CN113402594A

CN113402594A - 一种调控玉米苞叶的蛋白质及其相关生物材料与应用

Info

Publication number: CN113402594A
Application number: CN202110768471.7A
Authority: CN
Inventors: 贺岩; 王琪; 夏嫒嫒; 崔震海; 王淄
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-07-07
Filing date: 2021-07-07
Publication date: 2021-09-17

Abstract

本发明公开了一种调控玉米苞叶的蛋白质及其相关生物材料与应用。本发明公开的调控玉米苞叶的蛋白质为氨基酸序列是序列3的PCD2C蛋白质。本发明采用CRISPR‑Cas9基因敲除方法，获得了一个玉米PCD2C基因的缺失突变体(crispr‑pcd2c)，该突变体中PCD2C基因缺失244个核苷酸，引起了蛋白编码错义突变。对crispr‑pcd2c突变体及野生型进行苞叶宽度的表型统计，发现与野生型相比，crispr‑pcd2c突变体降低了16.58％的玉米苞叶宽度，而植株其他方面表型没有任何显著变化。说明，PCD2C及其编码基因可以用于调控玉米苞叶的生长。

Description

一种调控玉米苞叶的蛋白质及其相关生物材料与应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域中，一种调控玉米苞叶的蛋白质及其相关生物材料与应用。

背景技术

玉米机收籽粒是种植模式的一次大变革，是实现玉米大面积高产高效生产的关键措施和发展趋势。然而，目前我国推广的玉米品种普遍存在着籽粒脱水速度过慢、收获期含水量过高的问题，严重制约了玉米联合机收的产业化进程。影响玉米成熟期含水量的因素包括品种熟期、果穗苞叶性状和籽粒灌浆后期自身脱水速率；其中，苞叶性状本身即直接影响果穗脱水，且间接影响籽粒水分的散失，是玉米高产、宜机收育种需优先解决的关键性状。

玉米苞叶是着生在穗柄节上由叶鞘转化成的变态叶，是果穗营养贮存器官，也是玉米植株上果穗的保护器官，为果穗提供良好的发育环境。第一，苞叶通过包裹果穗维持了籽粒发育所需的适宜温度[1]。尤其在玉米生育后期，收获可能遇到冻害的情况下，苞叶可以防止热量的散失，有效地降低降温引起的冻害率[2]。第二，苞叶可以降低逆境环境引起的水分亏缺从而带来的玉米生殖抑制[3]。第三，合理的苞叶覆盖和紧密程度可以有效地降低或消除黄曲霉素的污染[4]。第四，玉米收获时，较长和紧密的苞叶可以阻止病害虫进入到果穗内部，从而有利于降低或阻止病虫害的发生[5，6]。

玉米果穗属于变态的侧茎，而果穗柄为缩短的茎秆，苞叶就是穗柄节上着生的由叶鞘转化成的变态叶。穗柄有节与缩短的节间分化，每一节有苞叶原基，最终发育为雌穗的苞叶。因此，苞叶的数量与穗柄的节数一致。当苞叶尖从穗部叶鞘伸出后，苞叶面积迅速增大，这一过程持续到吐丝期，且叶色转绿、质地坚韧、紧包花序。果穗与主茎相似，但全部节间都很短，而最上节最短，其它各节逐渐增长，最先长出的是最基部节上的叶，其它各叶构成“果穗苞”，包围和保护“顶生果穗”[7]。这样，果穗节间长度与苞叶的紧实度密切相关。苞叶伸展过程中，叶面积的膨大与苞叶伸长时间和伸展效率有关，与细胞液及细胞壁组成也有一定关系[8]。

玉米苞叶各表型性状的遗传规律，将决定其选育改良的方向。近几年，受高温旱害的影响，辽宁、黑龙江、山西，山东等多地玉米出现“玉米露顶”现象，玉米雌穗苞叶比穗轴窄，使籽粒裸露在外面，影响灌浆，导致减产；此外，苞叶窄容易招虫害，如双斑萤叶甲虫咬食花丝、金龟子咬食籽粒，也会造成减产。因此，合适的玉米苞叶宽度对玉米的产量提升也具有重要作用。

