CN111511916A - 花期调控基因cmp1和相关的载体及其应用 - Google Patents

花期调控基因cmp1和相关的载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了分离的多核苷酸和多肽、和重组DNA构建体和CRISPR‑Cas构建体，用于调控植物抽穗期或开花期，以及公开了利用这些重组DNA构建体和CRISPR‑Cas构建体的方法。进一步提供了包含这些重组DNA构建体或修饰的内源的CMP1基因的组合物。

Description

花期调控基因CMP1和相关的载体及其应用
技术领域
本技术领域涉及植物育种和遗传学，特别是涉及用于调控植物开花期和/或抽穗期的重组DNA构建体和基因组编辑构建体及调控植物开花期和/或抽穗期的方法。
发明背景
植物的生长周期通常包括营养生长期和生殖生长期，从营养生长到生殖生长的转变受到多种开花信号的影响，而开花信号受到诸如基因型的遗传因子和诸如光周期和光强度的环境因子等多种因素的影响(Dung等，Theoretical and Applied Genetics,97：714-720(1998))。
开花期或抽穗期是重要的农业性状，是植物分布和地域适应性的重要决定因素。大部分被子植物品种响应诸如日照长度和温度等环境刺激和包括发育时期在内的内部信号的诱导开花。
从遗传的角度来看，植物中存在两种表型变化，控制营养生长和成花生长。第一种遗传改变包括从营养到成花状态的转换，如果这种遗传改变不能正常发挥作用，那么将不会出现开花；第二个遗传事件是形成花。植物器官的顺序发育的观察表明存在一个遗传机制调控一系列基因依次被开启和关闭。
两个远亲双子叶植物拟南芥和金鱼草属植物研究，鉴定了三类同源异型基因，单独或联合决定花器官特征(Bowman等,Development，112：1(1991)；Carpenter和Coen，GenesDevl.，4：1483(1990)；Schwarz-Sommer等，Science，250：931(1990))，其中的一些基因是转录因子，其保守DNA结合结构域被指定为MADS盒(Schwarz-Sommer等，supra)。
控制花分生组织特征的早期活性基因也被分析确定。在拟南芥和金鱼草属植物中，花分生组织源于花序分生组织。控制分生组织细胞发育成花的两个因子是已知的，拟南芥中为LEAFY基因的产物(Weige等，Cell 69：843(1992))和APETALA1基因的产物(Mandel等，Nature360：273(1992))。当其中任何一个基因被突变失活时，包括花或花序特征的结构就会发育(Weigel，et al.，supra；Irish和Sussex，Plant Cell,2：741(1990))。在金鱼草属植物中，与拟南芥LEAFY基因同源的基因为FLORICAULA(Coen等，Cell，63：1311(1990))和APETALA1基因的同源基因SQUAMOSA(Huijser等，EMBOJ.，11：1239(1992))。后两个因子包含MADS盒结构域。
促进或延缓开花的起始对农民或种子生产者是有用的，因此，有必要开发新的组合物和方法来改变目标植物的开花特性(例如，气候较暖地区的谷类、水稻和玉米，以及气温较高地区的小麦、大麦、燕麦和黑麦)。本发明提供了这种组合物和方法。
发明概述
一方面，本发明包括一个分离的调控植物开花时间的多核苷酸，其包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：6的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中在植物中，增加所述多核苷酸的表达延长营养生长向生殖生长的转变，降低所述多核苷酸的表达量或功能促进营养生长向生殖生长的转变。在某些实例中，所述多核苷酸包括SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。在某些实例中，所述多核苷酸编码的多肽包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供了所述分离的多核苷酸在植物中调控开花期的应用，其中所述分离的多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：6的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列。所述分离的多核苷酸在某些实施例中，可以通过减少所述多核苷酸在植物中的表达或降低编码多肽的功能来促进早开花。所述分离的多核苷酸的应用为在某些实施例中，可以通过增加所述多核苷酸在植物中的表达来促进晚开花。
另一方面，本发明包括重组DNA构建体，其包含分离的开花时间调控多核苷酸和与之可操作连接的至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸包含(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5或6一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。在有些实施例中，至少有一个调控元件是在植物中起作用的启动子。在有些实施例中，至少有一个调控元件与该多核苷酸是异源的。
另一方面，本发明包括一种修饰的植物、植物细胞或种子，在所述修饰的植物、植物细胞或种子中，编码开花时间调控多肽CMP1的至少一种多核苷酸的表达量发生变化，其中，与同样条件下种植的对照植物相比，所述植物表现出改变的开花性状。
在某些实例中，增加所述被修饰植物、植物细胞和种子中开花时间调控基因CMP1的表达量时，上述的植物以及由上述的植物细胞和种子产生的植物的开花期，比没有增加所述基因表达量的对照植物要更晚。在某些实例中，所述被修饰植物、植物细胞和种子包含一个重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含CMP1多核苷酸和与之可操作相连的至少一个调控元件，所述CMP1多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5或6序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列；从而增加所述多核苷酸在修饰植物、植物细胞或种子的表达量。在有些实施例中，植物包含一种修饰的调控元件，其中所述修饰调控元件能够增加内源多核苷酸的表达量，所述内源多核苷酸包括(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：6的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列。
在某些实施例中，降低所述被修饰的植物、植物细胞和种子的开花时间调控基因CMP1的表达量或者机能，上述的植物以及由上述的植物细胞和种子产生的植物的开花期，比没有降低所述基因表达量或者机能的对照植物要早。在某些实施例中，植物包含一种抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含抑制元件和与之可操作连接的至少一个异源调控元件，所述抑制元件包括连续的至少100bp的下述序列：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5或6序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
在某些实施例中，植物、植物细胞或种子经过修饰后能够降低开花时间调控基因CMP1的功能或活性，从而在与对照植物比较时促进开花时间的提早。在某些实施例中，所述植物包含有一种改良的开花调控基因CMP1或其启动子，其方法是(a)引入一个DNA片段或删除一个DNA片段或置换一个DNA片段或(b)在包含有内源CMP1基因及其启动子的基因组位点引入一个或多个核苷酸变化。在和对照植物中的野生型CMP1多肽相比时，所述内源性CMP1多肽的机能或活性有所降低。
在某些实施例中，所述植物包含突变的CMP1基因导致所述植物中CMP1多肽的表达量或者机能的降低；在另一些实施例中，所述植物包含有一个突变的CMP1启动子导致表达量或机能的降低。
在某些实施例中，本发明提供的组合物和方法所应用的植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷。另一方面，本发明提供了一种水稻植株，所述水稻植株包含一个修饰的基因组位点，该基因组位点影响所述植物中一种内源多核苷酸的表达量或机能的增加或降低，所述内源多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7相比，具有至少90％的序列一致性，以致于当所述内源多核苷酸的表达量降低时所需的开花时间缩短；当所述内源多核苷酸的表达量增加时所需的开花时间延长。所述修饰的基因组位点在调控区域包含突变可以降低所述内源多核苷酸的表达量；所述修饰的基因组位点在基因中包含突变可以降低所述内源多核苷酸的表达量或活性。
另一方面，本发明提供了一种调控植物开花时间的方法，其包括改变水稻植株中编码开花时间调控多肽CMP1的多核苷酸的表达量或者功能。其中，所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：6的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％。在某些实施例中，所述方法包括增加所述多核苷酸在植株中的表达量进而延长植物从营养生长到生殖生长的转变；在某些实施例中，也包括减少所述多核苷酸在植株中的表达量，或降低多核苷酸的机能或活性，进而促进植物从营养生长到生殖生长的转变。
在某些实施例中，所述多核苷酸的表达量或活性的增减可以通过下述步骤改变：(a)通过重组DNA构建体增加植物中编码CMP1多肽的多核苷酸的表达量，其中所述重组DNA构建体包含一个编码CMP1多肽的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个异源调控元件，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQI ID NO：7的序列一致性至少为90％；(b)通过CRISPR-Cas构建体增加内源多核苷酸的表达量，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；(c)降低内源多核苷酸的活性或机能，所述多核苷酸编码多肽的氨基酸序列与AEQ ID NO:7的序列有至少90％的一致性；(d)通过一个抑制DNA构建体降低植物中编码CMP1多肽的多核苷酸的表达量，其中抑制DNA构建体包含一个沉默元件用于下调所述内源多核苷酸的表达，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％。
另一方面，本发明提供了一种制备植物的方法，与对照植物的野生型CMP1多肽的表达水平或活性相比，所述植物内源CMP1多肽的表达水平或活性得到了提高。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：在内源CMP1基因和其启动子所在的基因组区域(i)引入一段DNA片段增加CMP1的表达量，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变能有效增加内源CMP1多肽的表达水平或活性。
另一方面，本发明提供了一种制备植物的方法，与对照植物的野生型CMP1表达水平或活性相比，所述植物中内源CMP1多肽表达水平或活性降低。在某些实施例中，所述方法包括以下步骤：在内源CMP1基因和其启动子所在的基因组区域(i)引入一段DNA片段，删除一段DNA片段或替换一段DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变能使内源CMP1多肽的机能丢失。
在本文所述方法的某些实例中，通过使用锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)、CRISPR-Cas、引导Cas核酸内切酶、归巢核酸内切酶(Meganuleases)或CRISPR-Cas核糖核蛋白体引入等方法，改变(增加或减少)内源CMP1多肽的表达量、机能或活性。
另一方面，提供了一种从水稻植株群体中鉴定较晚开花时间相关的一个或多个等位基因的方法，该方法包括如下的步骤：(a)检测一个水稻植株群体中(i)编码多肽的基因组区域，或(ii)控制多肽表达的调控区域中的一个或多个多态性，其中，所述多肽选自SEQIDNO：7的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：7一致性为90％以上的氨基酸序列，其中编码所述多肽的基因组区域或调控所述多肽表达的调控区域的一个或多个多态性与晚开花相关；和(b)鉴定较晚开花时间相关的一个或多个多态性的一个或多个等位基因。其中所述较晚开花时间相关的一个或多个等位基因可用作辅助较晚开花时间水稻植株的筛选标记。
附图简述和序列表
根据以下的发明详述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的发明详述和附图以及序列表形成本申请的一部分。
图1为实时PCR分析测定的不同转基因水稻株系(DP2300)叶片中OsCMP1基因的相对表达水平。ZH11-TC叶片中基因的表达水平设置为1.00，每个转基因株系表达量柱上面的数字表示与ZH11-TC相比的变化倍数。
图2为sgRNA在水稻OsCMP1基因在基因组中的分布图。
图3为举例说明一个sgRNA在水稻OsCMP1基因在基因组中的分布。
图4为举例说明两个sgRNA在水稻OsCMP1基因在基因组中的分布。
图5为水稻植株中CRISPR-Cas构建体DP2855导入植物导致的突变序列比对。所述突变通过PCR和测序确定。参考序列为靶位点未修饰的位点，用下划线表示。PAM序列和预期的断裂位点也进行了标注。缺失、插入或替换分别用“-”，“斜体下划线核苷酸”或“粗体斜体核苷酸”表示。
图6为水稻植株中CRISPR-Cas构建体DP2925导入植物导致的突变序列比对。所述突变通过PCR和测序确定。参考序列为靶位点未修饰的位点，用下划线表示。PAM序列和预期的断裂位点也进行了标注。缺失、插入或替换分别用“-”，“斜体下划线核苷酸”或“粗体斜体核苷酸”表示。
图7为子代中gCAS-gRNA-DsRed分离过程示意图。
表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列的SEQ ID NOs
Figure BDA0002557585120000041
序列描述以及关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic AcidsRes.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循37C.F.R.§1.822中列出的规则。
详细说明
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。
如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
如本文所述：
“OsCMP1”是CCT基序家族蛋白1(CCT motif family protein 1，CMP1)，涉及水稻基因位点LOC_Os07g15770.1编码的能够调控水稻开花性状的多肽。“CMP1多肽”此处涉及OsCMP1多肽和源于其他植物的同源物。
OsCMP1多肽(SEQ ID NO:7)是水稻基因位点LOC_Os07g15770.1的编码序列(CDS)(SEQ ID NO:6)或核酸序列(SEQ ID NO:5)编码的氨基酸序列。TIGR(the internet atplant biology msu.edu/index.shtml)中，该多肽的注释为“CCT基序家族蛋白，表达”，但是没有在先的功能介绍。
本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。
“开花”指开花的过程，即在适宜的温度和湿度下，颖壳开裂，花药散射，或花的形成过程。此处开花用于表示从幼穗分化、成熟到幼穗抽出的过程。
“花发育”的意思是指从花分生组织开始到发育成熟花的花或花序的发育。
“生殖发育”的意思是指从花分生组织开始经过授粉到果实成熟的花或花序发育过程。
此处“早开花”的植物指开花早于对照的植物，因此这个词指的是显示开花起始较早的植物。植物的开花时间指播种到第一个花序出现的天数，例如，植物的“开花时间”可以使用现有的方法和标准确定。
“抽穗”此处指禾谷类作物发育完全的幼穗从剑叶鞘内伸出的时期或状态。
“抽穗期”和“抽穗时间”本文可互换使用，指从种子播种到某些植株主茎的穗从剑叶鞘中出现、或者到同一行50％幼穗从水稻植株剑叶鞘抽出的天数。抽穗期是重要的农业性状，由基本的营养基因和光周期敏感基因调控，在水稻品种的适应性和地理分布起关键的作用。适当的抽穗期是获得理想产量的前提。
通常情况下，水稻穗抽出后即开花，因此本文抽穗期也用于表示开花期。
成熟期是指90％的颖壳、粒小穗轴或副颖壳外观上变黄的时期，也是最好的收获期。
“植株高度”本文指从地面到单株植株最高穗或叶顶部的高度。
“全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，互补序列和核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。
“性状”指植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。
“农艺性状”是可测量的指标参数，包括但不限于：叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物营养组织氮含量、植物总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、植物营养组织游离氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。
“转基因的”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物。
“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。
对照植物或对照植物细胞包括，例如：(a)用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)相同基因组作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。
本文中，ZH11-WT、ZH11-TC、WT和空载体植物指对照植物。ZH11-WT代表野生型中花11；ZH11-TC代表通过组织培养中花11获得的水稻植株；WT代表野生型植物，例如稻花香2号；空载体代表转化空载DP0158获得水稻植株。
“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。
“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。
“基因”是一段可表达功能分子的核苷酸片段，所述功能分子，包括但不限于，特定蛋白，所述基因包括位于编码序列上游的调控序列(5’非编码序列)和下游序列(3’非编码序列)。“天然基因”是拥有自身调控序列的自然存在的基因。
“突变基因”是通过人工干预后的产生的基因。由此产生的“突变基因”的序列与非突变基因的序列相比，至少有一个核苷酸增加，删除或替换。“突变植物”是指含有突变基因的植物。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明中“定点突变”是指通过双链断裂诱发剂诱导靶序列DNA双链断裂，改变内源基因的特定序列，从而导致内源基因突变。
“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及该植株的子代。植物细胞包括但不限于来自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
“子代”包括植物的任何后续世代。
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。
术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。
“非基因组核酸序列”、“非基因组核酸分子”或“非基因组多核苷酸”指与天然或基因组核酸序列相比，存在一处或多处核酸序列改变的核酸分子。在某些实施方案中，天然或基因组核酸分子的改变包括但不限于：由于遗传密码的简并性而产生的核酸序列变化；植物表达的核酸序列密码子优化；与天然或基因组序列相比，至少一个氨基酸的替代、插入、删除和/或添加而引起的核酸序列的变化；与基因组核酸序列相连的一个或多个内含子的移除；一个或多个异源内含子的插入；与基因组核酸序列相连一个或多个上游或下游调控区域的删除；与基因组核酸序列相连的一个或多个异源上游或下游调控区域的插入；与基因组核酸序列相连的5’和/或3’非翻译区的删除；一个异源5’和/或3’非翻译区的插入；和多聚腺苷酸位点的修饰。在一些实施方案中，非基因组核酸分子是cDNA。在一些实施方案中，非基因组核酸分子为合成的核酸序列。
“重组DNA载体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA载体可包含不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。
“植物启动子功能”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。
“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。
“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
“基因组修饰”是指蓄意人为的向植物基因组核苷酸序列中导入改变或变化。
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。
