WO2018168016A1 - タバコ植物体とその製造方法 - Google Patents
タバコ植物体とその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2018168016A1 WO2018168016A1 PCT/JP2017/032871 JP2017032871W WO2018168016A1 WO 2018168016 A1 WO2018168016 A1 WO 2018168016A1 JP 2017032871 W JP2017032871 W JP 2017032871W WO 2018168016 A1 WO2018168016 A1 WO 2018168016A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- polynucleotide
- gene
- polypeptide
- tobacco plant
- tobacco
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/82—Solanaceae, e.g. pepper, tobacco, potato, tomato or eggplant
- A01H6/823—Nicotiana, e.g. tobacco
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
- A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
- A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
- C12N15/8229—Meristem-specific, e.g. nodal, apical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8291—Hormone-influenced development
- C12N15/8295—Cytokinins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
Abstract
葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体を提供すること。本発明は、１次わき芽の発達を抑制する変異が導入されているタバコ植物体、当該タバコ植物体を入手する方法、ならびに当該タバコ植物体からの収穫物および当該収穫物の加工物である。
Description
本発明は、葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体、当該タバコ植物体を入手する方法、ならびに当該タバコ植物体からの収穫物および当該収穫物の加工物に関する。
種子植物は、その生長過程において、種子の胚が発達して子葉および頂端分裂組織（shoot apical meristem）が形成される。上記頂端分裂組織の細胞分裂によって、葉原基（leaf primordium）が次々に形成され、葉原基の向軸側に腋生分裂組織（axillary meristem）が形成される。腋生分裂組織は、それから頂端分裂組織として機能して、わき芽（axillary Bud）になる。植物体の栄養成長時には、わき芽の発達は、通常、一時的に休眠状態にある（抑制されている）。主茎（primary shoot）の頂端分裂組織が、栄養成長状態から生殖成長状態に移行した場合、または死滅した場合に、わき芽の発達は、休眠状態から解放されて、促進される。わき芽の発達について、ナス科植物（例えば、トマトおよびタバコ）、他の植物（例えば、イネおよびシロイヌナズナ）において、複数の研究報告がある。
葉を収穫するための栽培植物としてのタバコ植物は、その栽培において、収穫葉の質および量の向上（例えば、収穫葉の、内容成分の蓄積、成熟および展開）を目的として、心止め（花を付けた頂端部の茎の切除）が施される。心止めを施すと、タバコ植物は、葉の付け根（葉腋）などから旺盛にわき芽の発達を開始する。わき芽の発達は、栄養分を当然消費するので、収穫葉に供給される栄養分を相対的に減少させる。よって、わき芽の発達および伸長は、収穫葉の品質および収量の低下につながる。したがって、葉たばこを収穫するためのタバコ植物体の栽培において、わき芽は、除去または発達抑制などの処理を受ける。
わき芽を除去する方法としては、手作業または機械による摘み取りが挙げられる。手作業による摘み取りには、莫大な労力（およびこれに伴う人件費の増大）、および低い効率性の問題がある。機械による摘み取りには、手作業に劣る作業の正確さのために植物体を損傷させる問題がある。また、わき芽を発達抑制する方法として、農薬が使用される。農薬の使用には、効果を持続させるための繰り返しの散布、植物体の生育への影響、農薬残留による収穫葉への影響、および残留農薬の検査コストの増大という問題がある。
ここで、タバコ植物以外の植物におけるわき芽の発達に関して、非特許文献１～４に以下のような開示がある。
ペチュニアのHAIRLY MERISTRM (HAM)遺伝子に変異を導入した変異体において、茎頂分裂組織に異所的にトライコームが形成されることが報告されている（非特許文献１）。このHAM遺伝子の、シロイヌナズナのオルソログであるLOST MERISTEMS (LOM)が、わき芽の形成が抑制されている変異体における、わき芽形成抑制の原因遺伝子として報告されている（非特許文献２）。シロイヌナズナにおいて少なくとも４遺伝子がHAMホモログと推定されており、HAM1と、２または３の他のHAMホモログとを同時に変異させると、変異の数の増加にしたがって、HAM1の単独変異より強くわき芽形成が抑制された（非特許文献２および３）。ペッパーのHAM遺伝子のホモログとして１種類が報告されており、当該遺伝子の変異によって、わき芽の形成が完全に抑制された（非特許文献４）。
Stuurman J, Jaggi F, Kuhlemeier C. (2002) Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells. Genes & Development 16: 2213-2218.
Schulze S, Schafer BN, Parizotto EA, Voinnet O, Theres K. (2010) LOST MERISTEMS genes regulate cell differentiation of central zone descendants in Arabidopsis shoot meristems The Plant Journal 64(4): 668-678.
Engstrom EM, Andersen CM, Gumulak-Smith J, Hu J, Orlova E, Sozzani R, Bowman JL. (2011) Arabidopsis homologs of the petunia hairy meristem gene are required for maintenance of shoot and root indeterminacy. Plant Physiology 155(2): 735-750.
David-Schwartz R, Borovsky Y, Zemach H, Paran I. (2013) CaHAM is autoregulated and regulates CaSTM expression and is required for shoot apical meristem organization in pepper. Plant Science 203-204: 8-16.
しかし、上述の文献から知り得るのは、タバコ植物以外においてわき芽を低減させ得ることに過ぎない。よって、わき芽の発達に基づく問題を解消または軽減した、葉たばこを収穫するために栽培されるタバコ植物が、どのようにすれば得られるか否かは、不明である。
本発明の課題は、葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体、当該タバコ植物体を入手する方法、ならびに当該タバコ植物体からの収穫物および当該収穫物の加工物を提供することである。
本発明者らは、上記課題に鑑みて、タバコ植物においてわき芽発達に関与すると予想される遺伝子を同定し、タバコ植物体において当該遺伝子を機能抑制した場合に得られる有利な影響を探索した結果として、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の一局面に係るタバコ植物体は、上記課題を解決するために、（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体である。
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体である。
また、本発明の一局面に係るタバコ植物体の製造方法は、（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含しており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体の製造方法である。
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含しており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体の製造方法である。
また、本発明の一局面に係る１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体の決定方法は、
タバコ植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程と、
当該サンプルに含まれているゲノムＤＮＡ上にある以下の（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異をゲノムから検出する工程と、
上記変異が検出されたタバコ植物体を、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体として決定する工程とを包含しており、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、決定方法である。
タバコ植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程と、
当該サンプルに含まれているゲノムＤＮＡ上にある以下の（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異をゲノムから検出する工程と、
上記変異が検出されたタバコ植物体を、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体として決定する工程とを包含しており、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、決定方法である。
本発明は、葉たばこを収穫するための栽培に適したタバコ植物体、当該タバコ植物体を入手する方法、ならびに当該タバコ植物体からの収穫物および当該収穫物の加工物を提供できるという効果を奏する。
〔１．タバコ植物体〕
本発明の一実施形態は、特定の３遺伝子のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されているタバコ植物体を提供する。ここで、上記機能抑制は、１次わき芽の発達を抑制する。
本発明の一実施形態は、特定の３遺伝子のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されているタバコ植物体を提供する。ここで、上記機能抑制は、１次わき芽の発達を抑制する。
特定の３遺伝子の具体例は、以下の（１）～（３）である。
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方。
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方。
上記（１）～（３）の遺伝子に含まれている各ポリヌクレオチドは以下の通りである。上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドである。上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである。
上記タバコ植物体は、後述の実施例に示す通り、野生株植物と比べて、１次わき芽の数もしくは重量の減少（例えば、野生株植物の１／２以下）を示すか、または１次わき芽を生じない。つまり、上記タバコ植物体からわき芽を除去する作業は、１回で済むか、または必要とされない。したがって、葉たばこを収穫するためのタバコ植物体の栽培における従来のわき芽処理と比較して、数分の１以下の労力で済む。
本明細書に使用される場合、「タバコ植物体」および「タバコ」は、個体全体（例えば、成体、苗および種子）、組織（例えば、葉、茎、花、根、生殖器官、胚およびこれらの一部など）、およびこれらの乾燥物を包含している。
本明細書に使用される場合、「わき芽（axillary bud）」は、葉原基（leaf primordium）の葉腋（leaf axil）部に形成される腋生分裂組織（axillary meristem）から生じる、芽（bud）および当該芽が発達したシュートの両方を指す。わき芽は、心止め後において、１次わき芽（primary axillary bud）、２次わき芽（secondary axillary bud）および３次わき芽（tertiary axillary bud）の順にしたがって、同じ葉の付け根に発達する。まず、心止め後に、１次わき芽が発達し、１次わき芽を除去すると、続いて２次わき芽が発達する。わき芽の「発達」は、上記腋生分裂組織から分化した状態に留まっていたわき芽が、茎頂の除去などによって活発な活動を始め、生長および伸長することを意味する。
わき芽の「数または重量」は、１個体における発達した１次わき芽の数または採取した１次わき芽の総重量（新鮮重量）を意味し、本明細書では１次わき芽を計測の主な対象にしている。
本明細書に使用される場合、「（アミノ酸配列の）配列同一性」は、基準となる（アミノ酸）配列に対して、言及されている（アミノ酸）配列が一致している割合を意味する。ここで、配列の一致していない部分は、（アミノ酸残基の）置換、付加、欠失または挿入が存在している部分である。
ここで、配列表に記載したアミノ酸配列を用いてポリペプチドを特定する記載「～に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチド」は、野生型ポリペプチドを意味する。当該野生型ポリペプチドは、後述のタバコ属植物に通常存在しているポリペプチドを意味する。本明細書において、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、実質的に同一の意味を有しており、交換可能に使用され得る。
したがって、タバコ植物体において存在量の減少しているポリペプチドは、配列表に示したそれぞれのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドであればよく、当該配列同一性は、より高い割合（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上）であることが好ましい。
ポリペプチドの「存在量の減少」は、野生型ポリペプチドの存在量を基準にして、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の当該ポリペプチドの存在を意味する。上記野生型ポリペプチドの存在量を基準にした上記ポリペプチドの存在量は、１次わき芽の数または重量の減少を結果としてもたらす上述の値から、適宜選択され得る。
なお、上記タバコ植物体における上述のポリペプチドの存在量の減少は、当該タバコ植物体から得られる、培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子、および子孫において、遺伝的に安定して受け継がれていることが好ましい。したがって、上記タバコ植物体は、人為的な操作を介して生成された培養細胞、カルス、プロトプラスト、種子または子孫から発生した個体であり得、当該個体を得るためのこれらの材料は、本発明の範囲に包含される。