适合玉米联合机收品种的基本要求是：生育期较短，后期抗倒伏能力强；更重要的，成熟期籽粒含水量要低，脱水速率快。先期研究表明，玉米苞叶形态结构特征是影响玉米果穗后期脱水速率的最直接因素。Zuber等(1950)提出苞叶宽度是影响玉米籽粒脱水速率的重要因素(Zuber MS.Eeffect of the Y-y factor pair on yield and otheragronomic characters in corn.Ph.D.diss.Iowa state college ames,1950,50(01-0245).)。苞叶总长与苞叶总宽是影响苞叶面积的决定性因素，其中苞叶总宽与苞叶总面积的相关性明显大于苞叶总长与苞叶面积的相关性(何丹，王秀全，刘昌明等，玉米苞叶几个农艺性状的相关关系及其遗传研究，玉米科学，2001，9(1)：43-45)。而脱水速率与苞叶覆盖程度呈负相关(Cross HZ,Kabir KM.Evaluation of field dry-down rates in earlymaize.Crop Science,1989,29(1):54-58.)，闫淑琴等(2007)对9份玉米自交系及所配杂交组合进行测定，结果表明：苞叶脱水速率、穗轴脱水速率与籽粒脱水速率正相关；苞叶数目多，面积大，含水量高，则籽粒脱水速率慢(闫淑琴,苏俊,李春霞等.玉米籽粒灌浆、脱水速率的相关与通径分析.黑龙江农业科学,2007,(4):1-4.)。由此可见，玉米苞叶宽度是影响玉米收获期脱水的重要性状。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控玉米苞叶的生长，尤其是如何调控玉米苞叶宽度。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了玉米苞叶相关蛋白或调控所述玉米苞叶相关蛋白含量或活性的物质在调控玉米苞叶生长中的应用，所述玉米苞叶相关蛋白(其名称为PCD2C)为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；

A2)将序列表中序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

上述A2)中的蛋白质，为与序列3所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列3所示的PCD2C。

上述应用中，所述物质可为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码PCD2C的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；

B8)降低PCD2C含量或活性的核酸分子；

B9)含有B8)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)-b15)中的任一种：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列3所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PCD2C的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码PCD2C的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PCD2C蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PCD2C蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PCD2C蛋白质且具有PCD2C蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码PCD2C蛋白质的核酸分子的表达盒(PCD2C基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PCD2C蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动PCD2C基因转录的启动子，还可包括终止PCD2C基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述PCD2C基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

B8)所述核酸分子可为crisper/cas9系统的可以降低PCD2C含量的sgRNA或其编码基因。所述sgRNA的靶序列可为序列1的第62-80位和/或第303-321位。

B8)所述核酸分子具体可为序列表中序列5的第439-533位和/或第1350-1444位所示的DNA片段或其编码的sgRNA。

B9)所述重组载体可为利用crispr/cas9系统制备的可以降低PCD2C含量的重组载体。所述重组载体可为含有序列表中序列5的第439-533位和第1350-1444位所示的两条DNA片段中的一条或两条的载体。在本发明的一个实施例中，B9)所述重组载体为pBUE411-PCD2C。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌EHA105。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

PCD2C或所述调控PCD2C含量或活性的物质在调控玉米苞叶宽度中的应用，也属于本发明的保护范围。

上文中，所述调控玉米苞叶可为抑制玉米苞叶生长。所述调控玉米苞叶宽度可为降低玉米苞叶宽度。

PCD2C或所述调控PCD2C含量或活性的物质在培育苞叶宽度降低玉米中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了下述X1或X2的方法：

X1、降低玉米苞叶宽度的方法，包括：降低受体玉米中PCD2C的含量，或降低受体玉米中PCD2C的活性，或抑制受体玉米中PCD2C编码基因的表达，或敲除受体玉米中PCD2C编码基因，得到与所述受体玉米相比苞叶宽度降低的目的玉米，实现玉米苞叶宽度的降低；

X2、培育苞叶宽度降低玉米的方法，包括：降低受体玉米中PCD2C的含量，或降低受体玉米中PCD2C的活性，或抑制受体玉米中PCD2C编码基因的表达，或敲除受体玉米中PCD2C编码基因，得到与所述受体玉米相比苞叶宽度降低的目的玉米。

上述方法中，敲除受体玉米中PCD2C编码基因可通过CRISPR/Cas9方法完成。

其中，CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列可为序列1的第62-80位和/或第303-321位。

具体的，敲除受体玉米中PCD2C编码基因可通过将上述B8)所述核酸分子或B9)所述重组载体导入受体玉米中并通过筛选完成。

所述重组载体可通过使用Ti质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for Plant MolecularBiology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,PlantMolecular Biology(2nd Edition).)或转化受体玉米。