本发明中所用的“引入”是指将核苷酸片段(如CRISPR-Cas DNA构建体)插入到一个细胞，即通过“转染”、“转化”或“转导”，包括将核苷酸片段导入真核细胞或原核细胞，且所述核苷酸片段可以整合到细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，从而变为一个自主复制子，或暂时性表达(例如转染mRNA)。
“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)导入其中的任何细胞。
本发明所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。
“瞬时转化”是指将一个核苷酸片段引入寄主有机体的细胞核或含DNA细胞器内，进而产生除稳定的遗传特征外的基因表达。
“稳定转化”是指将一个核苷酸片段引入寄主有机体的基因组内，进而产生稳定的遗传特征。
“核定位信号”是指靶向核蛋白的信号多肽(Raikhel，(1992)Plant Phys.100：1627-1632)。
一个“抑制DNA构建体”是植物基因组内转化或稳定整合的一个重组DNA构建体，所述重组构建体能沉默植物中的目标基因。所述目标基因可以是植物内源的，也可以是转基因的。本文中，“沉默”对于目标基因而言，通常是指由目标基因表达的mRNA水平的抑制，或者目标基因表达蛋白质或酶的抑制，或者所述酶活性水平或蛋白功能的抑制。“抑制”和“沉默”在本文中可以互相替换，包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”没有具体的机制，它包括但不限于反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎环抑制、基于RNAi的方法和基于小RNA的方法。
一个抑制DNA构建体可以包含一个来自目标基因的区域，并且可以包含目标基因区域的正义链(或反义链)全部或部分的核苷酸序列。根据应用的方法，所述区域和目标基因区域的全部或部分正义链(或反义链)有100％的同一性或少于100％的同一性(至少为50％,51％,52％,53％,54％,55％,56％,57％,58％,59％,60％,61％,62％,63％,64％,65％,66％,67％,68％,69％,70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,or 99％的同一性)。
那些本行业从业人员所熟知抑制DNA构建体，在所述目标基因被确定后就能很快的被构建出来。所述抑制DNA构建体包括但不仅限于：共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、双链RNA产物构建体、RNAi(RNA干扰)构建体、小RNA构建体。小RNA构建体如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。
“反义抑制”是指能够抑制目标基因或基因产物表达的反义RNA转录物的产生。
“共抑制”是指能够抑制目标基因或基因产物表达的正义RNA转录产物的产生。“正义”RNA是指包含mRNA的RNA转录本，可以在细胞内或体外转化为蛋白质。另一种变化描述了使用植物病毒序列来指导近端mRNA编码序列的抑制(公开PCT，NO.WO98/36083,1998.08.20)。
RNA干扰(RNAi)是指短干扰RNAs(siRNAs)介导动物的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire et al.Nature 391:806(1998))。所述植物中相应的过程通常被称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，在真菌中也被称为抑制。该转录后基因沉默的过程被认为是进化上保守的细胞防御机制，可以阻止外源基因的表达，且通常被不同门类的植物种群所共有(Fire et al.,Trends Genet.15:358(1999))。
现在有可能通过在植物中产生小RNAs的转基因结构来改变植物基因的表达。
小RNAs表现出是通过与互补的RNA或DNA目标序列进行碱基配对来发挥功能。当和RNA结合时，小RNAs会引起RNA的切割或目标序列的翻译抑制；当和DNA靶向序列结合时，小RNAs被认为是能够介导靶向序列的DNA甲基化。不论具体的机理如何，这些事件的后果是基因表达被抑制。
微小RNAs(miRNAs)是长度约为19到24个核苷酸的非编码RNA，已在动物和植物中被发现。
微小RNAs(miRNAs)被设计与目标基因转录的互补序列结合进而调控这些基因(如本文中的多核苷酸序列)，例如通过转录抑制和RNA切割。
“CRISPR-相关基因”是指编码成簇间隔短回文重复(CRISPR)-相关系统(Cas)的多肽组合物的核苷酸序列。所述基因耦合存在，与CRISPR位点侧翼片段相关或相邻。“Cas基因”和“CRISPR-相关基因”在本发明中可互换使用。例如包括但不限于，Cas3和Cas9,它们分别编码CRISPR类型I和CRISPR类型II系统中的内切酶。
“Cas内切酶”是指一个由Cas基因编码的Cas蛋白，所述Cas蛋白能导致DNA靶序列双链断裂。所述向导多核苷酸引导Cas内切酶识别，并有选择性导致细胞基因组特定位点的双链断裂。
“向导RNA(gRNA)”是指一个crRNA(CRISPR RNA)：tracrRNA融合的杂合RNA分子，由可改变的DNA原件编码。通常，gRNA包括一个拷贝的与基因组特定位点的前间区序列互补的间隔序列，和一个用于Cas内切酶和CRISPR复合体结合的结合域。
“向导多核苷酸”是指一个可与Cas内切酶形成复合体、且让Cas内切酶识别和选择DNA剪切靶位点的多核苷酸序列。所述前导多核苷酸由一个单分子或一个双分子组成。所述向导多核苷酸可以是一个RNA序列、DNA序列或者一个两者的组合物(RNA-DNA组合序列)。所述向导多核苷酸包括可选的至少一个核苷酸、磷酸二酯键或者修饰链，例如：核酸锁(LNA)、5-甲基-dC、2,6-二氨基嘌呤、2'-氟A、2'-氟U、2'-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、胆固醇分子链、聚乙二醇分子链、间隔物18(六乙二醇链)分子链、或5'至3'共价连接导致的环化。一个只包含有核糖核酸的向导多核苷酸也被称为“向导RNA”。
术语“向导多核苷酸/Cas内切酶体系”是指含有一个Cas内切酶和一个前导多核苷酸的复合体，可导致DNA靶序列的双链断裂。如果正确的前间区序列邻近基序(PAM)大致定位于靶序列的3'末端后，一旦向导RNA识别靶序列，Cas内切酶才能解开基因组靶位点附近的DNA双链序列，并对DNA双链进行剪切。
“基因组靶位点”是指定位于宿主基因组的用于定点突变和/或双链断裂的一个前间区和一个前间区序列邻近基序(PAM)。
“前间区”是指一段靶向突变和/或双链断裂的短的DNA序列(12-40个核苷酸)。所述前间区是基于crRNA或sgRNA的间隔序列的碱基互补配对，以CRISPR体系内切酶而导致酶促断裂。
“前间区序列邻近基序(PAM)”包括一段3-8个核苷酸序列，紧邻基因组靶位点前间区序列。术语“可变靶向域”和“VT域”在本文中能够互换使用，并且包含一个能够和双链DNA靶位点的单链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一个核苷酸序列域(VT域)和靶向序列的互补一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶向域至少有12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。在某些实施例中，可变靶向域包含12-30个核苷酸的连续拉伸。可变靶向域可以由一个DNA序列、一个RNA序列、一个修饰的DNA序列、一个修饰的RNA序列、它们的任何组合的合成物组成。
术语向导多核苷酸的“Cas内切酶识别域”和“CER域”在本文中可以互换使用，并且包含一个和Cas内切酶多肽相互作用的核苷酸序列(比如向导多核苷酸的第二核苷酸序列域)。所述CER域可以由一个DNA序列、一个RNA序列、一个修饰的DNA序列、一个修饰的RNA序列()(比如本文所描述的修饰物)、它们的任何组合的合成物组成。
链接着一个单向导多核苷酸cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列包含一个RNA序列、一个DNA序列、一个RNA-DNA合成序列。在某个实例中，链接着一个单向导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列至少有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸长度。在另一个实例中，链接着单向导多核苷酸cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可能包含一个四环序列，比如但是不限于，一个GAAA四环序列。
CRISPR位点(成簇规律间隔短回文重复，也称为SPIDRs-间隔散布定向重复)包括上述的DNA位点。CRISPR位点有一段短的、高度保守的DNA回文重复(一般24-40个核苷酸，重复1-140次，因此也称为CRISPR-重复单元)。所述重复序列(一般存在物种特异性)被不同数量的固定长度(一般20-58个核苷酸，依赖于CRISPR位点)的序列间隔(WO2007/025097公开于2017年3月1日)。
内切酶是可切断多核苷酸链的磷酸二酯键的酶类，包括在特定位点不破环碱基的前提下切断DNA的限制性内切酶。所述限制性内切酶包括类型I、类型II、类型III和类型IV内切酶及其亚类型。在类型I和类型III系统中，单复合体具有甲基化酶和限制活性。内切酶也包括归巢核酸内切酶(meganucleases或HEases)，它类似于限制性内切酶，能结合和剪切特定识别位点，然而所述归巢核酸内切酶识别位点通常更长，约18个核苷酸或更长(专利申请WO-PCT PCT/US12/30061，提交日期2012年3月22日)。根据保守序列基序，归巢核酸内切酶可分为四个家族，分别为LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H和His-Cys盒子家族。这些基序参与到金属离子和磷酸二酯键的水解过程的协调。归巢核酸内切酶的主要优势在于可识别DNA基序中的长的识别位点和容忍序列多态性。
TAL效应因子核酸酶是一种新的序列特异性核酸酶，能导致植物或其他生物基因组特定靶序列双链断裂。TAL效应因子核酸酶通过将一个天然或人工合成的转录激活样(TAL)效应因子或其功能区融合到核酸内切酶的催化结构域(诸如Foki内切酶)而产生的。所述独特的、模块化的TAL效应因子DNA结合域允许设计为带有潜在地、任何指定DNA识别特异性的蛋白质(Miller et al.(2011)Nature Biotechnology 29：143-148)。锌指核酸酶(ZFNs)是一种人工合成的双链断裂诱发剂，含有一个锌指DNA结构域和一个双链断裂诱导结构域。锌指结构域赋予识别位点特异性，其一般包括2、3或4个锌指结构。例如，有一个C2H2结构，然而其他锌指结构也是已知并是可改造的。锌指结构域是可设计的多肽，能特异结合选定的多核苷酸识别序列。ZFNs构成一个与非特异性内切核酸酶位点连接的DNA结合蛋白锌指结构域。例如，核酸酶位点来自于一个诸如FokI的类型l的内切核酸酶。其它功能可融入锌指结合域，包括转录激活域，转录阻遏域和甲基化酶。在一些例子中，剪切活性需要核酸酶的二聚作用。每一个锌指可识别靶DNA的3个连续碱基对。例如，一个含有3个锌指结构域能识别9个连续的核苷酸序列，两组含3个锌指结构域经二聚化作用后，则能识别18个核苷酸序列。
“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶位置”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶位置”在本发明中可互换使用，具体指植物细胞基因组中的一段核苷酸序列(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)，且在植物细胞基因组中能被Cas内切酶诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源位点，或者也可以是植物异源位点，但不会自然发生在基因组中；与自然发生相比，所述靶位点可以在异源基因组位上被发现。本发明中“内源目标序列”和“天然目标序列”可以互换使用，具体指植物基因组内源或天然基因组的目标序列，或是植物基因组靶序列的内源或天然位点。
“变异靶位点”、“变异靶序列”、“修饰靶位点”、“修饰靶序列”在本发明中可互换使用，具体指与未改变的靶序列相比，所述目标位点的目标序列至少有一处变异。所述变异包括，例如：(1)至少一个核苷酸替换，(2)至少一个核苷酸删除，(3)至少一个核苷酸插入，或(4)包含上述(1)-(3)的组合。
“序列一致性百分比(％)”是经过序列比对和引入缺口后，待测序列(query)相对于参考序列(subject)的氨基酸残基或核苷酸的一致性百分比，如果必须，所述序列一致性百分比是达到最大比例的序列一致性，且不考虑属于序列一致性的任何氨基酸保守型替换。为了确定序列一致性百分比进行的比对可以有多种方法，例如，利用诸如BLAST,BLAST-2的公开电脑软件确定序列一致性比例的比对是本领域技术人员熟知的。决定序列比对的合适参数，包括与待测全序列比对达到最大化匹配的算法。本发明中两个序列的“序列一致性百分数”是指序列匹配一致性的数量的函数(例如，待测序列的序列一致性计算包括，将两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100)。
现在转向实施方案：
实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于调控植物开花时间的重组DNA构建体(包括抑制构建体)、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法，用于调控开花时间的CRISPR-Cas构建体、含有突变了的开花时间调控基因或其启动子的组合物，以及应用CRISPR-Cas构建体的方法。
分离的多核苷酸和多肽：
本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：
在一些实施方案中，多核苷酸编码CMP1多肽。
在一些实施方案中，分离的多核苷酸包含(i)编码多肽的核酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列在与SEQ ID NO：7进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中全长互补序列和(i)的核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。增加所述多核苷酸的表达延长营养生长到生殖生长的转化；降低所述多核苷酸的表达促进营养生长到生殖生长的转化，任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体。
在一些实施方案中，分离的多肽，其氨基酸序列在与SEQ ID NO：7进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性。
在一些实施方案中，分离的多核苷酸，其包括：(i)核酸序列，所述核酸序列在与SEQ ID NO：5或6进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体。分离的多核苷酸优选为编码花期调控蛋白。增加所述多核苷酸的表达延长植物从营养生长到生殖生长转变；减少所述多核苷酸的表达量促进了从营养生长到生殖生长的转变。
重组DNA构建体和抑制DNA构建体
在一方面，本发明包括重组DNA构建体和抑制DNA构建体。
在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控元件(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：7进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种异源调控元件(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列在与SEQ ID NO：5或6进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的序列一致性；或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。
在另一实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码CMP1蛋白。这些多肽具有调控花期的活性，并可来自，例如水稻(Oryza sativa)、野生稻(Oryza australiensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、非洲型稻(Oryza glaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryza longistaminata)、南方野生稻(Oryza meridionalis)、药用野生稻(Oryzaofficinalis)、斑点野生稻(Oryza punctata)、普通野生稻(Oryza rufipogon)(红稻)、印度野生稻(Oryza nivara)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycinetomentella)。
在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。
抑制DNA构建体包括至少一个调控元件(如植物中有功能的启动子)可操作与一个或多个抑制元件连接，其中所述抑制元件包括至少100bp连续碱基对的(a)(i)一种核酸序列，所述核酸序列编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，或者(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；或者(b)源于目标基因的正义链或反义链的全部或部分的区域，其中所述目标基因编码花期调控多肽CMP1；或者(c)全部或部分(i)与SEQ ID NO:5的核酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，或者(ii)与SEQ ID NO:6的核酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，或者(iii)核酸序列(c)(i)或者(c)(ii)的全长互补核酸序列。
在某些实施例中，所述抑制构建体包括任意可操作地链接至调控元件的RNAi构建体(如siRNA、miRNA)。
应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。例如，丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。
CRISPR-Cas构建体：
一个CRIPSR/Cas构建体,包括一个编码CRISPRas酶的多核苷酸、一个编码核定位信号的多核苷酸、至少一个异源的调控元件和与其可操作连接的gRNA。其中，所述gRNA是针对包含内源CMP1基因和其调控元件的靶基因组区域。
在某些实例中，所述gRNA靶向的基因组区域含有一个多核苷酸，所述多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：5或6至少有95％一致性。
sgRNA序列分布于靶基因组序列上，所述靶基因组序列包括启动子、外显子、内含子5’-UTR和3’-UTR。在某些实例中，sgRNA序列选自于SEQ ID NO：18-39。
在某些实例中，单个sgRNA可用于构建基因组编辑构建体。单个sgRNA可以引导Cas9酶定位于靶区域，在靶DNA序列上产生双链断裂，启动非同源末端连接(NHEJ)修复机制和同源介导修复(HDR)，通常会在靶位点诱导随机插入、缺失和替换。
在某些实例中，两个sgRNAs也可以用于构建基因组编辑构建体，所属构建体可以引发片段删除、点突变(少量碱基的插入、删除和替换)。
调控元件：
本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)包含至少一个调控元件。
调控元件可以是启动子、增强子、5’UTR或3’UTR。
多个启动子可用于本发明的重组DNA构建体，启动子根据期望的结果选择，可包括宿主生物体中表达的组成型、组织特异型、诱导型、或其他启动子。
一般将引起基因在多数细胞类型中在多数情况下表达的启动子称为“组成型启动子”。
当组成型启动子驱动候选基因表达时能够评估候选基因的效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留提高植物调节开花时间的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。
适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-812)；稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，(1990)PlantCell2：163-171)；泛素启动子(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等人，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。
在选择启动子用于本发明方法时，期望使用组织特异性启动子或发育调节启动子。
组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，其调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。
