WO2009092925A2 - Production de plantes cleistogames - Google Patents

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WO2009092925A2
WO2009092925A2 PCT/FR2008/001589 FR2008001589W WO2009092925A2 WO 2009092925 A2 WO2009092925 A2 WO 2009092925A2 FR 2008001589 W FR2008001589 W FR 2008001589W WO 2009092925 A2 WO2009092925 A2 WO 2009092925A2
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plant
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mutation
mutant
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Yun-Hai Lu
Régine DELOURME
Boulos Chalhoub
Nathalie Piel
Cyril Falentin
Michel Renard
Harry Belcram
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Genoplante-Valor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants

Definitions

  • the invention relates to new means for obtaining and identifying keyhole plants, in particular Brassicaceae.
  • Brassicaceae also called cruciferous, includes many plants of agronomic interest. Brassica plants, including cabbages, rapeseed, rape, mustard, turnips, etc., may be mentioned. Other food plants, such as watercress, rocket, radish, horseradish, as well as ornamental plants, such as wallflowers, also belong to this family.
  • Arabidopsis thaliana which is a model plant widely used for genetic studies and molecular biology, also belongs to the family Brassicaceae.
  • Rapeseed Brassica napus
  • Brassica napus Brassica napus
  • Brassica oleracea Brassica oleracea
  • shuttle Brassica oleracea
  • Rapeseed is grown mainly for the production of oil, for animal feed, and recently for the production of biofuel. This plant is continually the subject of research aiming at its genetic improvement, whether by conventional techniques of varietal selection, or more recently by transgenesis.
  • Rapeseed is an allogamous species; its pollen can be transported by wind or pollinating insects over distances of several kilometers, which causes difficulties when it is desired to limit cross-fertilization between different rapeseed varieties, for example when selecting pure lines, or seed production.
  • rapeseed is able to hybridize with wild crucifers, such as ravenella, which poses an additional problem when growing genetically modified rapeseed in the field.
  • Mutant cleistogamous rapeseed, to prevent this dissemination of pollen, are described in the patent EP1037522 in the name of INRA. These mutants have complete flowers, but which do not open at anthesis. After normal development, the flowers usually remain closed until petal fall, which occurs after fertilization.
  • the inventors have now identified the Clgl gene for rape and demonstrated the mutation responsible for the cleistogamous character.
  • SEQ ID NO: 2 The sequence of a genomic rapeseed DNA fragment (isolated from the Primor-Clg variety) containing an allele of the Clgl gene bearing the mutation responsible for the key-typing phenotype is represented in the sequence listing in the appendix under the number SEQ ID NO: 3, and the deduced polypeptide sequence is represented under the number
  • the translation product deduced from the Clgl gene shows a high degree of homology with the product of the Arabidopsis At4g34100 gene.
  • the mutation responsible for the cleistogam phenotype is a C ⁇ T transversion at position 2157 of the sequence SEQ ID NO: 1, which induces the replacement of the amino acid proline at position 325 of the sequence SEQ ID NO: 2 by the amino acid leucine.
  • This mutation is located in a region of the gene that is perfectly (100%) conserved between the rapese Clgl protein and its Arabidopsis counterpart.
  • the identification by the inventors of a gene involved in cleistogamy, as well as a mutation of this gene imparting a key-typogam phenotype provides means making it easier to obtain plants, in particular Brassicaceae, cleistogamous, by making it possible in particular to detect the presence of this gene in plants from crosses or mutagenesis without the need to wait for the opening of flower buds, and also to introduce this character by transgenesis in plants.
  • Clgl protein is defined here as any polypeptide whose peptide sequence has at least 80%, preferably at least 85%, advantageously at least 90%, and most preferably at least 95% identity with the polypeptide.
  • SEQ ID NO: 2 and contains the following sequence: DGLDDADGAEDVPFDELVGMQGPVFHL (SEQ ID NO: 5).
  • the corresponding gene is called Clgl.
  • Clgl proteins belong to the family of zinc finger proteins, and contain a "RING-variant" domain and SSM4 domains.
  • the RING-variant and SSM4 domains are known per se, and are respectively designated as smartOO744 / PSSM-Id 48011 and COG5183 / PSSM-Id 34782 in the CDD database (Marchler-Bauer et al., Nucleic Acids Res., 35: D237-40, 2007).
  • the subject of the present invention is therefore a method for producing a cleistogamous plant, comprising a step of totally or partially inhibiting the opening of the flower buds in said plant, by expressing in said plant a mutant Clgl protein resulting from the mutation of a wild type Clgl protein as defined above, and whose activity is impaired relative to that of said wild-type Clgl protein.
  • the expression in a plant of a mutant Clgl protein whose activity is impaired can be obtained by mutation of an endogenous gene of said plant encoding the wild-type Clgl protein, in particular by chemical mutagenesis (for example by the EMS), or by physical mutagenesis by radiation (X-rays, UV). It can also be obtained by genetic transformation of said plant with a ⁇
  • polynucleotide encoding a mutant Clgl protein as defined above, said mutant protein interfering with the activity of the endogenous Clgl protein.
  • said mutant protein contains a mutation which induces the replacement of proline at position 13 of the sequence SEQ ID NO: 5 by an amino acid other than proline.
  • said plant is a Brassicaceae, preferably a plant of the genus Brassica, and preferably rapeseed.
  • the subject of the present invention is also a mutant polypeptide whose expression in a plant causes it to inhibit the opening of flower buds, characterized in that it results from the mutation of a Clgl polypeptide as defined above, said mutation inducing the substitution of proline at position 13 of the sequence SEQ ID NO: 5 by an amino acid other than proline.