上記タバコ植物体は、交配によって得られた育種後代をさらに包含し得る。イネ、コムギ、オオムギ、ダイズをはじめ、多くの植物種において変異体を用いた育種が行われている。例えば、変異原を用いて処理した変異体集団から単離した変異体は、対象とする遺伝子以外に多数の変異を有している。そのため一般的には、余分な変異を除くために戻し交雑を行う。この交雑において、優良な形質を保有している栽培品種と、上記変異体を交配させることによって、当該変異体の有している所望の形質（抑制された１次わき芽の発達）を、既存の栽培品種に導入することができる。このようにして得られた育種後代は、既存の栽培品種に高い付加価値を付与した品種であり得る。
ここで、上記変異体の所望の形質は、ゲノム上の複数の位置（例えば、複数の遺伝子）に導入された変異に由来する。したがって、当該変異を有している個体の選抜をあらかじめ行っておくことが、効率的な戻し交雑に必須である。個体の選抜には、個体における上記変異の有無、および当該変異がホモ接合型またはヘテロ接合型であることを簡便に検出可能であれば、有利である。当該検出は、遺伝子における変異を検出するための、後述する方法にしたがって実施可能である。以上の観点とは別に、栽培品種への戻り率（ゲノム全領域に占める栽培品種由来のゲノム領域の割合）の高い系統を、より少ない交雑回数によって得ることが好ましい。より少ない交雑回数の実現する手法としては、上記変異体および既存の栽培品種の間において多型を示すバックグラウンドマーカーを用いたＭＡＳ（Marker Assisted Selection）が挙げられる。多型を示すバックグラウンドマーカーとして、タバコにおいて知られているＳＮＰまたはＳＳＲ（Simple Sequence Repeat）を利用し得る。既存のマーカーの他に、交雑に用いる変異体および既存の栽培品種のゲノム配列を決定し、かつ比較することによって、塩基配列の差異、およびゲノム上にある反復配列の数の差異を特定できれば、これらの差異を、新たなマーカーとして利用可能である。
以下の説明において、遺伝子およびゲノムに関して、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）を基準にして説明する。以下の説明における基準であるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）は、複二倍体であり、祖先種であるＮｉｃｏｔｉａｎａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ由来のゲノム（Ｓゲノム）およびＮｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｍｅｎｔｏｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のゲノム（Ｔゲノム）の両方を有する。Ｎ．ｔａｂａｃｕｍにおいて、同一の名称によって表される遺伝子は、ほとんどの場合、ＳおよびＴゲノムのそれぞれに存在している。上記３遺伝子のそれぞれは、Ｓゲノムに２つ、Ｔゲノムに２つの対立遺伝子（すなわち、Ｎ．ｔａｂａｃｕｍのゲノム上に計４つ）を有している。
なお、タバコ植物体について、種間において実質的に同じ機能を果たすポリペプチドをコードする遺伝子の一部（すべてではない）の、コード領域における塩基配列は、栽培品種間に１～数％、栽培品種および近縁野生種の間に約１０％以下の差異を有し得る。
配列番号１に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号７に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号２に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号８に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されているＮｔＬＯＭ３のｃＤＮＡに該当し、配列番号７は、ＳゲノムのＮｔＬＯＭ３のｃＤＮＡ配列を、配列番号８は、ＴゲノムのＮｔＬＯＭ３のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号１３および１４はそれぞれ、ＮｔＬＯＭ３遺伝子のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
配列番号３に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号９に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号４に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１０に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されているＮｔＬＯＭ２のｃＤＮＡに該当し、配列番号９は、ＳゲノムのＮｔＬＯＭ２のｃＤＮＡ配列を、配列番号１０は、ＴゲノムのＮｔＬＯＭ２のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号１５および１６はそれぞれ、ＮｔＬＯＭ２遺伝子のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
配列番号５に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１１に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。配列番号６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドは、例えば、配列番号１２に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドによってコードされている。これらのポリヌクレオチドは、後述の実施例に示されているＮｔＬＯＭ１のｃＤＮＡに該当し、配列番号１１は、ＳゲノムのＮｔＬＯＭ１のｃＤＮＡ配列を、配列番号１２は、ＴゲノムのＮｔＬＯＭ１のｃＤＮＡ配列をそれぞれ示している。配列番号１７および１８はそれぞれ、ＮｔＬＯＭ１遺伝子のＳゲノムおよびＴゲノムにおける塩基配列を示している。
ここで、相同遺伝子を単離するための当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491,1988）が挙げられる。したがって、当業者は、例えば、配列番号７に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドもしくはその一部をプローブとしてか、または当該ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、種々の植物から（１）の遺伝子の相同遺伝子を容易に単離し得る。同様にして、配列番号８に示されている塩基配列を有しているポリヌクレオチドもしくはその一部を用いて、種々の植物から（１）の遺伝子の相同遺伝子を容易に単離し得る。これらの説明に接した当業者であれば、（２）の遺伝子の相同遺伝子を、配列番号９または１０の塩基配列（の一部）に基づいて、容易に単離し得るし、（３）の遺伝子の相同遺伝子を、配列番号１１または１２（の一部）に基づいて、容易に単離し得る。
ここで、ストリンジェントな条件は、いわゆる塩基配列に特異的な２本鎖のポリヌクレオチドは形成されるが、非特異的な２本鎖のポリヌクレオチドの形成が著しく抑制される条件をいう。換言すれば、相同性が高い核酸同士のハイブリッド、例えばプローブと完全一致した２本鎖ポリヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ値）から１５℃、好ましくは１０℃、更に好ましくは５℃低い温度までの範囲の温度でハイブリダイズする条件ともいえる。例えば、一般的なハイブリダイゼーション用緩衝液中で、６８℃、２０時間の条件でハイブリダイズする条件を挙げることができる。一例を示すと、０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，７%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１×デンハルト溶液からなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１６～２４時間ハイブリダイズさせ、さらに２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４，ｐＨ７．２，１%ＳＤＳ，１ｍＭ ＥＤＴＡからなる緩衝液中で温度が６０～６８℃、好ましくは６５℃、さらに好ましくは６８℃の条件下で１５分間の洗浄を２回行う条件を挙げることができる。他の例としては、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するＤＮＡの単離を期待し得る。ただし、上記ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。例えば、当業者であれば、Molecular Cloning（Sambrook, J. etal., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989)）等を参照することにより、こうした遺伝子を容易に取得することができる。
遺伝子を特定する言及として、本明細書に使用される場合、「（前者）・・・遺伝子、および（後者）・・・遺伝子の、少なくとも一方」は、以下の遺伝子（の組合せ）のいずれかを意味している。
（前者）の遺伝子（Ｓゲノム上の遺伝子）；
（後者）の遺伝子（Ｔゲノム上の遺伝子）；ならびに
（前者）の遺伝子（Ｓゲノム上の遺伝子）、および（後者）の遺伝子（Ｔゲノム上の遺伝子）の組合せ。
（前者）の遺伝子（Ｓゲノム上の遺伝子）；
（後者）の遺伝子（Ｔゲノム上の遺伝子）；ならびに
（前者）の遺伝子（Ｓゲノム上の遺伝子）、および（後者）の遺伝子（Ｔゲノム上の遺伝子）の組合せ。
したがって、上記（１）～（３）の遺伝子のうち、２遺伝子に変異が導入されている特定の実施形態において、上記タバコ植物体は、１遺伝子につき、Ｓゲノムにある２つの対立遺伝子のうち１つ以上（１つまたは２つ）およびＴゲノムにある２つの対立遺伝子のうち１つ以上（１つまたは２つ）から、選択される１つ以上の対立遺伝子に上述の変異を有している。つまり、上記特定の実施形態に係る上記タバコ植物体は、ゲノム上のＮｔＬＯＭ１～３から選択される２遺伝子に変異を有している。
上述の通り、タバコ植物体は、ＴゲノムおよびＳゲノムのそれぞれに１組（２つ）の遺伝子を有している場合が多い。よって、当該遺伝子の機能を、当該遺伝子に対する変異の導入によって完全に消失させるには、ＴゲノムおよびＳゲノムにあるすべて（４つ）の遺伝子に変異を導入する必要がある。ただし、１遺伝子の機能を変異によって完全に消失させたタバコ植物体において、１次わき芽の発達は抑制されない（後述の比較例を参照）。
ここで、本発明の一実施形態であるタバコ植物体は、少なくとも２遺伝子に変異を有していることが好ましく、２遺伝子に変異を有していることがより好ましい。より好ましいタバコ植物体において、変異を導入する対象である対立遺伝子の数は、計８つである。好ましいタバコ植物体において、８つの対立遺伝子のすべてに変異が導入されている必要はない。１次わき芽の発達の抑制が、例えば、８つの対立遺伝子のうち、６つ以上（６つまたは７つ）の対立遺伝子に変異が導入されているタバコ植物体において認められ得るからである。
後述する実施例に示す通り、上記タバコ植物体において変異が導入されている２遺伝子は、ＮｔＬＯＭ２および３の組合せであることが特に好ましい。これらの組合せに係る一実施形態において、上記タバコ植物体は、２遺伝子のうち、６つの対立遺伝子に変異を有しており、２つの対立遺伝子に変異を有していない。当該実施形態において、上記タバコ植物体は、ＮｔＬＯＭ２の４つの対立遺伝子およびＮｔＬＯＭ３の２つの対立遺伝子；ＮｔＬＯＭ２の３つの対立遺伝子およびＮｔＬＯＭ３の３つの対立遺伝子；またはＮｔＬＯＭ２の２つの対立遺伝子およびＮｔＬＯＭ３の４つの対立遺伝子に、変異を有している。
本明細書に使用される場合、「遺伝子の機能抑制」は、ゲノム上にある遺伝子が本来の機能を発揮しない状態を意味する。したがって、「遺伝子の機能抑制」は、「遺伝子の破壊」、「遺伝子の変異」および当該遺伝子以外（外来遺伝子を包含する）による当該「遺伝子の発現抑制」を包含する用語である。
「遺伝子の破壊」は、ゲノム上に本来ある遺伝子が存在しないこと、またはゲノム上にある遺伝子から転写産物が生成されないことを意味する。「遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異（機能の低下もしくは欠損）、機能的なポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、または機能的なポリペプチドが生成されるものの、当該ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異などを意味している。「遺伝子の発現抑制」は、当該遺伝子の塩基には変化を生じていないが、遺伝子の転写もしくは翻訳機能（ｍＲＮＡへの転写からそれに続くポリペプチドへの翻訳まで）が他の因子を介して修飾されて、ポリペプチドの生成量が低下しているか、またはポリペプチドの生成が生じていない状態などを意味する。「遺伝子の発現抑制」は、例えば、当該遺伝子から転写されるｍＲＮＡの分解によって生じ得る。
本明細書に使用される場合、「変異」は、本願の属する技術分野において通常に理解される意味を有しており、例えば、野生型のゲノム上にある塩基、または野生型ポリペプチドにあるアミノ酸残基の、任意の変化（例えば、置換、欠失、挿入、付加、重複、逆位または転座など）を意味する。したがって、「遺伝子の変異」は、本来の機能的なポリペプチドが生成されない遺伝子の変異、ポリペプチドが生成されるものの、生成される量が低下する遺伝子の変異、ポリペプチドが生成されるものの、ポリペプチドの安定性が低下する遺伝子の変異、遺伝子（コード領域、または非翻訳領域を含んでいる全長）の喪失、または遺伝子からの転写が抑制される変異（転写制御領域または転写開始領域の欠失など）などを意味している。
置換によって機能を欠損させる場合、プロモーター配列（コード領域を基準にして上流（５’側）にある配列、および下流（３’側）にある配列が挙げられる）、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域、イントロンの両端にある保存配列（５’ＧＴ－ＡＧ３’）、ならびにコード領域の少なくとも１つに、当該置換が存在し得る。
例えば、ある遺伝子のプロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域にある、遺伝子発現調節に重要な塩基配列における置換は、当該遺伝子の転写活性の低下または当該遺伝子からの転写産物の安定性の低下を生じる。これらの低下はいずれも、上記遺伝子からの転写産物の減少にともなって、翻訳産物の減少を生じ得る。イントロンの保存配列における置換は、ｍＲＮＡのスプライシング異常を引き起こすことによって、不要なイントロンが付加または挿入されている異常なｍＲＮＡを生じる。異常なｍＲＮＡは、例えばフレームシフトによって、異常な翻訳産物を生じさせるか、または翻訳終結しない。
コード領域にある置換は、不完全長の翻訳産物または本来の機能を維持していない翻訳産物を生じ得る。不完全長の翻訳産物は、アミノ酸をコードしているコドンのストップコドンへの、当該置換による変換（ナンセンス変異）に起因して生じる。不完全長の翻訳産物は、本来の翻訳産物と比べて、Ｃ末端のアミノ酸残基を含んでいる連続する１アミノ酸残基以上を欠失している。ナンセンス変異は、本来のストップコドンの上流にある任意のコドンに生じており、本来のストップコドンから、１コドン以上を挟んだ上流にあることが好ましい。本来の機能を損なっている翻訳産物は、アミノ酸置換によって生じる。当該翻訳産物は、立体構造の変化、または機能ドメインとしての機能の低下などを起こしている。上記アミノ酸置換は、翻訳産物の機能を変化させる高い可能性を有している非保存的置換であることが好ましい。非保存的置換は、電荷または疎水性の異なるアミノ酸への置換（例えば、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸、極性アミノ酸から非極性アミノ酸への置換）、ならびにかさ（立体的な大きさ）の異なる側鎖を有しているアミノ酸への置換などが挙げられる。