所述目的玉米理解为不仅包含PCD2C蛋白或其编码基因被改变的第一代玉米，也包括其子代。对于所述目的玉米，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

在本发明的一个实施例中，所述受体玉米为玉米B104。

PCD2C，也属于本发明的保护范围。

所述调控PCD2C含量或活性的物质，也属于本发明的保护范围。

发明人通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，结合玉米基因遗传转化方法，创制了一个玉米PCD2C基因的缺失突变体(crispr-pcd2c)，突变位点位于第一个外显子蛋白编码起始密码子ATG下游65bp-308bp处，是由244个核苷酸(序列1的第65-308位)的缺失引起的蛋白编码错义突变。对该基因的crispr-pcd2c突变体及野生型进行苞叶宽度的表型统计，发现与野生型相比，crispr-pcd2c突变体降低了16.58％的玉米苞叶宽度，而植株其他方面表型没有任何显著变化。说明，PCD2C及其编码基因可以用于调控玉米苞叶的生长。

附图说明

图1为电泳结果。泳道Marker为DNA Marker产品为GenStar的Direct-loadStarMarker D2000 Plus；泳道CK为没有转入载体的野生型对照玉米B104；泳道1-15为15株T₀代转基因玉米植株，泳道5、11的玉米和野生型相同，是未转基因成功的单株，泳道1-4、6-10、12-15均为阳性转基因单株。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

实施例1、

本发明发现了一个来源于玉米B73的调控玉米苞叶基因，其名称为PCD2C基因，该基因在B73中的基因组序列为序列表中序列1，CDS序列为序列2，编码序列3所示的PCD2C蛋白质。序列1中，第1-93位、第294-377位、第626-717位、第818-1113位、第1191-1419位、第1544-1748位、第2283-2378位为外显子序列。

PCD2C基因位于10号染色体上，全长3049bp，共有7个外显子，编码364个氨基酸。在玉米B73基因组公共数据库中(www.maizeGDB.org)，应用BLASTP程序进行序列检索，PCD2C基因从其全长考虑，在B73基因组上只包含一个拷贝，没有其它相似基因。

发明人通过CRISPR-Cas9基因敲除技术，结合玉米基因遗传转化方法，创制了一个玉米PCD2C基因的缺失突变体(crispr-pcd2c)，突变位点位于第一个外显子蛋白编码起始密码子ATG下游65bp处，是由244个核苷酸的缺失引起的蛋白编码错义突变。对该基因的crispr-pcd2c突变体及野生型进行苞叶宽度的表型统计，发现与野生型相比，crispr-pcd2c突变体降低了16.58％的玉米苞叶宽度，而植株其他方面表型没有任何显著变化。具体实验步骤如下：

1)sgRNA序列的选择

在玉米PCD2C基因上设计两个靶位点序列，长度分别均为19bp。

靶位点1位于PCD2C基因序列(Exon1)的第62-80位，靶位点1序列如下：ACCACTACACCACTAAGAT。

靶位点2位于PCD2C基因序列(Exon2)的第303-321位，靶位点2序列如下：ACTGGTGATATGGGCTTCA。

sgRNA骨架序列如下：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC；

sgRNA骨架的编码DNA序列如下：GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC。

2)CRISPR/Cas9载体的构建

制备含有靶序列的DNA片段MT1T2，MT1T2的序列如序列4所示。

将MT1T2经限制性内切酶BsaI-HF(NEB)酶切得到的线性载体与pBUE411载体(pBUE411载体记载于“Xing,H.L.,Dong,L.,Wang,Z.P.,Zhang,H.Y.,Han,C.Y.,Liu,B.,Wang,X.C.,and Chen,Q.J.(2014).A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genomeediting in plants.BMC plant biology 14,327.”文献中，公众可从中国农业大学处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用)经BsaI-HF酶切得到的线性载体相连，得到的序列正确重组载体即为CRISPR/Cas9载体，将该重组载体记为pBUE411-PCD2C。

pBUE411-PCD2C的部分序列(连有双靶位点以及MT1T2序列的部分)如序列5所示，序列5的第439-457位为靶点1的序列，第1350-1368位为靶点2的序列，第458-533位和第1369-1444位为sgRNA骨架的编码DNA序列。