  • the proline at position 13 of the sequence SEQ ID NO: 5 is replaced by a leucine.
  • the present invention also relates to a method for determining whether a plant contains a mutant gene whose expression induces an inhibition of the opening of flower buds, characterized in that it comprises the detection of the presence or absence in biological material from said plant, a polynucleotide encoding a mutant polypeptide according to the invention.
  • the present invention also relates to tools for implementing a method according to the invention; these include probes, or couples of nucleic acid primers for detecting the mutation defined above.
  • Nucleic acid probes according to the invention are capable of hybridizing selectively, under appropriate stringency conditions, either with an allele of the Clgl target gene coding for a mutant polypeptide according to the invention (also referred to herein as after allele CIg), either with a wild-type allele (that is, an allele coding for a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 5, also hereinafter referred to as the clg allele of said gene.
  • This selective hybridization is reflected at least by a significantly greater hybridization signal with the targeted allele than with the other allele of the same gene, and preferably by the presence of a hybridization signal with the target allele. and the absence of hybridization signal with the other allele.
  • Nucleic acid primers according to the invention make it possible to amplify, from genetic material derived from the plant to be tested, a target sequence corresponding to a region of the Clgl gene in which the mutation defined above is localized.
  • the presence or absence of this mutation can be detected on the amplification product by various methods known per se, for example by sequencing thereof, or by selective hybridization with a nucleic acid probe according to the invention.
  • a pair of primers that can be used for carrying out a process according to the invention consists of the following primers:
  • T2S095_F ACGCTGATGGTGCTGAAGAAGATC (SEQ ID NO: 6)
  • T2S095_R GTATTTTCCAATGCTGAGTCA (SEQ ID NO: 7)
  • kits for the implementation of a method according to the invention include for example:
  • At least one nucleic acid probe according to the invention associated with means for visualizing the hybridization, or at least one pair of primers according to the invention, associated with reagents allowing the implementation of an amplification reaction and / or means for detecting the amplification product, and optionally one or more restriction enzymes, as well as, if appropriate, positive and / or negative control amplification controls.
  • the present invention also encompasses isolated polynucleotides comprising a sequence encoding a mutant polypeptide according to the invention.
  • These polynucleotides may be, for example, genomic DNA fragments, or cDNAs, encoding said mutant polypeptide, isolated from a plant containing the mutation, or obtained by site-directed mutagenesis from a polynucleotide encoding a Clgl protein. wild type.
  • polynucleotides according to the invention are expression cassettes, in which a sequence coding for a mutant polypeptide in accordance with the invention, or an antisense sequence or an RNA1 sequence targeting the Clgl gene, is placed under control.
  • Said promoter may be the endogenous promoter of the Clg1 gene or a heterologous promoter.
  • a promoter having the same expression profile as the endogenous promoter Clgl it is not mandatory to use a promoter having the same expression profile as the endogenous promoter Clgl; a ubiquitous and constitutive promoter such as the 35S promoter of CaMV, or an inducible or tissue-specific promoter can also be used.
  • the present invention also encompasses recombinant vectors resulting from the insertion of an expression cassette according to the invention into a suitable host vector.
  • the expression cassettes and expression vectors according to the invention can, of course, also comprise other sequences, usually employed in this type of construction, • such as transcription terminators, leader sequences ( leader sequences), polyadenylation sites, as well as, where appropriate, enhancer sequences (enhancer sequences for transcription and translation). They can also include sequences allowing the monitoring of the transformation, as well as the identification and / or the selection of the transformed cells or organisms. These include reporter genes (eg, beta-glucuronidase (GUS), luciferase, or green fluorescent protein (GFP)), giving these cells or organisms a readily recognizable phenotype. or selection marker genes (eg, antibiotic resistance genes, or herbicide genes).
  • GUS beta-glucuronidase
  • GFP green fluorescent protein
  • the choice of the promoter, that of the host vector and that of the additional sequences that can be inserted into the cassettes and the expression vectors according to the invention for the regulation of expression, as well as that of the host vector, can be carried out in a conventional manner, by those skilled in the art based in particular on criteria such as the cells and host plants chosen, the desired expression profile in the host plant, the transformation protocols envisaged, etc. o
  • the present invention also encompasses host cells genetically transformed by an expression cassette according to the invention.
  • Cell or organism transformed by a polynucleotide means any cell or organism whose genetic content has been modified by transfer of said polynucleotide into said cell or said organism, irrespective of the transfer method which has been used, and in such a way that the genetic information provided by said polynucleotide is integrated into the chromosomal DNA or chromosomal remains ⁇ extra.
  • the host cells may be prokaryotic or eukaryotic cells.
  • prokaryotic cells it may especially be Agrobacteria such as Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizobium.
  • eukaryotic cells it may be in particular plant cells derived from dicotyledonous or monocotyledonous plants.
  • the subject of the present invention is also plants genetically transformed with at least one polynucleotide according to the invention, and in particular transgenic plants comprising in their genome at least one copy of a transgene containing a polynucleotide according to the invention. These transgenic plants exhibit a cleistogamous phenotype.
  • a transgenic plant is defined here as a transformed plant in which the exogenous genetic information provided by the transforming polynucleotide is stably integrated into the chromosomal DNA, in the form of a transgene, and can thus be transmitted to the descendants of said plant.
  • This definition encompasses also the 'progeny plants resulting from the initial transgenesis, provided that they contain in their genome a copy of the transgene.