置換以外の変異（欠失および挿入など）が、プロモーター配列、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域内に生じると、置換と同様に、転写活性または安定性の低下による転写産物量の低減、およびポリペプチドの量の低減が、結果として起こり得る。イントロンの保存配列への置換以外の変異はまた、置換と同様に、本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じさせ得る。コード領域への置換以外の変異はまた、アミノ酸残基の欠失もしくは挿入（３の倍数の、連続する塩基の欠失または挿入によって生じる）、またはフレームシフトによって本来と異なるアミノ酸配列を有しているポリペプチドの翻訳を生じ得る。また、その遺伝子全体を含んでいる大きな欠失または当該遺伝子への大きな断片の挿入は、当該遺伝子の発現自体を喪失させ得る。
上記遺伝子の変異または破壊の結果として生じた個体は、本明細書においてタバコ植物体の変異体（単に変異体と記載する）と呼ばれる。上記変異体は、ＳゲノムおよびＴゲノムのいずれかに上述の変異を有し得、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に上述の変異を有していることが好ましい。なお、機能を欠損させるための変異は１遺伝子に１種の変異を有しても良いし、複数の変異を有していても良く、変異の種類は問わない。ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれに２つずつある計４つの対立遺伝子の変異は、同じでも良いし、異なっていても良い。
上記遺伝子の発現抑制は、当該遺伝子からｍＲＮＡへの転写の抑制、当該遺伝子からｍＲＮＡを介したポリペプチドへの翻訳の抑制（例えば、当該ｍＲＮＡの分解）、および翻訳されたポリペプチドの機能の抑制を包含している。転写の抑制は、上記遺伝子からの転写を促進する転写因子の阻害、および転写開始因子の上記遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。翻訳の抑制は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子、または共抑制分子を用いて実現され得る。ポリペプチドの機能の抑制は、機能的なポリペプチドとの結合によって当該ポリペプチドの機能を阻害する分子（例えば、デコイ核酸、リボザイム、抗体および阻害ペプチド）によって実現され得る。
上記（転写、翻訳またはポリペプチドの機能の）抑制は、例えば、当該抑制を実現するための分子を植物体に直接に導入すること、または当該分子をコードする核酸分子を植物体に導入すること（植物体の形質転換）によって、実現され得る。ここで、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子は、当該植物体のゲノムにおける１つ以上の任意の領域に組み込まれる。上記抑制が実現される限り、植物体の形質転換の結果として、上記核酸分子が、ＳゲノムおよびＴゲノムの両方に組み込まれている必要はない。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子の発現産物であるポリペプチドの存在量の減少であることが好ましい。詳細には、当該存在量は、上記野生型ポリペプチドをコードする遺伝子の発現抑制を引き起こす変異に基づいて減少している。上述の通り、当該変異は、上記タバコ植物体のゲノム上に存在すればよい。
配列番号１、２、３、４、５または６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドは、野生株植物に存在するポリペプチド（またはそのバリアント）である。したがって、上記タバコ植物体は、上記ポリペプチドの存在量が野生株植物と比べて減少しているので、野生株植物の有している上記機能と比べて劣っている。当該機能は、例えば、野生株植物における、腋生分裂組織を形成する機能、腋生分裂組織からわき芽に分化する機能、またはわき芽の発達能を維持するか、もしくは向上させる機能である。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子の発現産物であるポリペプチドの翻訳量の減少であることが好ましい。ポリペプチドの翻訳は、ｍＲＮＡの減少（ｍＲＮＡ自身の不安定性、ｍＲＮＡの分解促進もしくはｍＲＮＡの転写の抑制などのｍＲＮＡの存在量などに起因する）またはｍＲＮＡからの翻訳量の減少（翻訳構成要素（ｔＲＮＡおよびリボソーム）の欠乏、リクルートの阻害、または機能的な欠損などに起因する）に基づいて生じる。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少であることが好ましい。ｍＲＮＡの転写量の減少は、例えば、遺伝子からのｍＲＮＡへの転写の抑制によって生じる。転写の抑制は、上記遺伝子に対する変異の導入の結果として生じる、転写開始因子の当該遺伝子へのアクセス阻害などによって実現され得る。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制は、上記少なくとも２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進であることが好ましい。ｍＲＮＡの分解は、ｍＲＮＡを分解する外来因子の存在、ｍＲＮＡを分解する内因性の構成要素の活性化、またはｍＲＮＡにおける分解促進配列の存在などによって引き起こされ得る。
上記タバコ植物体において、上記変異は、上記少なくとも２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記少なくとも２遺伝子の存在する領域外への挿入であることが好ましい。
上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であることが好ましい。
上記少なくとも２遺伝子の変異または破壊は、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトの結果として生じていることが好ましい。上記少なくとも２遺伝子の自然突然変異は、複製エラーおよび遺伝子の損傷によって一般的に生じる。当該損傷の原因は、天然に存在するか、もしくは人工的に生成された後に自然環境に留まっている公知の変異原（例えば、放射線、紫外線もしくは変異誘導物質（例えばＥＭＳなど））への暴露などである。上記少なくとも２遺伝子の変異原処理は、上記変異原をタバコ植物体に対して人為的に作用させること（および必要に応じて遺伝子修復機能の抑制との組合せ）によって、実施され得る。上記少なくとも２遺伝子の組換えは、公知の遺伝子組換え手法にしたがって、標的遺伝子の一部または全部を組換え配列によって相同的に組み換えることによって実施され得る。上記遺伝子のゲノム編集は、公知の技術（例えば、zinc-finger nucleases：ＺＦＮ、transcription activator-like effector nucleases：ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍなど）によって実施され得る。上記遺伝子ノックアウトは、公知のトランスポザーゼを利用した遺伝子の転移、またはＴ－ＤＮＡの挿入などによって、実施され得る。
以上において説明した種々の変異は、例えば以下に示す各遺伝子の公知のゲノム配列を参照した当業者によって、タバコ植物体に対して容易に導入され得る。すなわち、これらの配列情報に基づいて、本発明の概念に包含される種々のタバコ植物体のゲノムに存在する、変異を導入すべき領域が適宜決定され得る。
ＮｔＬＯＭ１：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS11024、および（Ｔゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS12340
ＮｔＬＯＭ２：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS9212、および（Ｔゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS8
ＮｔＬＯＭ３：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS9212、および（Ｔゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS8。
ＮｔＬＯＭ１：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS11024、および（Ｔゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS12340
ＮｔＬＯＭ２：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS9212、および（Ｔゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS8
ＮｔＬＯＭ３：（Ｓゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS9212、および（Ｔゲノム）Sol Genomics Network (SOL) accession #Ntab-TN90-AYMY-SS8。
上記タバコ植物体は、タバコ属植物であれば特に限定されず、タバコ属植物としては、タバコ（Nicotiana）属に属する植物であれば特に限定されず、例えば、ニコチアナ・アカウリス（Nicotiana acaulis）、ニコチアナ・アカミナタ（Nicotiana acuminata）、ニコチアナ・アカミナタ・ヴァリエーション・ムルツユロラ（Nicotiana acuminata var. multzjlora）、ニコチアナ・アフリカナ（Nicotiana africana）、ニコチアナ・アラタ（Nicotiana alata）、ニコチアナ・アンプレクシカウリス（Nicotiana amplexicaulis）、ニコチアナ・アレンツィイ（Nicotiana arentsii）、ニコチアナ・アテヌアタ（Nicotiana attenuata）、ニコチアナ・ベナビデシイ（Nicotiana benavidesii）、ニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）、ニコチアナ・ビゲロビイ（Nicotiana bigelovii）、ニコチアナ・ボナリエンシス（Nicotiana bonariensis）、ニコチアナ・カビコラ（Nicotiana cavicola）、ニコチアナ・クレベランディイ（Nicotiana clevelandii）、ニコチアナ・コルディフォリア（Nicotiana cordifolia）、ニコチアナ・コリンボサ（Nicotiana corymbosa）、ニコチアナ・デブネイ（Nicotiana debneyi）、ニコチアナ・エクセルシオール（Nicotiana excelsior）、ニコチアナ・フォゲッチアナ（Nicotiana forgetiana）、ニコチアナ・フラグランス（Nicotiana fragrans）、ニコチアナ・グラウカ（Nicotiana glauca）、ニコチアナ・グルチノサ（Nicotiana glutinosa），ニコチアナ・グッドスピーディイ（Nicotiana goodspeedii）、ニコチアナ・ゴセイ（Nicotiana gossei）、ニコチアナ・イングルバ（Nicotiana ingulba）、ニコチアナ・カワカミイ（Nicotiana kawakamii）、ニコチアナ・ナイチアナ（Nicotiana knightiana）、ニコチアナ・ラングスドルフィ（Nicotiana langsdorfi）、ニコチアナ・リニアリス（Nicotiana linearis）、ニコチアナ・ロンギフロラ（Nicotiana longiflora）、ニコチアナ・マリチマ（Nicotiana maritima）、ニコチアナ・メガロシフォン（Nicotiana megalosiphon）、ニコチアナ・ミエルシイ（Nicotiana miersii）、ニコチアナ・ノクチフロラ（Nicotiana noctiflora）、ニコチアナ・ヌディカウリス（Nicotiana nudicaulis）、ニコチアナ・オブツシフォリア（Nicotiana obtusifolia）、ニコチアナ・オクシデンタリス（Nicotiana occidentalis）、ニコチアナ・オクシデンタリス・サブスピーシーズ・ヘスペリス（Nicotiana occidentalis subsp. Hesperis）、ニコチアナ・オトフォラ（Nicotiana otophora）、ニコチアナ・パニクラタ（Nicotiana paniculata）、ニコチアナ・パウクツユロラ（Nicotiana pauczjlora）、ニコチアナ・ペチュニオイデス（Nicotiana petunioides）、ニコチアナ・プランバギニフォリア（Nicotiana plumbaginifolia）、ニコチアナ・クアドリヴァルヴィス（Nicotiana quadrivalvis）、ニコチアナ・レイモンディイ（Nicotiana raimondii）、ニコチアナ・レパンダ（Nicotiana repanda）、ニコチアナ・ロズラタ（Nicotiana rosulata）、ニコチアナ・ロズラタ・サブスピーシーズ・イングルバ（Nicotiana rosulata subsp. Ingulba）、ニコチアナ・ロツンディフォリア（Nicotiana rotundifolia）、ニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）（マルバタバコ）、ニコチアナ・セッチェルリイ（Nicotiana setchellii）、ニコチアナ・シムランス（Nicotiana simulans），ニコチアナ・ソラニフォリア（Nicotiana solanifolia）、ニコチアナ・スペガウイニイ（Nicotiana spegauinii）、ニコチアナ・ストックトニイ（Nicotiana stocktonii）、ニコチアナ・スアヴェオレンス（Nicotiana suaveolens）、ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）、ニコチアナ・チルシフロラ（Nicotiana thyrsiflora）、ニコチアナ・トメントサ（Nicotiana tomentosa）、ニコチアナ・トメントシフォミス（Nicotiana tomentosifomis）、ニコチアナ・トリゴノフィラ（Nicotiana trigonophylla）、ニコチアナ・アンブラティカ（Nicotiana umbratica）、ニコチアナ・アンドゥラタ（Nicotiana undulata）、ニコチアナ・ベルンチナ（Nicotiana velutina）、ニコチアナ・ウィガンディオイデス（Nicotiana wigandioides）、およびタバコ属植物のハイブリッドなどが挙げられる。中でもニコチアナ・ベンサミアナ、ニコチアナ・ルスチカおよびニコチアナ・タバカムがより好ましく、葉たばこ生産の原料として用いられるニコチアナ・ルスチカおよびニコチアナ・タバカムが特に好ましい。
〔２．タバコ植物体の製造方法〕
１つの局面において、本発明は、上述のタバコ植物体の製造方法を提供する。上記製造方法は、上述した３遺伝子のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、当該タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している。
１つの局面において、本発明は、上述のタバコ植物体の製造方法を提供する。上記製造方法は、上述した３遺伝子のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、当該タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含している。