3)转基因玉米植株的获得

将步骤2)所得pBUE411-PCD2C通过液氮冷冻法转至农杆菌感受态细胞EHA105(北京奥森鼎信生物技术有限公司)，得到重组菌EHA105/pBUE411-PCD2C。将重组菌EHA105/pBUE411-PCD2C在28℃条件下扩繁，扩繁得到的菌液采用农杆菌侵染法侵染玉米B104幼胚，经过筛选、分化和生根后，获得T0代转基因玉米植株。具体方法参考如下文献：魏晓禹，邵诗迪，孙苏等，农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化体系的建立，吉林农业大学学报，2017(06)640-647；黄璐，卫志明，农杆菌介导的玉米遗传转化[J]，实验生物学报，1999(04)。

其中，玉米B104记载于“Char,S.N.,Neelakandan,A.K.,Nahampun,H.,Frame,B.,Main,M.,Spalding,M.H.,Becraft,P.W.,Meyers,B.C.,Walbot,V.,Wang,K.,Yang,B.(2016).An Agrobacterium-delivered CRISPR/Cas9 system for high-frequencytargeted mutagenesis in maize.Plant biotechnology journal,15(2),257-268.”文献中。

4)转基因玉米植株的鉴定

采集T0代转基因玉米植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，用左引物crispr-pcd2c-F和右引物crispr-pcd2c-R引物进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。引物序列如下：

左引物crispr-pcd2c-F：TGGCTGAGCCTTCCCTTTGC；

右引物crispr-pcd2c-R：TGCCATCACGGATCTGTTCG。

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。

将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，并将测序结果与野生型玉米B104的PCD2C基因进行比对，鉴定T0代转基因玉米不同株系中PCD2C基因是否发生突变。

由于玉米是二倍体植株，当Cas9发挥作用开始剪切特定的基因时，同一个细胞内的两条同源染色体上的两个等位基因都有可能被编辑，产生同样类型或不同类型的突变，所以将一个植株中两个等位基因看成是两个基因编辑事件。纯合突变株指的是该植株的两条同源染色体的PCD2C基因发生了相同的突变。双等位基因突变株指的是该植株的两条同源染色体的PCD2C基因均发生了突变但突变形式不同。杂合突变株指的是该植株的两条同源染色体中的一条同源染色体的PCD2C基因发生了突变、另一条同源染色体的PCD2C基因未发生突变。野生型指的是该植株的两条同源染色体中的PCD2C基因均未发生突变。将纯合突变和双等位基因突变记为突变体。

鉴定结果表明：15株T₀代转基因玉米植株中，共检测T₀代阳性转基因玉米植株13株，其中纯合突变株数4株。PCD2C基因发生突变的植株即为阳性T₀代转基因玉米，并将PCD2C基因发生缺失突变的植株记作PCD2C基因的缺失突变体(crispr-pcd2c)。

其中，一株PCD2C基因的缺失突变体(crispr-pcd2c)的突变位点位于第一个外显子蛋白编码起始密码子ATG下游65bp处，是由244个核苷酸的缺失引起的蛋白编码错义突变，具体缺失片段为序列1的第65-308位所示的DNA片段，该缺失突变体(crispr-pcd2c)为纯合突变株。

和野生型玉米B104相比，缺失突变体(crispr-pcd2c)是将野生型玉米B104基因组中的PCD2C基因序列第481-802位缺失，且保持其他序列不变后得到的。缺失序列如下：

ACTACACCACTAAGATCGGTGGAGTCCCTGTATGTGTTTCCTGTGTAGCTCTTCCTGGTTCTAGCTTATGTCATGCACGTTATTCAGTTAACCCACCCATGATTATACATTTTACTCGATGACTCTTCTCGGAGGTCAGAGATTTTTCTGAGGGATCATAAGCAATGGGGCATCAGTAGTTGAAGGCCGAGCTCTTTTTGAGTCGTTTGCTGTTTTTTTTATTATGTAGGATTGGCCAACTGGT。

5)crispr-pcd2c突变体的表型分析

对缺失突变体(crispr-pcd2c)及野生型(玉米B104)的苞叶宽度进行测量，实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：在玉米籽粒完全成熟后，收获前的同一时间，田间调查苞叶长度和宽度，选取玉米果穗从外向内数第三片苞叶，用软绳尺测定苞叶长度(此处的苞叶长度是指苞叶基部到苞叶顶部的长度，不包括最顶端部分的旗叶)和宽度(宽度是指苞叶长度一半位置的苞叶完全展开宽度)。每次测量待测玉米的株数为50株，测量结果取平均值。