  • Different methods of obtaining transgenic plants are well known in themselves to those skilled in the art. Generally, these methods involve the transformation of plant cells, the regeneration of ⁇
  • the plant material (protoplasts, calli, cuttings, seeds, etc.) obtained from the transformed cells or transgenic plants in accordance with the invention is also part of the subject of the present invention.
  • the invention also encompasses the products obtained from the transgenic plants according to the invention, in particular fodder, wood, leaves, stems, roots, flowers and fruits.
  • the present invention also relates to the production of keyhole plants by crossing mutant plants according to the invention with other plants that do not possess the cleistogamous character. It also includes the plants resulting from this cross.
  • the present invention applies in particular to plants of the family Brassicaceae, and more particularly to species of the genus Brassica, including rapeseed. It can also be applied to other dicotyledonous plants or monocotyledons, and particularly advantageously to allogamous species.
  • T2S095_F ACGCTGATGGTGCTGAAGAAGATC
  • T2S095_R GTATTTTCCAATGCTGAGTCA
  • the changes made to create the BgIII restriction site are underlined.
  • This marker was analyzed on HD lines of the "BOOl-CIg x Yudal" population, as well as on quasi-isogenic lines, containing either the wild-type clg allele (AKAMAR, ASCONA, BRISTOL, CAPITOL, CCH 1083, EXPRESS lines). , FALCON, GIN 3683, H 133), or the Clg mutant allele (AKAMAR CLG, ASCONA CLG, CLG BRISTOL, CAPITOL CLG, CCH 1083 CLG, EXPRESS CLG, FALCON CLG, GIN 3683 CLG lines, obtained by crossing and backcrossing with the primary Primor- CIg mutant line).
  • the wild-type allele can be distinguished from the mutated allele after digestion BgIII by a difference in size of 20 bp clearly visualizable on a 3% agarose gel.
  • a 5999 bp insert comprising a 895 bp sequence before the translation codon of Clg1, containing the Clg1 promoter
  • the Primor-Clgl allele differs from the Darmain-clgl allele by SNP6 alone.
  • the DNAs were extracted from BAC clones by the alkaline lysis method, purified with chloroform, and digested with the XbaI enzyme. The digested fragments are separated on a 1% agarose gel. Fragments containing the gene and its promoter were then cut out of the gel, electroeluted and subcloned into the pBINPLUS and pBIB-Hygro vectors. Positive clones were selected by PCR using the primer pair described in Example 1.
  • Construction 1 dwarf-Dwaror allele clcl in the vector pBINPLUS.
  • Construction 2 Dwaror dwarf allele clgl in the vector pBIB-Hygro. b- Allelic form Primor-Clgl
  • Construction 3 Primor-Clgl allele in the vector pBINPLUS.
  • Rapeseed plants have been transformed by these Agrobacteria.
  • the genotype used for processing is the Westar variety, which is a spring colza of Canadian origin.
  • the Westar variety rapeseeds are disinfected with 70% ethanol for 2 minutes then put in a commercial solution of bleach, with a few drops of
  • the seeds are sown at a rate of 15 seeds per dish, put at 4 0 C for 3 nights and transferred to a culture chamber at 22/20 0 C, 16h / 8h of photoperiod with an illumination of 70 ⁇ mol / m2 / second.
  • the transformation is based on the protocol developed by Moloney et al. (Plant, This Rep 8: 238-242, 1989), and Sparrow et al. (Theor Appl., Broom 108: 1249-1255, 2004) for rapeseed.
  • the petioles of the cotyledons are excised from seedlings 7 days after germination.
  • the explants are then soaked in the suspension of Agrobacterium and then transplanted onto the coculture medium (germination medium containing 2 mg.l -1 of benzyl amino purine) at the rate of 10 explants / dish
  • the dishes are then placed in a culture chamber on an unlit shelf, for 72 hours, then the explants are transferred to the selection medium (co-culture medium supplemented with 400 mg / l of Timentin R (mixture of ticarcillin and clavulanic acid) and 25 mg / l of kanamycin as selective agents.)
  • the explants are transplanted every 3 weeks to the same medium.
  • Plants of Arabidopsis thaliana were transformed with Agrobacterium tumefaciens using construct 3 described above, according to a protocol similar to that described above for rapeseed.
  • Unconverted control plants B :: TO transformed plants, at different stages of flowering.

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Abstract

L'invention est relative à l'identification d'un gène mutant impliqué dans la cléistogamie, et à ses utilisations pour la production et/ou la sélection de plantes cléistogames.

Description

PRODUCTION DE PLANTES CLEISTOGAMES .
L'invention est relative à de nouveaux moyens d'obtention et d'identification de plantes cléistogames, notamment de Brassicacées . La famille des Brassicacées, également dénommées crucifères, comprend de nombreuses plantes d'intérêt agronomique. On citera notamment des plantes du genre Brassica, auxquelles appartiennent notamment les choux, le colza, la navette, la moutarde, les navets, etc. D'autres plantes à usage alimentaire, telles que le cresson, la roquette, les radis, le raifort, ainsi que des plantes ornementales, telles que les giroflées, appartiennent également à cette famille. Enfin Arabidopsis thaliana, qui est une plante modèle largement utilisée pour les études génétiques et de biologie moléculaire, appartient également à la famille des Brassicacées.
La Brassicacée dont la culture est la plus répandue est le colza (Brassica napus) issu d'un croisement naturel entre le chou (Brassica oleracea) et la navette (Brassica râpa) . Le colza est cultivé notamment pour la production d'huile, pour l'alimentation animale, et depuis peu pour la production de biocarburant. Cette plante fait continuellement l'objet de recherches visant à son amélioration génétique, que ce soit par les techniques classiques de sélection variétale, ou plus récemment, par transgénèse.