对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特殊的启动子包括种子优选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段。籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)；线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右。在籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；最终的成熟期起始于授粉后大约40天到收获，籽粒发育的这一过程中，籽粒开始休眠，变干。本发明中的“早期籽粒/胚乳启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。
早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，授粉后第5天活跃在特定组织中(WO 00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，在授粉后7-10天表达，和end2，授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/12733)。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuc1c(美国专利号6,407,315)；玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。
本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)plant Mol.Bio.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。
用于本发明的启动子包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CRlBIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)。
本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。
内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.CellBiol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。
增强子或增强子元件指的是一个顺式作用的转录调控元件，即顺式元件，它可调控多核苷酸序列整体表达模式的一个方面，但通常不足以单独驱动转录可操作连接的多核苷酸序列。分离的增强子元件可以与一个启动子融合形成一个嵌合的启动子顺式元件，从而调节基因表达。本领域的技术人员均知道增强子，增强子包括SV40增强子区域、CaMV 35S增强子元件等。一些增强子也可以改变普通调控元件的表达模式，例如，当没有增强子时，导致调控元件组成型表达，当存在增强子时，同一调控元件在某一特定组织或某些特定组织表达。CaMV35S启动子重复上游区域显示出大约增强10倍的表达量(Kay,R.等,(1987)Science 236：1299-1302)。
组合物：
本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体或抑制DNA构建体(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。
本发明的一个组合物为一种植物，与对照植物中野生型CMP1多肽的表达水平或活性相比，所述植物的内源CMP1多肽的表达水平或活性是下降的；与对照植物相比，所述植物表现出早开花的表型；所述植物中内源CMP1多肽的表达和活性通过引入到植物中的基因组修饰而降低。所述基因组修饰包括：在内源CMP1基因和其启动子所在的基因组区域a)插入一个DNA片段或删除一个DNA片段或替换一个DNA片段，或b)产生一个或多个核苷酸改变，从而降低内源CMP1多肽的表达水平或活性。
本发明的一个组合物为另一种植物，所述植物的CMP1基因被修饰，或CMP1基因的启动子被修饰。组合物还包括所述植物的任何子代，以及获取自所述植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含修饰的CMP1基因或启动子。所述子代包括植物通过自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。
在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新导入的重组DNA构建体的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子或水稻种子。
植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、油菜、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。
重组DNA构建体或抑制DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。CRISPR-Cas构建体可以稳定的整合进植物基因组中，导致的基因或启动子修饰可以稳定的在植物中进行遗传。
实施方案包括但不限于以下实施方案：
1.一种转基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，在其基因组中包含可操作地连接至少一种异源调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：7进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，其中所述植物表现出延长植物营养生长向生殖生长的转变(例如晚开花)。
2.一种基因组编辑的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，包含一个靶向的基因组修饰，导致一个多核苷酸表达量的增加，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：7进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，其中所述植物表现出延长植物营养生长向生殖生长的转变(例如晚开花)，基因组的修饰调整了一个调控元件或者插入一个表达调整元件。
3.一种转基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，在其基因组中包含抑制DNA构建体，所述抑制DNA构建体包含可操作连接至少一个异源调控元件序列的抑制元件，所述抑制元件源自感兴趣的靶基因的正义链或者反义链，所述区段的核苷酸序列与抑制元件来源的正义链或者反义链的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，其中所述感兴趣的靶基因编码CMP1多肽，所述植物与对照植物相比，显示早开花。
4.一种转基因植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，在其基因组中含有抑制DNA构建体)，所述抑制DNA构建体包含至少一个异源调控元件可操作连接至下列序列的至少100bp的连续碱基对的(a)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7相比，具有至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性，(b)核酸序列(a)的全长互补序列，其中与对照植物相比，所述植物表现出早开花。
5.一种基因组编辑的植物(例如水稻、玉米或大豆植物)，包含一个靶向的基因组修饰，导致一个多核苷酸表达量或机能的降低，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：7进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列一致性，其中与对照植物相比，所述植物表现出早开花。
6.实施方案1到5的植物，其中多聚核苷酸编码CMP1多肽，所述CMP1多肽可来自水稻(Oryza sativa)、野生稻(Oryza australiensis)、短舌野生稻(Oryza barthii)、非洲型稻(Oryza glaberrima)、阔叶稻(Oryza latifolia)、长雄野生稻(Oryzalongistaminata)、南方野生稻(Oryza meridionalis)、药用野生稻(Oryza officinalis)、斑点野生稻(Oryzapunctata)、普通野生稻(Oryza rufipogon)(红稻)、印度野生稻(Oryzanivara)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、甘蓝(Brassica oleracea)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。
7.1-6实施方案中上述植物的任意子代，实施方案1-6上述植物的任意种子，源于实施方案1-6任意上述植物的细胞和其子代。
前述实施方案1-7中的任意一项或本发明公开的其他实施方案中，重组DNA构建体还包括至少一个异源的在植物中有功能的启动子作为调控元件。
下面的例子描述了一些代表性的方法和技术用于调控植物开花时间和观测和/或评估植物在该条件下的农艺特征。
1.转化植物的子代，该转化植物对于重组DNA构建体来说是半合子的，该子代分离成包含或不包含该DNA构建体的植株：包含该重组DNA构建体的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体的子代是对照或参照植物)。
2.重组DNA构建体基因渗入至近交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变种中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本近交系或变种品系进行测量(即，亲本近交系或品种品系是对照或参照植物)。
3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本近交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本近交系产生，不同的是其中一个亲本近交系含有重组DNA构建体：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。
4.包含重组DNA构建体的植物：该植株可以相对于这样的对照植物进行评价或测量，该对照植物不包含重组DNA构建体，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体的植株相比较，该遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。
方法：
方法包括但不限于：调控植物开花时间的方法，观测和/或评估植物农业特征的方法，修饰或改变宿主内源基因组基因的方法，改变内源多肽的表达或活性的方法，制备种子的方法。
方法还包括但不限于如下方法：
对植物或植物细胞基因组靶序列进行基因组修饰的方法，选择植物的方法，基因编辑的方法，和将有兴趣的多核苷酸插入到植物基因组的方法。这些方法需要一个向导RNA/Cas内切酶体系，其中向导RNA引导Cas内切酶识别和选择细胞基因组特定位点，从而导致双链断裂。向导RNA/Cas内切酶体系是定点修饰植物，植物细胞或种子基因组的有效体系。本发明还提供了一个利用向导多核苷酸/Cas内切酶体系修饰细胞基因组靶位点或编辑细胞基因组核苷酸序列方法和组合物。一旦确定基因组靶位点，可以采用多种方法对感兴趣的多核苷酸对靶位点进行修饰。
在一个实施方案中，提供了一种修饰植物细胞基因组靶位点的方法，所述方法包括引入一个向导RNA和一个Cas内切酶至所述植物，所述向导RNA和Cas内切酶能形成一个复合体，从而利用Cas内切酶导致所述靶位点的双链断裂。
另外，提供了一种修饰植物细胞基因组靶位点的方法，所述方法包括：a)将一个向导RNA和一个Cas内切酶引入到一个植物细胞，所述向导RNA和Cas内切酶能形成一个复合体，从而利用Cas内切酶导致所述靶位点的双链断裂；和b)确定至少包含一个修饰位点的植物细胞，所述修饰是指在靶位点存在至少一处包括一个或多个核苷酸缺失、插入或替换。
蛋白质的改变可以有多种方式，包括氨基酸替换，删除，截短和插入。这些方法是本领域已知的。例如，通过DNA突变导致蛋白氨基酸序列变化。例如，诱变和核苷酸序列变化的方法可参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92；Kunkel等(1987)和其他参考文献。氨基酸替换不会影响蛋白的生物学活性，例如，在Dayhoff等(1978，Atlas ofProtein Sequence and Structure，Natl Biomed Res Found，华盛顿)描述的模式中有提及。保守替换，例如与其他拥有相似特性的一个氨基酸的交换可能是可取的。保守型替换、插入和氨基酸替换并不期望能对蛋白的特性产生根本改变；任何替换、删除、插入或重组的效应都能通过常规筛选实验评估。双链断裂诱导活性筛选是已知的，一般通过评估整体活性和包含靶位点的特定DNA。
也提供了一种编辑细胞基因组核苷酸序列的方法，所述方法包括将一个向导多核苷酸、一个Cas内切酶和一个可选择的多核苷酸修饰模板引入一个细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切酶能形成一个复合体，从而使Cas内切酶在所述细胞基因组靶位点产生双链断裂；所述多核苷酸修饰模板包括至少一个核苷酸修饰的所述核苷酸序列。细胞基因组的核苷酸序列选自：启动子序列，终止子序列，调控原件序列，拼接位点，编码序列，多聚泛素化位点，内含子位点和内含子增强基序。
进一步提供了一种编辑细胞基因组启动子序列的方法，所述方法包括将一个向导多核苷酸、一个多核苷酸修饰模板和至少一个Cas内切酶引入一个细胞中，其中所述向导RNA和Cas内切酶能形成一个复合体，从而使Cas内切酶在所述细胞基因组靶位点产生双链断裂；所述多核苷酸修饰模板包括至少一个核苷酸修饰的所述核苷酸序列。
产生转基因植物的方法，其包括用本发明的任何分离的多核苷酸或重组DNA构建体来转化植物细胞并由转化的植物细胞再生转基因植物。本发明也涉及由该方法制备的转基因植物，以及从该转基因植物中获取的转基因种子。
用于从细胞或细胞培养基中分离本发明多肽的方法，其中所述细胞包含具有本发明多核苷酸的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含本发明的多核苷酸可操作地连接到至少一种调控序列，并且其中转化的宿主细胞在适于重组DNA构建体表达的条件下生长。
改变宿主细胞中本发明多肽表达水平的方法，包括：(a)用本发明的重组DNA构建体转化宿主细胞；以及(b)在适于表达所述重组DNA构建体的条件下使转化的细胞生长，其中重组DNA构建体的表达导致转化的宿主细胞中的本发明多肽含量改变。
一种产生修饰植物的方法包括将本发明公开的任意CRISPR-Cas构建体转化植物细胞和由转化的植物细胞再生修饰的植物，其中本方法获得的修饰的植物和修饰的种子可用于本发明的其它方法。
一种改变本发明多肽在植物中表达水平的方法包括：(a)将本发明CRISPR-Cas构建体转化植物可再生细胞；和(b)由步骤(a)的可再生植物细胞再生修饰的植物，其中所述植物基因是编辑的；(c)使转化植物生长，其中CRISPR-Cas构建体的表达导致转化植物细胞中本发明多肽含量的变化。
一种方法，与对照植物中野生型CMP1多肽表达水平和活性相比，通过引入基因组修饰降低植物中内源CMP1多肽表达水平或活性的方法，其中所述植物与对照植株相比，表现出早开花的表型；其中所述方法包括的步骤为：在内源CMP1基因和其启动子所在的基因组区域(i)引入一段DNA、删除一段DNA或替换一段DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变能有效降低内源CMP1多肽的表达水平或活性。
一种生产种子的方法，包括前述的任一方法，进一步还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含重组DNA构建体。
在一个实施例中，提供了一个可以使植物(例如水稻)延迟开花的方法，所述方法包括使一个多核苷酸表达量的增加，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：7至少90％的序列一致性。该多核苷酸表达量的增加可以通过上述的任何方法使用上述任何的多核苷酸或者组合物得以调整实现。
在一个实施例中，提供了一个可以使植物(例如水稻)早开花的方法，所述方法包括使一个多核苷酸表达量的降低，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽的氨基酸序列在与SEQ ID NO：7至少90％的序列一致性。该多核苷酸表达量的降低可以通过上述的任何方法使用上述任何的多核苷酸或者组合物得以调整实现。
在一些实施例中，本发明的种子在其基因组中包含本发明的重组DNA构建体。
可以通过任何适当的技术将本发明的重组DNA构建体导入植物中，所述技术包括但不限于DNA直接导入、化学处理、电转化、微注射、转染、载体介导的DNA转移、基因枪轰击或农杆菌的转化。植物转化和再生的技术在国际专利公开号WO 2009/006276中描述，其全部内容并入作为参考。
本领域的技术人员熟悉包含有外源分离的可编码兴趣蛋白的核苷酸片段的植物的培育和再生的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合子修饰植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的基因转化植物和培育再生植物的方法。再生植物可以自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交。本领域的技术人员熟知培育本文披露的含有期望多肽的转基因植物的方法。
性状的堆叠
转基因植物可包含本发明公开的一个或多个花期调控多核苷酸与一个或多个另外的多核苷酸的堆叠，从而导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列的堆叠的转基因植物可通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一者或两者来获得。这些方法包括但不限于培育各自包含所关注多核苷酸的单独品系，用后续基因转化包含本文所公开的基因的转基因植物，以及将基因共转化进单个植物细胞中。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的两种或更多种性状(例如，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。如本文所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况中，可能期望引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。
实施例
实施例1.水稻激活标签突变体库的构建
本研究使用含有4X CaMV 35S增强子的T-DNA插入双元载体，采用林拥军和张启发描述的农杆菌介导法转化中花11号水稻(Oryza sativa L.)(Lin and Zhang((2005)PlantCell Rep.23:540-547)，构建水稻激活标签突变体库。中花11号水稻是中国农业科学院作物研究所培育的，我们从北京未名凯拓农业生物技术公司获得第一批种子。使用T-DNA插入双元载体转化中花11号水稻胚诱导的愈伤组织，产生转基因株系苗，收获的转基因种子构成突变体库。
实施例2.水稻激活标签突变体库开花性状的观察
水稻植株种植在北京田间(40°13’N)或者新疆田间(40°34’N)，植物生长发育过程中记录植株的表型。
方法
水稻种子于32℃800ppm多菌灵中消毒8h后，蒸馏水冲洗3～5次，然后在32℃水中浸泡16h，在35-37℃培养箱中萌发18h。萌发的种子种植在田间苗床上，三叶期时，将幼苗移栽到田间稻田中。每个激活标签株系(ATL)的10棵植株种植一行，ZH11-TC(组织培养获得的中花11号)临近ATL水稻，种植在同一个小区，并用作对照。
水稻植株正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥，实验过程中观察并记录植株表型。
本试验记录抽穗期和成熟期，抽穗期包括始穗日和50％抽穗期，始穗日是指第一个穗，通常是指主茎穗抽出剑叶叶鞘的日期，50％抽穗期是指一行中植株50％的幼穗抽出剑叶叶鞘的日期，成熟期指每穗谷粒颖壳、谷粒小穗轴或副护颖90％以上变黄的日期。如果ATL水稻植株的抽穗期早于对照水稻植物，那么ATL水稻被认为是早抽穗的植株，如果ATL水稻植株的抽穗期晚于对照水稻植物，那么ATL水稻被认为是晚抽穗的植株。插入的T-DNA可能会影响ATL中的基因，一些基因在控制ATL植物开花时间上发挥作用。
本试验还测定了植株高度、有效穗数和单株产量。植株高度指从地表到最高穗或叶顶部的长度。收获时，将每个转基因株系的全部或位于中间位置的六株收获,先将稻穗剪下并存放在一个袋子中，然后将茎部贴地剪下放在另外的袋子中，测定每个单株的有效穗数和单株产量。植株高度、有效穗数和单株产量采用ASReml混合线性模型分析。
结果：
1)AH41120
将40株T2代AH41120和39株ZH11-TC植株移栽到北京田间稻田。水稻植株正常管理，7月21日，四行AH41120水稻植株均显示出50％的幼穗抽剑叶叶鞘，而ZH11-TC水稻植株自8月20日才有50％的幼穗抽出。这些结果表明AH41120水稻植株比对照植株早抽穗30天。测定的产量结果如表2所示，AH41120水稻植株的单株籽粒产量高于对照ZH11-TC.
