抑制可以是作为上述基因的表达产物的多肽的翻译量与野生型植物相比减少。多肽的翻译是基于mRNA的减少(mRNA本身的不稳定性、mRNA的分解促进或mRNA的转录的抑制等mRNA存在量等所引起)或来自mRNA的翻译量的减少(翻译构成要素(tRNA及核糖体)的欠乏、募集(recruit)的抑制、或功能性的缺损等所引起)而发生的。

在上述烟草属植物体中，上述功能抑制可以是来自上述内源基因的mRNA的转录量与野生型植物相比减少。mRNA的转录量的减少例如通过抑制由内源基因向mRNA的转录而发生。转录的抑制可以通过作为对上述内源基因导入突变的结果而发生的、转录起始因子与该内源基因结合的抑制等而实现。

在上述烟草属植物体中，上述功能抑制可以是由上述内源基因转录得到的mRNA的分解的促进。mRNA的分解可以通过异常的mRNA的生成(发生无义介导的mRNA降解)、分解mRNA的外来因子的存在、分解mRNA的内源性的构成要素的活化、或mRNA中的分解促进序列的存在等而引起。在烟草属植物体中，由上述内源基因转录得到的mRNA的分解受到促进时，上述烟草属植物体内的上述mRNA减少。即，在上述烟草属植物体中，上述功能抑制可以是由上述内源基因转录得到的mRNA量与野生型植物相比减少。这里，“由内源基因转录得到的mRNA的存在量的减少”是指，以野生型植物中该内源基因的转录物的存在量作为基准，存在70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下、或1％以下的该转录物。

在上述烟草属植物体中，上述突变可以是表达促进由上述内源基因转录得到的mRNA的分解的因子的多核苷酸向存在上述内源基因的区域外的插入。上述因子可以为反义RNA分子、RNAi分子或共抑制分子。

上述突变被插入至存在上述内源基因的区域外的烟草属植物体的实施方式可以替换为紧接在实施例之前的项目(总结)中的2个(8)。

本发明的一个方式的烟草属植物体抑制了包含编码由序列号2、5或6所示的氨基酸序列形成的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因的功能。序列号2表示林烟草的AO2(在本说明书中也称为“NsAO2”)的氨基酸序列，序列号5表示由红花烟草的S基因组编码的AO2(在本说明书中也称为“NtAO2-S”)的氨基酸序列，另外，序列号6表示由红花烟草的T基因组编码的AO2(在本说明书中也称为“NtAO2-T”)的氨基酸序列。

序列号1表示NsAO2基因的CDS序列(编码序列号2所示的氨基酸)。序列号35为编码区域中包含序列号1所示的碱基序列的NsAO2基因的基因组DNA序列。序列号3表示NtAO2-S基因的CDS序列(编码序列号5所示的氨基酸)。序列号36为编码区域中包含序列号3所示的碱基序列的NtAO2-S基因的基因组DNA序列。序列号4表示NtAO2-T基因的CDS序列(编码序列号6所示的氨基酸)。序列号37为编码区域中包含序列号4所示的碱基序列的NtAO2-T基因的基因组DNA序列。

本发明的一个方式的烟草属植物体抑制了如下内源基因的功能，所述内源基因相对于序列号2、5或6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性、且包含编码具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域。

在优选的实施方式中，上述烟草属植物体没有抑制如下内源基因的功能，所述内源基因相对于序列号62、63或64所示的氨基酸序列具有95％以上(96％、97％、98％、99％及100％)的序列同一性、且包含编码具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域。上述烟草属植物体中存在2个上述内源基因时，一个内源基因中的上述编码区域编码相对于序列号62或63所示的氨基酸序列具有上述序列同一性的多肽。上述烟草属植物体中存在2个上述内源基因时，另一个内源基因中的上述编码区域编码相对于序列号64所示的氨基酸序列具有上述序列同一性的多肽。

序列号62表示林烟草的AO1(NsAO1)的氨基酸序列。序列号65表示NsAO1基因的CDS序列(编码序列号62所示的氨基酸)。序列号68为在编码区域中包含序列号65所示的碱基序列的NsAO1基因的基因组DNA序列。序列号63表示由红花烟草的S基因组编码的AO1(NtAO1-S)的氨基酸序列。序列号66表示NtAO1-S基因的CDS序列(编码序列号63所示的氨基酸)。序列号69为在编码区域中包含序列号66所示的碱基序列的NtAO1-S基因的基因组DNA序列。序列号64表示由红花烟草的T基因组编码的AO1(NtAO1-T)的氨基酸序列。序列号67表示NtAO1-T基因的CDS序列(编码序列号64所示的氨基酸)。序列号70为编码区域中包含序列号67所示的碱基序列的NtAO1-T基因的基因组DNA序列。

本说明书中使用的用语“(氨基酸序列的)序列同一性”是指，相对于作为基准的(氨基酸)序列，所述的(氨基酸)序列一致的比例。这里，序列中不一致的部分为存在(氨基酸残基的)置换、添加、缺失或插入的部分。

这里，使用序列表中记载的氨基酸序列确定多肽的记载“相对于～所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽”可以是烟草属植物体中通常存在的多肽。在本说明书中，“多肽”及“蛋白质”具有实质上相同的含义，可以交换使用。

因此，在本发明的烟草属植物体中存在量减少的上述特定的多肽只要是具有与序列表所示的各氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽即可，该序列同一性优选为更高的比例(例如，96％、97％、98％或99％以上)。

多肽的“存在量的减少”是指，以野生型多肽的存在量作为基准，存在70％以下、60％以下、50％以下、40％以下、30％以下、20％以下、10％以下、5％以下或1％以下的该多肽。以上述野生型多肽的存在量作为基准的上述多肽的存在量可以从带来烟草属植物体中的低生物碱含量的上述值中适当选择。

需要说明的是，本发明的烟草属植物体中的上述多肽存在量的减少优选在由该烟草属植物体得到的培养细胞、愈伤组织、原生质体、种子及后代中遗传稳定地得到继承。因此，本发明的烟草属植物体可以是由借助人工操作生成的培养细胞、愈伤组织、原生质体、种子及后代产生的个体，用于得到该个体的这些材料也包含于本发明的范围。

本发明的烟草植物体可以进一步包含通过交配而得到的育种后代。以稻、小麦、大麦、大豆为代表，在多个植物类种中进行了使用突变体的育种。例如，在从用突变原进行了处理的突变体群中分离出的突变体的情况下，除了目标基因以外，也有多个突变。因此，通常为了除去多余的突变而进行回交。此时，通过与具有优良性状的栽培品种进行交配，将突变体所具有的性状导入栽培品种，由此可以得到具有更高附加值的栽培品种。由于突变体所具有的性状来自于突变，因此为了进行回交，需要对具有突变的个体进行筛选。此时，带来目标性状(本发明中为低生物碱)的突变的数量越少，应着眼的突变的数量越减少，因此，可减轻回交的劳动。为了进行高效的回交，需要简便地检测有无突变和突变是纯合型还是杂合型的方法。该方法可以使用后述的检测突变的方法来进行。另外，通过使用在突变体与栽培品种之间显示出多态性的背景标志物进行MAS(Marker Assisted Selection)，可以以较少的杂交次数高效地得到返回栽培品种的比率高的品系。作为多态性标志物，可以利用烟草中公知的SNP、SSR(Simple Sequence Repeat)。如果需要，可以对待使用的烟草的基因组序列进行解读，确定碱基序列的区别、重复序列数的区别，从而获得并利用新的多态性标志物。

本发明的一个方式的烟草属植物体抑制了以下内源基因的功能，所述内源基因由在序列号2、5或6所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生了缺失、置换或添加的氨基酸序列构成、且包含编码具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域。这里，各氨基酸序列中发生缺失、置换或添加的氨基酸的数量例如为1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、1～9个、1～8个、1～7个、1～6个、1～5个、1～4个、1～3个、1～2个、或1个。

本发明的一个方式的烟草属植物体抑制了以下内源基因的功能，所述内源基因包含由序列号1、3或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸作为编码区域。这里，序列号1、3及4分别表示林烟草的AO2(NsAO2)、由红花烟草的S基因组编码的AO2(NtAO2-S)、以及由红花烟草的T基因组编码的AO2(NtAO2-T)的编码区域核苷酸序列。

本发明的一个方式的烟草属植物体抑制了以下内源基因的功能，所述内源基因包含与由序列号1、3或4所示的核苷酸序列构成的多核苷酸互补的核苷酸序列构成的多核苷酸在严格条件下杂交、且编码具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域。