结果表明：缺失突变体(crispr-pcd2c)由外向内第3片苞叶宽度为8.45±0.01cm，玉米B104由外向内第3片苞叶宽度为10.13±0.01cm，二者间具有显著差异，缺失突变体(crispr-pcd2c)的玉米苞叶宽度降低了16.58％；缺失突变体(crispr-pcd2c)由外向内第3片苞叶长度为22.00±0.01cm，玉米B104由外向内第3片苞叶长度为22.81±0.01cm，突变体与B104相比没有显著差异。另外，且植株缺失突变体(crispr-pcd2c)与玉米B104在株高、穗上叶宽叶长、叶鞘宽叶鞘长、苞叶数量上均没有任何显著变化。

转基因敲除突变体表型统计结果表明PCD2C可以调控玉米苞叶宽度的建成。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

参考文献：

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【9】Cui Z,Luo J,Qi C,et al.Genome-wide association study(GWAS)revealsthe genetic architecture of four husk traits in maize.BMC genomics,2016,17(1):946。

<110> 中国农业大学

<120> 一种调控玉米苞叶的蛋白质及其相关生物材料与应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2633

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 1

atggcggagg tgcatctagg tctgccaggt ccctgggcgg cggattacag ggagatggcc 60

gaccactaca ccactaagat cggtggagtc cctgtatgtg tttcctgtgt agctcttcct 120

ggttctagct tatgtcatgc acgttattca gttaacccac ccatgattat acattttact 180

cgatgactct tctcggaggt cagagatttt tctgagggat cataagcaat ggggcatcag 240

tagttgaagg ccgagctctt tttgagtcgt ttgctgtttt ttttattatg taggattggc 300

caactggtga tatgggcttc aagcccgaga ctcttcagtg cagcttatgt gggaccaagc 360

tttgtcttgt tgctcaggta aatgtcttcg tgtcgttgat taagcaagaa tttactagtt 420

gaaaaacatc tttatggtca gtcatgtaag gaaacggagt gttgcagtgc ttgggcacag 480

gcttgtaaag ttacaagctt gcagttctct gacttagcat tacgaactat gtttacgaac 540

agatccgtga tggcacaaaa cgcttgtatg ttgatgaatc aatgtcgttc cttgtaaaaa 600

aaaactaatg tggttcggac ttaaggtaca tgcgcctgtg gcaaagctaa acattgagga 660

gaggataatc tatgtgcttg tttgcccgac accagaatgt ggacctaaac ctcaaaggca 720

agtatatgcc aattgattca atctttttat tagatatcca gacattttta catgatttta 780

agtcagtacc tttttgttcc tttttcttct tatatagttg gaaggttcta agagttcaaa 840

aatgccataa tgttatgcaa acagaaggtg gtggtgatga attaggtcaa ccgaatggac 900

cttcttctac aagtcttcca gaagaacaga atgataaaaa taaaattcct gagacaaatg 960

atgacgattt tgatctagat gccttagccg aagcacttga acaagctgca actttggcat 1020

caaactcaaa gaagaagaac aaatcgaagc atgctaatgc tcctgtaaaa cgtcctgtat 1080

tgaaggagca agcatgtgat ctgagcatac ctggtgagga caactttgaa acaactcgtt 1140

accatgtatg caaaacccga gtgttttgat ctgataaaat tttgttgcag tccttccttg 1200

tttttacata cattataata aggaactata tgggggcaaa ggcgctgtgg gttcaagtag 1260

cagtgagttg gttttggaca aagaaatcat ggatgccgca aatgacgaag aagaaaaatg 1320

ggaaggagaa aagtatgagt acgatagagc tattggtgct gacagaactt ttttaaaatt 1380

caagaaacgg ctggatgcat atccccagca atgctttagg tagctaaaca tttagtttac 1440

atagtatcat tgcaacctga cttggtattt gcaaaccatt tgtttcttgt cccttttggt 1500

ttgcacagcc tgaattaaat tttggcttgc aatatttctt taggtattct tatggtggca 1560

agccactgtt ggctacaaca aaattacaag atcctggcac ctgtaggctg tgtggttcac 1620

cacgccagta tgaactgcaa ttgatgtctc ctttatcata ctttctccat gaagctggag 1680

acggttcctc aaattatgca cccagcagct ggacttggct gactgttata atatacacct 1740

gccccaaggt atgtcttttc ttcaatttcc tgatacggta gtgtaagaaa ttccgagtgc 1800