上記導入するステップは結果として、当該変異によって引き起こされる上記遺伝子の機能抑制を介して、１次わき芽の発達を抑制する。上記遺伝子の機能抑制を介した、１次わき芽の発達を抑制することの概要については、上述の通りである。よって、上記ステップを実施するための具体例として、ベクターを用いたタバコ植物体の形質転換を介した遺伝子の発現抑制および遺伝子への変異の導入を挙げて以下に説明する。
遺伝子の発現抑制または遺伝子への変異の導入を目的としたタバコ植物の形質転換に使用されるベクターとしては、ベクター内に挿入されたポリヌクレオチドを植物細胞内で発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。当該ベクターとしては、例えば、アグロバクテリウムを介して植物細胞に目的のポリヌクレオチドを導入することができる、ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、およびｐＳＭＡ系のベクターなどが好適に用いられる。特に、バイナリーベクター系（ｐＢＩＧ、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ２２１、およびｐＰＺＰ２０２など）のプラスミドが好ましい。
遺伝子の発現抑制をＲＮＡｉによって実現する場合、標的遺伝子の発現をＲＮＡｉによって抑制するために使用されるＲＮＡｉトリガー配列が、上記ベクターに挿入される。当該ＲＮＡｉトリガー配列は、例えば、配列番号１、２、３、４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部、または配列番号７、８、９、１０、１１もしくは１２を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部である、連続する少なくとも２１～３０塩基（例えば、２１塩基以上、２２塩基以上、２３塩基以上、２４塩基以上、２５塩基以上、２６塩基以上、２７塩基以上、２８塩基以上、２９塩基以上、および３０塩基以上）の塩基配列に示されるポリヌクレオチド（センスＲＮＡ部分）、ならびに当該ポリヌクレオチドと相補的な塩基配列に示されるポリヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ部分）である。上述の「連続する少なくとも２１～３０塩基」の塩基配列は、より詳細には、連続する２１塩基以上、２３塩基以上、２５塩基以上、３０塩基以上、３５塩基以上、４０塩基以上、４５塩基以上、５０塩基以上、６０塩基以上、７０塩基以上、８０塩基以上、９０塩基以上、または１００塩基以上の塩基配列を意味する。
上述の通り、本発明に係るタバコ植物体における遺伝子の発現抑制は、遺伝的に受け継がれていることが好ましい。したがって、上記ＲＮＡｉトリガー配列は、上記タバコ植物体のゲノムに組み込まれていることが好ましい。
異なる遺伝子が発現抑制されている２つのタバコ植物体を交配することによって、同時に複数の遺伝子が発現抑制されているタバコ植物体を入手し得る。また、複数の異なる遺伝子を同時に発現抑制し得る形質転換を実施した後に、複数の異なる遺伝子が同時に発現抑制されているタバコ植物体を選抜することによって、複数の遺伝子が同時に発現抑制されているタバコ植物体を入手し得る。
なお、交配を利用して複数の遺伝子が機能抑制されているタバコ植物体を入手する場合、交配させる一方のタバコ植物体は、遺伝子の変異または破壊（以下に詳述されている）によって、他方のタバコ植物体は、形質転換（の結果として、遺伝子が発現抑制されている）によって作製され得る。
タバコ植物体の遺伝子に対する変異の導入は、公知のゲノム編集技術によって実現され得る。当該ゲノム編集技術としては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍでは、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質が、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮでは、融合タンパク質（ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼが融合されている）が、標的細胞内に存在すれば、ゲノム編集可能である。したがって、上記ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質、ならびに上記融合タンパク質はいずれも、標的細胞に直接的に導入され得る。これらを標的細胞に直接的に導入する方法としては、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、およびパーティクルボンバードメント法などが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍでは、ゲノム上のＸＧＧのすぐ上流にある塩基配列の相補的な配列が、ガイドＲＮＡの一部と塩基対を形成し、当該塩基配列内において２本鎖のゲノムＤＮＡがＣａｓ９によって切断を受ける。ガイドＲＮＡによって認識される当該塩基配列は、例えば、配列番号１、２、３、４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）、または配列番号７、８、９、１０、１１もしくは１２を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部のうち、ＸＧＧのすぐ上流にある連続する１０塩基以上（例えば、１５塩基以上、好ましくは１７塩基以上、より好ましくは１８塩基以上、より一層好ましくは１９塩基以上、最も好ましくは２０塩基以上）である。
ＴＡＬＥＮでは、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在する塩基配列と結合する。当該塩基配列は、２本鎖ゲノムＤＮＡの一方の鎖および他方の鎖に存在し、したがって、上記一対のＤＮＡ結合ドメインの一方は当該一方の鎖に、他方は、当該他方の鎖に結合する。上記ＤＮＡ結合ドメインは、３３～３４アミノ酸残基を繰り返し単位（モジュール）として、結合する塩基数と対応する数のモジュールから構成されている。ＤＮＡ結合ドメインによって結合される塩基配列は、配列番号１、２、３、４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）、または配列番号７、８、９、１０、１１もしくは１２を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する１０塩基以上、好ましくは１４塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
ＺＦＮでは、ＴＡＬＥＮと同様に、二量体を形成する人工ヌクレアーゼの一対のＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在する塩基配列と結合する。当該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のジンクフィンガーモジュールから構成されている。当該塩基配列は、配列番号１、２、３、４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）、または配列番号７、８、９、１０、１１もしくは１２を有しているポリヌクレオチド（０．１～１％の置換を有し得る）の一部のうち、ＦｏｋＩ切断ドメインの両端に、５～２０塩基のスペーサを介して存在する、それぞれ連続する９塩基以上、好ましくは１２塩基以上、より好ましくは１８塩基以上である。
以上のＲＮＡｉ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ、ＴＡＬＥＮおよびＺＦＮについての説明のそれぞれは、全項目の記載にしたがって、配列番号１、２、３、４、５もしくは６に示されるアミノ酸配列を有しているポリペプチドを、当該ポリペプチドと９０％以上の配列同一性を有している、タバコ属に含まれている他の種に存在する相同分子種のポリペプチドと読み替え可能である。また、同様にして、前段落の記載は、配列番号７、８、９、１０、１１もしくは１２を有しているポリヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドと９０％以上の配列同一性を有している、タバコ属に含まれている他の種に存在する相同遺伝子のポリヌクレオチドと読み替え可能である。
上述の通り、本発明に係るタバコ植物体の上記少なくとも２遺伝子に導入された、当該少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異は、遺伝的に受け継がれていることが好ましい。しかし、ゲノム編集のためにタバコ植物体に導入された外因性のポリヌクレオチドは、所望の変異がタバコ植物体に導入されたことを確認した後に当該タバコ植物体から排除されることが好ましい。上記外因性のポリヌクレオチドがタバコ植物体に維持されていると、所望されない変異が導入され（続け）ることによって、所望の形質（例えば、１次わき芽の抑制）が失われたり、タバコ植物体の生存を脅かすおそれがあるためである。
タバコ植物体の上記少なくとも２遺伝子に対する変異の導入、または当該少なくとも２遺伝子の破壊は、他の生物工学的な手法（例えば、トランスポゾンまたはアグロバクテリウムを利用した手法）によって実施され得る。当該手法の具体例は、タバコのレトロトランスポゾンｔｎｔ１もしくは他の植物におけるトランスポゾン、またはアグロバクテリウムのＴ１プラスミドにおけるＴ－ＤＮＡをタバコ植物体に導入する方法である。
代替的に、上記導入または破壊は、他の手法（タバコ植物体の変異原処理）によって実施され得る。変異源の例としては、小分子の化合物（例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、N-エチル-N-ニトロソウレア（ＥＮＵ）、アジ化ナトリウムなど）、および放射線（例えば、γ線、重イオンビーム、Ｘ線、中性子線、紫外線など）が挙げられる。
変異は、再生可能な任意のタバコ植物体に導入され得る。当該タバコ植物体の例は、種子、根、葉、花、生殖器官または胚であり、好ましくは種子である。
以上の手法によって得られるのは、種々の変異を有している（または変異を有していない）植物体の変異体集団であり得る。したがって、当該変異体集団から、所望の表現型を示す個体がさらに選抜され得る。個体を選抜することの例として、変異原を用いて処理した場合に得られる変異体集団（パネル）から所望の個体を選抜する手順を説明する。
１遺伝子について、Ｔゲノム、Ｓゲノム両方の合計４つの対立遺伝子における変異、または当該合計４つの対立遺伝子の破壊によって機能を欠損しているタバコ変異体は、例えば、以下の方法で獲得できる。上述のようにタバコを変異原によって処理し、タバコゲノム全体に変異を生じさせたタバコの変異体集団（パネル）を作製し、ゲノムＤＮＡを抽出する。Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれの遺伝子特異的プライマーを利用して、パネルのゲノムＤＮＡから標的遺伝子（ポリヌクレオチド）を増幅し、その産物の塩基配列を決定し、変異を有する系統を選抜する。選抜した系統のＭ２個体群から、Ｓゲノム、Ｔゲノムそれぞれにホモ接合型変異を有するＭ２個体を取得し、それらを交配したＦ１を作製する。さらにその自殖後代（Ｆ２）を育成し、その中からＳ、Ｔ両ゲノムともホモ接合型の変異を有する個体を取得する（二因子劣性のため１／１６の確率で得られる）。
代替的に、２遺伝子に変異を有しているタバコ変異体は、以上の方法によって得られた１遺伝子に変異を有しているタバコ変異体をさらに変異原処理すること、２遺伝子に変異を有しているタバコ変異体を上述の変異体集団から選抜すること、または以上の方法によって得られた異なる１遺伝子に変異を有している２種類のタバコ変異体を交配し、かつ所望の２遺伝子に変異を有しているタバコ植物体を選抜することによって入手され得る。変異の導入手法を変更する場合、以上の記載における変異原に関する説明を他の手法（上述した、ゲノム編集もしくは遺伝子ノックアウトを用いたタバコ植物体への変異の導入、およびベクターを用いたタバコ植物体の形質転換など）に置き換えればよい。
すなわち、２遺伝子（第１および第２の遺伝子）に変異を有しているタバコ植物体、２遺伝子が破壊されているタバコ植物体、または第１の遺伝子に変異を有しており、かつ第２の遺伝子が破壊されているタバコ植物体は、例えば（１）～（４）の段階を経て入手され得る。なお、例えば（１）において２遺伝子に同時に変異を導入し、かつ（２）において２遺伝子に変異を有しているタバコ変異体を選抜することによって、（３）および（４）は省略され得る。
（１）任意の変異導入手法（例えば、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集、遺伝子ノックアウトおよび形質転換、ならびこれらのあらゆる組合せなど）によって、上記変異体集団を生成する
（２）（１）によって生成されたタバコ変異体から、第１の遺伝子に変異を有している（または第１の遺伝子が破壊されている）第１のタバコ変異体を選抜する
（３）（１）および（２）を繰り返し、第２の遺伝子に変異を有している（または第２の遺伝子が破壊されている）第２のタバコ変異体を準備する
（４）第１および第２のタバコ植物体を交配する。
（１）任意の変異導入手法（例えば、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集、遺伝子ノックアウトおよび形質転換、ならびこれらのあらゆる組合せなど）によって、上記変異体集団を生成する
（２）（１）によって生成されたタバコ変異体から、第１の遺伝子に変異を有している（または第１の遺伝子が破壊されている）第１のタバコ変異体を選抜する
（３）（１）および（２）を繰り返し、第２の遺伝子に変異を有している（または第２の遺伝子が破壊されている）第２のタバコ変異体を準備する
（４）第１および第２のタバコ植物体を交配する。
本発明に係るタバコ植物体の製造方法は、上記生成するステップにおいて生成されたタバコ植物体から、１次わき芽の数または重量が、上記野生株植物と比べて１／２以下に減少している個体を選抜するステップをさらに包含している。上記選抜するステップは、例えば、上記少なくとも２遺伝子の破壊、変異または発現抑制に基づいて実施される。
上記少なくとも２遺伝子の変異または破壊は、当該遺伝子における変異の有無の検出によって決定され得る。遺伝子における変異を検出する方法としては、（１）市販のシーケンサー等を利用して、ＤＮＡ塩基配列を直接解読する方法、（２）ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法を用いて配列に違いを電気泳動の距離の違いで検出する方法、（３）ＣｙｃｌｅａｖｅＰＣＲ法を用いて、ＳＮＰ（Single Nucleotide Polymorphism）を検出する方法、（４）Ｔ７ ＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅＩなどを用いてミスマッチ部位を切断することにより変異の有無を検出する方法、（５）制限酵素処理による切断の有無から変異の有無が判別できるＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法、（６）意図的にミスマッチを含むプライマーセットを用いることにより、制限酵素による切断の有無から変異の有無が判別できるｄＣＡＰＳ（derived CAPS）法、（７）変異配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いてプローブがハイブリダイズされたか否かを検出することにより変異の有無を判別する方法（ＴａｑＭａｎプローブを用いたＰＣＲ法、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ解析法）、（８）欠失や挿入の場合には、遺伝子のＰＣＲ増幅断片（２本鎖）の長さの違いを電気泳動の移動度の差から変異を検出する方法などがあるが、変異の有無が判別できる方法であればよい。代替的に、遺伝子の変異または破壊は、遺伝子の改変の結果として生じるポリペプチド、または野生型ポリペプチドの発現量の検出（例えば、ウェスタンブロット）によって決定され得る。
上述の変異を導入するステップに先立って、発現抑制する遺伝子および／または変異を導入する遺伝子を決定するために、以下に示す手順（１および２）が、必要に応じて実施される。