严格条件是指，所谓的可形成对核苷酸序列特异性的双链的多核苷酸、但非特异性的双链的多核苷酸的形成显著受到抑制的条件。换言之，可以认为是同源性高的核酸彼此的杂交的条件，例如为在比与探针完全一致的双链多核苷酸的熔解温度(Tm值)至低15℃、优选低10℃、进一步优选低5℃的温度范围的温度下进行杂交的条件。例如，可以举出在一般的杂交用缓冲液中，在68℃、20小时的条件下进行杂交的条件。示出一例，可以举出在包含0.25MNa₂HPO₄、pH7.2、7％SDS、1mM EDTA、1×邓哈特(Denhardt’s)溶液的缓冲液中于温度为60～68℃、优选为65℃、进一步优选为68℃的条件下进行16～24小时杂交，并进一步在包含20mM Na₂HPO₄、pH7.2、1％SDS、1mM EDTA的缓冲液中于温度为60～68℃、优选为65℃、进一步优选为68℃的条件下进行2次15分钟的清洗的条件。作为其它例子，在25％甲酰胺、更严格的条件下，在包含50％甲酰胺、4×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)、50mM Hepes pH7.0、10×邓哈特溶液、20μg/ml改性鲑鱼精子DNA的杂交溶液中于42℃下进行预杂交过夜后，添加经标记的探针，在42℃下保温过夜，由此进行杂交。随后的清洗中的清洗液及温度条件为“1×SSC、0.1％SDS、37℃”左右，作为更严格的条件，可以为“0.5×SSC、0.1％SDS、42℃”左右，作为进一步严格的条件，可以在“0.2×SSC、0.1％SDS、65℃”左右下实施。越这样地使杂交的清洗条件变得严格，越可以期待具有与探针序列高的同源性的DNA的分离。其中，上述SSC、SDS及温度的条件的组合为示例，本领域技术人员可以通过将确定杂交的严格性的上述或其它要素(例如，探针浓度、探针的长度、杂交反应时间等)进行适当组合，从而实现与上述相同的严格性。例如，本领域技术人员可以通过参照Molecular Cloning(Sambrook,J.etal.,Molecular Cloning:a Laboratory Manual 2nd ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press,10Skyline Drive Plainview,NY(1989))等而容易地获得这样的基因。

〔2.烟草属植物体的制备方法〕

本发明的一个实施方式提供一种烟草属植物体的制备方法，该方法包括：在烟草属植物体的基因组中的该内源基因中导入特异性地引起上述(a)及(b)的内源基因中至少一者的功能抑制的突变的工序。导入烟草属植物体的突变的详细情况记载于项目〔1.烟草属植物体〕。

在上述制备方法中，可以从具有突变的植物体的突变体集团中进一步筛选显示出期望的表型的个体。作为筛选个体的例子，对于从使用突变原进行了处理的情况下得到的突变体集团(panel)筛选期望的个体的步骤进行说明。

在2个等位基因(红花烟草的情况下为包含T基因组、S基因组这两者的等位基因的合计4个等位基因)具有突变的功能缺损的烟草属植物体的突变体例如可以通过以下的方法获得。如上所述，用突变原对烟草属植物体进行处理，制作使基因组整体发生了突变的突变体集团(panel)，提取基因组DNA。利用各自的基因特异性引物从panel的基因组DNA中扩增靶基因(多核苷酸)，确定其产物的碱基序列，筛选具有纯合型的突变的品系。例如，在红花烟草的情况下，首先，获得在S基因组、T基因组分别具有纯合型突变的品系(M2)，制备将它们交配而得到的F1。进一步，培育其自体繁殖后代(F2)，从其中获得S、T两基因组均具有纯合型的突变的品系。需要说明的是，关于仅在S基因组及T基因组中的任一者具有突变的功能缺损的烟草属植物体的突变体的获得，只要确认在得到的M2中不是对象的基因组上的基因没有发生突变即可。

显示出期望的表型的个体的筛选可以通过生物碱含量的测定、或天冬氨酸氧化酶活性的测定而进行。

作为在AO2基因具有突变的烟草的制备方法的一例，如上所述用EMS等突变原对烟草进行处理，制作使烟草的基因组整体发生了突变的烟草突变体集团(panel)，提取基因组DNA。利用对基因特异性的引物分别从panel的基因组DNA中、或从将它们聚集而成的组合中扩增AO2基因，确定其产物的碱基序列，筛选导入了纯合型的突变的品系。首先，分别获得在S型基因组导入了纯合型的突变的品系及在T型基因组导入了纯合突变的品系，制备将它们交配而成的F1。进一步，培育其自体繁殖后代(F2)，从其中获得在S型基因组及T型基因组这两者中导入了纯合型的突变的品系(由于双因子隐性(二因子劣性)，因此以1/16的概率得到)。

因此，上述一个实施方式的方法可以进一步包括一个以上的工序。

·制备使烟草基因组整体发生了突变的烟草突变体集团(panel)的工序、

·从上述panel中包含的品系中提取基因组DNA的工序、

·确定基因组DNA中的AO2基因的碱基序列的工序、

·从上述panel中筛选导入了纯合型的突变的品系的工序、以及

·确认上述品系中的生物碱含量的工序。

上述品系可以在实施确认生物碱含量的工序之前的任意时刻与未实施突变处理的品系交配。交配可以排除AO2基因以外的可能存在的突变。在特定的实施方式中，AO2基因具有突变的上述品系可以与未实施突变处理的品系(为了制作上述panel而使用的原始的品系)进行多次回交。

从烟草突变体提取基因组DNA只要基于公知的方法进行即可，可以使用市售的提取试剂盒。另外，基因组DNA可以为粗纯化物，也可以为经过若干纯化工序而得到的纯化品。

多核苷酸的扩增例如可以通过PCR法进行，也可以通过例如LCR(ligase chainreaction)法或LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification)法等其它公知的基因扩增方法进行。

用于扩增各多核苷酸的引物序列例如可以根据碱基序列进行设计。根据序列号36(S型的AO2基因的基因组序列)的碱基序列与序列号37(T型的AO2基因的基因组序列)的碱基序列的同源性分析结果，首先找到S型特异性的区域及T型特异性的区域。通过对该区域设计引物，可以从提取到的基因组DNA(包含S型及T型)中对S型及T型的AO2基因分别进行特异性地扩增。作为进行设计的部位，可以从S型或T型特异性的区域中选择，优选为内含子、5’非翻译区域或3’非翻译区域。引物的长度优选为15个碱基～30个碱基、特别优选为17个碱基～25个碱基。引物序列可以基于对碱基序列特异性的区域、或两个碱基序列共通的区域的序列而设计。另外，作为用于扩增包含突变部位的给定碱基数的序列的引物，只要能够发挥功能即可，其序列中可以包含1个或更多的置换、缺失和/或添加。另外，引物可以根据需要用荧光物质或放射性物质等进行标记。

扩增的各多核苷酸的长度只要是后述的各种检测方法能够利用的长度即可，没有特别限定，例如为20个碱基～5000个碱基、更优选为50个碱基～2000个碱基、进一步优选为100个碱基～700个碱基、更进一步优选为100个碱基～500个碱基。

〔3.其它〕

本发明的一个实施方式提供一种低生物碱含量的烟草属植物体的确定方法。该确定方法包括以下的工序：

通过采集烟草属植物体的一部分而获得样品的工序；

检测特异性地引起位于该样品中包含的基因组上的上述内源基因的功能抑制的突变的工序；以及

将检测到上述突变的烟草属植物体确定为低生物碱含量的烟草属植物体的工序。

这里，该功能抑制在烟草属植物体中带来低生物碱含量。即，上述确定方法可用于烟草属植物体的制备方法等。

本发明的一个实施方式提供一种烟草属植物体的育种方法。该方法包括：使通过上述确定方法确定的低生物碱含量的烟草属植物体进行交配的工序。

本发明的一个实施方式提供上述烟草属植物体、通过上述制备方法得到的烟草属植物体、通过上述确定方法确定的烟草属植物体、或通过上述育种方法得到的烟草属植物体的、后代或通过该烟草属植物体的交配而得到的育种后代。在本实施方式中，例如，在林烟草的情况下，通过仅抑制一个AO2基因的功能就可带来极低的尼古丁含量。因此，能够基于以位于AO2基因上的突变作为标记的单因子隐性(劣性)的遗传方式进行育种，育种的劳动比以往大幅减轻。另外，例如，在红花烟草的情况下，通过抑制两个AO2基因的功能就可带来极低的尼古丁含量。因此，能够基于以位于AO2-S基因上的突变及位于AO2-T基因上的突变作为标记的双因子隐性的遗传方式进行育种，育种的劳动也比以往减轻。此外，由于即使抑制一个AO2基因的功能也可带来低尼古丁性，因此，能够基于以位于AO2-S基因上或AO2-T基因上的突变作为标记的单因子隐性的遗传方式进行育种，育种的劳动比以往大幅减轻。

在大量的植物品种中进行了使用突变体的育种。例如，从使用突变原进行了处理的突变体集团分离出的突变体除了作为对象的基因以外，还具有多个突变。因此，通常为了消除多余的突变而进行回交。在该杂交中，通过使具有优良性状的栽培品种与上述突变体进行交配，可以向现有的栽培品种导入该突变体所具有的期望的性状。由此得到的育种后代可以是对现有的栽培品种赋予了高附加值的品种。此时，带来低生物碱的目标突变的数量越少，应着眼的突变的数量越减少，因此可以减轻回交的劳动。

本发明的一个实施方式提供从上述烟草属植物体、通过上述制备方法得到的烟草属植物体、通过上述确定方法确定的烟草属植物体、通过上述育种方法得到的烟草属植物体、或者上述后代或育种后代收获到的烟叶。烟叶是指从烟草属植物体收获并用于烟草制品的制造的叶。