Le colza est une espèce de type allogame ; son pollen peut être transporté par le vent ou les insectes pollinisateurs sur des distances de plusieurs kilomètres, ce qui occasionne des difficultés lorsque l'on souhaite limiter une fécondation croisée entre différentes variétés de colza, par exemple lors de la sélection de lignées pures, ou de la production de semences. En outre, le colza est capable de s'hybrider avec des crucifères sauvages, telles que la ravenelle, ce qui pose un problème supplémentaire lors de la culture en champ de colzas génétiquement modifiés.
Des mutants cléistogames de colza, permettant d'éviter cette dissémination du pollen, sont décrits dans le Brevet EP1037522 au nom de l' INRA. Ces mutants présentent des fleurs complètes, mais qui ne s'ouvrent pas à l'anthèse. Après un développement normal, les fleurs restent en général fermées jusqu'à la chute des pétales, qui a lieu après la fécondation.
L'analyse génétique du caractère cléistogame a montré qu'il est contrôlé par un gène majeur [CIgI) semi- dominant, à effet additif. Ce gène n'avait toutefois pas été identifié jusqu'à présent, et la sélection des plantes contenant l'allèle mutant ne pouvait s'effectuer que sur la base de leur phénotype. Les plantes hétérozygotes pour la mutation qui présentent des fleurs incomplètement ouvertes, peuvent être difficiles à identifier, d'autant que l'expression de ce caractère est influencée par le fonds génétique et l'environnement.
Les Inventeurs ont maintenant identifié le gène Clgl du colza et mis en évidence la mutation responsable du caractère cléistogame.
La séquence d'un fragment d'ADN génomique de colza
(isolé de la variété Darmor Nain-jbzh) contenant un allèle sauvage du gène Clgl est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, et la séquence polypeptidique déduite est représentée sous le numéro
SEQ ID NO: 2. La séquence d'un fragment d'ADN génomique de colza (isolé de la variété Primor-Clg) contenant un allèle du gène Clgl portant la mutation responsable du phénotype cléistogame est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3 , et la séquence polypeptidique déduite est représentée sous le numéro
SEQ ID NO: 4 .
Le produit de traduction déduit du gène Clgl présente un degré élevé d' homologie avec le produit du gène At4g34100 d' Arabidopsis . La mutation responsable du phénotype cléistogame est une transversion C → T en position 2157 de la séquence SEQ ID NO: 1, qui induit le remplacement de l'acide aminé proline en position 325 de la séquence SEQ ID NO: 2 par l'acide aminé leucine.
Cette mutation est située dans une région du gène qui est parfaitement (100%) conservée entre la protéine Clgl de colza et son homologue d' Arabidopsis. L'identification par les Inventeurs d'un gène impliqué dans la cléistogamie, ainsi que d'une mutation de ce gène conférant un phénotype cléistogame fournit des moyens facilitant l'obtention de plantes, notamment de Brassicacées, cléistogames, en permettant notamment de détecter la présence de ce gène dans des plantes issues de croisements ou de mutagénèse sans qu'il soit nécessaire d'attendre l'ouverture des boutons floraux, et en permettant également d'introduire ce caractère par transgénèse dans des plantes. On définit ici comme « protéine Clgl » tout polypeptide dont la séquence peptidique possède au moins 80%, de préférence au moins 85%, avantageusement au moins 90%, et de manière tout à fait préférée au moins 95% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2, et contient la séquence suivante : DGLDDADGAEDVPFDELVGMQGPVFHL (SEQ ID NO: 5) . Le gène correspondant est dénommé Clgl.
Ces protéines Clgl appartiennent à la famille des protéines à doigts de zinc, et contiennent un domaine « RING- variant » et des domaines SSM4. Les domaines RING-variant et SSM4 sont connus en eux-mêmes, et sont respectivement désignés sous les références smartOO744/PSSM-Id 48011 et COG5183/PSSM- Id 34782 dans la base de données CDD (Marchler-Bauer et al., Nucleic Acids Res., 35: D237-40, 2007).
La présente invention a en conséquence pour objet une méthode pour produire une plante cléistogame, comprenant une étape consistant a inhiber totalement ou partiellement l'ouverture des boutons floraux dans ladite plante, en exprimant dans ladite plante une protéine Clgl mutante résultant de la mutation d'une protéine Clgl de type sauvage telle que définie ci-dessus, et dont l'activité est altérée par rapport à celle de ladite protéine Clgl de type sauvage.
L'expression dans une plante d'une protéine Clgl mutante dont l'activité est altérée peut être obtenue par mutation d'un gène endogène de ladite plante codant pour la protéine Clgl de type sauvage, notamment par mutagénèse chimique (par exemple par l'EMS), ou par mutagénèse physique par radiations (Rayons X, UV) . Elle peut également être obtenue par transformation génétique de ladite plante avec un ^
polynucléotide codant pour une protéine Clgl mutante telle que définie ci-dessus, ladite protéine mutante interférant avec l'activité de la protéine Clgl endogène.
Avantageusement ladite protéine mutante contient une mutation qui induit le remplacement de la proline en position 13 de la séquence SEQ ID NO: 5 par un acide aminé autre que la proline.
De préférence ladite plante est une Brassicacée, de préférence, une plante du genre Brassica, et avantageusement le colza.