１．わき芽の発達を制御すると推定されるタバコ遺伝子の単離
わき芽を制御する可能性がある遺伝子は、他植物における先行技術文献（例えば、遺伝子とわき芽の関係が確認された非特許文献）から選択し、その遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の同一性を指標に、タバコから遺伝子を獲得することができる。例えば、公知のデータベースに登録されている配列に対して、ｂｌａｓｔ（Basic Local Alignment Search Tool）による検索を行うことで、公知のタバコ遺伝子ないしは、タバコに近縁な植物種の遺伝子（例えば、トマト）の塩基配列、アミノ酸配列を入手することができる。公知の配列が部分長であった場合、既知の配列情報を利用して、一般的な方法、例えば、ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング、Ｒａｃｅ（Rapid amplification of cDNA ends）法により、全長ｃＤＮＡを入手することができる。
わき芽を制御する可能性がある遺伝子は、他植物における先行技術文献（例えば、遺伝子とわき芽の関係が確認された非特許文献）から選択し、その遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列の同一性を指標に、タバコから遺伝子を獲得することができる。例えば、公知のデータベースに登録されている配列に対して、ｂｌａｓｔ（Basic Local Alignment Search Tool）による検索を行うことで、公知のタバコ遺伝子ないしは、タバコに近縁な植物種の遺伝子（例えば、トマト）の塩基配列、アミノ酸配列を入手することができる。公知の配列が部分長であった場合、既知の配列情報を利用して、一般的な方法、例えば、ｃＤＮＡライブラリーからのスクリーニング、Ｒａｃｅ（Rapid amplification of cDNA ends）法により、全長ｃＤＮＡを入手することができる。
新規にわき芽を制御する可能性がある遺伝子は、例えば、標的とする組織や処理により発現する遺伝子を選抜することにより得ることができる。標的とする組織や処理は以下に挙げる情報を基に選択することができる。わき芽の原基形成に関与する遺伝子は、わき芽原基の形成に先立って発現し、わき芽原基の維持や生長に関する遺伝子はわき芽原基で発現することが知られている（例えば、ＬＳ、Ｂｌｉｎｄ遺伝子）。わき芽の休眠や発達に関与する遺伝子は休眠、脱休眠わき芽で発現が増減することが知られている（例えばＢＲＡＮＣＨＥＤ１）。また、いくつかの植物ホルモンがわき芽の制御に関与していることが知られている。オーキシンが頂芽優勢に、ストリゴラクトンがわき芽の発達抑制に、サイトカイニンがわき芽の伸長に、アブシジン酸が休眠に関与している。
わき芽の発達を制御する可能性のある遺伝子の新たな選抜は、発現特異性を利用した一般的な方法によって実施され得る。当該方法としては、例えば、（１）ｃＤＮＡの塩基配列から遺伝子発現プロファイリングデータを取得する方法、および対象組織で発現する遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを作製して末端配列をシーケンスする方法や、制限酵素断片を直列につないでシーケンスするＳＡＧＥ（Serial Analysis of Gene Expression）法などが挙げられる。（２）ディファレンシャルハイブリダイゼーションにより遺伝子発現プロファイリングデータを取得する方法。マクロアレイ、ＤＮＡチップが良く知られている。（３）ディファレンシャルディスプレイ法により複数のサンプル間で発現レベルの異なる遺伝子（Differentially Expressed Genes：DEGs）を得ることができる。ＰＣＲ増幅断片の量を比較する方法が挙げられる。
単離した遺伝子の増幅
ポリヌクレオチドの増幅はＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法で行うことができるが、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法などで行ってもよい。
ポリヌクレオチドの増幅はＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法で行うことができるが、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法やＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法などで行ってもよい。
ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーは、Ｓゲノム、Ｔゲノムの遺伝子が混在するタバコゲノムから、各ゲノムの目的遺伝子を特異的に増幅することができるプライマーであればよい。目的遺伝子を特異的に増幅できるのであれば、１またはそれ以上の置換、欠失、挿入、付加を含んでいてもよい。また、プライマーは必要に応じて蛍光物質、放射線等で標識されていてもよい。
増幅の鋳型として使用するゲノムＤＮＡの抽出は公知の方法で行えばよく、市販の抽出キットを用いても良い。ゲノムＤＮＡは簡易抽出した粗精製物であっても、精製工程を経た精製物でもよい。
２．わき芽の発達に関与すると推定される遺伝子の同定
対象とする遺伝子の発現や機能を抑制した組換え体及び変異体を作製し、温室、人工気象室、網室または圃場で栽培することにより、遺伝子の効果を確認することができる。発生するわき芽の数や重量を、対照と比較することにより、わき芽の発生、発達に対する効果が確認できる。わき芽の数や重量は心止めを行わないで行ってもよいが、好ましくは心止めにより脱休眠させてわき芽の発達を促進させて行う。わき芽の数や重量の調査はいずれかの時期に１回行ってもよいし、複数回行ってもよい。複数回調査する場合は、間隔を置いて、調査することが好ましい。例えば、週に１回、１次わき芽の数を数え、それらを採取して重量を調査する方法で行うことができる。
対象とする遺伝子の発現や機能を抑制した組換え体及び変異体を作製し、温室、人工気象室、網室または圃場で栽培することにより、遺伝子の効果を確認することができる。発生するわき芽の数や重量を、対照と比較することにより、わき芽の発生、発達に対する効果が確認できる。わき芽の数や重量は心止めを行わないで行ってもよいが、好ましくは心止めにより脱休眠させてわき芽の発達を促進させて行う。わき芽の数や重量の調査はいずれかの時期に１回行ってもよいし、複数回行ってもよい。複数回調査する場合は、間隔を置いて、調査することが好ましい。例えば、週に１回、１次わき芽の数を数え、それらを採取して重量を調査する方法で行うことができる。
調査は特定のわき芽（例えば１次わき芽）だけに着目して行ってもよいし、数だけ、重量だけに絞って別々に行ってもよい。その場合、回数、間隔はそれぞれの調査に適した方法で行うことが好ましい。
〔３．その他〕
本発明の他の局面は、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体の決定方法を提供する。１次わき芽の抑制は、タバコ植物体における、上述した少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入することによって生じる。ここで、当該機能抑制は、１次わき芽の発達を抑制する。つまり、上記決定方法は、タバコ植物体の製造方法などに利用される。したがって、当該決定方法の詳細は、タバコ植物体およびその製造方法に関するこれまでの項目を参照すればよい。
本発明の他の局面は、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体の決定方法を提供する。１次わき芽の抑制は、タバコ植物体における、上述した少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を導入することによって生じる。ここで、当該機能抑制は、１次わき芽の発達を抑制する。つまり、上記決定方法は、タバコ植物体の製造方法などに利用される。したがって、当該決定方法の詳細は、タバコ植物体およびその製造方法に関するこれまでの項目を参照すればよい。
また、本発明の他の局面は、上記タバコ植物体、上記製造方法によって得られたタバコ植物体、上記決定方法によって決定されたタバコ植物体、上記育種方法によって得られたタバコ植物体、または上記子孫もしくは育種後代から収穫された葉たばこ、当該葉たばこから得られた乾燥たばこ、ならびに当該乾燥たばこから得られたたばこ製品を提供する。したがって、葉たばこ、乾燥たばこおよびたばこ製品を得るための、タバコ植物体およびその製造方法の詳細は、これまでの項目を参照すればよい。
〔４．核酸分子〕
本発明の他の局面は、これまでの項目に述べた任意の局面に利用され得る、単離されている核酸分子を提供する。当該核酸分子の具体例としては、以下の（１）～（６）の単離された核酸分子：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ａ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｂ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｃ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｄ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｅ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｆ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｇ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｈ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｉ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｊ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；および
（６）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有している（ｋ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｌ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子が挙げられる。
本発明の他の局面は、これまでの項目に述べた任意の局面に利用され得る、単離されている核酸分子を提供する。当該核酸分子の具体例としては、以下の（１）～（６）の単離された核酸分子：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ａ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｂ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｃ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｄ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（３）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｅ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｆ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（４）配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｇ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｈ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；
（５）配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしている（ｉ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｊ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子；および
（６）配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有している（ｋ）ポリヌクレオチド、もしくは当該（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的な（ｌ）ポリヌクレオチドを含んでいる、核酸分子が挙げられる。
上記核酸分子の他の例は、項目１に述べたタバコ属植物のゲノムから単離された核酸分子である。上記（１）～（６）の核酸分子のより詳細な例は、後述する実施例に記載の、ＳゲノムおよびＴゲノムのそれぞれにあるＮｔＬＯＭ１～３である。したがって、上記核酸分子は、コード領域だけでなく、上記タバコ属植物のゲノムに存在する各遺伝子の全長であり得る。例えば、上記核酸分子は、配列番号７、８、９、１０、１１および１２のいずれかによって示されるポリヌクレオチドに対する９０％以上の配列同一性を有しているポリヌクレオチドの配列を、当該分野において公知の手法にしたがって同定することによって、単離され得る。また、例えば、上記核酸分子は、配列番号１、２、３、４、５および６のいずれかによって示されるポリペプチドに対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの配列を、当該分野において公知の手法にしたがって同定することによって、単離され得る。
（まとめ）
以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
以上の各実施形態をまとめると、本発明は、以下のように要約され得る。
（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体。
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制が、上記１次わき芽の数または重量を、野生株植物と比べて１／２以下に減少させることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制が、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子の発現産物であるポリペプチドの存在量の減少であることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制が、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子の発現産物であるポリペプチドの翻訳量の減少であることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制が、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少であることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記機能抑制が、上記少なくとも２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進であることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記変異が、上記少なくとも２遺伝子に導入されていることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記変異が、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されていることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記変異が、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記遺伝子の存在する領域外への挿入であることが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記因子は、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であることが好ましい。