本发明的一个实施方式提供由上述烟叶得到的干燥叶(干燥烟草)。干燥叶是通过将烟叶干燥而得到的。作为干燥方法，可以使用任意的方法，作为例子，可以列举自然干燥、暖风干燥、热风干燥等，但并不限定于此。需要说明的是，在本说明书中，干燥叶包括由干燥叶得到的去筋烟丝、粉末、片、叶脉、颗粒及提取物。

本发明的一个实施方式提供由上述干燥叶得到的烟草制品。烟草制品可以为任意的形态，作为例子，可以列举：烟丝、雪茄、管烟、卷烟、电子烟、无烟烟草、鼻烟(唇烟(Snus)、鼻烟(Snuff))、水烟、以将烟草加热而产生的气溶胶作为气溶胶源而使用的非燃烧加热型烟草制品、不将烟草加热而抽吸其香味的非加热型烟草制品等，但并不限定于此。

对于它们的详细情况，参照与烟草属植物体及其制造方法相关的上述事项。

(总结)

将以上的各实施方式进行总结，本发明可以概括如下。

即，

(1)一种烟草属植物体，其在基因组中导入了特异性地引起以下至少一个内源基因的功能抑制的突变，所述内源基因为：

包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及

包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。

(2)根据(1)所述的烟草属植物体，其中，上述功能抑制为：与野生型植物相比，上述多肽的存在量减少。

(3)根据(2)所述的烟草属植物体，其中，上述功能抑制为：与野生型植物相比，上述多肽的翻译量减少。

(4)根据(2)所述的烟草属植物体，其中，上述功能抑制为：与野生型植物相比，来自上述内源基因的mRNA的转录量减少。

(5)根据(2)所述的烟草属植物体，其中，上述功能抑制为：由上述内源基因转录得到的mRNA的分解受到促进。

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的烟草属植物体，其中，在上述内源基因导入了上述突变。

(7)根据(6)所述的烟草属植物体，其中，通过自然突变、突变原处理、基因组编辑或基因敲除导入了上述突变。

(8)根据(5)所述的烟草属植物体，其中，上述突变为表达促进上述mRNA的分解的因子的多核苷酸向存在上述内源基因的区域外的插入。

(9)根据(8)所述的烟草属植物体，其中，上述因子为反义RNA分子、RNAi分子或共抑制分子。

(10)根据(1)～(9)中任一项所述的烟草属植物体，其属于红花烟草、林烟草或黄花烟草。

(11)一种烟草属植物体的制备方法，该方法包括：

在烟草属植物体的基因组中导入特异性地引起以下至少一个内源基因的功能抑制的突变的工序，所述内源基因为：

(12)根据(11)所述的制备方法，其中，上述功能抑制为：与野生型植物相比，上述多肽的存在量减少。

(13)根据(12)所述的制备方法，其中，上述功能抑制为：与野生型植物相比，上述多肽的翻译量减少。

(14)根据(12)所述的烟草属植物体，其中，上述功能抑制为：与野生型植物相比，来自上述内源基因的mRNA的转录量减少。

(15)根据(12)所述的烟草属植物体，其中，上述功能抑制为：由上述内源基因转录得到的mRNA的分解受到促进。

(16)根据(11)～(15)中任一项所述的制造方法，其中，上述进行导入的工序包括在上述内源基因导入上述突变。

(17)根据(16)所述的制备方法，其中，上述进行导入的工序通过自然突变、突变原处理、基因的重组、基因组编辑或基因敲除而实施。

(18)根据(12)～(15)中任一项所述的制造方法，其中，上述进行导入的工序包括在存在该内源基因的区域外插入表达促进由上述内源基因转录得到的mRNA的分解的因子的多核苷酸。

(19)根据(18)所述的制备方法，其中，上述因子为反义RNA分子、RNAi分子或共抑制分子。

(20)(1)～(10)中任一项所述的烟草属植物体或通过(11)～(19)中任一项所述的制造方法得到的烟草属植物体的后代、或者由该烟草属植物体的交配而得到的育种后代。

(21)一种烟叶，其是从(1)～(10)中任一项所述的烟草属植物体、通过(11)～(19)中任一项所述的制造方法得到的烟草属植物体、或者(20)所述的后代或育种后代收获而得到的。

(22)一种干燥叶，其是由(21)所述的烟叶制成的。

(23)一种烟草制品，其包含(22)所述的干燥叶。

以上的各实施方式或者也可以概括如下。

(1)一种烟草属植物体，其在基因组中的以下至少一个内源基因中导入了特异性地引起该内源基因的功能抑制的突变，所述内源基因为：

(a)包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及

(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。

(2)根据(1)所述的烟草属植物体，其中，

上述功能抑制为：与野生型植物相比，由上述内源基因生成的mRNA的存在量减少。

(3)根据(2)所述的烟草属植物体，其中，

上述功能抑制为：与野生型植物相比，由上述内源基因生成的mRNA的分解受到促进。

(4)根据(2)所述的烟草属植物体，其中，

上述功能抑制为：与野生型植物相比，来自上述内源基因的mRNA的转录量减少。

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的烟草属植物体，其中，

上述功能抑制为：与野生型植物相比，上述多肽的存在量减少。

(6)根据(5)所述的烟草属植物体，其中，

上述功能抑制为：与野生型植物相比，上述多肽的翻译量减少。

(7)根据(1)～(6)中任一项所述的烟草属植物体，其中，

通过突变原处理、基因组编辑或基因敲除导入了上述突变。

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的烟草属植物体，其属于红花烟草、林烟草或黄花烟草。

(9)根据(1)～(8)中任一项所述的烟草属植物体，其没有抑制以下内源基因的功能，所述内源基因为：

(c)包含编码相对于序列号62或序列号63所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因、以及

(d)包含编码相对于序列号64所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。

(10)一种烟草属植物体的制备方法，该方法包括：

(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因，

上述进行导入的工序包含在上述内源基因导入上述突变。

(11)根据(10)所述的制备方法，其中，

(12)根据(11)所述的制备方法，其中，

(13)根据(11)所述的制备方法，其中，

(14)根据(10)～(13)中任一项所述的制造方法，其中，

(15)根据(14)所述的制备方法，其中，

(16)根据(10)～(15)中任一项所述的制造方法，其中，

上述进行导入的工序通过突变原处理、基因的重组、基因组编辑或基因敲除而实施。

(17)根据(10)～(16)中任一项所述的制造方法，其进一步包括：

不抑制以下内源基因的功能，所述内源基因为：

(18)(1)～(9)中任一项所述的烟草属植物体、或通过(10)～(17)中任一项所述的制造方法得到的烟草属植物体后代、或者通过该烟草属植物体的交配而得到的育种后代。

(19)一种烟叶，

(a)其在基因组上的内源基因中具有抑制该内源基因的功能的突变，所述内源基因包含编码相对于序列号2或序列号5所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域；和/或

(b)其在基因组上的内源基因中具有抑制该内源基因的功能的突变，所述内源基因包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有95％以上的序列同一性的多肽的多核苷酸作为编码区域，

与从野生型烟草属植物体收获得到的烟叶相比，所述烟叶显示出低生物碱含量。

(20)一种干燥叶，

与由从野生型烟草属植物体收获得到的烟叶制成的干燥叶相比，所述干燥叶显示出低生物碱含量。

(21)一种烟草制品，其包含(20)所述的干燥叶。

以下，示出实施例对本发明的实施方式进行详细说明。当然，本发明并不限定于以下的实施例，对于细节部分可以有各种方式。另外，本发明并不限定于上述的实施方式，可以在权利要求所示的范围进行各种变更，将各公开的技术方式适当组合而得到的实施方式也包含于本发明的技术范围。另外，参考并援引本说明书中记载的全部文献。

实施例

〔实施例1：林烟草(Nicotiana sylvestris)低尼古丁产生突变品系(SNIC品系)的分离〕

栽培烟草、红花烟草(染色体数：2n＝4x＝48)是来自于为二倍体的烟草野生种林烟草(染色体数：2n＝2x＝24)及也为二倍体的烟草野生种绒毛状烟草(染色体数：2n＝2x＝24)的杂交的双二倍体，具有来自于各个亲本的2个亚基因组(将来自于林烟草的亚基因组及来自于绒毛状烟草的亚基因组分别称为“S”或“S基因组”及“T”或“T基因组”)。因此，在红花烟草中，考虑到等位基因的存在，对于大量的基因，具有相同功能的基因分别存在2对(S型基因组中1对＝2个等位基因及T型基因组中1对＝2个等位基因)。因此，在红花烟草中，为了将成为靶的基因的功能丧失突变作为表型进行观察，需要使功能重复的全部4个等位基因两者发生突变。

另一方面，由于林烟草为二倍体，因此，可以在发生了突变的最初的世代(M1代)的下一代M2代中观察到由一个基因的突变引起的表型。因此，制作林烟草突变体文库，尝试了低尼古丁产生突变体的获得。