La présente invention a également pour objet un polypeptide mutant dont l'expression dans une plante entraîne chez celle-ci une inhibition de l'ouverture des boutons floraux, caractérisé en ce qu'il résulte de la mutation d'un polypeptide Clgl tel que défini ci-dessus, ladite mutation induisant le remplacement de la proline en position 13 de la séquence SEQ ID NO: 5 par un acide aminé autre que la proline.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la proline en position 13 de la séquence SEQ ID NO: 5 est remplacée par une leucine .
La présente invention a également pour objet un procédé pour déterminer si une plante contient un gène mutant dont l'expression induit une inhibition de l'ouverture des boutons floraux, caractérisé en ce qu' il comprend la détection de la présence ou de l'absence, dans du matériel biologique provenant de ladite plante, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide mutant conforme à l'invention.
La présente invention a également pour objet des outils pour la mise en œuvre d' un procédé conforme à l'invention ; il s'agit notamment de sondes, ou de couples d' amorces d' acide nucléique permettant la détection de la mutation définie ci-dessus.
Des sondes d' acide nucléique conformes à l'invention sont capables de s'hybrider sélectivement, dans des conditions de stringence appropriées, soit avec un allèle du gène-cible Clgl codant pour un polypeptide mutant conforme à l'invention (également dénommé ci-après allèle CIg), soit avec un allèle sauvage (c'est-à-dire un allèle codant pour un polypeptide comprenant la séquence SEQ ID NO: 5, également dénommé ci-après allèle clg) dudit gène.
Cette hybridation sélective se traduit au minimum par un signal d'hybridation significativement plus important avec l' allèle ciblé qu'avec l'autre allèle du même gène, et de préférence par la présence d'un signal d'hybridation avec 1' allèle ciblé et l'absence de signal d'hybridation avec l'autre allèle.
Les principes généraux de conception et d'utilisation de sondes spécifiques permettant l'analyse de polymorphismes ne concernant qu'un petit nombre de nucléotides, voire un seul nucléotide, ont été initialement décrits par SAIKI et al., (Nature, 324,163-166, 1986), et sont bien connus en eux-mêmes. Des conditions de stringence appropriées à une hybridation sélective peuvent être facilement déterminées par l'homme du métier pour un polynucléotide donné; elles dépendent notamment de la longueur du polynucléotide, de sa composition en bases, et du pourcentage de différences entre les allèles à discriminer, au niveau de la portion du gène ciblée par l'hybridation.
Des amorces d' acide nucléique conformes à l'invention permettent d'amplifier, à partir de matériel génétique issu de la plante à tester, une séquence cible correspondant à une région du gène Clgl dans laquelle est localisée la mutation définie ci-dessus.
La présence ou l'absence de cette mutation peut être détectée sur le produit d'amplification par diverses méthodes connues en elles-mêmes, par exemple par séquençage de celui-ci, ou par hybridation sélective avec une sonde d'acide nucléique conforme à l'invention ou par digestion avec une enzyme de restriction reconnaissant une séquence-cible présente exclusivement, soit dans le produit d'amplification issu de l' allèle sauvage, soit dans celui issu de l' allèle mutant ; on peut également effectuer une amplification sélective de l' allèle recherché, en utilisant au moins une amorce d'amplification choisie de manière à n'observer une amplification que si cet allèle est présent dans le matériel génétique analysé.
A partir des informations fournies par la présente invention, l'homme du métier peut facilement obtenir des sondes et amorces permettant la détection de la mutation définie ci-dessus.
A titre d'exemple non-limitatif, un couple d'amorces utilisable pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à 1 ' invention est constitué par les amorces suivantes :
T2S095_F : ACGCTGATGGTGCTGAAGAAGATC (SEQ ID NO: 6)
T2S095_R : GTATTTTCCAATGCTGAGTCA (SEQ ID NO: 7)
La présente invention a également pour objet des kits pour la mise en œuvre d' un procédé conforme à l'invention. Ces kits comprennent par exemple :
- au moins une sonde d' acide nucléique conforme à l'invention, associée à des moyens de visualisation de l'hybridation, ou au moins un couple d' amorces conforme à l'invention, associé à des réactifs permettant la mise en œuvre d'une réaction d'amplification et/ou à des moyens de détection du produit d'amplification, et éventuellement à une ou plusieurs enzymes de restriction, ainsi que, le cas échéant, des témoins positifs et/ou des témoins négatifs d'amplification.
La présente invention englobe également des polynucléotides isolés comprenant une séquence codant pour un polypeptide mutant conforme à l'invention. Ces polynucléotides peuvent être par exemple des fragments d'ADN génomique, ou des ADNc, codant pour ledit polypeptide mutant, isolés à partir d'une plante contenant la mutation, ou obtenus par mutagenèse dirigée à partir d'un polynucléotide codant pour une protéine Clgl de type sauvage.
Avantageusement, des polynucléotides conformes à l'invention sont des cassettes d'expression, dans lesquelles une séquence codant pour un polypeptide mutant conforme à l'invention, ou une séquence antisens ou une séquence d'ARNi ciblant le gène Clgl, est placée sous contrôle d'un promoteur ^
approprié. Ledit promoteur peut être le promoteur endogène du gène Clgl, ou bien un promoteur hétérologue. Dans le second cas, il n'est pas obligatoire d'utiliser un promoteur possédant le même profil d'expression que le promoteur endogène Clgl ; on peut également utiliser un promoteur ubiquitaire et constitutif tel que le promoteur 35S du CaMV, ou un promoteur inductible ou tissu-spécifique.
La présente invention englobe également des vecteurs recombinants, résultant de l'insertion d'une cassette d'expression conforme à l'invention dans un vecteur hôte approprié .