上記タバコ植物体において、ニコチアナ・タバカムまたはニコチアナ・ルスチカに属することが好ましい。
タバコ植物体の製造方法であって、
（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含しており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体の製造方法。
（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含しており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体の製造方法。
上記タバコ植物体の製造方法において、上記導入するステップにおいて生成される個体から、上記１次わき芽の発達が抑制されている個体を選抜するステップをさらに包含していることが好ましい。
上記タバコ植物体の製造方法において、上記選抜するステップにおいて、上記１次わき芽の数または重量が野生株植物と比べて減少している個体を選抜することが好ましい。
上記タバコ植物体において、上記導入するステップが、上記少なくとも２遺伝子に上記変異を導入することを含んでいることが好ましい。
上記タバコ植物体の製造方法において、上記導入するステップが、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施されることが好ましい。
上記タバコ植物体の製造方法において、上記導入するステップが、上記少なくとも２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、当該少なくとも２遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいることが好ましい。
上記タバコ植物体の製造方法において、上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子であることが好ましい。
１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体の決定方法であって、
タバコ植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程と、
当該サンプルに含まれているゲノムＤＮＡ上にある以下の（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異をゲノムから検出する工程と、
上記変異が検出されたタバコ植物体を、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体として決定する工程とを包含しており、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、決定方法。
タバコ植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程と、
当該サンプルに含まれているゲノムＤＮＡ上にある以下の（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異をゲノムから検出する工程と、
上記変異が検出されたタバコ植物体を、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体として決定する工程とを包含しており、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、決定方法。
上記決定方法によって決定された、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体を交配させることを包含している、タバコ植物体の育種方法。
上記タバコ植物体、上記製造方法によって得られたタバコ植物体、上記決定方法によって決定されたタバコ植物体、または上記育種方法によって得られたタバコ植物体の、子孫または当該タバコ植物体の交配によって得られた育種後代。
上記タバコ植物体、上記製造方法によって得られたタバコ植物体、上記決定方法によって決定されたタバコ植物体、上記育種方法によって得られたタバコ植物体、または上記子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
上記葉たばこから得られた、乾燥たばこ。
上記乾燥たばこから得られた、たばこ製品。
〔１．タバコ植物におけるわき芽発達に関与する候補遺伝子〕
（ａ）blast解析
シロイヌナズナのＬＯＭ１遺伝子のアミノ酸配列をクエリ配列として、NCBIのウェブページ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）においてｔｂｌａｓｔｎを行った結果、ニコチアナ・シルベストリス、トメントシフォルミスの各ゲノム配列データベース（whole genome shotgun contigs (wgs)）から５４％のアミノ酸同一性を有する２つの遺伝子配列（ASAF01021035, ASAG01097213）、および４１％のアミノ酸同一性を有する２つの遺伝子配列（ASAF01015857, ASAG01076972）が得られた。一方で、ｃＤＮＡライブラリー（ＳＲ－１のわき芽に由来）のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）解析結果に対するｔｂｌａｓｔｎからも同様な配列を得た。
（ａ）blast解析
シロイヌナズナのＬＯＭ１遺伝子のアミノ酸配列をクエリ配列として、NCBIのウェブページ（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）においてｔｂｌａｓｔｎを行った結果、ニコチアナ・シルベストリス、トメントシフォルミスの各ゲノム配列データベース（whole genome shotgun contigs (wgs)）から５４％のアミノ酸同一性を有する２つの遺伝子配列（ASAF01021035, ASAG01097213）、および４１％のアミノ酸同一性を有する２つの遺伝子配列（ASAF01015857, ASAG01076972）が得られた。一方で、ｃＤＮＡライブラリー（ＳＲ－１のわき芽に由来）のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）解析結果に対するｔｂｌａｓｔｎからも同様な配列を得た。
（ｂ）ｃＤＮＡの調製およびＬＯＭ遺伝子の単離
ｔｏｔａｌ ＲＮＡを次のように抽出した。RNAlater（Ａｍｂｉｏｎ）にタバコ（ＳＲ－１）の茎頂、芽生えおよびわき芽のそれぞれを浸漬し、冷凍保存した。これらを融解させ、これに２０μｌの１ＭのＤＴＴを加えた０．５ｍｌのＲＴＬバッファー（QIAGEN）を加えた。混合物を、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて摩砕（２５００ｒｐｍ、１分間）した。摩砕後の懸濁物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）することによって得た上澄から、マグトレーション（プレジションシステムサイエンス）またはRNeasy Kit（QIAGEN）を用いて、DNaseありの条件においてｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。
ｔｏｔａｌ ＲＮＡを次のように抽出した。RNAlater（Ａｍｂｉｏｎ）にタバコ（ＳＲ－１）の茎頂、芽生えおよびわき芽のそれぞれを浸漬し、冷凍保存した。これらを融解させ、これに２０μｌの１ＭのＤＴＴを加えた０．５ｍｌのＲＴＬバッファー（QIAGEN）を加えた。混合物を、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて摩砕（２５００ｒｐｍ、１分間）した。摩砕後の懸濁物を遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分間）することによって得た上澄から、マグトレーション（プレジションシステムサイエンス）またはRNeasy Kit（QIAGEN）を用いて、DNaseありの条件においてｔｏｔａｌ ＲＮＡを精製した。
ｔｏｔａｌ ＲＮＡから、以下のキットのいずれかを用いて、各キットに添付のマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡを調製した。
・PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）
・PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（タカラバイオ）。
・PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ）
・PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser（タカラバイオ）。
一方で、上述の通りに抽出したｔｏｔａｌ ＲＮＡおよびSMARTer RACE cDNA Amplification Kit（クローンテック）を用いて、キットに添付のマニュアルにしたがって、ｃＤＮＡを合成し、Ｒａｃｅを実施した。Ｒａｃｅのｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲには、３００倍希釈した１ｓｔ ＰＣＲ産物を鋳型として使用した。Ｒａｃｅにおける反応条件を以下のように設定した。
（１ｓｔ ＰＣＲ）
９８℃で１０秒および７２℃で１０秒を１サイクルとして、５サイクル
９８℃で１０秒、７０℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、５サイクル
９８℃で１０秒、６０℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、２５サイクル
（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）
９８℃で１０秒、５５℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、２５サイクル。
（１ｓｔ ＰＣＲ）
９８℃で１０秒および７２℃で１０秒を１サイクルとして、５サイクル
９８℃で１０秒、７０℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、５サイクル
９８℃で１０秒、６０℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、２５サイクル
（ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ）
９８℃で１０秒、５５℃で５秒および７２℃で５秒を１サイクルとして、２５サイクル。
Ｒａｃｅ用のプライマーとして、キットに付属のプライマー、および以下に示す遺伝子に特異的なプライマーを使用した。
（ＮｔＬＯＭ１）
LOM1_5R-1：ACCCATCCAAGACCTCAAGCAGGGCT
LOM_5R-nest1：TGATTGAGCCGCGCCAATATC
（ＮｔＬＯＭ２および３）
LOM2_5R-1：GGCCTTATAAGCATCCATCTTAAGCACAC
LOM_5R-nest1：TGATTGAGCCGCGCCAATATC。
（ＮｔＬＯＭ１）
LOM1_5R-1：ACCCATCCAAGACCTCAAGCAGGGCT
LOM_5R-nest1：TGATTGAGCCGCGCCAATATC
（ＮｔＬＯＭ２および３）
LOM2_5R-1：GGCCTTATAAGCATCCATCTTAAGCACAC
LOM_5R-nest1：TGATTGAGCCGCGCCAATATC。
上述のｃＤＮＡを鋳型として用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を酵素として用いた場合、反応条件を以下のように設定した。９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で５秒および７２℃で１０秒＊を１サイクルとして、３０～４０サイクル
７２℃で１０秒
＊７２℃の伸長反応は、増幅断片の長さ１ｋｂにつき１０秒に設定した。
９８℃で１０秒、５５℃で５秒および７２℃で１０秒＊を１サイクルとして、３０～４０サイクル
７２℃で１０秒
＊７２℃の伸長反応は、増幅断片の長さ１ｋｂにつき１０秒に設定した。
Tks Gflex DNA Polymerase（タカラバイオ）と酵素として用いた場合、反応条件を以下のように設定した。
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で６０秒＊を１サイクルとして３０～４０サイクル
６８℃で６０秒
＊６８℃の伸長反応は、増幅断片の長さ１ｋｂにつき６０秒に設定した。
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で６０秒＊を１サイクルとして３０～４０サイクル
６８℃で６０秒
＊６８℃の伸長反応は、増幅断片の長さ１ｋｂにつき６０秒に設定した。
ＲＴ－ＰＣＲ用の対象遺伝子およびプライマーの組合せを、以下に示す。
ＮｔＬＯＭ１
Ｓゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-1_RT-R1：GAATGTTGGATTGTTCACCG
Ｔゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-2_RT-R1：GTTTGATTGTTCTTATAACACCGA
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
LOM2_RT-F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTCA
LOM2_RT-R1：ACACATAAGGAGAAAATGACGC
NtLOM2-2-1_F1：TTCAGATGATTGTAATACCTCAAAGT
NtLOM2-2-1_R1：AACACACTGATATTTAAACAGGGA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-1_F1：TTTGTAGTGGGTTTAGCTGATTT
NtLOM2-1-1_R1：ACACATACGGAGAAAATGACATAG
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
LOM2_RT-F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTCA
LOM2_RT-R2：ACAGGCAATAGTGGAGGTGATA
NtLOM2-2-2_F1：ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAAC
NtLOM2-2-2_R1：TCTGTTTACACGTAGGAATGCTT
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-2_F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTC
NtLOM2-1-2_R1：ATGCTGAAAGATACTACGCAGATT。
（ｃ）ゲノムＤＮＡ断片の調製およびＬＯＭ遺伝子の単離
ゲノムＤＮＡ断片を、簡易抽出法またはＣＴＡＢ法にしたがって、タバコ（ＳＲ－１）の葉から抽出した。ＣＴＡＢ法は、公知の手法なので詳述を省く。簡易抽出法を次の手順の通りに行った。０．３～０．５ｍｌの抽出バッファー（０．２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．４ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ）に入れた葉片を、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて摩砕（２５００ｒｐｍ、１分間）した。摩砕後の懸濁物から上澄を取り、エタノール沈殿によって上澄からゲノムＤＮＡ断片を精製した。