用0.6％EMS将林烟草的种子处理16小时，然后，用蒸馏水以每次30分钟清洗8次。播种处理后的种子，栽培处理当代(M1代)的植物。由各自的品系得到了自体繁殖种子(M2代)。可以由4945个的EMS突变林烟草品系分别得到约200粒以上的种子。

林烟草的主生物碱为降烟碱。在林烟草的叶中，尼古丁在老化/干燥中被转变为降烟碱。因此可以认为，如果筛选老化/干燥后降烟碱产生能力降低的林烟草突变体，可得到降低了作为降烟碱的前体的尼古丁的突变体。

将6～7叶期的温室培育苗的叶在37℃、湿度85％下干燥(老化)处理3天，促进从尼古丁向降烟碱的转变。将处理叶的一部分(前端部2cm×2cm)在包含1％的Tween-20的30％的NaOH中浸渍数秒钟，将组织破坏后，在0.4mL氯仿中浸渍1小时，提取出内容成分。将氯仿层20μL负载于滤纸上(Absorbent paper CB-09A、ATTO公司制)，用喷雾器将靛红溶液(在乙酸2.5mL与乙醇50mL的混合液中溶解有0.1g的吲哚-2,3-二酮(FUJIFILM Wako PureChemical公司制)的溶液)均匀地喷雾，在120℃下处理4分钟。在存在降烟碱时，降烟碱与靛红发生反应而呈现蓝色。以此为指标简单地判别了降烟碱浓度。具体而言，作为显色的指标，制作了将标准品降烟碱含量分为0.05％、0.1％、0.25％、0.5％、0.75％这5个等级的指示器，作为显色程度的基准。将这些显色分别设为降烟碱指标值(或降烟碱指数)1、2、3、4、5。将显示指标值1的样品作为筛选对象。

将降低了降烟碱含量的个体移植于4号盆，进一步使其生长2周，切碎鲜叶，用甲醇提取尼古丁，通过气相色谱/质谱分析法(GC-MS)分析测定了尼古丁。以相对于对照(野生型的林烟草)的峰面积比计算出尼古丁量。使用以上的测定体系，将总计4202的EMS突变林烟草品系的M2代供于筛选，从8个品系中获得了基本上不含尼古丁的突变体或尼古丁含量降低至对照(未经突变处理的野生型林烟草)的数％的突变体15个体(表1)。

关于全部个体，得到了自体繁殖种子(M3代)。培育M3代，移植于4号盆，在2个月后进行掐尖(摘芯)，在2周后采集根，切碎，进行甲醇提取，进行了GC-MS分析，结果是在全部品系中尼古丁含量为对照的0～数％。由此表明，对于低尼古丁产生突变体而言，其原因在于根中的尼古丁生物合成不完全，而不是尼古丁从根向地上部的转移不完全(表1)。

[表1]

*供于诱导M2代幼苗的叶老化，通过简易测定法检测降烟碱

**将M2代的植物移植于4号盆，将一个半月后的叶切碎，用甲醇提取，供于GC-MS分析

此外，对于一部分低尼古丁产生突变体，在田地中进行培育，将掐尖后1个月的成熟叶进行1个月的空气干燥之后，将叶切碎供于次生烟碱(minor alkaloid)分析(参照Beitr.Tabakforsch.Int.，21：369-379(2005))，测定了尼古丁、降烟碱、新烟草碱、毒藜碱及麦司明。将结果示于表2。

在野生型的林烟草(WT)中，尼古丁和降烟碱的合计量为单位干燥的叶的重量1.2％～1.3％(12～13mg/g干叶)，与此相对，低尼古丁产生突变体的尼古丁和降烟碱的合计量极低，为定量限以下～0.024％(0.24mg/g干叶)。另外，在任意的低尼古丁品系中，总生物碱量均低于0.04％(0.4mg/g干叶)(表2)。如表3所示，对8个品系分别赋予了SNIC品系的ID。

[表2]

		尼古丁	降烟碱	新烟草碱	毒藜碱	麦司明	总生物碱
								品系编号	个体编号	％	％	％	％	％	％
WT		ND	1.312	0.011	0.004	0.083	1.313
								04N257	4	ND	0.022	0.008	0.003	0.003	0.036
04N257	6	ND	0.024	0.007	0.003	0.003	0.038
								WT		ND	1.196	0.017	0.003	NT	1.216
06N615	2	ND	NQ(0.006)	0.004	NQ(0.001)	NT	NQ(0.011)
								06N615	5	ND	NQ(0.006)	0.004	ND	NT	NQ(0.01)

ND：检测限以下，NQ：定量限以下，NT：未实施分析。

[表3]

ID	品系(代)
		SNIC1	04N257-4(M4)
SNIC2	04M472-7(M3)
		SNIC3	04N584-8(M4)
SNIC4	06N615-5(M3)
		SNIC5	06N1296-7(M4)
SNIC6	06N4850-7(M4)
		SNIC7	06N14439-2(M3)
SNIC8	06N15427-2(M3)

〔实施例2：SNIC品系的表征〕

在田地中栽培了实施例1中得到的8个中的6个SNIC品系及对照的林烟草。对于各品系，将12个个体供于试验。在开花期进行掐尖，在约6周后，对于各品系，从3个个体采样从上起第2片叶。实施了空气干燥(将24小时的1个循环(30℃、湿度75％、16小时→22℃、湿度85％、8小时)重复30天(30个循环))。接着，去除叶脉，进行冷冻干燥后，供于次生烟碱分析。其结果是，全部SNIC品系的尼古丁含量和降烟碱含量的合计为0.04％(0.4mg/g干叶)以下。其相对于作为对照的林烟草中的含量(100％)为2.6％以下(表4)。另外，将SNIC品系的尼古丁含量、降烟碱含量、新烟草碱含量、毒藜碱含量合计而得到的总生物碱为0.1％(1mg/g干叶)左右以下。

[表4]

表4.田地栽培的SNIC品系及林烟草的生物碱分析(3个个体的平均值)

ND：检测限以下。

接下来，将全部8个SNIC品系相互杂交而制备F1品系，实施了显示出低尼古丁性的基因座的等位性(対立性)检测。

F1品系通过除了将SNIC6作为花粉亲本的组合以外的全部组合的正反交配而制备(图1)。对于各品系，在温室中培育了4个个体。在播种后第5周移植于3号盆，然后，对进一步经过约2周的个体的下位叶进行采样，供于上述的简易降烟碱检测。

其结果是，关于SNIC3和SNIC8，在与其它品系的F1品系中观察到了降烟碱蓄积，因此，可以认为该2个品系由于与其它不同的基因座的突变而发生了低尼古丁化。另一方面，将其它6个品系(SNIC1、SNIC2、SNIC4、SNIC5、SNIC6、SNIC7)相互组合而得到的全部F1个体的降烟碱指数为1，显示出保持了低尼古丁性(图1)。即，明确了这些6个品系的低尼古丁性由相同的基因座的突变决定。

制备将SNIC4及SNIC7这2个品系分别与林烟草交配而得到的F1代，进一步进行自体繁殖而得到了F2代。对于两个品系，分别培育96个F2个体，确认了低生物碱性的分离比(这里，“生物碱”是包括尼古丁和降烟碱的总称)。对播种后约2个月的个体的下位叶进行采样，供于简易降烟碱检测，将降烟碱指数为2以下的个体移植于4号盆。在移植于4号盆约1周后实施掐尖，进一步去除下位叶，仅残留3片上位叶。在掐尖10天后实施追肥，在30天后收获了全部叶。接着，去除叶脉，进行冷冻干燥，供于次生烟碱分析。在尼古丁浓度低的情况下，按照CORESTA推荐方法No.62从叶的切碎物中提取尼古丁，然后使用GC-MS进行了测定。

其结果是，对于尼古丁含量和降烟碱含量的合计(以下也称为“生物碱含量”)为0.04％以下的个体而言，在来自于SNIC4的F2代中存在25个，在来自于SNIC7的F2代中存在18个(表5、表5中的“Nsy1-1”～“Nsy1-5”表示用作对照的野生型的林烟草品系的结果)。在其它个体中，最低也显示出2.3％的生物碱含量。由此确认了生物碱含量的明确的分离。生物碱含量为2.3％以上的个体数∶生物碱含量为0.04％以下的个体数的分离比在SNIC4中为71∶25，在SNIC7中除了枯死的12个个体以外为66∶18。这表明，未脱离预想的隐性单因子决定的期待分离比(3∶1)(χ2检验、SNIC4：p＝0.81、SNIC7：p＝0.45)，低生物碱性由隐性单因子决定。另外，在相同条件下栽培的野生型的林烟草的生物碱含量为3.11～5.03％。即，显示出低生物碱性的F2个体的生物碱含量为野生型林烟草的0.8～1.3％以下。需要说明的是，显示出低生物碱性的F2品系与野生型的林烟草同样地正常生长。

[表5]

表5.来自于SNIC4及SNIC5的F2个体中显示出低生物碱性的个体的生物碱含量分析结果

〔实施例3：基于MutMap分析的原因基因的鉴定〕

“MutMap法”是将集团分离分析(bulked segregant analysis、BSA)和全基因组测序(whole genome sequencing、WGS)组合而鉴定突变体的原因基因区域的方法(Abe，A.etal.，Nat.Biotechnol.，30(2)：174-178(2012))。与目前进行的图位克隆(map-basedcloning)相比，该方法不需要制作标记，而且不需要使用大量的个体，因此可以大幅削减劳力和时间，能够更迅速地进行基因鉴定。