Les cassettes d'expression et les vecteurs d'expression conformes à l'invention peuvent, bien entendu, comprendre en outre d'autres séquences, usuellement employées dans ce type de constructions, • telles que des terminateurs de transcription, des séquences de tête (leader séquences), des sites de polyadénylation, ainsi que, le cas échéant, des séquences amplificatrices (séquences « enhancer » de transcription et de traduction) . Ils peuvent également comprendre des séquences permettant le suivi de la transformation, ainsi que l'identification et/ou la sélection des cellules ou organismes transformés. Il s'agit notamment de gènes rapporteurs (par exemple celui de la beta-glucuronidase (GUS) , celui de la luciférase, ou celui de la "green fluorescent protein" (GFP) ) , conférant à ces cellules ou organismes un phénotype aisément reconnaissable, ou bien de gènes marqueurs de sélection (par exemple gènes de résistance à un antibiotique, ou à un herbicide) .
Le choix du promoteur, celui du vecteur-hôte et celui des séquences additionnelles pouvant être insérées dans les cassettes et les vecteurs d'expression conformes à l'invention de régulation de l'expression, ainsi que celui du vecteur-hôte, peut être effectué, de manière classique, par l'homme du métier en fonction notamment de critères tels que les cellules et plantes-hôtes choisies, le profil d'expression souhaité dans la plante hôte, les protocoles de transformation envisagés, etc. o
La présente invention englobe également des cellules-hôtes génétiquement transformées par une cassette d'expression conforme à l'invention.
On entend par cellule ou organisme transformé par un polynucléotide, toute cellule ou organisme dont le contenu génétique a été modifié par transfert dudit polynucléotide dans ladite cellule ou ledit organisme, quelle que soit la méthode de transfert qui a été utilisée, et de manière que l'information génétique apportée par ledit polynucléotide soit intégrée dans l'ADN chromosomique ou demeure extra¬ chromosomique .
Les cellules hôtes peuvent être des cellules procaryotes, ou eucaryotes. Dans le cas de cellules procaryotes, il peut notamment s'agir d'Agrobactéries telles qu' Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizobium. Dans le cas de cellules eucaryotes, il peut s'agir notamment de cellules végétales, issues de plantes dicotylédones ou monocotylédones .
La présente invention a également pour objet des plantes génétiquement transformées par au moins un polynucléotide conforme à l'invention, et notamment des plantes transgéniques comprenant dans leur génome au moins une copie d' un transgène contenant un polynucléotide conforme à l'invention. Ces plantes transgéniques présentent un phénotype cléistogame.
On définit ici comme plante transgénique une plante transformée chez laquelle l'information génétique exogène apportée par le polynucléotide transformant est intégrée de manière stable dans l'ADN chromosomique, sous forme de transgène, et peut ainsi être transmise aux descendants de ladite plante. Cette définition englobe donc également les' descendants des plantes résultant de la transgénèse initiale, dès lors qu' ils contiennent dans leur génome une copie du transgène . Différentes méthodes d' obtention de plantes transgéniques sont bien connues en elles-mêmes de l'homme du métier. Généralement, ces méthodes impliquent la transformation de cellules végétales, la régénération de ^
plantes à partir des cellules transformées, et la sélection des plantes ayant intégré le transgène.
Des techniques très nombreuses de transformation de cellules végétales germinales ou somatiques (isolées, sous forme de cultures de tissus ou d'organe, ou sur la plante entière), et de régénération des plantes sont disponibles. Le choix de la méthode la plus appropriée dépend généralement de la plante concernée.
Le matériel végétal (protoplastes, cals, boutures, graines, etc..) obtenu à partir des cellules transformées ou des plantes transgéniques conformes à l'invention fait également partie de l'objet de la présente invention. L' invention englobe également les produits obtenus à partir des plantes transgéniques conformes à l'invention, notamment le fourrage, le bois, les feuilles, les tiges, les racines, les fleurs et les fruits.
La présente invention a également pour objet l'obtention de plantes cléistogames par croisement de plantes mutantes conformes à l'invention avec d'autres plantes ne possédant pas le caractère cléistogame. Elle englobe également les plantes résultant de ce croisement.
La présente invention s'applique notamment aux plantes de la famille des Brassicacées, et plus particulièrement aux espèces du genre Brassica, et notamment au colza. Elle peut également s'appliquer à d'autres plantes dicotylédones ou des monocotylédones, et de manière particulièrement avantageuse, aux espèces allogames.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la détection de la mutation CIg, et la construction de plantes transgéniques exprimant le gène muté. EXEMPLE 1: DETECTION DE LA MUTATION CIg PAR PCR CHEZ LE COLZA
Afin de développer un marqueur PCR allèle- spécifique qui permette de distinguer l'allèle sauvage clg de l'allèle muté CIg (cléistogame) et ainsi de diagnostiquer la présence de la mutation chez diverses variétés de colza, nous avons défini un couple d'amorces dont l'une a été modifiée de ^
façon à créer dans le produit d'amplification un site de restriction BgIII (AGATCT) s'il s'agit de la mutation Clg (mutant cléistogame) . Par contre, ce site de restriction n'est pas présent s'il s'agit de l'allèle sauvage clg. La séquence de ces amorces est la suivante :
T2S095_F : ACGCTGATGGTGCTGAAGAAGATC, T2S095_R : GTATTTTCCAATGCTGAGTCA
Les modifications apportées pour créer le site de restriction BgIII sont soulignées. Ce marqueur a été analysé sur des lignées HD de la population « BOOl-CIg x Yudal », ainsi que sur des lignées quasi-isogéniques, contenant soit l'allèle sauvage clg (lignées AKAMAR, ASCONA, BRISTOL, CAPITOL, CCH 1083, EXPRESS, FALCON, GIN 3683, H 133), soit l'allèle muté Clg (lignées AKAMAR CLG, ASCONA CLG, BRISTOL CLG, CAPITOL CLG, CCH 1083 CLG, EXPRESS CLG, FALCON CLG, GIN 3683 CLG, obtenues par croisements et rétrocroisements avec la lignée mutante Primor- CIg de départ) .