表2.AH41120水稻植株开花性状和籽粒产量分析(第一次试验)
Figure BDA0002557585120000191
第二年，将40株AH41120和39株ZH11-TC植株移栽到北京田间稻田中。结果如表3所示，AH41120水稻植株比对照植株早抽穗19天，AH41120水稻植株的单株籽粒产量稍低于ZH11-TC的单株籽粒产量。
表3.AH41120水稻植株开花性状和籽粒产量分析(第二次试验)
Figure BDA0002557585120000192
2)AH11081
扩繁试验中存活的两株AH11081水稻植株中，一株水稻植株早开花21天。随后AH11081水稻植株在新疆田间干旱条件下验证两次，其中第一次试验中，AH11081水稻植株出现部分早抽穗和早成熟的表型，第二次试验中，39株AH11081水稻植株中23株早抽穗约15天。
实施例3.ATL水稻植株的开花性状验证
最佳的生产需要抽穗期或开花时间的精确调控，而抽穗期或开花时间的变化依赖于种植地理位置和气候。
为了进一步验证ATL水稻植株的开花性状，将T2代种子种植在不同的地理位置或环境中：HN(海南,18°30’N),CS(长沙,28°11’N)；BJ(北京,40°13’N)and NX(宁夏,38°36'N,海拔1106.3m).
方法与实施例2描述的方法相同。
结果：
1)AH41120-CS
20株AH41120水稻植株(T-DNA插入,AH41120-F)种植在长沙稻田中，ZH11-TC和分离自T-DNA插入的AH41120的阴性水稻植株(无T-DNA插入，AH41120-N)临近种植，并用做对照。如表4所示，AH41120-F水稻植株与其对照的抽穗期和成熟期无差异。
表4.AH41120水稻植株在长沙田间的开花性状验证
Figure BDA0002557585120000201
2)AH41120-BJ
两批种子在不同的时间种植，其中第二批的种植时间比第一批晚10天。在这两批的试验中，北京稻田中种植20株AH41120-F水稻植株，ZH11-TC和AH41120-N水稻植株临近种植，并用做对照。如表5所示，第一批次中，AH41120-F水稻植株比ZH11-TC和AH41120-N水稻植株分别早抽穗20天和21天；AH41120-F水稻植株比对照植株分别早成熟1.5天和2天。第二批次中，AH41120-F水稻植株比ZH11-TC和AH41120-N水稻植株分别早抽穗13天和15天；AH41120-F水稻植株比对照植株分别早成熟10.8天和13天。AH41120-F水稻植株的籽粒产量约等于ZH11-TC和AH41120-N水稻植株(表6)。这些结果进一步表明AH41120-F在北京稻田中比对照植株早抽穗和早成熟。
表5.AH41120水稻植株在北京田间的开花性状验证
Figure BDA0002557585120000202
表6.AH41120水稻植株在北京田间的籽粒产量分析
Figure BDA0002557585120000203
3)AH11081-CS
20株AH11081水稻植株(T-DNA插入,AH11081-F)种植在长沙稻田中，ZH11-TC和分离自T-DNA插入的AH11081的阴性水稻植株(无T-DNA插入，AH11081-N)临近种植，并用做对照。如表7所示，AH11081-F水稻植株比ZH11-TC和AH11081-N水稻植株分别早抽穗7天和8天。这些结果表明AH11081-F水稻植株在长沙稻田中比对照植株早抽穗和早成熟。
表7.AH11081水稻植株在长沙田间的开花性状验证
Figure BDA0002557585120000211
4)AH11081-BJ
20株AH11081-F种植在北京稻田中，ZH11-TC和AH11081-N临近种植，并用做对照。如表8所示，AH11081-F水稻植株比ZH11-TC和AH11081-N水稻植株分别早抽穗17天和20天。表9表明，AH11081-F水稻植株的单株籽粒产量约等于ZH11-TC的，高于AH11081-F水稻植株。这些结果进一步表明在北京稻田中AH11081-F水稻植株比对照早抽穗和早成熟。
实施例2和实施例3的数据进一步表明AH11081水稻植株在不同的地理位置(新疆、长沙和北京)均比对照早抽穗和早成熟。
表8.AH11081水稻植株在北京田间的开花性状验证
Figure BDA0002557585120000212
表9.AH11081水稻植株在北京田间的籽粒产量分析
Figure BDA0002557585120000213
这些结果表明AH41120和AH11081水稻植株在不同的地理位置，如长沙(28°11’N)、北京(40°13’N)、宁夏(38°36'N,海拔1106.3m)和新疆(40°34’N)表现出早抽穗或早开花的表型。
根据这些实验结果，分离AH41120和AH11081株系中调控抽穗期或开花时间的基因。
实施例4.激活标签基因的鉴定
AH41120和AH11081中T-DNA插入位点的侧翼基因被鉴定。
采用CTAB法(Murray,M.G.and W.F.Thompson.(1980)Nucleic Acids Res.8:4321-4326)提取AH41120和AH11081株系中叶片组织的基因组DNA，插入位点的侧翼序列通过分子技术获得。
一个T-DNA插入到AH41120水稻植株7号染色体上(MSU7.0http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)，一个T-DNA插入到AH11081水稻植株的7号染色体上。AH41120植株中T-DNA插入位点的侧翼核苷酸序列如SEQ ID NO:1和2所示，AH11081植株中T-DNA插入位点的侧翼序列如SEQ ID NO:3和4所示。进一步的分析显示T-DNA插入到AH41120水稻植株LOC_Os07g15770编码序列的上游约3500bp处，T-DNA插入到AH11081水稻植株LOC_Os07g15770的编码区域，在起始密码子下游约10bp处，因此将位于水稻基因位点LOC_Os07g15770的基因分离。
位于位点LOC_Os07g15770.1的水稻基因编码OsCMP1，一个CMP1多肽，该多肽在TIGR(the internet at plant biology msu.edu/index.shtm)中注释为“CCT基序家族蛋白，表达的”。
实施例5.开花时间调控基因的克隆和过表达载体的构建
设计引物，克隆水稻花期调控基因(OsCMP1、LOC_Os07g15770)。以中花11植株的基因组DNA为模板采用常规方法和下列引物克隆OsCMP1的gDNA。
gcI-3433：5'-ATGGGGATGGCCAATGAGGAG-3'(SEQ ID NO：9)
gcI-3434：5'-ATCTATCTGAACCATTGTCCAAGCTC-3'(SQE ID NO：10)
PCR扩增产物长度为2786bp，琼脂糖凝胶电泳后，采用试剂盒回收，并与TA克隆载体连接。测序验证构建体中的序列和连接方向后，将基因克隆入双元载体DP0158中(pCAMBIA1300-DsRed)。DP2300构建体中克隆序列和OsCMP1的编码序列如SEQ ID NO：5和6所示，OsCMP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
实施例6.产生基因表达量增加的水稻植株
过表达载体和空载体(DP0158)采用林拥军和张启发((2005)Plant Cell Rep.23:540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻。转化实验室获得的T0代转基因幼苗移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中。过表达载体含有DsRED和HYG基因，T1和T2代种子在绿色荧光灯下发红色荧光的为转基因种子，并用于下列开花性状验证试验。
转基因水稻植株中基因表达分析：
采用标准的实时RT-PCR程序分析转基因水稻植株中基因的表达水平。EF1α基因用作内参显示转基因水稻和对照植物的扩增和上样量类似。EF1αmRNA水平用于规范基因表达量。
DP2300水稻植株中OsCMP1基因表达量水平采用SEQ ID NOs:11和12序列的引物进行测定，采集T1代抽穗期DP2300水稻植株的倒二叶，提取mRNA。如图1所示，ZH11-TC水稻中的表达量水平设置为1.00，OsCMBP1在转基因株系中过量表达，然而相同的株系的不同单株的表达量不同，表明OsCMBP1基因在不同的世代存在分离。
DP2300-F1：5’-ACGAGAAGCAAATCCGGTAC-3’(SEQ ID NO：11)
DP2300-R1：5’-TGATCAGGTTCTTTGGCGAAG-3’(SEQ ID NO：12)
实施例7.OsCMP1过表达水稻植株的开花性状的观察
实验室转化获得40株T0转基因幼苗(DP2300)，于8月上旬移栽到北京田间(40°13’N)获得T1代种子从8月份到11月份，白天的时间逐渐变短，黑夜的时间逐渐变长，长夜间/段日照会促进水稻早抽穗。十月下旬，温度开始降低，为保证合适的温度和较好的灌浆，在塑料大棚中使用电加热器进行加热，同时期种植的ZH11-TC和其他转基因水稻植株在11月上旬收获，而OsCMP1转基因水稻植株到11月中旬也没有抽穗。
T0苗的稻桩于11月下旬移栽到海南田间(18°30’N)，同时期移栽的ZH11-TC和其他转基因水稻植株于2月下旬收获，而只有5株OsCMP1转基因水稻植株比ZH11-TC和其他转基因水稻植株晚抽穗5到10天，2株OsCMP1转基因水稻晚抽穗62天，6株OsCMP1转基因水稻晚抽穗90天，其他的转进水稻植株未抽穗。最终，收获了5株晚抽穗天数较少的转基因株系的T1代种子。
北京和海南田间种植的T0代OsCMP1转基因水稻植株表现出较高和粗的茎，北京田间种植的这些OsCMP1转基因水稻植株比临近种植的ZH11-TC和其他转基因水稻植株高约20-30cm。
这些结果表明OsCMP1过表达水稻植株在不同的环境中种植是表现出晚抽穗或者不抽穗，过量表达OsCMP1基因影响水稻的抽穗期或者开花时间，OsCMP1基因调控水稻抽穗期或者开花时间和株高。
实施例8.OsCMP1过表达水稻植株的开花性状的验证
为进一步探讨OsCMP1转基因水稻(DP2300)的开花性状，并探讨温度或光周期是否影响转基因水稻的抽穗期或开花期，将T1和T2代种子种植在不同的地理位置或环境条件下：HN(海南,18°30’N)、CS(长沙，28°11’N)和BJ(北京,40°13’N)。
试验方法与实施例2描述的方法相同。
结果：
1)DP2300-CS
5个OsCMP1过量表达水稻株系种植在长沙田间进行测试，ZH11-TC水稻植株临近种植，并用做对照。如表10所示，所有转基因水稻植株比ZH11-TC晚抽穗。DP2300.11、DP2300.13和DP2300.16水稻植株比ZH11-TC对照分别晚抽穗4天、5天和5天；DP2300.14和DP2300.15水稻植株分别比ZH11-TC对照晚抽穗25天和50天。这些结果表明OsCMP1过量表达水稻植株在北纬28度(28°N)比对照植株晚抽穗，OsCMP1基因的表达量越高，抽穗期越晚。除DP2300.14和DP2300.15水稻株系外，其他晚抽穗的三个水稻株系的植株在收获前成熟，这三个株系的成熟期与ZH11-TC植株相近。
表10.OsCMP1过表达水稻植株在长沙田间的开花性状验证
Figure BDA0002557585120000231
2)DP2300-BJ
相同的5个OsCMP1过量表达水稻株系在北京田间进行测试，ZH11-TC水稻植株临近种植并用做对照，每个转基因株系种植10个植株。如表11所示，所有DP2300.11和DP2300.13水稻植株比ZH11-TC对照分别晚抽穗3天和1天，部分DP2300.14、DP2300.15和DP2300.16水稻植株比ZH11-TC对照晚抽穗，4株DP2300.14水稻植株、1株DP2300.15水稻植株和3株DP2300.16水稻植株在收获前没有抽穗。除DP2300.14外的晚抽穗水稻植株在收获前成熟，成熟期与ZH11-TC植株相近。这些结果进一步表明OsCMP1过量表达水稻植株在不同的种植环境中晚抽穗或者不抽穗。
表11.OsCMP1过表达水稻植株在北京田间开花性状验证
Figure BDA0002557585120000232
Figure BDA0002557585120000241
实施例9.sgRNA序列的设计
采用可用的工具分析靶基因组序列产生候选的sgRNA序列，sgRNA序列也可以通过其他的网络工具产生，所述网络工具包括,但不限于,网站http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/和在线的CRISPR-PLANT。
本申请中，将OsCMP1启动子和基因序列(SEQ ID NO:8and SEQ ID NO:5)通过分析产生多个sgRNA序列。OsCMP1启动子和基因序列包括启动子、外显子、内含子、5’-UTR和3’-UTR，并产生了多个sgRNA序列。选择其中的22个sgRNA序列，其在OsCMP1启动子和基因序列上的分布如图2所示，sgRNA序列如序列SEQ ID NO:18-39所示。
实施例10.OsCMP1基因的CRIPSR-Cas构建体的构建
在CRIPSR-Cas9构建体中，玉米Ubi启动子(SEQ ID NO：13)驱动优化后的Cas9蛋白编码序列(SEQ ID NO：14)，CaMV35S 3’-UTR(SEQ ID NO：15)增加Cas9蛋白的表达水平，水稻U6启动子(SEQ ID NO：16)驱动gRNA的表达(gRNA骨架，SEQ ID NO：17)。
单个sgRNA可用于构建基因组编辑构建体(图3)，sgRNA选自包括启动子、外显子、内含子和UTR的任一区域。单个sgRNA可以引导Cas9酶定位于靶区域，在靶DNA序列上产生双链断裂，启动非同源末端连接(NHEJ)修复机制和同源介导修复(HDR)，通常会在靶位点诱导随机插入、缺失和替换。例如，所述编辑可以移除OsCMP1基因启动子区域的表达原件，从而降低mRNA水平，或导致OsCMP1多肽结构的变化而降低OsCMP1蛋白活性。
两个sgRNAs也可以用于构建基因组编辑构建体(图4)，两个或多个sgRNA选自启动子、外显子、内含子和UTR的基因片段区域。所属构建体可以引发片段删除、点突变(少量碱基的插入、删除和替换)。
表12为引物序列，靶位置和特定序列。DP2855构建体包含一个sgRNA,目标引物首先退火形成短的双链片段，然后将片段插入到pHSG396GW-URS-UC-mpCas9&U6-DsRed载体中(基于VK005-01改进的载体，购买予北京唯尚立德生物技术公司)。pHSG396GW-URS-UC-mpCas9&U6-DsRed克隆载体的元件详见SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQID NO：16和SEQ ID NO：17。确定gRNA片段的核苷酸序列后，将gRNA片段连入表达载体PCAMBIA1300DsRed-GW-Adv.ccdB中。针对含有两个sgRNA的构建体，不同的引物首先退火形成双链片段，然后两个gRNA片段融合并插入到克隆载体中，接着插入到表达载体中形成DP2925。预计的断裂位点可参见图2。
DP2855和DP2925构建体中的sgRNA靶向OsCMP1基因所在基因组区域。
表12.构建OsCMP1基因编辑的CRISPR/Cas9构建体的引物
Figure BDA0002557585120000242
实施例11.转化获得基因编辑水稻
本研究中，OsCMP1基因的CRIPSR-Cas9构建体采用林拥军和张启发((2005)PlantCell Rep.23：540-547)描述的农杆菌介导的方法转化入中花11号水稻和稻花香2号水稻中。通过PCR和测序验证转化实验室获得的T0代转基因幼苗，然后移栽至田间水田中获得T1种子，T1和T2代种子储藏在4℃冷库中。获得中花11水稻植株采用DP2855和DP2925表示，获得稻花香2号水稻植株采用RL2855和RL2925表示。
实施例12.确定水稻植株中OsCMP1基因修饰和剪切位点
以转化幼苗的基因组DNA为模板，设计引物扩增基因组编辑位点附近的靶序列。扩增的靶序列通过测序确定编辑结果，具体见图5和图6。基因组编辑产生的修饰诸如至少一个核苷酸的插入、删除或替换能导致编码序列的提前终止，翻译移码和/或至少一个氨基酸残基的删除。
如图5所示，在DP2855(中花11)水稻植株预期位点产生了10个突变，其中1个核苷酸插入突变类型1-4的预期位点，导致产生翻译移码，ORF读码框提前终止，预计翻译的多肽含有104个氨基酸；突变类型5中删除3个核苷酸，导致推测翻译的多肽中缺失一个氨基酸；突变类型6中删除2两个核苷酸，导致翻译移码，因此造成ORF读码框提前终止；突变类型7-10中，多个核苷酸被删除，导致ORF读码框提前终止。
如图6所示，在DP2925(中花11)水稻植株预期位点产生了9个突变，其中1个核苷酸插入突变类型1-4的两个预期位点，导致产生翻译移码，ORF读码框提前终止，这四种突变类型产生的多肽与DP2855水稻植株(突变类型1-4)类似；1个核苷酸插入突变类型5和6的第二个预期位点，导致ORF读码框提前终止，并产生多余259个氨基酸的多肽；突变类型7-9中，也产生ORF读码框提前终止，产生的多肽多余199个氨基酸。
DP2855水稻植株和DP2925水稻植株中的突变导致OsCMP1编码序列在CCT超家族结构域之前的翻译提前终止，这将进一步影响翻译多肽的长度和活性。
RL2855,RL2925稻花香2号水稻植株中产生类似的突变。
基因组编辑纯合水稻植株用于后续功能验证。
实施例13.OsCMP1修饰水稻植株开花性状观察
结果:
1)T0代中花11(ZH11)
DP2855-BJ
转化实验室产生的T0代转化ZH11幼苗(DP2855)移栽到北京田间(40°13’N)获得T1代种子，植物生长过程中记录表型。始穗日指第一个穗抽出剑叶叶鞘约2cm时的日期，本试验中采用移栽日至始穗日的天数作为抽穗期的指标。DP2855H、DP2855P和DP2855N分别代表针对预期靶位点的纯合、杂合和基因编辑阴性ZH11水稻植株。如表13所示，DP2855纯合水稻植株的平均始穗天数比ZH11-TC水稻植株少10天；DP2855杂合水稻植株的平均始穗天数比ZH11-TC水稻植株少6天；DP2855编辑阴性水稻植株平均始穗天数与ZH11-TC水稻植株相近。结果表明，在北京田间，T0代DP2855纯合和杂合水稻植株比ZH11-TC早抽穗。
表13.T0代OsCMP1基因编辑(DP2855)的ZH11水稻植株在北京的开花性状
Figure BDA0002557585120000251
DP2925-BJ
转化实验室产生的T0代转化ZH11幼苗(DP2925)移栽到北京田间(40°13’N)获得T1代种子。植物生长过程中记录表型，记录始穗日。DP2925H、DP2925P和DP2925N分别代表针对预期靶位点的纯合、杂合和基因编辑阴性ZH11水稻植株。如表14所示，DP2925纯合水稻植株的平均始穗天数比ZH11-TC水稻植株少12天；DP2925杂合水稻植株的平均始穗天数比ZH11-TC水稻植株少8天；DP2925编辑阴性水稻植株平均始穗天数大于ZH11-TC水稻植株相近。结果表明，在北京田间，T0代DP2925纯合和杂合水稻植株比ZH11-TC早抽穗。
表14.T0代OsCMP1基因编辑(DP2925)的ZH11水稻植株在北京的开花性状
Figure BDA0002557585120000261
2)T0代稻花香2号
RL2855-HN
转化实验室产生的第一批T0代转化稻花香2号幼苗(RL2855)于10月下旬移栽到海南田间(18°30’N)获得T1代种子。植物生长过程中记录表型，记录始穗日。RL2855H、RL2855P和RL2855N分别代表针对预期靶位点的纯合、杂合和基因编辑阴性稻花香2号水稻植株。在海南，自9月下旬到12月中旬白昼时间变短，夜晚的时间变长，且12月20日白昼时间最短，较长的夜晚时间/较短的白昼时间将促进水稻早抽穗。如表15所示，RL2855纯合水稻植株的平均始穗天数比RL2855N水稻植株少13天；RL2855杂合水稻植株的平均始穗天数比RL2855N水稻植株少10天。这些结果表明，在海南田间，T0代RL2855纯合和杂合水稻植株比其编辑阴性水稻植株早抽穗。
表15.T0代OsCMP1基因编辑(RL2855)的稻花香2号水稻植株在海南的开花性状(第一次试验)
Figure BDA0002557585120000262
转化实验室产生的第二批T0代转化稻花香2号幼苗(RL2855)于1月上旬移栽到海南田间(18°30’N)获得T1代种子。植物生长过程中记录表型。在海南，自12月下旬到次年的3月中旬白昼时间变长，夜晚的时间变短，较长的白昼时间/较短的夜晚时间将促进水稻晚抽穗。如表16所示，与RL2855N编辑阴性水稻植株相比，RL2855纯合水稻植株的平均始穗天数少6天；RL2855杂合水稻植株的平均始穗天数少4天。这些结果也表明，在海南田间，T0代RL2855纯合和杂合水稻植株比其编辑阴性水稻植株早抽穗，光周期影响水稻的抽穗期或开花时间性状。
表16.T0代OsCMP1基因编辑(RL2855)稻花香2号水稻植株在海南的开花性状(第二次试验)
Figure BDA0002557585120000263
Figure BDA0002557585120000271
RL2925-HN
转化实验室产生的T0代转化稻花香2号幼苗(RL2925)于11月上旬移栽到海南田间(18°30’N)获得T1代种子。植物生长过程中记录表型，记录始穗日。RL2925H、RL2925P和RL2925N分别代表针对预期靶位点的纯合、杂合和基因编辑阴性稻花香2号水稻植株。在海南，自9月下旬到12月中旬白昼时间变短，夜晚的时间变长，且12月20日白昼时间最短，较长的夜晚时间/较短的白昼时间将促进水稻早抽穗。如表17所示，RL2925纯合水稻植株和RL2925杂合水稻植株的平均始穗天数比RL2925N编辑阴性水稻植株约少5天。这些结果表明，在海南田间，T0代RL2925纯合和杂合水稻植株比其编辑阴性水稻植株早抽穗。
表17.T0代OsCMP1基因编辑(RL2925)的稻花香2号水稻植株在海南的开花性状
Figure BDA0002557585120000272
实施例14
OsCMP1修饰水稻的开花性状验证
从T0代植株获得T1和T2代种子。因为T-DNA可随机插入在水稻细胞的12条染色体上，当T-DNA插入位点与目的靶位点分布在不同的染色体上或即使在一条染色体上也相距较远时，在体细胞通过减数分裂形成生殖细胞的过程中，T-DNA会与目的靶位点发生分离，在形成的T1代种子中能够得到靶位点编辑但不含有gCAS9-gRNA-DsRed的正常颜色种子(图7)。种子种植后，采用分子技术鉴定编辑模式。其中一些突变与实施例12描述的相同。株系ID中的字母“B”表示正常颜色的种子。
试验方法与实施例2描述的方法相同。
结果：
1)ZH11植株
T1代DP2855-HN
试验中，种植6个T1代纯合OsCMP1修饰水稻株系(DP2855)，ZH11-TC和经过转化过程具有野生型(未突变的)OsCMP1基因的基因组编辑阴性的水稻植株(DP2855N)用作对照。一个核苷酸“T”插入到所述T1代OsCMP1修饰水稻株系的预期靶位置，导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，这6个OsCMP1株系中的突变类型属于图5中的突变类型2，推测翻译的多肽有104个氨基酸。这些植株11月播种，12月移栽到稻田中，ZH11-TC对照从播种到50％抽穗期的天数为70.5天，DP2855N为67天，构建体水平，DP2855H水稻植株比ZH11-TC和DP2855N水稻植株分别早抽穗9天和5天；所有的DP2855H水稻株系比ZH11-TC和DP2855N水稻植株早抽穗。如表18所示，所有的基因组编辑水稻植株比对照早成熟。