在MutMap法中，首先，使具有期望性状的突变体品系与突变原处理中使用的亲本品种进行交配而得到F1代，进一步使F1个体进行自体繁殖而得到F2代。可以认为，在多数情况下，由突变得到的性状是由隐性突变引起的。因此，F1代的表型为野生型，F2代的表型应分离成野生型∶突变型为3∶1。

3-1.参考基因组的构建

按照CTAB法从林烟草的经硫敌草(Ethiolate)处理的叶提取了基因组DNA。将该基因组DNA供于使用了下一代测序仪的核苷酸序列分析，构建基因组序列，将其用作参考基因组。构建的参考基因组由3518个scaffold构成，N50为48.7Mb。

为了预测参考基因组中的基因区域，使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)从来自于林烟草的根(播种后6周：根1、掐尖后1周：根2)、茎(开花后1周)、叶(播种后6周：叶1、开花后1周：叶2、成熟期(掐尖后40天)：叶3、黄色干燥第2天：叶4、空气干燥第3天：叶5)、腋芽、花(茎顶：花1、蕾：花2、开花后1天：花3、开花后4天：花4)、发芽种子、愈伤组织(来自于根：愈伤组织1、来自于叶：愈伤组织2)的总计16种器官(n＝3)提取RNA，供于基于NextSeq500(Illumina公司)的RNA-seq。

基因区域的预测通过将RNA-seqread映射(mapping)至参考基因组、并将机器预测与基于亲缘植物的蛋白质序列的CDS区域预测进行组合而进行。

3-2.MutMAP分析

将来自于SNIC4及SNIC7的F2个体中显示出低生物碱性的各25个体及18个体的基因组DNA按照各个品系进行等量混合，制备了来自于不同的品系的2种主体(bulk)DNA。将主体DNA供于使用了Hiseq X ten(Illumina公司)的双端(paired end)测序，分别得到了131Gb及132Gb的测序数据。使用得到的测序数据实施了MutMap分析。

作为参考基因组，使用了上述构建的林烟草基因组序列。测序read的质量控制、测序read向参考基因组的映射、以及突变的提取中使用了CLC Genomic Workbench(QIAGEN公司)。根据分析的结果，提取两个品系共通的候选区域，进一步在该区域内检索了两个品系共通且具有突变(SNP-index＝1)的基因。

其结果是，提取了编码L-天冬氨酸氧化酶(L-aspartate oxidase、AO)的基因(CDSID：nsv1s000268m03938)作为唯一的基因。将林烟草的AO基因区域的基因组序列示于序列号35。

通过使用了表6所示的引物的PCR及Sanger测序，在SNIC4中发现了在第2外显子中产生终止密码子的无义突变(序列号35的3563位的C→T)，在SNIC7中发现了在第7外显子中具有移码突变(序列号35的5141位的C的缺失)。

此外，对未供于MutMAP分析的剩余的4个品系的AO基因的序列进行了确认，结果是在该4个品系的AO基因中发现了以下的突变：

·SNIC1：第2外显子中发生由中性氨基酸向酸性氨基酸的非保守性氨基酸置换(Val→Glu)的置换(序列号35的3756位的T→A)；

·SNIC2：第7外显子中的无义突变(序列号35的5533位的C→T)；

·SNIC5：第4外显子的起始点的剪接突变(序列号35的4266位的G→A)；

·SNIC6：第3外显子中发生由中性氨基酸向碱性氨基酸的非保守性氨基酸置换(Gly→Arg)的置换(序列号35的4033位的G→A)

根据以上结果可以认为，AO基因中的突变为低生物碱性的原因。

[表6]

〔实施例4：烟草(Nicotiana)属AO序列的表征〕

已知烟草属中存在AO1及AO2这2个AO基因。在Kajikawa等的文献(2017，Plantphysiology，174：999-1011)中，将红花烟草S基因组上的AO2基因称为“AO2.1”(SolGenomics的gene no.19078)，将红花烟草T基因组上的AO2基因称为“AO2.2”(Sol Genomics的gene no.71591)。另外，AO1基因称为“AO1”(Sol Genomics的gene no.57190)。

实施例3中鉴定为林烟草的低生物碱性突变的原因基因的AO(ID：nsv1s000268m03938)与AO2.1显示出99.9％的序列同一性、与AO2.2显示出97.6％的序列同一性、与AO1显示出93.1～93.5％的序列同一性(具有多个剪接变体)，因此可以认为是AO2基因，因此标记为“NsAO2”。其中，AO2.1的序列的长度仅为1107bp，另一方面，上述NsAO2的CDS的长度长达1947bp，因此可以认为，AO2.1为不完全的序列，上述NsAO2为完全的序列。另外，如上所述，本申请实施例中使用的林烟草的基因组序列中存在另一种AO(ID：nsv1s000268m03841)，其与Kajikawa等得到的AO1显示出很高的序列同一性(98％)，因此标记为“NsAO1”。

根据使用在林烟草的各种器官及阶段中得到的RNA进行了RNA-seq分析的结果表明，NsAO1在所有的器官中均以低水平表达，与此相对，NsAO2很强的根特异性表达(图2)。由于尼古丁的生物合成在根中进行，因此表明NsAO2有助于尼古丁生物合成。

将NsAO2基因的编码区域的核苷酸序列(CDS)示于序列号1，将所编码的蛋白质的氨基酸序列示于序列号2。将NsAO2基因的CDS供于对NCBI的数据库的类似序列检索(BLAST、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，结果是检索到了表7所示的基因作为显示出97％以上的序列同一性的基因。可以认为它们为AO2基因。需要说明的是，除此之外，还检索到了序列同一性为93％左右的基因，可以认为它们为AO1。另外，将NsAO2的氨基酸序列同样地供于检索，结果是检索到了表8所示的氨基酸作为显示出97％以上的序列同一性的氨基酸。可以认为它们为AO2的氨基酸序列。除此之外，还检索到了序列同一性为90％左右的氨基酸序列，可以认为它们为AO1的氨基酸序列。

对烟草(N.tabacum)品种“Tsukuba(つくば)1号”的基因组序列进行分析，鉴定了认为是来自于S基因组的AO2(NtAO2-S、ID:nttv1s110m00779、序列号3)及认为是来自于T基因组的AO2(NtAO2-T、ID:nttv1s507m02461、序列号4)。将NtAO2-S及NtAO2-T的CDS序列供于对NCBI的数据库的同源性检索，结果是检索到了表9所示的基因。同源性均高达97％以上，可以认为它们为AO2基因。需要说明的是，除此之外，还检索到了同源性为92～93％左右的基因，可以认为它们为AO1基因。另外，将NtAO2-S及NtAO2-T的氨基酸序列(分别为序列号5、序列号6)同样地供于检索，结果是检索到了表10所示的氨基酸。同源性均高达96％以上，可以认为它们为AO2的氨基酸序列。需要说明的是，除此之外，还检索到了同源性为90～92％左右的基因，可以认为它们为AO1的氨基酸序列。

将使用遗传信息处理软件Genetyx(GENETYX公司)绘制的烟草(Nicotiana)属植物的AO氨基酸序列的分子系统树示于图3。此外，将使用了由烟草(N.tabacum)“Tsukuba 1号”的各种器官制备的RNA的RNA-seq数据的AO基因(NtAO2-S、NtAO2-T、NtAO1-S、NtAO1-T)的表达曲线示于图4。与林烟草同样，烟草的AO1(NtAO1-S、NtAO1-T)在植物整体中很弱地构成性表达，另一方面，AO2(NtAO2-S、NtAO2-T)很强地根特异性表达。

[表7]

[表8]

[表9]

[表10]

根据以上的结果表明，仅由NsAO2的突变(NsAO1没有突变)负责得到的植物体表现出的表型(生物碱量的降低)。上述主体DNA的测序数据也进一步证明了以上的结果(即，位于SNIC4及SNIC7的基因组的NsAO1中不存在突变)。

〔实施例5：AO2的功能受到抑制的红花烟草及林烟草重组体的制备及其生物碱量的分析〕

(5-1)植物体的重组操作

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)从林烟草的幼苗的根提取RNA，使用PrimeScript(商标)RT reagent Kit(Takara Bio公司)合成了cDNA。以该cDNA作为模板，使用表11所示的引物对2种NsAO2的基因片段(RNAi的trigger序列)进行了扩增。该基因片段为在林烟草中特异性靶向NsAO2、在红花烟草中特异性靶向NtAO2-S和NtAO2-T这两者的方式设计的RNAi用的触发器序列。PCR使用了PrimeSTAR(注册商标)Max DNA Polymerase(Takara Bio公司)。引物的5’末端添加了用于后述的克隆的CACC序列。