Les résultats sont illustrés sur la Figure 1. Légende de la Figure 1 :
1: AKAMAR ; 2 : AKAMAR CLG; 3 : ASCONA ; 4 : ASCONA CLG ; 5 : BRISTOL ; 6 : BRISTOL CLG ; 7 : CAPITOL ; 8 : CAPITOL CLG ; 9 : CCH 1083 ; 10 : CCH 1083 CLG ; 11 : EXPRESS ; 12 : EXPRESS CLG ; 13 : FALCON ; 14 : FALCON CLG ; 15 : GIN 3683 ; 16 : GIN 3683 CLG ; 17 : H 133 (zeruca).
L'allèle sauvage peut être distingué de l'allèle muté après digestion BgIII par une différence de taille de 20 pb clairement visualisable sur un gel d' agarose de 3%. Ces résultats montrent qu' il y a une association absolue entre le profil du marqueur et le caractère cléistogame.
EXEMPLE 2 : CONSTRUCTION DE COLZAS TRANSGENIQUES EXPRIMANT L'ALLELE CLG
Construction des vecteurs d' expression
Deux vecteurs binaires ont été choisis pour les constructions :
1) Vecteur pBINPLUS (Engelen et al., Transgenic Research 4: 288-90, 1995) avec sélection kanamycine dans les bactéries et dans les plantes. 2) Vecteur pBIB-Hygro (Becker F, Nucleic Acids Res. 18:203, 1990) avec sélection kanamycine dans les bactéries et hygromycine dans les plantes.
Un insert de 5999 pb comprenant une séquence de 895 pb avant le codon d'initiation de la traduction de Clgl, contenant le promoteur de Clgl ;
- la séquence codant pour Clgl (4144 pb) ;
- une séquence de 960 pb en aval du codon stop, contenant la région 3'UTR du gène Clgl ; a été clone dans chacun de ces vecteurs, au site Xbal.
Cet insert est schématisé sur la Figure 2.
Ces inserts ont été obtenus à partir de deux formes alléliques du gène, issues de deux plantes différentes : a- Darmor-nain-clgl issu du cultivar Darmor-nain : il s'agit d'un allèle sauvage, ne conférant pas le caractère cléistogamie b- Primor-Clgl : il s'agit de l' allèle muté conférant le caractère de cléistogamie.
Le Tableau I ci-dessous indique les différences (SNP) entre ces deux formes alléliques, et leurs positions sur la séquence SEQ ID NO: 1:
Tableau 1
L' allèle Primor-Clgl diffère de l' allèle Darmor- nain-clgl par le seul SNP6.
Les ADNs ont été extraits à partir de clones BAC par la méthode de lyse alcaline, purifiés au chloroforme, et digérés par l'enzyme Xbal. Les fragments digérés sont séparés sur un gel d' agarose 1%. Les fragments contenant le gène et son promoteur ont été ensuite découpés du gel, électro-élués et sous-clonés dans les vecteurs pBINPLUS et pBIB-Hygro. Les clones positifs ont été sélectionnés par PCR à l'aide du couple d'amorces décrit à l'Exemple 1.
Au total 4 constructions ont été réalisées : a- Forme allélique Darmor-nain-clgl
- Construction 1 : allèle Darmor nain-clgl dans le vecteur pBINPLUS.
- Construction 2 : allèle Darmor nain-clgl dans le vecteur pBIB-Hygro. b- Forme allélique Primor-Clgl
Construction 3 : allèle Primor-Clgl dans le vecteur pBINPLUS.
- Construction 4 : allèle Primor-Clgl dans le vecteur pBIB- Hygro. Transformation des plantes
Les 4 constructions décrites ci-dessus ont été transformées dans des bactéries Agrobacterium tumefaciens, souche C58.
Des plantes de colza ont été transformées par ces Agrobactéries. Le génotype utilisé pour les transformations est la variété Westar, colza de printemps d'origine canadienne .
Transformation
Les graines de colza variété Westar sont désinfectées à l'éthanol 70% pendant 2 mn puis mises dans une solution commerciale d'eau de javel, additionnée de quelques gouttes de
Tween 80 pendant 20 mn. Elles sont ensuite rincées 3 fois 5 mn avec de l'eau ultra-pure stérile. Puis elles sont mises à germer sur du milieu MS (Murashige et al., Physiol Plant 15(3): 473-497, 1962), additionné de 30 g/1 de saccharose et 8 g/1 de phytagar (Duchefa) , pH 5.7 dans des boîtes de Pétri de
94 mm de diamètre. Les graines sont semées à raison de 15 graines par boite, mises à 40C pendant 3 nuits et transférées en chambre de culture à 22/200C, 16h/8h de photopériode avec un éclairement de 70 μmol/m2/seconde .