ＮｔＬＯＭ１
Ｓゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-1_RT-R1：GAATGTTGGATTGTTCACCG
Ｔゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-2_RT-R1：GTTTGATTGTTCTTATAACACCGA
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
LOM2_RT-F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTCA
LOM2_RT-R1：ACACATAAGGAGAAAATGACGC
NtLOM2-2-1_F1：TTCAGATGATTGTAATACCTCAAAGT
NtLOM2-2-1_R1：AACACACTGATATTTAAACAGGGA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-1_F1：TTTGTAGTGGGTTTAGCTGATTT
NtLOM2-1-1_R1：ACACATACGGAGAAAATGACATAG
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
LOM2_RT-F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTCA
LOM2_RT-R2：ACAGGCAATAGTGGAGGTGATA
NtLOM2-2-2_F1：ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAAC
NtLOM2-2-2_R1：TCTGTTTACACGTAGGAATGCTT
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-2_F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTC
NtLOM2-1-2_R1：ATGCTGAAAGATACTACGCAGATT。
（ｃ）ゲノムＤＮＡ断片の調製およびＬＯＭ遺伝子の単離
ゲノムＤＮＡ断片を、簡易抽出法またはＣＴＡＢ法にしたがって、タバコ（ＳＲ－１）の葉から抽出した。ＣＴＡＢ法は、公知の手法なので詳述を省く。簡易抽出法を次の手順の通りに行った。０．３～０．５ｍｌの抽出バッファー（０．２ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．４ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ）に入れた葉片を、マルチビーズショッカー（安井器械）を用いて摩砕（２５００ｒｐｍ、１分間）した。摩砕後の懸濁物から上澄を取り、エタノール沈殿によって上澄からゲノムＤＮＡ断片を精製した。
上述のゲノムＤＮＡ断片を鋳型として用いたゲノムＰＣＲによって、３遺伝子を増幅させた。使用した酵素および酵素に対応する反応条件は、上述ＲＴ－ＰＣＲと同様であるので、対象遺伝子およびプライマーの組合せを以下に示す。
ＮｔＬＯＭ１
Ｓゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-1_RT-R1：GAATGTTGGATTGTTCACCG
Ｔゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-2_RT-R1：GTTTGATTGTTCTTATAACACCGA
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-2-1_F1：TTCAGATGATTGTAATACCTCAAAGT
NtLOM2-2-1_R1：AACACACTGATATTTAAACAGGGA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-1_F1：TTTGTAGTGGGTTTAGCTGATTT
NtLOM2-1-1_R1：ACACATACGGAGAAAATGACATAG
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-2-2_F1：ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAAC
NtLOM2-2-2_R1：TCTGTTTACACGTAGGAATGCTT
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-2_F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTC
NtLOM2-1-2_R1：ATGCTGAAAGATACTACGCAGATT。
ＮｔＬＯＭ１
Ｓゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-1_RT-R1：GAATGTTGGATTGTTCACCG
Ｔゲノム遺伝子
LOM1_RT-F1：AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG
LOM1-2_RT-R1：GTTTGATTGTTCTTATAACACCGA
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-2-1_F1：TTCAGATGATTGTAATACCTCAAAGT
NtLOM2-2-1_R1：AACACACTGATATTTAAACAGGGA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-1_F1：TTTGTAGTGGGTTTAGCTGATTT
NtLOM2-1-1_R1：ACACATACGGAGAAAATGACATAG
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-2-2_F1：ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAAC
NtLOM2-2-2_R1：TCTGTTTACACGTAGGAATGCTT
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-1-2_F1：CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTC
NtLOM2-1-2_R1：ATGCTGAAAGATACTACGCAGATT。
（ｄ）得られた遺伝子の配列決定
上記３遺伝子を増幅させたＰＣＲ産物のそれぞれを、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing Kit（ライフテクノロジー）を用いてクローニングした。なお、当該ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動およびMiniEluteカラム（QIAGEN）を組み合わせた一般的な手法によって、必要に応じて、クローニング前に精製した。クローニングしたＤＮＡそれぞれの塩基配列を、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）を用いて、キャピラリーシーケンサー3730xl DNA Analyzer（ABI）にかけて決定した。シーケンスプライマーは配列情報から適宜設計して使用した。
上記３遺伝子を増幅させたＰＣＲ産物のそれぞれを、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing Kit（ライフテクノロジー）を用いてクローニングした。なお、当該ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動およびMiniEluteカラム（QIAGEN）を組み合わせた一般的な手法によって、必要に応じて、クローニング前に精製した。クローニングしたＤＮＡそれぞれの塩基配列を、BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（ABI）を用いて、キャピラリーシーケンサー3730xl DNA Analyzer（ABI）にかけて決定した。シーケンスプライマーは配列情報から適宜設計して使用した。
（ｅ）結果
以上の遺伝子の単離および配列解析から決定された３つの候補遺伝子を、ＮｔＬＯＭ１～３と名付けた。
以上の遺伝子の単離および配列解析から決定された３つの候補遺伝子を、ＮｔＬＯＭ１～３と名付けた。
〔２．候補遺伝子の機能抑制を生じている植物体の作製〕
ＮｔＬＯＭ１～３の機能抑制が、タバコ植物体のわき芽発達に与える影響を調べるために、ＮｔＬＯＭ１～３が発現抑制されている組換えタバコ植物体（以下では単に組換え体と記載する）、およびＮｔＬＯＭ１～３の構造遺伝子に変異を導入したタバコ植物体（以下では単に変異体と記載する）を作製した。
ＮｔＬＯＭ１～３の機能抑制が、タバコ植物体のわき芽発達に与える影響を調べるために、ＮｔＬＯＭ１～３が発現抑制されている組換えタバコ植物体（以下では単に組換え体と記載する）、およびＮｔＬＯＭ１～３の構造遺伝子に変異を導入したタバコ植物体（以下では単に変異体と記載する）を作製した。
（２－１．組換え体の作製）
（ａ）形質転換の準備
組換え体の作製のために、まず形質転換用のベクターを、以下のように準備した。
（ａ）形質転換の準備
組換え体の作製のために、まず形質転換用のベクターを、以下のように準備した。
ＲＮＡｉトリガー配列（１）～（３）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを、５’末端にＣＣＡＣが付加され、かつＲＮＡｉトリガー配列が２７０～５００ｂｐの長さになるように設計した。ＮｔＬＯＭ２および３の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガー配列（１）、ＮｔＬＯＭ１の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガー配列（２）、ならびにＮｔＬＯＭ２の発現を抑制するためのＲＮＡｉトリガー配列（３）を、１．の結果に基づいて生成させたＳＲ－１由来のｃＤＮＡを鋳型にして、PrimeSTAR Max DNA Polymerase（タカラバイオ）を用いてＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ条件、プライマーの組合せ、および得られたＲＮＡｉトリガー配列は、以下の通りである。
（ＰＣＲ条件）
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で５秒、および７２℃で１０秒を１サイクルとして、３０～４０サイクル
７２℃で１０秒
（ＲＮＡｉトリガー配列（１）用のプライマー）
LOM2_Tr_F1：CACCTCCAATCAAGCTATTCTTG
LOM2_Tr_R1：GTATCTCATAATATTGGAGGGCGT
（ＲＮＡｉトリガー配列（２）用のプライマー）
LOM1_Tr_F1：CACCAGCTATTCAAAGCTGCAG
LOM1_Tr_R1：AACTTTCTCTAGTGAGTCCAAGCTC
（ＲＮＡｉトリガー配列（３）用のプライマー）
D-NsSCL22_F1：CACCCCTAGCAGGAGCAAAAGGG
NsSCL22_R3：ATGGCTGCAGCTCAGTAACC
（ＲＮＡｉトリガー配列（１））
CACCTCCAATCAAGCTATTCTTGAAGCTCTTGGGGATGCCAAGCAAATTCACATAATAGATTTTGACATTGGCTGTGGTGCTCAATGGTCCTCATTTATGCAAGAACTCCCGAGCAGCAATAGAAAGGCAACTTCTCTAAAGATTACTGCCTTTGTATCTCCTTCAACCCACCACTCCGTTGAGATTGGCATCATGCACGAAAGTTTAACGCTGTTTGCTAATGATGTGGGAATCAGATTTGAGCTGGAAGTTATTAACTTGGATTCCTTTGACCCTAAGACTTATCCCTTATCCTCCTTGAGGTCATCTGAGTGTGAGGCTATTGCTATTAATTTCCCCATCTGGTCTATTTCAAGTTGTCTATTTGCATTTCCTTCACTTCTTCACTGTATGAAGCAGCTTTCACCAAAAGTTGTTGTATCATTGGAACGTGGATGTGAACGTACTGAACTCCCCTTAAAGCATCACCTCCTCCACGCCCTCCAATATTATGAGATAC
（ＲＮＡｉトリガー配列（２））
cACCAGCTATTCAAAGCTGCAGAGCTGGTCCAGACAGGGAATCCAGTACTCGCGCAAGGGATATTGGCGCGGCTCAATCACCAGCTCTCTCCAATTGGTAAGCCTTTCTATAGGGCTGCTTTTTATTGCAAGGAAGCTTTACAATTGCTACTTCATACCAACACCAACAACTTGAACAACCCCTCTATACCATCTTCTTCACCTTTTAATCTCATCTTCAAGATTGGTGCCTATAAGTCCTTCTCTGAGATCTCACCAGTTGCACAGTTTGCTAATTTCACTTGTAACCAAGCCCTGCTTGAGGTCTTGGATGGGTTTGAAAGAATTCATATTGTTGATTTTGATATCGGCTATGGCAGGCAATGGGCTTCTCTTATGCAAGAGCTTGCCTTGAGAAGTGGTGGCGCACCTACCCTGAAAATAACTGCATTGGCCTCACCCTCCACACATGACCAACTAGAGCTTGGACTCACTAGAGAAAGTT
（ＲＮＡｉトリガー配列（３））
caccCCTAGCAGGAGCAAAAGGGGTACTTGGTGTTTCAGGTTATGTACCTTCAATTTCTTCTTCACCAGAAGCAGCAATTTGTAATAAAGGTTTAAACTTTACAAGAAACGAATCTGTCTCAGTGTTGGATGCAAGAAGTCCTAGTCCTTCAGCTTCATCTTCCTCGTGTTCTTATGGTGGACAATATGCTGGAAATAATGGAGTTCCCGGCGCCGGAGCTGGAAAAATTGACGGCCGGAAAGAGGAGTTGGTTACTGAGCTGCAGCCAT
５’末端の小文字のｃ（２）またはｃａｃｃ（３）を、ベクター構築のために人為的に付加した。
（ＰＣＲ条件）
９４℃で３０秒
９８℃で１０秒、５５℃で５秒、および７２℃で１０秒を１サイクルとして、３０～４０サイクル
７２℃で１０秒
（ＲＮＡｉトリガー配列（１）用のプライマー）
LOM2_Tr_F1：CACCTCCAATCAAGCTATTCTTG
LOM2_Tr_R1：GTATCTCATAATATTGGAGGGCGT
（ＲＮＡｉトリガー配列（２）用のプライマー）
LOM1_Tr_F1：CACCAGCTATTCAAAGCTGCAG
LOM1_Tr_R1：AACTTTCTCTAGTGAGTCCAAGCTC
（ＲＮＡｉトリガー配列（３）用のプライマー）
D-NsSCL22_F1：CACCCCTAGCAGGAGCAAAAGGG
NsSCL22_R3：ATGGCTGCAGCTCAGTAACC
（ＲＮＡｉトリガー配列（１））
CACCTCCAATCAAGCTATTCTTGAAGCTCTTGGGGATGCCAAGCAAATTCACATAATAGATTTTGACATTGGCTGTGGTGCTCAATGGTCCTCATTTATGCAAGAACTCCCGAGCAGCAATAGAAAGGCAACTTCTCTAAAGATTACTGCCTTTGTATCTCCTTCAACCCACCACTCCGTTGAGATTGGCATCATGCACGAAAGTTTAACGCTGTTTGCTAATGATGTGGGAATCAGATTTGAGCTGGAAGTTATTAACTTGGATTCCTTTGACCCTAAGACTTATCCCTTATCCTCCTTGAGGTCATCTGAGTGTGAGGCTATTGCTATTAATTTCCCCATCTGGTCTATTTCAAGTTGTCTATTTGCATTTCCTTCACTTCTTCACTGTATGAAGCAGCTTTCACCAAAAGTTGTTGTATCATTGGAACGTGGATGTGAACGTACTGAACTCCCCTTAAAGCATCACCTCCTCCACGCCCTCCAATATTATGAGATAC