ccgaaacatt attcctggat agtagttcat ttgaaaaacc atttgatcta caaagtacac 1860

catgaagaac agtataccat caaagcatca cttgagcttt gtttggtgaa gagatttctg 1920

cgtccttgat gttctcaatg tacttcagaa ttcctagcag acaaggatgc taggttgtct 1980

gaaacatcta ccaggattta atccagtcta caaagtagac ttccaatggc actattttct 2040

tagacaaaca aatttctggt ctgtgggttt cgccagattc catcttgtcc cttgggaact 2100

ttgttagtta tccttgtcac ggcaatcttg aaagctcagt gggctgctac atgcacgtag 2160

ttgtcattgt ttaatatttc ttcttcctgg taccggggtg aaaccagaca ttgttcattg 2220

tgttcttttg tttacagttc tcctctctgc actattcctt agcctgtatc aatttactgc 2280

agagctgctg cccgtcctca tgcggtggaa agccccagag ctgttgttgg ggagcagcgg 2340

aggaggagat cctgattcag gaggatgaag tcctttagga tctaaccagt gctggttgag 2400

aaactattcc cgatttgaac atgtaatatg cagttttttt ttgttctcca atggttagag 2460

ttgtaaagct atctgaaatt ttgaagtgtg ttttgttatt gtgccctggt atactgcaga 2520

actgtcatac ttcacacagt atcatatcag actagtaaga tttttttttc tttgtggctg 2580

ttgttttccg ctgcaaaatc atttttttct aggtgcctgg attgtcaact cca 2633

<210> 2

<211> 1095

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 2

atggcggagg tgcatctagg tctgccaggt ccctgggcgg cggattacag ggagatggcc 60

gaccactaca ccactaagat cggtggagtc cctgattggc caactggtga tatgggcttc 120

aagcccgaga ctcttcagtg cagcttatgt gggaccaagc tttgtcttgt tgctcaggta 180

catgcgcctg tggcaaagct aaacattgag gagaggataa tctatgtgct tgtttgcccg 240

acaccagaat gtggacctaa acctcaaagt tggaaggttc taagagttca aaaatgccat 300

aatgttatgc aaacagaagg tggtggtgat gaattaggtc aaccgaatgg accttcttct 360

acaagtcttc cagaagaaca gaatgataaa aataaaattc ctgagacaaa tgatgacgat 420

tttgatctag atgccttagc cgaagcactt gaacaagctg caactttggc atcaaactca 480

aagaagaaga acaaatcgaa gcatgctaat gctcctgtaa aacgtcctgt attgaaggag 540

caagcatgtg atctgagcat acctgtcctt ccttgttttt acatacatta taataaggaa 600

ctatatgggg gcaaaggcgc tgtgggttca agtagcagtg agttggtttt ggacaaagaa 660

atcatggatg ccgcaaatga cgaagaagaa aaatgggaag gagaaaagta tgagtacgat 720

agagctattg gtgctgacag aactttttta aaattcaaga aacggctgga tgcatatccc 780

cagcaatgct ttaggtattc ttatggtggc aagccactgt tggctacaac aaaattacaa 840

gatcctggca cctgtaggct gtgtggttca ccacgccagt atgaactgca attgatgtct 900

cctttatcat actttctcca tgaagctgga gacggttcct caaattatgc acccagcagc 960

tggacttggc tgactgttat aatatacacc tgccccaaga gctgctgccc gtcctcatgc 1020

ggtggaaagc cccagagctg ttgttgggga gcagcggagg aggagatcct gattcaggag 1080

gatgaagtcc tttag 1095

<210> 3

<211> 364

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays L.）

<400> 3

Met Ala Glu Val His Leu Gly Leu Pro Gly Pro Trp Ala Ala Asp Tyr

1 5 10 15

Arg Glu Met Ala Asp His Tyr Thr Thr Lys Ile Gly Gly Val Pro Asp

20 25 30

Trp Pro Thr Gly Asp Met Gly Phe Lys Pro Glu Thr Leu Gln Cys Ser

35 40 45

Leu Cys Gly Thr Lys Leu Cys Leu Val Ala Gln Val His Ala Pro Val

50 55 60

Ala Lys Leu Asn Ile Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Val Leu Val Cys Pro