使用MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)将PCR产物纯化后，克隆于载体pENTR(商标)/D-TOPO(注册商标)(Life Technologies公司)。确认了插入物的核苷酸序列后，使用GATEWAY(注册商标)LR Clonase(注册商标)II Enzyme Mix(Thermo FisherScientific公司)将插入物克隆至RNAi载体pSP231(参照国际公开第2011/102394号公报)。pSP231为以pHellsgates12(参照Wesley et al.，Plant J.，27：581-590(2001))为基础的双元载体，包含Green Fluorescence protein(GFP)基因。在pSP231中，RNAi序列(具有夹在触发器序列的倒位反复序列中的pdk/cat内含子)由花椰菜花叶病毒35SRNA基因启动子驱动。克隆至pSP231后，确认RNAi触发器序列和其朝向，制成了最终的RNAi构建物。

[表11]

表11.RNAi载体的制备中使用的引物序列

通过将得到的RNAi构建物导入红花烟草及林烟草，可以控制红花烟草的AO2基因(NtAO2-S及NtAO2-T)或林烟草中的AO2基因的功能。

通过电穿孔将具有使用引物组(序列号21及22)扩增的触发器序列的RNAi构建物导入土壤杆菌LBA4404。在得到的转化体土壤杆菌中，通过PCR确认了RNAi触发器序列的存在，然后，使用该土壤杆菌实施了品种Tsukuba 1号”(N.tabacum)的转化(以下记载为“NtAO2-RNAi品系”)。作为对照，制备了基于导入有不含触发器序列的pSP231载体的土壤杆菌的Tsukuba 1号的转化体(以下记载为“Empty品系”)。

从通过使土壤杆菌感染叶切片并在包含卡那霉素(50μg/mL)的Linsmaier andSkoog(LS)培养基上进行培养而得到的愈伤组织得到了卡那霉素耐性的再分化个体。在该再分化个体中，将能够在叶整体确认到GFP荧光的个体在苗木箱中培育，在苗木箱内充分生长的时刻移植至3号盆。移植时，对各个体的叶及根的一部分进行采样，用液氮冷冻后在-80℃下保管。

(5-2)期望的重组体的筛选

接着，在移植后的个体中，通过RNAi确定了NsAO2的功能受到抑制的个体。为了进行确定，如下所述通过实时PCR对采样得到的叶及根中的NsAO2 mRNA进行了定量。

使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN公司)从采样得到的叶及根提取总RNA。通过使用了PrimeScript(商标)RT reagent kit with gDNA Eraser(TakaraBio公司)的逆转录由提取到的总RNA中的0.5μg总RNA进行了基因组DNA的去除及cDNA的合成。以合成的cDNA 1μL作为模板，使用TaqMan(注册商标)Fast Advanced Master Mix(Thermo FisherScientific公司)在10μL的反应体系中实施了实时PCR。通过使用了elfα(elongationFactor-1α)作为基准基因的ΔΔCt法确认了目标基因的转录物量。

将各基因的检测所使用的引物及探针的序列示于表12。需要说明的是，AO1及AO2的检测所使用的引物及探针的一部分针对各基因的3’非翻译区域(UTR)的核苷酸序列而设计。

[表12]

表12.实时PCR用的引物及探针的序列

基于实时PCR的结果(图5)确定了显示出以下的转录物的存在量的6个个体。图5以相对于Empty-12的转录物量(纵轴的值1)的相对值示出了各品系的转录物量。在图5中，“AO2-(数字)”是指NtAO2-RNAi品系，“Empty-(数字)”是指对照品系，误差条表示测定误差(3次反复试验间的标准误差)。

·根：与对照相比，非常少量的AO(AO1及AO2两者)及AO2转录物

·叶：与对照同等的量的AO及AO1转录物

筛选了上述6个个体作为仅AO2转录物减少而AO1转录物未减少的个体。以下，对如此确定上述6个体中的AO1及AO2的转录曲线的理由进行说明。以下，只要没有特别说明，“AO”表示“AO1及AO2两者”，“AO1”表示“仅AO1”，“AO2”表示“仅AO2”。

首先，烟草属植物体中的AO表达曲线如下所示(参考图4及非专利文献6)。

AO1的表达：在各组织中构成性的较低水平的表达。

AO2的表达：在根中特异性的高水平的表达、以及在其它组织中极低水平的表达。

即，只要对烟草属植物体的根中的转录物(AO及AO2)进行定量，就能够判定烟草属植物体中的AO2转录物量的减少。

将用于制作图4的图表的实测值的一部分示于表13。

[表13]

表13.Tsukuba 1号的根及叶中的AO1及AO2的转录物量(基于RNA-seq分析的FPKM值)

根据表13可知，烟草属植物体的根中的AO2转录物的充分减少是指烟草属植物体(整体)中的AO2转录物的充分减少(图5的右下)。另外，根据表13可知，烟草属植物体的叶中的AOl转录物的保持(与对照比较的重组体中)是指实质上不存在脱靶效应(基于上述RNAi构建物的AO1转录物的非特异性减少)(图5的右上)。另外，根及叶中的AO转录物量(AO1转录物及AO2转录物这两者)的确定可以补充上述意义(图5的左下及左上)。这是由于，基于表13所示的各个组织不同的AO1及AO2转录方式，叶(基本上没有AO2转录物)的AO转录物量实质上表示AO1转录物量，根(AO2转录物占大部分)的AO转录物量实质上表示AO2转录物量。

(5-3)筛选到的重组体及对照中的生物碱含量的评价

将得到的6个个体的NtAO2-RNAi品系及3个个体的Empty品系转移至3号盆后，在人工气候室(28℃下16h明期、22℃下8h暗期)中培育了约1个月。然后，将人工气候室切换为低温短日照条件(18℃、8h天长)，进行培育。在低温短日照条件下培育后，在开花期采集2～4片中位叶，在70℃下进行16小时干燥、粉碎，供于次生烟碱分析试验。将试验的结果示于表14。

[表14]

次生烟碱(miner alkaloid)分析结果

如表14所示，在对照的试样中检测到了0.08～0.23％(0.8～2.3mg/g干燥叶)的尼古丁及降烟碱。在NtAO2-RNAi品系的试样中，尼古丁为检测限以下(ND)，从6个个体中的2个体检测到了降烟碱(0.008％、0.007％)。如以上所述，证明了烟草属植物中的AO2的功能抑制显示出生物碱量的降低。

这里，在非专利文献9中记载了，在使AO2(非专利文献9的标记为AO1)转录物减少的个体(以下记载为“D9_AO2-RNAi”)中，在下位叶产生斑点，老化变早。但是，确认了NtAO2-RNAi品系及对照的全部个体正常地生长(没有确认到非专利文献9中记载的现象)。

在D9_AO2-RNAi的叶中，AO的转录物量比野生型植物降低(最大为1.4、最小为10.9)(非专利文献9的Fig.5)。但是，如表13中证明的那样，叶中的AO转录物基本上不包含AO2转录物(基本上不产生AO2的转录物)。因此，D9_AO2-RNAi中的AO转录物量的降低实质上反映了AO1的转录物量的降低。

本实施例中制备的烟草属植物体显示出AO2转录物量的降低及AO1转录物量的保持。该烟草属植物体正常地生长(未显示出非专利文献9中记载的上述现象)。与对照相比，该烟草属植物体显示出大幅降低的生物碱含量。即，可知，AO2表达特异性地受到抑制的烟草属植物体显示出对于烟草栽培有用的性状(生物碱含量的降低及正常的成长)。

〔实施例6：AO2的功能受到抑制的烟草突变体的制备〕

得到了AO2-S或AO2-T具有突变的烟草突变体。

对于2000个品系的烟草突变体分析NtAO2-S和NtAO2-T基因区域的核苷酸序列，鉴定了突变。详细而言，播种对烟草品种Tsukuba 1号的种子进行了EMS处理而制备的烟草突变体2000个个体的各M1代得到的突变体自体繁殖后代种子(M2种子)，将从培育的各品系8个个体的幼苗提取到的DNA混合(bulk)(田岛等，平成23年度日本植物病理学会大会，P234，烟草突变体panel的制备)，分析了核苷酸序列。将NtAO2-S和NtAO2-T基因区域的基因组序列分别示于序列号36及37。

其结果是，NtAO2-S或NtAO2-T中具有无义突变、移码突变或剪接突变的任一种的品系分别发现了11个品系(总计22个品系)(表15及表16)。在全部这些品系中，位于另一个基因组(S基因组上具有突变时为T基因组、或者在T基因组上具有突变时为S基因组)上的AO2基因没有突变而保持了野生型的状态。即，在NtAO2-S基因中具有突变的品系中NtAO2-T基因没有突变，在NtAO2-T基因中具有突变的品系中NtAO2-S基因没有突变。对于两个基因各选择3个突变体，播种这些品系的种子，在幼苗时提取DNA。将该DNA作为模板，使用表17所示的引物进行PCR，筛选了以纯合方式具有突变的个体。PCR使用了KOD One(注册商标)PCRMaster Mix(TOYOBO公司)。

[表15]