表18.T1代OsCMP1基因编辑(DP2855)ZH11水稻植株在海南的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000273
Figure BDA0002557585120000281
T1代DP2855-CS
两个T1代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2855)种植在长沙田间，ZH11-WT和DP2855N水稻植株用作对照。一个核苷酸“T”插入这两个OsCMP1修饰的水稻株系的预期靶位点，导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，所述突变类型属于的突变类型2，预测翻译的多肽含有104个氨基酸。这些植株于5月份播种，6月份移栽到稻田中，每个株系的20株种植在两行。ZH11-WT对照和DP2855N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为76天，两个DP2855H水稻株系比ZH11-WT和DP2855N水稻植株早抽穗10天，并且比对照早成熟(表19)。
表19.T1代OsCMP1基因编辑(DP2855)ZH11水稻植株在长沙的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000282
T1代DP2855-BJ
两个相同T1代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2855)种植在北京田间，ZH11-WT和DP2855N水稻植株用作对照。这些植株于5月份播种，6月份移栽到稻田中，每个株系的20株种植在两行。ZH11-WT对照和DP2855N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为92天，两个DP2855H水稻株系比ZH11-WT和DP2855N水稻植株早抽穗21天，并且比对照早成熟(表20)。
表20.T1代OsCMP1基因编辑(DP2855)ZH11水稻植株在北京的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000283
T2代DP2855-CS
10个T2代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2855)种植在长沙田间，ZH11-WT和DP2855N水稻植株用作对照。一个核苷酸“T、A、C、G”插入到OsCMP1修饰的水稻植株预期的靶位点,导致翻译移码，并造成ORF读码框提前终止，突变类型如图5的类型1-4所示，推测翻译的多天含有104个氨基酸。水稻植株于5月份播种，6月份移栽到田间，每个株系的20株苗种植在两行中。如表21所示，ZH11-WT对照和DP2855N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为76天；构建体水平上，基因组编辑的DP2855H水稻株系比ZH11-WT和DP2855N水稻植株早抽穗8天，并且比对照早成熟。
表21.T2代OsCMP1基因编辑(DP2855)的ZH11水稻植株在长沙的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000291
T2代DP2855-BJ
10个相同的T2代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2855)种植在北京田间，ZH11-WT和DP2855N水稻植株用作对照。水稻植株于5月份播种，6月份移栽到田间，每个株系的20株苗种植在两行中。如表22所示，ZH11-WT对照和DP2855N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为108天；构建体水平上，基因组编辑的DP2855H水稻株系比ZH11-WT和DP2855N水稻植株早抽穗18天，并且比对照早成熟19天。所有的基因编辑的DP2855H株系显示相近的抽穗期和成熟期。
表22.T2代OsCMP1基因编辑(DP2855)ZH11水稻植株在北京的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000292
Figure BDA0002557585120000301
T1代DP2925-HN
试验中，种植9个T1代纯合OsCMP1修饰水稻株系(DP2925)，ZH11-TC和经过转化过程具有野生型(未突变的)OsCMP1基因的基因组编辑阴性的水稻植株(DP2925N)用作对照。这9个修饰株系具有5种基因编辑模式，DP2925H.05B、DP2925H.06B和DP2925H.15B植株中靶位点基因变编辑模式图6中的突变类型1，DP2925H.12B植株中的编辑模式为突变类型2，DP2925H.11B植株中的编辑模式为突变类型4，DP2925H.02B、DP2925H.13B和DP2925H.14B植株的编辑模式为突变类型5，DP2925H.17B植株中的编辑模式为突变类型8，上述突变导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，推测翻译的多肽有104个氨基酸或者249-263个氨基酸。水稻植株11月播种，12月移栽到稻田中，ZH11-TC对照从播种到50％抽穗期的天数为71天，DP2925N为68天；构建体水平，DP2925H水稻植株比ZH11-TC和DP2925N水稻植株早抽穗。如表23所示，所有的DP2925H水稻株系比ZH11-TC和DP2925N水稻植株早抽穗，部分的基因组编辑水稻植株比对照早成熟。
表23.T1代OsCMP1基因编辑(DP2925)ZH11水稻植株在海南的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000302
Figure BDA0002557585120000311
T1代DP2925-CS
两个T1代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2925)种植在长沙田间，ZH11-WT和DP2925N水稻植株用作对照。一个核苷酸“T”插入这两个OsCMP1修饰的水稻株系的第二个预期靶位点，而第一给预期靶位点没有突变，因此导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，所述突变类型属于图6的突变类型5，预测翻译的多肽含有263个氨基酸。水稻植株于5月份播种，6月份移栽到稻田中，每个株系的20株种植在两行。ZH11-WT对照和DP2925N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为76天，两个DP2925H水稻株系比ZH11-WT和DP2925N水稻植株早抽穗8天，并且比对照早成熟(表24)。
表24.T1代OsCMP1基因编辑(DP2925)ZH11水稻植株在长沙的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000312
T1代DP2925-BJ
两个相同的T1代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2925)种植在北京田间，ZH11-WT和DP2925N水稻植株用作对照。水稻植株于5月份播种，6月份移栽到稻田中，每个株系的20株种植在两行。如表25所示，ZH11-WT对照和DP2925N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为92天，两个DP2925H水稻株系比ZH11-WT和DP2925N水稻植株早抽穗20天，并且比对照早成熟。
表25.T1代OsCMP1基因编辑(DP2925)ZH11水稻植株在北京的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000313
T2代DP2925-CS
10个T2代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2925)种植在长沙田间，ZH11-WT和DP2925N水稻植株用作对照。这10个修饰株系具有5种基因编辑模式，DP2925H.02B和DP2925H.13B植株中靶位点基因变编辑模式图6中的突变类型5，其余基因编辑株系中的编辑模式为突变类型1-4。上述突变导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，推测翻译的多肽有104个氨基酸或者263个氨基酸。水稻植株于5月份播种，6月份移栽到田间，每个株系的20株苗种植在两行中。ZH11-WT对照和DP2925N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为76天；构建体水平上，基因组编辑的DP2925H水稻株系比ZH11-WT和DP2925N水稻植株早抽穗。如表26所示，所有基因编辑的DP2925H水稻株系比ZH11-WT和DP2925N水稻植株早抽穗，并且比对照早成熟。
表26.T2代OsCMP1基因编辑(DP2925)ZH11水稻植株在长沙的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000321
T2代DP2925-BJ
10个相同的T2代纯合的OsCMP1修饰水稻株系(DP2925)种植在北京田间，ZH11-WT和DP2925N水稻植株用作对照。水稻植株于5月份播种，6月份移栽到田间，每个株系的20株苗种植在两行中。ZH11-WT对照和DP2925N水稻植株自播种到50％抽穗期的天数为108天；构建体水平上，基因组编辑的DP2925H水稻株系比ZH11-WT和DP2925N水稻植株早抽穗。如表27所示，所有基因编辑的DP2925H水稻株系比ZH11-WT和DP2925N水稻植株早抽穗，并且比对照早成熟。
表27.T2代OsCMP1基因编辑(DP2925)ZH11水稻植株在北京的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000322
Figure BDA0002557585120000331
海南(18°30’N)、长沙(28°11’N)‘和北京(40°13’N)的田间试验表明基因编辑的DP2855和DP2925水稻植株能够早抽穗，纬度越高，抽穗期差别越大。基因组编辑OsCMP1基因，即使是一个核苷酸的插入，也可以调控ZH11水稻品种的开花时间性状。
2)稻花香2号
T1代RL2855-BJ
OsCMP1基因组编辑的稻花香2水稻幼苗(RL2855)种植在北京田间(40°13’N)，野生型稻花香2号和经过转化过程具有野生型(未突变的)OsCMP1基因的基因组编辑阴性的稻花香2号水稻植株(RL2855N)用作对照。所测试的水稻植株的靶位点基因组编辑模式属于图5中的突变类型2，突变导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，推测翻译的多肽有104个氨基酸。水稻植株6月移栽到稻田中，植株生长过程中记录表型和始穗日。如表28所示，RL2855水稻植株的平均始穗天数比野生型稻花香2号和RL2855N水稻植株少25天。这些结果表明基因组编辑RL2855水稻植株比对照早抽穗。
表28.T1代OsCMP1基因编辑(RL2855)稻花香2号水稻植株在北京的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000332
T1代RL2855-黑龙江
OsCMP1基因组编辑的稻花香2水稻幼苗(RL2855)种植在黑龙江田间(45°53’N)，野生型稻花香2号和RL2855N用作对照。水稻植株5月移栽到稻田中，植株生长过程中记录表型和始穗日。如表29所示，RL2855水稻植株的平均始穗天数比野生型稻花香2号少14天，所有的基因编辑RL2855水稻植株早抽穗。这些结果表明，在黑龙江(45°53’N)，
基因组编辑RL2855水稻植株比对照早抽穗。
表29.T1代OsCMP1基因编辑(RL2855)稻花香2号水稻植株在黑龙江的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000341
T1代RL2925-BJ
OsCMP1基因组编辑的稻花香2水稻幼苗(RL2925)种植在北京田间(40°13’N)，野生型稻花香2号和经过转化过程具有野生型(未突变的)OsCMP1基因的基因组编辑阴性的稻花香2号水稻植株(RL2925N)用作对照。所测试的水稻植株的靶位点基因组编辑模式属于图6中的突变类型1-4，突变导致翻译移码，并造成ORF读码框的提前终止，推测翻译的多肽有104个氨基酸。水稻植株6月移栽到稻田中，植株生长过程中记录表型和始穗日。如表30所示，RL2925水稻植株的平均始穗天数比野生型稻花香2号水稻植株少27天，所有的基因编辑水稻植株早抽穗。这些结果表明，在北京，基因组编辑RL2925水稻植株比对照早抽穗。
表30.T1代OsCMP1基因编辑(RL2925)稻花香2号水稻植株在北京的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000342
Figure BDA0002557585120000351
T1代RL2925-黑龙江
OsCMP1基因组编辑的稻花香2水稻幼苗(RL2925)种植在黑龙江田间(45°53’N)，野生型稻花香2号用作对照。水稻植株5月移栽到稻田中，植株生长过程中记录表型和始穗日。如表31所示，RL2925水稻植株的平均始穗天数比野生型稻花香2号水稻植株少15天，所有的基因编辑RL2925水稻植株早抽穗。这些结果表明，在黑龙江(45°53’N)，基因组编辑RL2925水稻植株比对照早抽穗。
表31.T1代OsCMP1基因编辑(RL2925)稻花香2号水稻植株在黑龙江的开花性状分析
Figure BDA0002557585120000352
北京(40°13’N)和黑龙江(45°53’N)的田间试验表明基因组编辑的RL2855和RL2925稻花香2号水稻植株能够早抽穗，纬度越高，抽穗期差异越小。OsCMP1基因的基因组编辑，即使只有一个核苷酸和插入，能够调控开花时间性状。
上述实验表明，OsCMP1基因的基因组编辑影响开花时间性状，OsCMP1基因中，一个碱基的插入、两个碱基的删除或者小片段的删除，均可以在不同的品种，不同的纬度，诸如海南(18°30’N)、长沙(28°11’N)、北京(40°13’N)、黑龙江(45°53’N)，促进水稻早开花。
序列表
<110> 未名生物农业集团有限公司
先锋海外公司
<120> 花期调控基因CMP1和相关的载体及其应用
<130> RTS22593I
<150> 201711459345.3
<151> 2017-12-28
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 226
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 1
attaatccat aattaacata tgtgatgcta tagtaaacat gttctaatca tagattaatt 60
aggcttaaaa aatttgtctc gcgaattagc tcttatttaa tcaattagtt ttattattat 120
tctacgttca atagttctaa ctagtgtcca aacatccgaa gtgacaaaga ctaaaattta 180
gtccttagat ccaaacacca cctaagacag gaatctagat atctag 226
<210> 2
<211> 677
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 2
gccccatttc ctttgcagtt ccatttacag tccgcctaga aataaaaggg tccggtatcc 60
aagaaaatct ttcctgtagt agtgaaactg ctttaaattt gaccaagttt ataaaaaaag 120
tagtaacatt ttcaacccaa gataaactta ttataaaaat atatttaatt attgatttga 180
taaaactaat ttagtattat aaatattact atatttgtct ataaacttag tcaatcttga 240
aacaatatga ctttgatcaa agtcaaaacg tcttataatc tgaaacggag gaagtagata 300
gataagatac ttgaattgat catgtgcgca cgttatatgc aaaatcaagg cttaataatt 360
aagatcattg atccgatttc atgagtgcat acatactaat tatttagagt ttactatgta 420
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atcgcagtca tattagtata ccgtggtttg agaacccaca aaagatatct acatgtcata 540
tcacacatat aaatctgtat tactcccttc gtcacataat ataaaggatt ttaaaagtat 600
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<210> 3
<211> 910
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 3
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gagtgcatct tatacttaag gtctaccaca agcataaaga aaatattctc tctctcattt 180
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caaatctaac tatagtacat aattttacta gaactacact ataataatta tataacttgt 360
atagatgtat taaaataata tatgcaactt tatatctaat ttgatagaga taataatgta 420
gttactgtaa ctagggtata actggagtat aagtaacatg taacttgcta attttttaaa 480
aaacttgcaa gctggtggga tcgaggtcct gggttcgaac cccatgcagc gcacaaatta 540
tgtttctcac acgggatttt tttccatgaa cgcgccagca cgaatcttga gatgaatctg 600
acggtcaaaa attcgaaaga atttaccccc gttttctgtc gatagaaaac tagcaaatcc 660
gtttcagcaa tagcattatg ggaattgctt taacaacaat caaactattc atgggccact 720
tctaagatca cactagaccc atatacattg agattgccct gatatatcca tctaattcat 780
ggacattttc ctagtcttgg ggggatataa tataatagga gctagagggg ggcatgggta 840
gtgaagtcca gccagcgcag aagatccttg gggggatctg gttgcaatgg ggatggccaa 900
tgaggagtcg 910
<210> 4
<211> 559
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 4
gtcatcgaac agccaggcca cgctctcgcc gtcgtcgccg ccgccgtcgt tgccgaagaa 60
ctggaactcg tgcaccggtg gcgccggggc gccgatcccc tggcacgcac tcggcgggaa 120
gacgaagggg aatccatcat catcgtggcg atggcgggag caacagccgc caccgtcggc 180
gccgcacagg ccacatcctt ctccggctgc tggtcccatc gacatgaacg gataaatcaa 240
actcgatcga gctacaaaca acaactagct agagctagct agtaagttag ctatagcagg 300
tgaggtcact tgagctcgat cagctcagct agctagggtt gtgaaatgct tgtgatcact 360
gatcgatcag cgagatcgat gacttgtaat aatataggta caagaagaag aagaagaaga 420
agacagggca agttggggat gagggaaagg taggggggcc attgcgagat catattatga 480
tcgatcgagg agagcggggc gatctgtgga tggatttggt ccttacgtgg aggaatccgg 540
ccgccttttt tcacctgat 559
<210> 5
<211> 2786
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 5
atggggatgg ccaatgagga gtcgccaaat tatcaggtga aaaaaggcgg ccggattcct 60
ccacgtaagg accaaatcca tccacagatc gccccgctct cctcgatcga tcataatatg 120
atctcgcaat ggccccccta cctttccctc atccccaact tgccctgtct tcttcttctt 180
cttcttcttg tacctatatt attacaagtc atcgatctcg ctgatcgatc agtgatcaca 240
agcatttcac aaccctagct agctgagctg atcgagctca agtgacctca cctgctatag 300
ctaacttact agctagctct agctagttgt tgtttgtagc tcgatcgagt ttgatttatc 360
cgttcatgtc gatgggacca gcagccggag aaggatgtgg cctgtgcggc gccgacggtg 420
gcggctgttg ctcccgccat cgccacgatg atgatggatt ccccttcgtc ttcccgccga 480
gtgcgtgcca ggggatcggc gccccggcgc caccggtgca cgagttccag ttcttcggca 540
acgacggcgg cggcgacgac ggcgagagcg tggcctggct gttcgatgac tacccgccgc 600
cgtcgcccgt tgctgccgcc gccgggatgc atcatcggca gccgccgtac gacggcgtcg 660
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ccctcggcga acggcccgac ctggacgccg ggctcggcct cggcggcggc ggcggccggc 780