65 70 75 80

Thr Pro Glu Cys Gly Pro Lys Pro Gln Ser Trp Lys Val Leu Arg Val

85 90 95

Gln Lys Cys His Asn Val Met Gln Thr Glu Gly Gly Gly Asp Glu Leu

100 105 110

Gly Gln Pro Asn Gly Pro Ser Ser Thr Ser Leu Pro Glu Glu Gln Asn

115 120 125

Asp Lys Asn Lys Ile Pro Glu Thr Asn Asp Asp Asp Phe Asp Leu Asp

130 135 140

Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Gln Ala Ala Thr Leu Ala Ser Asn Ser

145 150 155 160

Lys Lys Lys Asn Lys Ser Lys His Ala Asn Ala Pro Val Lys Arg Pro

165 170 175

Val Leu Lys Glu Gln Ala Cys Asp Leu Ser Ile Pro Val Leu Pro Cys

180 185 190

Phe Tyr Ile His Tyr Asn Lys Glu Leu Tyr Gly Gly Lys Gly Ala Val

195 200 205

Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Val Leu Asp Lys Glu Ile Met Asp Ala

210 215 220

Ala Asn Asp Glu Glu Glu Lys Trp Glu Gly Glu Lys Tyr Glu Tyr Asp

225 230 235 240

Arg Ala Ile Gly Ala Asp Arg Thr Phe Leu Lys Phe Lys Lys Arg Leu

245 250 255

Asp Ala Tyr Pro Gln Gln Cys Phe Arg Tyr Ser Tyr Gly Gly Lys Pro

260 265 270

Leu Leu Ala Thr Thr Lys Leu Gln Asp Pro Gly Thr Cys Arg Leu Cys

275 280 285

Gly Ser Pro Arg Gln Tyr Glu Leu Gln Leu Met Ser Pro Leu Ser Tyr

290 295 300

Phe Leu His Glu Ala Gly Asp Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Pro Ser Ser

305 310 315 320

Trp Thr Trp Leu Thr Val Ile Ile Tyr Thr Cys Pro Lys Ser Cys Cys

325 330 335

Pro Ser Ser Cys Gly Gly Lys Pro Gln Ser Cys Cys Trp Gly Ala Ala

340 345 350

Glu Glu Glu Ile Leu Ile Gln Glu Asp Glu Val Leu

355 360

<210> 4

<211> 964

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 4

atatatggtc tctggcgatc ttagtggtgt agtggtgttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