La transformation est basée sur le protocole développé par Moloney et al. (Plant. CeIl Rep 8:238-242, 1989), et Sparrow et al. (Theor. Appl . Genêt. 108:1249-1255, 2004) pour le colza. Les pétioles des cotylédons sont excisés à partir des plantules 7 jours après leur mise en germination. Ils sont ensuite trempés dans la suspension d' Agrobacterium puis repiqués sur le milieu de coculture (milieu de germination contenant 2 mg.l"1 de benzyl amino purine) à raison de 10 explants/boite. Les boites sont ensuite placées en chambre de culture sur une étagère non éclairée, pendant 72h. Puis les explants sont transférés sur le milieu de sélection (milieu de co-culture additionné de 400 mg/1 de TimentinR (mélange de ticarcilline et d'acide clavulanique) et 25 mg/1 de kanamycine comme agents sélectifs) . Les explants sont repiqués toutes les 3 semaines sur le même milieu.
Régénération des plantes transformées Les bourgeons verts qui apparaissent sur les cals à la base des explants sont excisés et repiqués en flacons de 150 ml sur le milieu d'enracinement (milieu Murashige et Skoog/2) contenant 50 mg/1 d' IBA (acide indolbutyrique) , 10 g/1 de saccharose, 0.8% de phytagar, 400mg/l de TimentinR et 50 mg/1 de kanamycine. Ils sont repiqués régulièrement sur le même milieu jusqu'à ce que les racines se développent. Les plantules enracinées sont alors repiquées en mini-serre, dans des mottes de substrat favorisant le développement des racines . Phénotype des plantes de colza transformées
Le phénotype de plants de colza transformés en utilisant la construction 3 décrite ci-dessus est illustré par la Figure 3.
Légende de la Figure 3 : a) contrôle colza non transformé b) et c) deux transformants TO (Clg_6.A2 et Clg_6.Tl) d) un transformant Tl (issu de l' autofécondation d'un 3éme transformant T0:Clg_l.A). Ces résultats montrent que chez les transformants représentés sur les photos b, c et d, les fleurs restent fermées ou ^ ^
partiellement fermées à un stade de floraison où les fleurs sont ouvertes chez le témoin non transformé.
Phénotype de plantes d'Arabidopsis transformées
Des plantes d' Arabidopsis thaliana (Ecotype WS) ont été transformées avec Agrobacterium tumefaciens en utilisant la construction 3 décrite ci-dessus, selon un protocole similaire à celui décrit ci-dessus pour le colza.
Le phénotype de ces plantes est illustré par la Figure 4. Légende de la Figure 4 :
A : Plantes contrôle non transformées B : : Plantes TO transformées, à différents stades de floraison.
Chez les plantes transformées les pétales restent collés au pistil (cf. en particulier les deux photos du bas des plantes TO) et ne s'ouvrent pas contrairement à ce qui est observé pour les fleurs du témoin WS non transformé.

Claims

REVENDICATIONS
1) Méthode pour produire une plante cléistogame comprenant une étape consistant à inhiber totalement ou partiellement l'ouverture des boutons floraux dans ladite plante, en exprimant dans ladite plante un polypeptide mutant résultant de la mutation d'un polypeptide sauvage possédant au moins 80% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2 et contenant la séquence suivante: DGLDDADGAEDVPFDELVGMQGPVFHL
(SEQ ID NO: 5), l'activité dudit polypeptide mutant étant altérée par rapport à celle du polypeptide sauvage.
2) Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que la plante est une Brassicacée.
3) Méthode selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite Brassicacée est le colza. 4) Méthode selon une quelconque des revendications
1 à 3, caractérisée en ce que l'inhibition est obtenue par l'expression d'un polypeptide mutant résultant de la mutation d'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2 et contenant la séquence suivante: DGLDDADGAEDVPFDELVGMQGPVFHL (SEQ ID NO: 5), ladite mutation induisant le remplacement de la proline en position 13 de la séquence SEQ ID NO: 5 par un acide aminé autre que la proline.
5) Polypeptide mutant dont l'expression dans une plante entraîne chez celle-ci une inhibition de l'ouverture des boutons floraux, caractérisé en ce qu'il résulte de la mutation d'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité avec le polypeptide SEQ ID NO: 2 et contenant la séquence suivante: DGLDDADGAEDVPFDELVGMQGPVFHL (SEQ ID NO: 5), ladite mutation induisant le remplacement de la proline en position 13 de la séquence SEQ ID NO: 5 par un acide aminé autre que la proline .
6) Polynucléotide codant pour un polypeptide mutant selon la revendication 5.
7) Procédé pour déterminer si une plante contient un gène mutant dont l'expression induit une inhibition de l'ouverture des boutons floraux, caractérisé en ce qu'il comprend la détection de la présence ou de l'absence, dans du matériel biologique provenant de ladite plante, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide mutant selon la revendication 5.
8) Sonde d'acide nucléique utilisable pour la détection d'un polynucléotide codant un polypeptide mutant selon la revendication 5.
9) Couple d'amorces oligonucléotidiques utilisables pour la détection d'un polynucléotide codant un polypeptide mutant selon la revendication 5.
10) Couple d'amorces selon la revendication 9 constitué par les amorces suivantes :
T2S095_F : ACGCTGATGGTGCTGAAGAAGATC (SEQ ID NO: 6)
T2S095_R : GTATTTTCCAATGCTGAGTCA (SEQ ID NO: 7)
11) Cassette d'expression recombinante comprenant un polynucléotide selon la revendication 6 placé sous contrôle d'un promoteur approprié.
12) Vecteur recombinant résultant de l'insertion, dans un vecteur-hôte approprié, d'une cassette d'expression selon la revendication 11.
13) Cellule-hôte génétiquement transformée par une cassette d'expression selon la revendication 11.
14) Plante transgénique comprenant un transgène contenant une cassette d'expression selon la revendication 11.
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