acgccgaggc cgcggccagc gccaccatcg tgagtatcaa tccaataatc ctgatccggc 840
cggcatgatc ggctcgattg agccgtgtcg attattaatt tccatcttat atattattaa 900
ttgatgaatt cttgattgat tcatcgatcc tcctcgtctt ttcttggctt ctttgttttt 960
gttatttagt caaaaacaac tcttcatttc tgctgcctat atgccgtaca acttcaaact 1020
atcaaaggtc aaataatcga tcaatatata ccaagtttga attaatttgg agcttaatta 1080
attaattact ggcttgcagc agctggttta tagtattgtt tctagctata tatgtgaggg 1140
ccgtgtgtgg gatgtgattt gcatctttcg atgacgactt aattaattcg atgatatatt 1200
tcattgcata tgcatacgga tccagcctct gtctatactg tacgattcca catacgtata 1260
tgtacggtta agtcagtata tatactttta gatagtcgcg tgtgcttttc gagttcggta 1320
gctatatttt agattgtaaa aacaagtcag aggctaattt tataatctag aaatacttat 1380
ttccccatat ataagcgtat gttaaatatt gatggtgtaa tctacttata tgtcaggaaa 1440
catcattgct tgctttctgg cgctttcttc tacatatcag tagaggaaaa tggaaaaaaa 1500
aagatgaatt ttgatgttgt agtttgctat attcagcata tataccatca gttatacata 1560
tgcagatctt gctaaaacca aaataaaaat agaactgtaa ggagatattg tgcttctcgg 1620
tctatttact tacagtttgt tgagaagtaa tacgagcaag caaatgtata tatatatttc 1680
tttagaactg caaggagatg catatacatg tgtgattcaa acacacgtac tgcacattca 1740
aactataaaa acaacttgat tgccgtagaa gttaaaaggg agacatatcc atgggtttcg 1800
gattctaaat caatctatgt gtaaatgaaa ctttagtata gtaggaaata ggttttcaaa 1860
aaaaaaagta tagtaggaaa tagtatgtgt atatgccttt ttaaccctta attacaagtt 1920
gttataattc agtgttaaca aagtcacgga ctcacagagt gtgcccttac acaatttcag 1980
actaatttgt aaatgcatcg atcgtcacat tttatgtggt tcaattatct gacacagtta 2040
attaatggtg gccgatcgat gtatgctctt ctagctttcc agctatatgc gtatgtaata 2100
aatgaataaa acgtgtagga tgaaatgtga atacgcatca ttgtaattaa tttgattaat 2160
gctagtaaaa aatctgcaaa tttgtctttt tgaaattaaa atatgcctta taaaattaat 2220
ggacccaggc ccctagggca aaatatattg gggcacaaaa tcatgtccat atatacattc 2280
ttatttgaaa gtagactctg aaacaaaata tgcccatata aatcaaggga ggttacaact 2340
aactgcattt gcttatgcgt acatctggat tgtaacttct atgttttgta catacgatga 2400
ttaattgtat tcgagcttct taattgtaca tctattaact aactagtttt gcagatgtca 2460
tattgtggga gcacgttcac tgacgcagcg agctcgatgc ccaaggagat ggtggccgcc 2520
atggccgatg atggggagag cttgaaccca aacacggtgg ttggcgcaat ggtggagagg 2580
gaggccaagc tgatgaggta caaggagaag aggaagaaga ggtgctacga gaagcaaatc 2640
cggtacgcgt ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagtgagagg tcgcttcgcc 2700
aaagaacctg atcaggaagc tgtcgcaccg ccatccacct atgtcgatcc tagtaggctt 2760
gagcttggac aatggttcag atagat 2786
<210> 6
<211> 864
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 6
atggggatgg ccaatgagga gtcgccaaat tatcaggtga aaaaaggcgg ccggattcct 60
ccacctcgat cgagtttgat ttatccgttc atgtcgatgg gaccagcagc cggagaagga 120
tgtggcctgt gcggcgccga cggtggcggc tgttgctccc gccatcgcca cgatgatgat 180
ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcg tgccagggga tcggcgcccc ggcgccaccg 240
gtgcacgagt tccagttctt cggcaacgac ggcggcggcg acgacggcga gagcgtggcc 300
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cggcagccgc cgtacgacgg cgtcgtggcg ccgccgtcgc tgttcaggag gaacaccggc 420
gccggcgggc tcacgttcga cgtctccctc ggcgaacggc ccgacctgga cgccgggctc 480
ggcctcggcg gcggcggcgg ccggcacgcc gaggccgcgg ccagcgccac catcatgtca 540
tattgtggga gcacgttcac tgacgcagcg agctcgatgc ccaaggagat ggtggccgcc 600
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gaggccaagc tgatgaggta caaggagaag aggaagaaga ggtgctacga gaagcaaatc 720
cggtacgcgt ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagtgagagg tcgcttcgcc 780
aaagaacctg atcaggaagc tgtcgcaccg ccatccacct atgtcgatcc tagtaggctt 840
gagcttggac aatggttcag atag 864
<210> 7
<211> 287
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 7
Met Gly Met Ala Asn Glu Glu Ser Pro Asn Tyr Gln Val Lys Lys Gly
1 5 10 15
Gly Arg Ile Pro Pro Pro Arg Ser Ser Leu Ile Tyr Pro Phe Met Ser
20 25 30
Met Gly Pro Ala Ala Gly Glu Gly Cys Gly Leu Cys Gly Ala Asp Gly
35 40 45
Gly Gly Cys Cys Ser Arg His Arg His Asp Asp Asp Gly Phe Pro Phe
50 55 60
Val Phe Pro Pro Ser Ala Cys Gln Gly Ile Gly Ala Pro Ala Pro Pro
65 70 75 80
Val His Glu Phe Gln Phe Phe Gly Asn Asp Gly Gly Gly Asp Asp Gly
85 90 95
Glu Ser Val Ala Trp Leu Phe Asp Asp Tyr Pro Pro Pro Ser Pro Val
100 105 110
Ala Ala Ala Ala Gly Met His His Arg Gln Pro Pro Tyr Asp Gly Val
115 120 125
Val Ala Pro Pro Ser Leu Phe Arg Arg Asn Thr Gly Ala Gly Gly Leu
130 135 140
Thr Phe Asp Val Ser Leu Gly Glu Arg Pro Asp Leu Asp Ala Gly Leu
145 150 155 160
Gly Leu Gly Gly Gly Gly Gly Arg His Ala Glu Ala Ala Ala Ser Ala
165 170 175
Thr Ile Met Ser Tyr Cys Gly Ser Thr Phe Thr Asp Ala Ala Ser Ser
180 185 190
Met Pro Lys Glu Met Val Ala Ala Met Ala Asp Asp Gly Glu Ser Leu
195 200 205
Asn Pro Asn Thr Val Val Gly Ala Met Val Glu Arg Glu Ala Lys Leu
210 215 220
Met Arg Tyr Lys Glu Lys Arg Lys Lys Arg Cys Tyr Glu Lys Gln Ile
225 230 235 240
Arg Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu Met Arg Pro Arg Val Arg
245 250 255
Gly Arg Phe Ala Lys Glu Pro Asp Gln Glu Ala Val Ala Pro Pro Ser
260 265 270
Thr Tyr Val Asp Pro Ser Arg Leu Glu Leu Gly Gln Trp Phe Arg
275 280 285
<210> 8
<211> 4000
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 8
tatcctaaga taggaatgcc ctgtttggtt tagggactaa attttaatcc ctatcacatc 60
gaatgtttga cactaattag aagtactaaa cgtagactaa tgccaaaacc cattccataa 120
ccttggacta atttgcgaga taaatctatt aagcctaatt aatccataat taacatatgt 180
gatgctatag taaacatgtt ctaatcatag attaattagg cttaaaaaat ttgtctcgcg 240
aattagctct tatttaatca attagtttta ttattattct acgttcaata gttctaacta 300
gtgtccaaac atccgaagtg acaaagacta aaatttagtc cttagatcca aacaccacct 360
aagacaggaa tctagatatc tagattcgtt gttctatgat aggccacgtc atatcctaga 420
ttatttcttt ttggaacgga gggagtaagt atactatcga tcataatggc gacgtgacca 480
ataatatacg tgtacaatta ccaactgtgt actccctctg tcctataata taagggattt 540
tttagggagg tctagacagg ctccttatct agattcgtca aactatgatg tgccatatac 600
ttttaaaatc ctttatatta tgtgacgaag ggagtaatac agatttatat gtgtgatatg 660
acatgtagat atcttttgtg ggttctcaaa ccacggtata ctaatatgac tgcgatatgt 720
ttacgtaacc tttatagcga ggtagattta ttttcagata agtggaatcg actttgtaca 780
tagtaaactc taaataatta gtatgtatgc actcatgaaa tcggatcaat gatcttaatt 840
attaagcctt gattttgcat ataacgtgcg cacatgatca attcaagtat cttatctatc 900
tacttcctcc gtttcagatt ataagacgtt ttgactttga tcaaagtcat attgtttcaa 960
gattgactaa gtttatagac aaatatagta atatttataa tactaaatta gttttatcaa 1020
atcaataatt aaatatattt ttataataag tttatcttgg gttgaaaatg ttactacttt 1080
ttttataaac ttggtcaaat ttaaagcagt ttcactacta caggaaagat tttcttggat 1140
accggaccct tttatttcta ggcggactgt aaatggaact gcaaaggaaa tggggcgggg 1200
gggggggggg tacatgcgcc agaccatcgc ccgcatagga aaatcaattt tcgtgtgcgg 1260
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aggcgacgtg cggtggcggg aaggaggcag cccgcgcccc tcggtggcgg gaggcagttg 1680
gacagagtcg gcctgcgtcc ctcggcggtg ttaggtggtg ggacagaggc ggcccgcgcc 1740
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gaggcacctg catgtgaaaa tcacgatttt cccagacccc tgggtgcgag cgggccgacc 2160
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ctttgactaa agtcaaaacg tcttataact gaaatggagg gagtagaaaa caatattttc 2280
cctttagtaa actcatgaaa ccatccggct ttgcaatttc aatagacact aaaatttctg 2340
ttgttgccaa aattttgaaa atttcatgaa tttcgatgtt ttctaaccgg aaatatttta 2400
agttttaaca tatttttgac caaatttaca aatatttaaa aaaattagaa aaattttggg 2460
ggagatttgt gcttgccggt ggagcaaaat ttgttttttt gaacgactcg cacaagacgg 2520
tgcgaagttt tattgataga gcagaaaaaa attacaagat taaccaagaa aaaggaaaaa 2580
atataccacc acccacacac cgacagcgcc aacacatggg tccgggagaa ggctagcacc 2640
ggacaggccg tcactaagcg tgaccaaccg ccactaggcc aacaaaggaa cacagaagag 2700
aacgcccaaa aaacgccctt acaaccaaca caaagcccaa ctccatctag attgtgcttg 2760
caccaatcgt tcgagtggtt tcggcaaggg gatgcctaaa cgacgtctcc aacgagagaa 2820
gcgacggaaa accgtcgcca ccatccgtca gggactcaaa agagccaaga ttgggctttc 2880
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accatcgttg tcggtccagt caagaccaag ctgggttttc acccaccgct catcacctgc 3000
aaatccacgg ctgacgcacc gatgctccac cacagctcaa cctctgccga tgtgtgggac 3060
cactgcaccc cgtccccgcc ggctagcctt cgtgcgccga agaccgcgcc acaccctcaa 3120
tctattatca gtcatatgta tgagagcaac cacggtatat cgaaaggtaa ccttatggca 3180
atgattacat ttataaagtg gaacacatac attgtgagaa atagctttag cttagagtgc 3240
atcttatact taaggtctac cacaagcata aagaaaatat tctctctctc atttatgtca 3300
tgaacaagag ctgaaaagca ggtttttcta tctcataagg gccccatatt attgttaaat 3360
ttcagcaagg gattagctaa aaaactgttg caggtttttt gagtaaaaaa ctttcaaatc 3420
taactatagt acataatttt actagaacta cactataata attatataac ttgtatagat 3480
gtattaaaat aatatatgca actttatatc taatttgata gagataataa tgtagttact 3540
gtaactaggg tataactgga gtataagtaa catgtaactt gctaattttt taaaaaactt 3600
gcaagctggt gggatcgagg tcctgggttc gaaccccatg cagcgcacaa attatgtttc 3660
tcacacggga tttttttcca tgaacgcgcc agcacgaatc ttgagatgaa tctgacggtc 3720
aaaaattcga aagaatttac ccccgttttc tgtcgataga aaactagcaa atccgtttca 3780
gcaatagcat tatgggaatt gctttaacaa caatcaaact attcatgggc cacttctaag 3840
atcacactag acccatatac attgagattg ccctgatata tccatctaat tcatggacat 3900
tttcctagtc ttggggggat ataatataat aggagctaga ggggggcatg ggtagtgaag 3960
tccagccagc gcagaagatc cttgggggga tctggttgca 4000
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for cloning gDNA of OsCMP1 gene
<400> 9
atggggatgg ccaatgagga g 21
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for cloning gDNA of OsCMP1 gene
<400> 10
atctatctga accattgtcc aagctc 26
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer for real-time RT-PCR analysis of OsCMP1 gene
<400> 11
acgagaagca aatccggtac 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer for real-time RT-PCR analysis of OsCMP1 gene
<400> 12
tgatcaggtt ctttggcgaa g 21
<210> 13
<211> 1934
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 13
cagtgcagcg tgacccggtc gtgcccctct ctagagataa tgagcattgc atgtctaagt 60
tataaaaaat taccacatat tttttttgtc acacttgttt gaagtgcagt ttatctatct 120
ttatacatat atttaaactt tactctacga ataatataat ctatagtact acaataatat 180
cagtgtttta gagaatcata taaatgaaca gttagacatg gtctaaagga caattgagta 240
ttttgacaac aggactctac agttttatct ttttagtgtg catgtgttct cctttttttt 300
tgcaaatagc ttcacctata taatacttca tccattttat tagtacatcc atttagggtt 360
tagggttaat ggtttttata gactaatttt tttagtacat ctattttatt ctattttagc 420
ctctaaatta agaaaactaa aactctattt tagttttttt atttaataat ttagatataa 480
aatagaataa aataaagtga ctaaaaatta aacaaatacc ctttaagaaa ttaaaaaaac 540
taaggaaaca tttttcttgt ttcgagtaga taatgccagc ctgttaaacg ccgtcgacga 600
gtctaacgga caccaaccag cgaaccagca gcgtcgcgtc gggccaagcg aagcagacgg 660
cacggcatct ctgtcgctgc ctctggaccc ctctcgagag ttccgctcca ccgttggact 720