ttcgttttgc attgagtttt ctccgtcgca tgtttgcagt tttattttcc gttttgcatt 180

gaaatttctc cgtctcatgt ttgcagcgtg ttcaaaaagt acgcagctgt atttcactta 240

tttacggcgc cacattttca tgccgtttgt gccaactatc ccgagctagt gaatacagct 300

tggcttcaca caacactggt gacccgctga cctgctcgta cctcgtaccg tcgtacggca 360

cagcatttgg aattaaaggg tgtgatcgat actgcttgct gctcatgaat ccaaaccaca 420

cggagttcaa attcccacag attaaggctc gtccgtcgca caaggtaatg tgtgaatatt 480

atatctgtcg tgcaaaattg cctggcctgc acaattgctg ttatagttgg cggcagggag 540

agttttaaca ttgactagcg tgctgataat ttgtgagaaa taataattga caagtagata 600

ctgacatttg agaagagctt ctgaactgtt attagtaaca aaaatggaaa gctgatgcac 660

ggaaaaagga aagaaaaagc catacttttt tttaggtagg aaaagaaaaa gccatacgag 720

actgatgtct ctcagatggg ccgggatctg tctatctagc aggcagcagc ccaccaacct 780

cacgggccag caattacgag tccttctaaa agctcccgcc gaggggcgct ggcgctgctg 840

tgcagcagca cgtctaacat tagtcccacc tcgccagttt acagggagca gaaccagctt 900

ataagcggag gcgcggcacc aagaagcgtg aagcccatat caccagtgtt tagagaccaa 960

taat 964

<210> 5

<211> 1735

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 5

agtaattcat ccaggtctcc aagttctagg attttcagaa ctgcaactta ttttatcaag 60

gaatctttaa acatacgaac agatcactta aagttcttct gaagcaactt aaagttatca 120

ggcatgcatg gatcttggag gaatcagatg tgcagtcagg gaccatagca caagacaggc 180

gtcttctact ggtgctacca gcaaatgctg gaagccggga acactgggta cgttggaaac 240

cacgtgatgt gaagaagtaa gataaactgt aggagaaaag catttcgtag tgggccatga 300

agcctttcag gacatgtatt gcagtatggg ccggcccatt acgcaattgg acgacaacaa 360

agactagtat tagtaccacc tcggctatcc acatagatca aagctgattt aaaagagttg 420

tgcagatgat ccgtggcgat cttagtggtg tagtggtgtt ttagagctag aaatagcaag 480

ttaaaataag gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 540

tttcgttttg cattgagttt tctccgtcgc atgtttgcag ttttattttc cgttttgcat 600

tgaaatttct ccgtctcatg tttgcagcgt gttcaaaaag tacgcagctg tatttcactt 660

atttacggcg ccacattttc atgccgtttg tgccaactat cccgagctag tgaatacagc 720

ttggcttcac acaacactgg tgacccgctg acctgctcgt acctcgtacc gtcgtacggc 780

acagcatttg gaattaaagg gtgtgatcga tactgcttgc tgctcatgaa tccaaaccac 840

acggagttca aattcccaca gattaaggct cgtccgtcgc acaaggtaat gtgtgaatat 900

tatatctgtc gtgcaaaatt gcctggcctg cacaattgct gttatagttg gcggcaggga 960

gagttttaac attgactagc gtgctgataa tttgtgagaa ataataattg acaagtagat 1020

actgacattt gagaagagct tctgaactgt tattagtaac aaaaatggaa agctgatgca 1080

cggaaaaagg aaagaaaaag ccatactttt ttttaggtag gaaaagaaaa agccatacga 1140

gactgatgtc tctcagatgg gccgggatct gtctatctag caggcagcag cccaccaacc 1200

tcacgggcca gcaattacga gtccttctaa aagctcccgc cgaggggcgc tggcgctgct 1260

gtgcagcagc acgtctaaca ttagtcccac ctcgccagtt tacagggagc agaaccagct 1320

tataagcgga ggcgcggcac caagaagcgt gaagcccata tcaccagtgt tttagagcta 1380

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1440

gtgctttttt ttttcgtttt gcattgagtt ttctccgtcg catgtttgca gttttatttt 1500

ccgttttgca ttgaaatttc tccgtctcat gtttgcagcg tgttcaaaaa gtacgcagct 1560

gtatttcact tatttacggc gccacatttt catgccgttt gtgccaacta tcccgagcta 1620

gtgaatacag cttggcttca cacaacactg gtgacccgct gacctgctcg tacctcgtac 1680

cgtcgtacgg cacagcattt ggaattaaag ggtgtgatcg atactgcttg ctgct 1735

Claims

1.玉米苞叶相关蛋白或调控所述玉米苞叶相关蛋白含量或活性的物质在调控玉米苞叶生长中的应用，所述玉米苞叶相关蛋白为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列3的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述物质为下述B1)至B9)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B8)降低权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白含量或活性的核酸分子；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)-b15)中的任一种：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2所示的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列3所示的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的cDNA分子或DNA分子。

4.权利要求1-3中任一所述玉米苞叶相关蛋白或所述调控所述玉米苞叶相关蛋白含量或活性的物质在调控玉米苞叶宽度中的应用。

5.权利要求1-3中任一所述玉米苞叶相关蛋白或所述调控所述玉米苞叶相关蛋白含量或活性的物质在培育苞叶宽度降低玉米中的应用。

6.下述X1或X2的方法：

X1、降低玉米苞叶宽度的方法，包括：降低受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的含量，或降低受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的活性，或抑制受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白编码基因的表达，或敲除受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白编码基因，得到与所述受体玉米相比苞叶宽度降低的目的玉米，实现玉米苞叶宽度的降低；

X2、培育苞叶宽度降低玉米的方法，包括：降低受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的含量，或降低受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白的活性，或抑制受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白编码基因的表达，或敲除受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白编码基因，得到与所述受体玉米相比苞叶宽度降低的目的玉米。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：敲除受体玉米中权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白编码基因通过CRISPR/Cas9方法完成。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：CRISPR/Cas9方法中sgRNA的靶序列为序列1的第62-80位和/或第303-321位。

9.权利要求1中所述玉米苞叶相关蛋白。

10.权利要求1-3中任一所述调控所述玉米苞叶相关蛋白含量或活性的物质。