在NtAO2-S具有突变的突变体品系

	突变的种类	序列号36中的位置	野生型的碱基	突变型的碱基
					NtAO2-s-1	无义突变	3792位	C	T
NtAO2-s-2	无义突变	3792位	C	T
					NtAO2-s-3	剪接突变	4178位	G	A
NtAO2-s-4	无义突变	3504位	C	T
					NtAO2-s-5	剪接突变	4267位	G	A
NtAO2-s-6	移码突变	5288位	G	-
					NtAO2-s-7	无义突变	5648位	G	A
NtAO2-s-8	无义突变	5747位	G	A
					NtAO2-s-9	无义突变	5852位	G	A
NtAO2-s-10	无义突变	6041位	G	A

[表16]

在NtAO2-T具有突变的突变体品系

	突变的种类	序列号37中的位置	野生型的碱基	突变型的碱基
					NtAO2-t-1	无义突变	3124位	C	T
NtAO2-t-2	无义突变	3288位	G	A
					NtAO2-t-3	剪接突变	4078位	G	A
NtAO2-t-4	剪接突变	4078位	G	A
					NtAO2-t-5	无义突变	3304位	C	T
NtAO2-t-6	剪接突变	4810位	G	A
					NtAO2-t-7	剪接突变	5032位	G	A
NtAO2-t-8	无义突变	5361位	C	T
					NtAO2-t-9	无义突变	5605位	G	A
NtAO2-t-10	无义突变	5813位	G	A
					NtAO2-t-11	无义突变	5988位	C	T

其结果是，得到了NtAO2-S基因中具有突变的3个品系。在其中的2个品系中，对于NtAO2-S基因，以纯合型产生了1个无义突变(编码NtAO2-S蛋白质的第150位的谷氨酰胺(Q)的密码子通过核苷酸置换(C←T；序列号36的3792位)而改变为终止密码子)(NtAO2-s-1及NtAO2-s-2)。

在另一个品系中，在NtAO2-S基因中，以纯合型产生了1个剪接突变(NtAO2-S基因的第三内含子的5’侧通过核苷酸置换(G→A；序列号36的4178位)而未被正常地剪接)(NtAO2-s-3)。

另外，得到了NtAO2-T基因中具有突变的3个品系。在第一品系中，在NtAO2-T基因中，以纯合型产生了1个无义突变(编码NtAO2-T蛋白质的第42位的谷氨酰胺(Q)的密码子通过核苷酸置换(C←T；序列号37的3124位)而改变为终止密码子)(NtAO2-t-1)。

在第二品系中，在NtAO2-T基因中，以纯合型产生了1个无义突变(编码NtAO2-T蛋白质的第48位的色氨酸(W)的密码子通过核苷酸置换(G→A；序列号37的3288位)而改变为终止密码子)(NtAO2-t-2)。

在第三品系中，在NtAO2-T基因，以纯合型产生了1个剪接突变(NtAO2-T基因的第三内含子的3’侧通过核苷酸置换(G→A；序列号37的4078位)而未被正常地剪接)(NtAO2-t-3)。

对于烟草(N.tabacum)的NtAO2-S或NtAO2-T的各突变体，调查了尼古丁含量降低效果。

在温室中培育植物(突变体)，对开花期的3片真叶进行了采样。在70℃下干燥8小时后进行粉碎，供于次生烟碱分析。

其结果是，AO2基因未被破坏的烟草突变体2个品系的尼古丁含量为0.34％及0.41％(平均0.38％)。另一方面，AO2-S的突变体2个品系(NtAO2-s-2、NtAO2-s-1)的尼古丁含量为0.10及0.16％(平均0.13％、对照的34％)，AO2-T的突变体(NtAO2-t-2)的尼古丁含量为0.18％(对照的47％)。另外，在AO2基因未被破坏的烟草突变体中，新烟草碱含量为0.012％～0.016％。另一方面，在AO2-S及AO2-T单独突变体中约减半，为0.004％～0.009％。降烟碱及毒藜碱的含量均为定量限以下。通常，为了使红花烟草的基因产生突变而获得表型，需要在来自于S基因组的基因及来自于T基因组的基因这两者产生突变(例如，Liedschulte等(2017)Plant Cell Environ.40:364-377)。但是，在本发明中表明，即使是单一的基因(NtAO2-S或NtAO2-T)的突变，也具有减少尼古丁的效果。

由此表明，通过烟草(N.tabacum)中存在的2个AO2基因、即AO2-S及AO2-T中的任一者单独的突变，尼古丁含量基本上减半。另外表明，在具有AO2-S和AO2-T这两者的突变的突变体中，以尼古丁为代表的生物碱的含量变得极低的可能性很高。

在温室(24℃)下培育NtAO2-s-1及NtAO2-t-1，并进行交配，由此得到了F1代(NtAO2-F1-1)。在温室下培育NtAO2-s-2及NtAO2-t-2，并进行交配，由此得到了F1代(NtAO2-F1-2)。在温室中培育各F1代，并进行自体繁殖，由此得到了来自于不同的突变体品系的2个品系的F2代(NtAO2-F2-1及NtAO2-F2-2)。

播种2个品系的F2代，从临时栽植苗提取DNA，并且通过使用了表17的引物的PCR对突变周边的序列进行了扩增。将使用了iSeq 100(Illumina公司)的扩增产物的测序中利用的序列(P7序列、P5序列及各个体的条码序列)添加于该扩增产物进行了PCR。然后，将添加有上述序列的上述扩增产物供于使用了iSeq 100(Illumina公司)的测序，确认了各个体的基因型。

其结果是，得到了2组在NtAO2-S及NtAO2-T以纯合型具有突变的个体(NtAO2-sstt)及在两个基因不具有突变的个体(NtAO2-SSTT)的组。对于这些个体，在转移至3号盆后，通过PCR及Sanger测序进行了序列检测，确定了基因型(表18)。

[表18]

各F2代的各基因型的个体数

将各个体移植至1/5000瓦氏盆，在开花期掐尖。3周后，从各个体采集了2片真叶(无追肥)。在采集了2片真叶后的个体中，按照各基因型选择显示出较良好成长的3个个体，对它们进行了追肥处理。具体而言，从上起留下3片叶，将叶全部去除，施用了50g烟草用有机复合肥料Burley S625(清和肥料工业株式会社)。在约3周后，从各个体采集全部3片叶(有追肥)。将采集到的真叶(无追肥)及叶(有追肥)分别去除叶脉后，在70℃下干燥16小时，进行粉碎，供于次生烟碱分析。

作为分析的结果，在AO2的4个等位基因具有突变的个体(NtAO2-sstt)与在该4等位基因不具有突变的个体(NtAO2-SSTT)相比，显示出大幅降低的尼古丁含量(图6及表19)及总生物碱含量(表19)。

对于无追肥的叶中的尼古丁含量而言，在2组中，分别在AO2的全部等位基因中具有突变(NtAO2-sstt)与不具有突变(NtAO2-SSTT)之间确认到很大的差异(t检验、1％的水平、有显著差异)。如图6的左侧所示，对于NtAO2-F2-1组中的尼古丁含量(平均值±标准偏差)而言，有突变：检测限以下，无突变：0.18％±0.099％。如图6的右侧所示，对于NtAO2-F2-2组中的尼古丁含量(平均值±标准偏差)而言，有突变：0.01％±0.02％，无突变：0.56％±0.286％。

将有追肥的叶中的尼古丁含量及总生物碱含量(尼古丁、降烟碱、新烟草碱、毒藜碱及麦司明量的总和)示于表19。

[表19]

追肥处理后的NtAO2-F2-1和NtAO2-F2-2的SSTT个体及sstt个体的生物碱含量

N.D.＝检测限以下。

另外，详细而言，对于追肥处理后的样品，对于对照的NtAO2-SSTT而言，尼古丁含量在NtAO2-F2-1中为2.07～3.62％，在NtAO2-F2-2中为1.05～3.22％。另一方面，对于NtAO2-sstt而言，在NtAO2-F2-1中为0.01～0.02％，在NtAO2-F2-2中3个个体均为0.01％(表19)。另外，总生物碱含量(尼古丁、降烟碱、新烟草碱、毒藜碱及麦司明量的总和)在对照的NtAO2-F2-1中为2.29～4.13％，在NtAO2-F2-2中为1.20～3.74％。另一方面，对于NtAO2-sstt而言，在NtAO2-F2-1中为0.01～0.02％，在NtAO2-F2-2中3个个体均为0.01％(表19)。

如表19所示，NtAO2-sstt中的有追肥的叶具有0.01～0.02％的尼古丁含量。NtAO2-SSTT中的有追肥的叶具有1.05～3.62％的尼古丁含量。该值与一般的田地栽培个体的尼古丁含量1.5～4.5％(参照非专利文献1)为相同程度。因此，NtAO2-sstt显示出极低的尼古丁含量及总生物碱含量(均相对于基因型SSTT的含量为低于1％的含量)。

需要说明的是，虽然全部个体在株高或着叶数方面具有偏差(没有基于基因型的差异)，但基本正常地生长。如下所述，在一部分个体中确认到了不基于AO2基因突变的斑的产生。

在NtAO2-F2-1中，未确认到叶的斑的产生或早期的老化。在NtAO2-F2-2中，在sstt及SSTT这两者(与AO2基因的突变无关)，在叶上确认到外观类似的斑的产生。因此，可以认为斑的产生是与品系NtAO2-F2-2共通的除AO2基因以外的突变所引起的。另外，上述斑的外观与后述的比较例的突变体(AO1的功能受到抑制)中确认到的斑的外观明显不同。