tgctccgctg tcggcatcca gaaattgcgt ggcggagcgg cagacgtgag ccggcacggc 780
aggcggcctc ctcctcctct cacggcaccg gcagctacgg gggattcctt tcccaccgct 840
ccttcgcttt cccttcctcg cccgccgtaa taaatagaca ccccctccac accctctttc 900
cccaacctcg tgttgttcgg agcgcacaca cacacaacca gatctccccc aaatccaccc 960
gtcggcacct ccgcttcaag gtacgccgct cgtcctcccc cccccccctc tctaccttct 1020
ctagatcggc gttccggtcc atggttaggg cccggtagtt ctacttctgt tcatgtttgt 1080
gttagatccg tgtttgtgtt agatccgtgc tgctagcgtt cgtacacgga tgcgacctgt 1140
acgtcagaca cgttctgatt gctaacttgc cagtgtttct cttggggaat cctgggatgg 1200
ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt 1260
ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt 1320
ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat 1380
cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt 1440
gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat 1500
aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt 1560
ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata 1620
ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc 1680
ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga 1740
tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa 1800
ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata 1860
tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac 1920
gctatttatt tgct 1934
<210> 14
<211> 4206
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of nuclear localization sequence and Cas9
gene
<400> 14
atggccccta agaagaagag aaaggtcggt attcacggcg ttcctgcggc gatggacaag 60
aagtatagta ttggtctgga cattgggacg aattccgttg gctgggccgt gatcaccgat 120
gagtacaagg tcccttccaa gaagtttaag gttctgggga acaccgatcg gcacagcatc 180
aagaagaatc tcattggagc cctcctgttc gactcaggcg agaccgccga agcaacaagg 240
ctcaagagaa ccgcaaggag acggtataca agaaggaaga ataggatctg ctacctgcag 300
gagattttca gcaacgaaat ggcgaaggtg gacgattcgt tctttcatag attggaggag 360
agtttcctcg tcgaggaaga taagaagcac gagaggcatc ctatctttgg caacattgtc 420
gacgaggttg cctatcacga aaagtacccc acaatctatc atctgcggaa gaagcttgtg 480
gactcgactg ataaggcgga ccttagattg atctacctcg ctctggcaca catgattaag 540
ttcaggggcc attttctgat cgagggggat cttaacccgg acaatagcga tgtggacaag 600
ttgttcatcc agctcgtcca aacctacaat cagctctttg aggaaaaccc aattaatgct 660
tcaggcgtcg acgccaaggc gatcctgtct gcacgccttt caaagtctcg ccggcttgag 720
aacttgatcg ctcaactccc gggcgaaaag aagaacggct tgttcgggaa tctcattgca 780
ctttcgttgg ggctcacacc aaacttcaag agtaattttg atctcgctga ggacgcaaag 840
ctgcagcttt ccaaggacac ttatgacgat gacctggata accttttggc ccaaatcggc 900
gatcagtacg cggacttgtt cctcgccgcg aagaatttgt cggacgcgat cctcctgagt 960
gatattctcc gcgtgaacac cgagattaca aaggccccgc tctcggcgag tatgatcaag 1020
cgctatgacg agcaccatca ggatctgacc cttttgaagg ctttggtccg gcagcaactc 1080
ccagagaagt acaaggaaat cttctttgat caatccaaga acggctacgc tggttatatt 1140
gacggcgggg catcgcagga ggaattctac aagtttatca agccaattct ggagaagatg 1200
gatggcacag aggaactcct ggtgaagctc aatagggagg accttttgcg gaagcaaaga 1260
actttcgata acggcagcat ccctcaccag attcatctcg gggagctgca cgccatcctg 1320
agaaggcagg aagacttcta cccctttctt aaggataacc gggagaagat cgaaaagatt 1380
ctgacgttca gaattccgta ctatgtcgga ccactcgccc ggggtaattc cagatttgcg 1440
tggatgacca gaaagagcga ggaaaccatc acaccttgga acttcgagga agtggtcgat 1500
aagggcgctt ccgcacagag cttcattgag cgcatgacaa attttgacaa gaacctgcct 1560
aatgagaagg tccttcccaa gcattccctc ctgtacgagt atttcactgt ttataacgaa 1620
ctcacgaagg tgaagtatgt gaccgaggga atgcgcaagc ccgccttcct gagcggcgag 1680
caaaagaagg cgatcgtgga ccttttgttt aagaccaatc ggaaggtcac agttaagcag 1740
ctcaaggagg actacttcaa gaagattgaa tgcttcgatt ccgttgagat cagcggcgtg 1800
gaagacaggt ttaacgcgtc actggggact taccacgatc tcctgaagat cattaaggat 1860
aaggacttct tggacaacga ggaaaatgag gatatcctcg aagacattgt cctgactctt 1920
acgttgtttg aggataggga aatgatcgag gaacgcttga agacgtatgc ccatctcttc 1980
gatgacaagg ttatgaagca gctcaagaga agaagataca ccggatgggg aaggctgtcc 2040
cgcaagctta tcaatggcat tagagacaag caatcaggga agacaatcct tgactttttg 2100
aagtctgatg gcttcgcgaa caggaatttt atgcagctga ttcacgatga ctcacttact 2160
ttcaaggagg atatccagaa ggctcaagtg tcgggacaag gtgacagtct gcacgagcat 2220
atcgccaacc ttgcgggatc tcctgcaatc aagaagggta ttctgcagac agtcaaggtt 2280
gtggatgagc ttgtgaaggt catgggacgg cataagcccg agaacatcgt tattgagatg 2340
gccagagaaa atcagaccac acaaaagggt cagaagaact cgagggagcg catgaagcgc 2400
atcgaggaag gcattaagga gctggggagt cagatcctta aggagcaccc ggtggaaaac 2460
acgcagttgc aaaatgagaa gctctatctg tactatctgc aaaatggcag ggatatgtat 2520
gtggaccagg agttggatat taaccgcctc tcggattacg acgtcgatca tatcgttcct 2580
cagtccttcc ttaaggatga cagcattgac aataaggttc tcaccaggtc cgacaagaac 2640
cgcgggaagt ccgataatgt gcccagcgag gaagtcgtta agaagatgaa gaactactgg 2700
aggcaacttt tgaatgccaa gttgatcaca cagaggaagt ttgataacct cactaaggcc 2760
gagcgcggag gtctcagcga actggacaag gcgggcttca ttaagcggca actggttgag 2820
actagacaga tcacgaagca cgtggcgcag attctcgatt cacgcatgaa cacgaagtac 2880
gatgagaatg acaagctgat ccgggaagtg aaggtcatca ccttgaagtc aaagctcgtt 2940
tctgacttca ggaaggattt ccaattttat aaggtgcgcg agatcaacaa ttatcaccat 3000
gctcatgacg catacctcaa cgctgtggtc ggaacagcat tgattaagaa gtacccgaag 3060
ctcgagtccg aattcgtgta cggtgactat aaggtttacg atgtgcgcaa gatgatcgcc 3120
aagtcagagc aggaaattgg caaggccact gcgaagtatt tcttttactc taacattatg 3180
aatttcttta agactgagat cacgctggct aatggcgaaa tccggaagag accacttatt 3240
gagaccaacg gcgagacagg ggaaatcgtg tgggacaagg ggagggattt cgccacagtc 3300
cgcaaggttc tctctatgcc tcaagtgaat attgtcaaga agactgaagt ccagacgggc 3360
gggttctcaa aggaatctat tctgcccaag cggaactcgg ataagcttat cgccagaaag 3420
aaggactggg acccgaagaa gtatggaggt ttcgactcac caacggtggc ttactctgtc 3480
ctggttgtgg caaaggtgga gaagggaaag tcaaagaagc tcaagtctgt caaggagctc 3540
ctgggtatca ccattatgga gaggtccagc ttcgaaaaga atccgatcga ttttctcgag 3600
gcgaagggat ataaggaagt gaagaaggac ctgatcatta agcttccaaa gtacagtctt 3660
ttcgagttgg aaaacggcag gaagcgcatg ttggcttccg caggagagct ccagaagggt 3720
aacgagcttg ctttgccgtc caagtatgtg aacttcctct atctggcatc ccactacgag 3780
aagctcaagg gcagcccaga ggataacgaa cagaagcaac tgtttgtgga gcaacacaag 3840
cattatcttg acgagatcat tgaacagatt tcggagttca gtaagcgcgt catcctcgcc 3900
gacgcgaatt tggataaggt tctctcagcc tacaacaagc accgggacaa gcctatcaga 3960
gagcaggcgg aaaatatcat tcatctcttc accctgacaa accttggggc tcccgctgca 4020
ttcaagtatt ttgacactac gattgatcgg aagagataca cttctacgaa ggaggtgctg 4080
gatgcaaccc ttatccacca atcgattact ggcctctacg agacgcggat cgacttgagt 4140
cagctcgggg gggataagag accagcggca accaagaagg caggacaagc gaagaagaag 4200
aagtag 4206
<210> 15
<211> 367
<212> DNA
<213> Cauliflower mosaic virus
<400> 15
cggtacgctg aaatcaccag tctctctcta caaatctatc tctctctatt ttctccataa 60
ataatgtgtg agtagtttcc cgataaggga aattagggtt cttatagggt ttcgctcatg 120
tgttgagcat ataagaaacc cttagtatgt atttgtattt gtaaaatact tctatcaata 180
aaatttctaa ttcctaaaac caaaatccag tactaaaatc cagatctcct aaagtcccta 240
tagatctttg tcgtgaatat aaaccagaca cgagacgact aaacctggag cccagacgcc 300
gttcgaagct agaagtaccg cttaggcagg aggccgttag ggaaaagatg ctaaggcagg 360
gttggtt 367
<210> 16
<211> 742
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 16
ctcattagcg gtatgcatgt tggtagaagt cggagatgta aataattttc attatataaa 60
aaaggtactt cgagaaaaat aaatgcatac gaattaattc tttttatgtt ttttaaacca 120
agtatataga atttattgat ggttaaaatt tcaaaaatat gacgagagaa aggttaaacg 180
tacggcatat acttctgaac agagagggaa tatggggttt ttgttgctcc caacaattct 240
taagcacgta aaggaaaaaa gcacattatc cacattgtac ttccagagat atgtacagca 300
ttacgtaggt acgttttctt tttcttcccg gagagatgat acaataatca tgtaaaccca 360
gaatttaaaa aatattcttt actataaaaa ttttaattag ggaacgtatt attttttaca 420
tgacaccttt tgagaaagag ggacttgtaa tatgggacaa atgaacaatt tctaagaaat 480
gggcatatga ctctcagtac aatggaccaa attccctcca gtcggcccag caatacaaag 540
ggaaagaaat gagggggccc acaggccacg gcccactttt ctccgtggtg gggagatcca 600
gctagaggtc cggcccacaa gtggcccttg ccccgtggga cggtgggatt gcagagcgcg 660
tgggcggaaa caacagttta gtaccacctc gctcacgcaa cgacgcgacc acttgcttat 720
aagctgctgc gctgaggctc ag 742
<210> 17
<211> 83
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA scaffold
<400> 17
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA1 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 18
tggcgaagcg acctctcact 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA2 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 19
cttgcaagct ggtgggatcg 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA3 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 20
ccacctatgt cgatcctagt 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA4 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 21
agcaaccacg gtatatcgaa 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA5 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 22
ccgatcccct ggcacgcact 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA6 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 23
ggtttcatga gttttactaaa 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA7 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 24
gtggaggtgt gactatcggc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA8 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 25
cgtttcagc aatagcattat 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA9 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 26
ttattgttaa atttcagcaa 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA10 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 27
cggtccagt caagaccaagc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA11 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 28
aaataatttt tctgcgcgga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA12 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 29
caaggatctt ctgcgctggc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA13 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 30
agcacaatct agatggagtt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA14 for target site sequence for OsCMP1
promoter
<400> 31
tgaggagtcg ccaaattatc 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA15 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 32
taagttagct atagcaggtg 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA16 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 33
acagggcaag ttggggatga 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA17 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 34
ctcacgttcg acgtctccct 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA18 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 35