在AO2的全部等位基因具有突变、而在AO1的全部等位基因不具有突变的本实施例的烟草属植物体正常地生长。该烟草属植物体显示出与对照相比大幅降低的生物碱含量。即，可知，不表达功能性的AO2蛋白质的烟草属植物体显示出对烟草栽培有用的性状(生物碱含量的降低及正常成长)。

〔比较例1：AO1的功能受到了抑制的烟草突变体〕

如下所述制备了AO1-S或AO1-T具有突变的烟草突变体。

通过对2000个品系的烟草突变体与实施例6同样地进行分析，鉴定了在NtAO1-S具有突变的NtAO1-S突变体(15个品系)及在NtAO1-T具有突变的NtAO1-T突变体(12个品系)。确认了NtAO1-S突变体在NtAO1-T不具有突变，NtAO1-T突变体在NtAO1-S不具有突变。选择3个品系的NtAO1-S突变体(表18中的第1行～第3行)及3个品系的NtAO1-T突变体，播种这些种子，从它们的幼苗中提取DNA。将该DNA用于模板，并且通过使用了引物组的PCR确定了具有纯合型的突变。在PCR中使用了KOD One(注册商标)PCR Master Mix(TOYOBO公司)。表20中总结了突变体的名称(第1～3行：NtAO1-S突变体的品系、第4～6行：NtAO1-T突变体的品系)、突变的种类、以及突变的确定(PCR)所使用的引物。

[表20]

AO1突变体的突变确认所使用的引物序列

*下划线表示用于随后的基于下一代测序仪的突变检测的标签序列。

NtAO1-s-1在NtAO1-S基因中以纯合型产生了1个无义突变(ORF内的1个密码子向终止密码子的改变)。该无义突变是在编码位于野生型NtAO1-S蛋白质的第41位的谷氨酰胺(Q)的密码子发生的核苷酸置换(C→T)。

NtAO1-s-2在NtAO1-S基因中以纯合型产生了1个无义突变。该无义突变是在编码位于野生型NtAO1-S蛋白质第146位的谷氨酰胺(Q)的密码子发生的核苷酸置换(C→T)。

NtAO1-s-3在NtAO1-S基因中以纯合型产生了1个无义突变。该无义突变是在编码位于野生型NtAO1-S蛋白质的第277位的甘氨酸(G)的密码子发生的核苷酸置换(G→T)。

NtAO1-t-1在NtAO1-T基因中以纯合型产生了1个无义突变。该无义突变是在编码位于野生型NtAO1-T蛋白质的第44位的色氨酸(W)的密码子发生的核苷酸置换(G→A)。

NtAO1-t-2在NtAO1-T基因中以纯合型产生了无义突变。该无义突变是在编码位于野生型NtAO1-T蛋白质的第61位的谷氨酰胺(Q)的密码子发生的核苷酸置换(C→T)。

NtAO1-t-3在NtAO1-T基因中以纯合型产生了剪接突变(引起剪接异常的核苷酸置换)。该剪接突变是在NtAO1-T基因的第2外显子的3’侧末端发生的核苷酸置换(G→A)。

在温室中培育以上的突变体。通过将NtAO1-s-1与NtAO1-t-1交配而得到了F1代(NtAO1-F1-1)。通过将NtAO1-s-2与NtAO1-t-2交配而得到了F1代(NtAO1-F1-2)。通过培育各F1代并进行自体繁殖，得到了来自于不同的突变体品系的2个品系的F2代(NtAO1-F2-1及NtAO1-F2-2)。

播种2个品系的F2代，从各192个个体的临时栽植苗提取DNA，并且通过使用了表20的引物的PCR对突变周边的序列进行了扩增。将使用了iSeq 100(Illumina公司)的扩增产物的测序中利用的序列(P7序列、P5序列及各个体的条码序列)添加于该扩增产物进行了PCR。然后，将添加有上述序列的上述扩增产物供于使用了iSeq 100(Illumina公司)的测序，确认了各个体的基因型。

其结果是，在NtAO1-F2-1及NtAO1-F2-2的全部个体中，不存在在NtAO1-S及NtAO1-T基因以纯合型具有上述突变的基因型的个体。拟南芥的AO(相当于烟草属植物的AO1)的功能破坏突变体被报告具有胚性致死(Katoh,A.et al.(2006)Plant Physiology 141:851-857)。因此，可以认为在烟草中AO1(AO1-S及AO1-T)的突变体也显示出致死性。

接着，在NtAO1-F2-1及NtAO1-F2-2中，将显示出以下(1)～(5)的基因型的个体(每1基因型为多个个体)转移至3号盆，在基于PCR及Sanger测序的基因型确认后，在温室(24℃)中进行培育(表20)。将培育的个体的基因型及个体数示于表21。

(1)在NtAO1-S基因以纯合型具有突变、而在NtAO1-T基因不具有突变的个体(NtAO1-ssTT)、

(2)在NtAO1-S基因不具有突变、而在NtAO1-T基因以纯合型具有突变的个体(NtAO1-SStt)、

(3)在NtAO1-S基因以杂合型具有突变、而在NtAO1-T基因以纯合型具有突变的个体(NtAO1-Sstt)、

(4)在NtAO1-S基因不具有突变、而在NtAO1-T基因以杂合型具有突变的个体(NtAO1-SStT)、以及

(5)在NtAO1-S基因及NtAO1-T基因不具有突变的个体(NtAO1-SSTT)。

[表21]

各基因型的个体数

如下所述评价了培育的个体(生物碱含量及成长状态)。

在开花期采集2～4片中位叶，在70℃下干燥16小时后，将粉碎的叶供于次生烟碱分析。其结果是在(1)～(4)及(5)之间没有在基因型导致的生物碱含量方面确认到差异(图7)。个体(1)～(4)的生长基本正常。但是，在包含1个以上突变等位基因的个体(1)～(4)的半数中，在下位叶确认到了斑(表21、图8)。在个体(5)中没有确认到斑。将以上的结果总结于表22。

[表22]

评价结果

突变等位基因数	有斑	无斑	总计
				3	2	2	4
2	8	5	13
				1	1	0	1
0	0	4	4

AO1涉及生命活动所必需的NAD+的生物合成，是在植物的生命活动中起到重要作用的酶基因。如上所述，根据AO1的功能被破坏的突变体显示出致死也可以证明该作用的重要性。因此，可以认为，在AO1基因中存在的1个以上的突变等位基因会对植物的生理状态造成不良影响，产生无突变的个体中没有确认到的异常(产生叶的斑等)。

非专利文献9的D9_AO2-RNAi中确认到了与上述异常类似的现象。在D9_AO2-RNAi中，确认到了叶中的AO转录物量的降低(如上所述，可以认为实质上表示AO1的转录物量的降低)。将本比较例的结果与上述现象及上述降低结合考虑，在D9_AO2-RNAi中，AO2及AO1这两者的功能受到了抑制的预想是合理的。

根据以上结果可知，为了兼顾正常的成长及叶中的生物碱的含量的降低，至少需要抑制AO2基因的功能并且保持AO1基因的功能。

工业实用性

根据本发明，可提供低生物碱含量的烟草属植物体。

Claims

1.一种烟草属植物体的制备方法，该方法包括：

在烟草属植物体的基因组中导入特异性地引起以下(a-1)和(b)、或者(a-2)和(b)的功能抑制的突变的工序：

(a-1)包含编码相对于序列号2所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性、且具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因；

(a-2)包含编码相对于序列号5所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性、且具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因；

(b)包含编码相对于序列号6所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性、且具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因，

进行所述导入的工序包含在所述内源基因导入所述突变，

不对以下内源基因(c-1)和(d)、或者(c-2)和(d)进行功能抑制，

(c-1)包含编码相对于序列号62所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性、且具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因；

(c-2)包含编码相对于序列号63所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性、且具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因；

(d)包含编码相对于序列号64所示的氨基酸序列具有99％以上的序列同一性、且具有天冬氨酸氧化酶活性的多肽的多核苷酸作为编码区域的内源基因。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，

所述功能抑制为：与野生型植物相比，由所述内源基因生成的mRNA的存在量减少。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其中，

所述功能抑制为：与野生型植物相比，由所述内源基因生成的mRNA的分解受到促进。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其中，

所述功能抑制为：与野生型植物相比，来自所述内源基因的mRNA的转录量减少。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，

所述功能抑制为：与野生型植物相比，所述多肽的存在量减少。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其中，

所述功能抑制为：与野生型植物相比，所述多肽的翻译量减少。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，

进行所述导入的工序通过突变原处理、基因的重组、基因组编辑或基因敲除而实施。

8.一种干燥叶，其在基因组中导入特异性地引起以下(a-1)和(b)、或者(a-2)和(b)的功能抑制的突变：

并且，与由野生型烟草属植物体收获得到的烟叶制成的干燥叶相比，所述干燥叶显示出低生物碱含量，

不对以下内源基因(c-1)和(d)、或者(c-2)和(d)进行功能抑制，

9.一种烟草制品，其包含权利要求8所述的干燥叶。