ttaatggacc caggccccta 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA19 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 36
tcgcgtgtgc ttttcgagtt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA20 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 37
gattgccgta gaagttaaaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA21 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 38
gccggccgga tcaggattat 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of gRNA22 for target site sequence for OsCMP1
gene
<400> 39
ttgcgccaac caccgtgttt 20
<210> 40
<211> 90
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 40
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcg tgccagggga tcggcgcccc 60
ggcgccaccg gtgcacgagt tccagttctt 90
<210> 41
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 41
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtcgc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 42
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 42
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagttgc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 43
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 43
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtagc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 44
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 44
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtggc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 45
<211> 86
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 45
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcc aggggatcgg cgccccggcg 60
ccaccggtgc acgagttcca gttctt 86
<210> 46
<211> 88
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 46
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgtg ccaggggatc ggcgccccgg 60
cgccaccggt gcacgagttc cagttctt 88
<210> 47
<211> 79
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 47
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccaggggat cggcgccccg gcgccaccgg 60
tgcacgagtt ccagttctt 79
<210> 48
<211> 85
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 48
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtcca ggggatcggc gccccggcgc 60
caccggtgca cgagttccag ttctt 85
<210> 49
<211> 54
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 49
tgcgtgccag gggatcggcg ccccggcgcc accggtgcac gagttccagt tctt 54
<210> 50
<211> 90
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 50
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcg tgccagggga tcggcgcccc 60
ggcgccaccg gtgcacgagt tccagttctt 90
<210> 51
<211> 90
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 51
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagtgagagg tcgcttcgcc aaagaacctg 60
atcaggaagc tgtcgcaccg ccatccacct 90
<210> 52
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 52
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagttgc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 53
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 53
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 54
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 54
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtagc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 55
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 55
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 56
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 56
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtagc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 57
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 57
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagtagagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 58
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 58
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagttgc gtgccagggg atcggcgccc 60
cggcgccacc ggtgcacgag ttccagttct t 91
<210> 59
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 59
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagtagagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 60
<211> 90
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 60
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcg tgccagggga tcggcgcccc 60
ggcgccaccg gtgcacgagt tccagttctt 90
<210> 61
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 61
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 62
<211> 81
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 62
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgcg tgccagggga tggcgccacc 60
ggtgcacgag ttccagttct t 81
<210> 63
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 63
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 64
<211> 74
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 64
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccg ccaggggatc ggcgcatgcc accggtgcac 60
gagttccagt tctt 74
<210> 65
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 65
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 66
<211> 48
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 66
cgatgatgat ggattcccgg cgccaccggt gcacgagttc cagttctt 48
<210> 67
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 67
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91
<210> 68
<211> 104
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 68
cgatgatgat ggattcccct tcgtcttccc gccgagtgtc aggggatcgg cgcgtgccag 60
gggatcggcg ccccggcgcc accggtgcac gagttccagt tctt 104
<210> 69
<211> 91
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 69
ccagaaaagc ctatgccgag atgaggcccc gagttgagag gtcgcttcgc caaagaacct 60
gatcaggaag ctgtcgcacc gccatccacc t 91

Claims (37)

1.一种分离的开花时间调控多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ IDNO：5的序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：6的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％；或(d)核苷酸序列(a)、(b)或(c)的全长互补序列，其中在植物中，增加所述多核苷酸的表达量延迟植物开花时间，降低所述多核苷酸的表达量促进植物早开花。
2.根据权利要求1所述的分离的开花时间调控多核苷酸，其中所述多核苷酸包括SEQID NO：5或SEQ ID NO：6的核苷酸序列。
3.根据权利要求1的所述分离的开花时间调控多核苷酸，其中，所述分离的多核苷酸编码的多肽包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
4.使用权利要求1-3中任一要求的所述分离的开花时间调控多核苷酸来调控植物的开花时间
5.使用权利要求1-3中任一要求的植物中所述分离的开花时间调控多核苷酸，(a)通过降低多核苷酸的表达和/或机能促进植物开花时间的提早；或(b)通过提高多核苷酸的表达促进植物开花时间的延迟。
6.一种重组DNA构建体，其包含权利要求1-3任一项分离的开花时间调控多核苷酸和与之可操作连接的至少一个异源调控元件。
7.一种具有增加的开花时间调控多核苷酸表达的修饰植物，该植物含有权利要求1中的多核苷酸序列，当与不具有所述增加表达的对照植物在相同条件下比较时，所述植物表现出开花时间的延迟。
8.根据权利要求7中所述的植物，所述植物包含一种重组DNA构建体，其中所述重组DNA构建体包含权利要求1-3任一项中的开花时间调控多核苷酸和与之可操作连接的至少一个调控元件。
9.根据权利要求7所述的植物，该植物包含一个修饰的调控元件从而提高内源多核苷酸的表达，所述内源多核苷酸包括权利要求1所述的多核苷酸序列。
10.一种具有降低的开花时间调控多核苷酸表达的修饰植物，该植物含有权利要求1中的多核苷酸序列，当与对照植物在相同条件下比较时，所述植物表现出开花时间的提早。
11.根据权利要求10所述的植物，该植物包含一个抑制DNA构建体，其中所述抑制DNA构建体包含抑制元件和与之可操作连接的至少一个调控元件。所述抑制元件包括连续的至少100bp的下述序列：(a)一种多核苷酸，其编码的苷酸序列和SEQ ID NO:5或6序列有至少85％的一致性；(b)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO:7序列有至少90％的一致性；或(c)核苷酸序列(a)或(b)的全长互补序列。
12.根据权利要求10所述的植物，该植物在其开花时间调控基因上包含一个突变基因组位点，所述开花时间调控基因包含的权利要求1所述的多核苷酸序列或其启动子，通过向包含有开花时间调控基因及其启动子的基因组区域(a)引入一个DNA片段或删除一个DNA片段或者替换一个DNA片段或(b)引入一个或多个核苷酸变化。
13.根据权利要求12所述的植物，所述植物在开花时间调控基因上包含一个突变的基因组位点，该开花时间调控基因具有权利要求1所述的核苷酸序列。和对照植物相比较，该植物中开花时间调控基因的功能是降低的。
14.根据权利要求13所述的植物，所述植物在开花时间调控基因上包含一个突变的启动子，该开花时间调控基因具有权利要求1所述的核苷酸序列。和对照植物相比较，该植物中开花时间调控基因的表达是下降的。
15.根据权利要求7-14中任一项所述的植物，所述的植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。
16.包含有一个修饰基因组位点的水稻植株，其内源多核苷酸编码的多肽的表达量发生了改变，所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:7序列的一致性至少为90％。当所述水稻植株内源多核苷酸的功能降低时，其开花所需的时间也减少了；当所述水稻植株内源多核苷酸的表达量增加时，其开花所需的时间也增加了。
17.根据权利要求16所述的水稻植物，其中所述修饰的基因组位点在其内源多核苷酸的调控区域包含一个突变，所述内源多核苷酸编码多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:7序列的一致性至少为90％。所述突变能够降低该内源多核苷酸的表达。
18.根据权利要求16所述的水稻植株，其中所述修饰的基因组位点在其内源多核苷酸的基因区域包含一个突变，所述内源多核苷酸编码多肽的核苷酸序列与SEQ ID NO:7序列的一致性至少为90％。所述突变能够降低内源多核苷酸的功能。
19.根据权利要求18所述的植物，其中所述的修饰基因组位点的内源多核苷酸包含一个核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:5或6的一致性至少为95％。
20.根据权利要求19所述的水稻植株，其中所述修饰的基因组位点包含一个含有SEQID NO:41-49中任一核苷酸序列的突变。
21.根据权利要求19所述的水稻植株，其中，所述修饰的基因组位点包括两个突变，其核苷酸序列为SEQ ID NO:52和53、SEQ ID NO:54和55、SEQ ID NO:56和57、SEQ ID NO:58和59、SEQ ID NO:60和61、SEQ ID NO:62和63、SEQ ID NO:64和65、SEQ ID NO:66和67或SEQID NO:68和69。
22.一种调控水稻植株开花时间的方法，其包括改变水稻植株中权利要求1所述的多核苷酸的表达量。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸包括：(a)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ ID NO：5序列一致性至少为85％；(b)一种多核苷酸，其核苷酸序列与SEQ IDNO：6的序列一致性至少为85％；(c)一种多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：7的序列一致性至少为90％。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸的表达量或功能通过下述的一个步骤改变：
(a)通过重组DNA构建体增加植物中权利要求1所述多核苷酸序列的多核苷酸的表达量，其中所述重组DNA构建体包含一个权利要求1所述多核苷酸序列的多核苷酸和与其可操作连接的至少一个调控元件；
(b)通过一个CRISPR-Cas增加植物中包含有权利要求1所述的多核苷酸序列的多核苷酸的表达，其中所述CRISPR-Cas构建体是针对核苷酸序列SEQ ID NO:8；
(c)降低一个内源多核苷酸编码的多肽的功能，所述多肽的氨基酸序列和SEQ ID NO:7的一致性至少为90％；以及
(d)通过抑制DNA构建体降低植物中含有权利要求1所述多核苷酸序列的多核苷酸的表达量，其中抑制DNA构建体包含一个沉默元件用于下调所述内源多核苷酸的表达，所述内源多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：7的序列一致性至少为90％。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，与对照植物相比，增加水稻植株中所述多核苷酸的表达量延长开花时间，所述对照植物没有所述增加的表达量。
26.根据权利要求24所述的方法，其中，与对照植物相比，降低水稻植株中所述多核苷酸的表达量促进早开花，所述对照植物没有所述降低的表达量。
27.根据权利要求24所述的方法，其中，与对照植物相比，减少所述植物中所述多核苷酸的功能能够促进开花时间的提前。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，通过使用一个含有至少一个SEQ ID NOs：18-39核苷酸序列的sgRNA靶向SEQ ID NO:5或6的核苷酸序列来降低多核苷酸的功能。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述sgRNA是SEQ ID NO:22的核苷酸序列。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述sgRNA是SEQ ID NO:22和18的核苷酸序列。
31.一种制备植物的方法，为与对照植物的野生型开花时间调控多肽的表达水平或活性相比，增加/降低植物中含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的内源开花时间调控多肽的表达水平或活性；所述方法包括以下步骤：在内源开花时间调控基因或其启动子所在的基因组区域(i)引入一段能够增加/降低开花时间调控多核苷酸的表达量的DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述改变能有效增加/降低内源开花时间调控多肽的表达水平或活性。
32.一种制备植物的方法，当与对照植物的野生型开花时间调控多肽表达水平或活性相比，能够降低植物中含有SEQ ID NO:7氨基酸序列的内源开花时间调控多肽表达水平或活性方法；所述方法包括以下步骤：在内源开花时间调控基因所在的基因组区域(i)引入一段DNA片段、删除一段DNA片段或替换一段DNA片段，或(ii)引入一个或多个核苷酸改变，其中所述修饰能有效降低内源开花时间调控多肽的表达水平或活性。,
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述改变通过锌指核酸酶、转录激活样效应因子核酸酶(TALENs)、CRISPR-Cas、引导Cas核酸内切酶、归巢核酸内切酶(Meganucleases)或CRISPR-Cas核糖核蛋白复合体引入。
34.从水稻植株群体中鉴定较晚开花时间相关的一个或多个等位基因的方法，该方法包括如下的步骤：
(a)检测一个水稻植株群体中(i)编码多肽的基因组区域，或(ii)控制多肽表达的调控区域中的一个或多个多态性，其中，所述多肽选自SEQ ID NO：7的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：7一致性为90％以上的氨基酸序列，其中编码所述多肽的基因组区域或调控所述多肽表达的调控区域的一个或多个多态性与晚开花相关；和
(b)鉴定较晚开花时间相关的一个或多个多态性的一个或多个等位基因。
35.根据权利要求34所述的方法，其中较晚开花时间相关的一个或多个等位基因可用作辅助选择较晚开花时间水稻植株的筛选标记。
36.根据权利要求34所述的方法，其中一个或多个多态性位于多聚核苷酸的编码区。
37.根据权利要求34所述的方法，其中调控区域是一个启动子。
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