（ＲＮＡｉトリガー配列（２））
cACCAGCTATTCAAAGCTGCAGAGCTGGTCCAGACAGGGAATCCAGTACTCGCGCAAGGGATATTGGCGCGGCTCAATCACCAGCTCTCTCCAATTGGTAAGCCTTTCTATAGGGCTGCTTTTTATTGCAAGGAAGCTTTACAATTGCTACTTCATACCAACACCAACAACTTGAACAACCCCTCTATACCATCTTCTTCACCTTTTAATCTCATCTTCAAGATTGGTGCCTATAAGTCCTTCTCTGAGATCTCACCAGTTGCACAGTTTGCTAATTTCACTTGTAACCAAGCCCTGCTTGAGGTCTTGGATGGGTTTGAAAGAATTCATATTGTTGATTTTGATATCGGCTATGGCAGGCAATGGGCTTCTCTTATGCAAGAGCTTGCCTTGAGAAGTGGTGGCGCACCTACCCTGAAAATAACTGCATTGGCCTCACCCTCCACACATGACCAACTAGAGCTTGGACTCACTAGAGAAAGTT
（ＲＮＡｉトリガー配列（３））
caccCCTAGCAGGAGCAAAAGGGGTACTTGGTGTTTCAGGTTATGTACCTTCAATTTCTTCTTCACCAGAAGCAGCAATTTGTAATAAAGGTTTAAACTTTACAAGAAACGAATCTGTCTCAGTGTTGGATGCAAGAAGTCCTAGTCCTTCAGCTTCATCTTCCTCGTGTTCTTATGGTGGACAATATGCTGGAAATAATGGAGTTCCCGGCGCCGGAGCTGGAAAAATTGACGGCCGGAAAGAGGAGTTGGTTACTGAGCTGCAGCCAT
５’末端の小文字のｃ（２）またはｃａｃｃ（３）を、ベクター構築のために人為的に付加した。
ＰＣＲ産物を、pENTR（商標）/D-TOPOベクター（ライフテクノロジー）にクローニングし、各ＲＮＡｉトリガー配列の塩基配列を確認した。それから、Gateway LR Clonase II Enzyme Mix（ライフテクノロジー）を用いて、各ＲＮＡｉトリガー配列をpSP231ベクターに導入した。pSP231ベクターは、pHellsgate12（Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590参照）のＳａｃＩ部位にＧＦＰ（Green-fluorescent protein遺伝子）発現カセットを挿入したベクターである。また、pSP231ベクターは、ＲＮＡｉトリガー配列の逆位反復配列の間にｐｄｋ／ｃａｔイントロンが挟まれている型のＲＮＡｉ配列を、カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ ＲＮＡ遺伝子プロモーターによって発現可能なバイナリーベクターである。pSP231ベクターに導入された配列を確認するために、各ＲＮＡｉトリガー配列のセンス鎖およびアンチセンス鎖を個別に、TaKaRa Ex TaqおよびPrimeSTAR Max DNAPolymerase（タカラバイオ）を用いたＰＣＲによって増幅させた。ＰＣＲ産物を、MiniElute（QIAGEN）を用いて精製した後に、シーケンサにかけた。シーケンサによって、pSP231ベクターに、以上に示したＲＮＡｉトリガー配列（１）、（２）または（３）が導入されていることを確認した。
ＲＮＡｉトリガー配列を含んでいるpSP231ベクターを用いて、アグロバクテリウム（Agrobacteriumu tumefaciens） LBA4404を、エレクトロポレーションによって形質転換した。LBA4404において、各ＲＮＡｉトリガー配列が増幅されたことをＰＣＲによって確認した後に、当該アグロバクテリウムを、タバコの形質転換に使用した。
（ｂ）タバコの形質転換、および形質転換された種子の採種
以下に説明する通りに、一般的な方法にしたがって、タバコ（品種：ＳＲ－１）の形質転換を行った。形質転換された上記アグロバクテリウムをタバコ葉の切片に感染させ、カナマイシンを含んでいるLinsmaier and Skoog培地において培養することによって得られたカルスからカナマイシン耐性の再分化個体を得た。これらの再分化個体から、葉全体におけるＧＦＰに基づく強い蛍光、およびスペーサ部分（PPDKイントロン）の高発現が確認された個体を選抜した。選抜した個体（Ｔ０個体）を、３号鉢に移植し、２３～２５℃の閉鎖系温室において一定条件のもとに栽培した。Ｔ０個体を自殖させて、Ｔ１種子を採種した。
以下に説明する通りに、一般的な方法にしたがって、タバコ（品種：ＳＲ－１）の形質転換を行った。形質転換された上記アグロバクテリウムをタバコ葉の切片に感染させ、カナマイシンを含んでいるLinsmaier and Skoog培地において培養することによって得られたカルスからカナマイシン耐性の再分化個体を得た。これらの再分化個体から、葉全体におけるＧＦＰに基づく強い蛍光、およびスペーサ部分（PPDKイントロン）の高発現が確認された個体を選抜した。選抜した個体（Ｔ０個体）を、３号鉢に移植し、２３～２５℃の閉鎖系温室において一定条件のもとに栽培した。Ｔ０個体を自殖させて、Ｔ１種子を採種した。
（ｃ）Ｔ１組換え体の選抜
まず、Ｔ１種子をLinsmaier and Skoog培地に無菌的に播種し、芽生えのＧＦＰに基づく蛍光を観察した。観察結果に基づいて、形質転換の結果としてホモ接合型の変異を有している個体（単に「ホモ」と記載する）、および変異を有していない個体（単に「ヌル」）と記載する）と推定される個体をそれぞれ選抜した。
まず、Ｔ１種子をLinsmaier and Skoog培地に無菌的に播種し、芽生えのＧＦＰに基づく蛍光を観察した。観察結果に基づいて、形質転換の結果としてホモ接合型の変異を有している個体（単に「ホモ」と記載する）、および変異を有していない個体（単に「ヌル」）と記載する）と推定される個体をそれぞれ選抜した。
Ｔ１系統の個体の葉から単離したｔｏｔａｌ ＲＮＡを用いたｑＰＣＲによって、ＮｔＬＯＭ１～３の発現レベルを決定した。ｑＰＣＲの詳細は、以下の通りである。
ｑＰＣＲのプライマーおよびプローブの設計をシグマアルドリッチジャパンに依頼した。１．の（ｂ）に記載の通りに、葉から単離したｔｏｔａｌ ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。２～５倍に希釈したｃＤＮＡ、上述の通りに得られたプライマー、およびTaq Man Fast Advanced Master Mix（ABI）を用いて、ｑＰＣＲを行った。定量化の対照として、eukaryotic elongation factor-1α遺伝子（accession No. AF120093、efla）を増幅させた。定量化用プローブとして、レポータ色素－クエンチャーの組合せ（FAM-TAMURA（解析対象の遺伝子）およびVIC-TAMURA（対照））を用いた。以下の各遺伝子を対象にしている配列において、１番目はフォワードプライマーであり、２番目はリバースプライマーであり、３番目はプローブである。
（ＮｔＬＯＭ２および３（共通））
ＮｔＬＯＭ２、３共通（図２）
LOM2-1-F：CGAGAAGCGCCAGACGTCA
LOM2-1-R：TGTTGTTGTTAAAAGAAAGAGTCATCA
LOM2-1-P：AGCAGCAGGAACTCTTGTCAGCTTTGTCTT
ＮｔＬＯＭ２（図３、４、１０）
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2_S-F：CCCATCAGTTAGCTTGAAACAAC
NtLOM2_S-R：TTATTTGAGTCAATGACAACAGAACC
NtLOM2_S-P：AAGAACCTGCAACTGAAACTCCACAACCCA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2_T-F：CCCATCAGTCAGCTTGAAACAA
NtLOM2_T-R：TGTTTGAGTCTATGACAGCATAACC
NtLOM2_T-P：AGAACCTGCCACTGAAACTCCACCACCC
ＮｔＬＯＭ３（図３、４、１０）
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM3_S-F：CTTAAGCGCACTATTGCCTGAG
NtLOM3_S-R：CCTCAAGCTTAGGTACAATTAATGGT
NtLOM3_S-P：CTTGCTGCCGCGTTTGTCCCAATG
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM3_T-F：GCTTAAGTGCTCTATTGCCTGAA
NtLOM3_T-R：TCAAGCTTAGGTACAATTAATGGCT
NtLOM3_T-P：CTTGCTGCCGCATTTGTCCCAATGG
（ＮｔＬＯＭ１）
Ｓ、Ｔゲノム共通（図１）
LOM1-F：CTACCATTTCCAAACCATGTAATTCAA
LOM1-R：CTCTCAATTCTTGGTTGGAGCA
LOM1-P：CTCAAACCTTCTTGAGTCGTTAGATGCCGT。
（ＮｔＬＯＭ２および３（共通））
ＮｔＬＯＭ２、３共通（図２）
LOM2-1-F：CGAGAAGCGCCAGACGTCA
LOM2-1-R：TGTTGTTGTTAAAAGAAAGAGTCATCA
LOM2-1-P：AGCAGCAGGAACTCTTGTCAGCTTTGTCTT
ＮｔＬＯＭ２（図３、４、１０）
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2_S-F：CCCATCAGTTAGCTTGAAACAAC
NtLOM2_S-R：TTATTTGAGTCAATGACAACAGAACC
NtLOM2_S-P：AAGAACCTGCAACTGAAACTCCACAACCCA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2_T-F：CCCATCAGTCAGCTTGAAACAA
NtLOM2_T-R：TGTTTGAGTCTATGACAGCATAACC
NtLOM2_T-P：AGAACCTGCCACTGAAACTCCACCACCC
ＮｔＬＯＭ３（図３、４、１０）
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM3_S-F：CTTAAGCGCACTATTGCCTGAG
NtLOM3_S-R：CCTCAAGCTTAGGTACAATTAATGGT
NtLOM3_S-P：CTTGCTGCCGCGTTTGTCCCAATG
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM3_T-F：GCTTAAGTGCTCTATTGCCTGAA
NtLOM3_T-R：TCAAGCTTAGGTACAATTAATGGCT
NtLOM3_T-P：CTTGCTGCCGCATTTGTCCCAATGG
（ＮｔＬＯＭ１）
Ｓ、Ｔゲノム共通（図１）
LOM1-F：CTACCATTTCCAAACCATGTAATTCAA
LOM1-R：CTCTCAATTCTTGGTTGGAGCA
LOM1-P：CTCAAACCTTCTTGAGTCGTTAGATGCCGT。
ｑＰＣＲの結果に基づいて、ＮｔＬＯＭ１～３の発現レベルを、ヌルの発現レベルを１に設定したときの、ホモの発現レベルの比として算出した。図１は、ＮｔＬＯＭ１のｍＲＮＡ発現レベルを決定した結果を示す図であり、図２は、ＮｔＬＯＭ２および３のｍＲＮＡ発現レベルを決定した結果を示す図である。なお、図１および２には、目的の組換え体として選抜した系統についての結果のみを示している。
図１に示す通り、ＮｔＬＯＭ１に関する系統１１、２０および２４はいずれも、ヌルにおける発現レベルの１／２を下回る発現レベルを示した。図２に示す通り、ＮｔＬＯＭ２および３に関する系統７は、ヌルにおける発現レベルの約１／３の発現レベルを示した。これらの系統のそれぞれを、ＮｔＬＯＭ１～３の発現抑制を生じているホモとして選抜した。
（ｄ）Ｔ２組換え体
ＮｔＬＯＭ２および３に関するＴ１個体（ヌルおよびホモ）を、Ｔ１種子を採種したときと同様に自殖させて、Ｔ２種子を採種した。Ｔ２種子を（ｃ）に記載の通りに生育させ、かつＮｔＬＯＭ２および３の発現レベルを決定した。その結果を図３および４に示す。図３および４において、図１および２と同様にヌルの発現レベルを１に設定した。図３は、ＳおよびＴゲノムに分けて、各遺伝子の発現レベルを決定した結果を示す図であり、図４は、図３の結果を各遺伝子にまとめた結果に対応する。図３に示す通り、ＳおよびＴゲノムにおいて発現レベルに差はあったものの、図４に示す通り、総計としては、ヌルの発現レベルの１／２以下の発現レベルを示していた。このＴ２個体（２遺伝子抑制組換え体）の種子を、実施例のわき芽評価試験に供した。
ＮｔＬＯＭ２および３に関するＴ１個体（ヌルおよびホモ）を、Ｔ１種子を採種したときと同様に自殖させて、Ｔ２種子を採種した。Ｔ２種子を（ｃ）に記載の通りに生育させ、かつＮｔＬＯＭ２および３の発現レベルを決定した。その結果を図３および４に示す。図３および４において、図１および２と同様にヌルの発現レベルを１に設定した。図３は、ＳおよびＴゲノムに分けて、各遺伝子の発現レベルを決定した結果を示す図であり、図４は、図３の結果を各遺伝子にまとめた結果に対応する。図３に示す通り、ＳおよびＴゲノムにおいて発現レベルに差はあったものの、図４に示す通り、総計としては、ヌルの発現レベルの１／２以下の発現レベルを示していた。このＴ２個体（２遺伝子抑制組換え体）の種子を、実施例のわき芽評価試験に供した。
（２－１．変異体の作製）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍを利用して、ＮｔＬＯＭ１～３に変異を導入した変異体を以下のように作製した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍを利用して、ＮｔＬＯＭ１～３に変異を導入した変異体を以下のように作製した。
（ａ）形質転換の準備
アグロバクテリウムを形質転換するベクターとして、バイナリベクターpRI-201-AN（タカラバイオ）を用いた。pRI-201-ANのNdeI-SalI間に、植物用にコドン最適化されたｐｃｏＣａｓ９（参考文献１）を、KpnI-BamHI間にsgRNA発現カセットを導入した。ガイド配列GN20GG用のプロモータとしてAtU6-1（参考文献２）、およびscaffold-polyT配列として参考文献２に報告されている配列を用いた。つまり、３’末端のPAM配列（NGG）を除いたガイド配列が、プロモータおよびscaffold-polyT配列の間に挿入されているsgRNA発現カセットを設計した。５’末端にKpnIサイトおよび３’末端にBamHIサイトが付加されているsgRNA発現カセットを、ライフテクノロジーのGeneArt（登録商標） Strings（商標） DNA Fragmentsから合成を委託した。５’末端にNdeIサイトおよび３’末端にSalIサイトが付加されているＣａｓ９の人工合成を、タカラバイオに委託して、当該Ｃａｓ９を入手した。
アグロバクテリウムを形質転換するベクターとして、バイナリベクターpRI-201-AN（タカラバイオ）を用いた。pRI-201-ANのNdeI-SalI間に、植物用にコドン最適化されたｐｃｏＣａｓ９（参考文献１）を、KpnI-BamHI間にsgRNA発現カセットを導入した。ガイド配列GN20GG用のプロモータとしてAtU6-1（参考文献２）、およびscaffold-polyT配列として参考文献２に報告されている配列を用いた。つまり、３’末端のPAM配列（NGG）を除いたガイド配列が、プロモータおよびscaffold-polyT配列の間に挿入されているsgRNA発現カセットを設計した。５’末端にKpnIサイトおよび３’末端にBamHIサイトが付加されているsgRNA発現カセットを、ライフテクノロジーのGeneArt（登録商標） Strings（商標） DNA Fragmentsから合成を委託した。５’末端にNdeIサイトおよび３’末端にSalIサイトが付加されているＣａｓ９の人工合成を、タカラバイオに委託して、当該Ｃａｓ９を入手した。
Ｃａｓ９およびsgRNA発現カセットが導入されたpRI201-ANを用いて、アグロバクテリウム LBA4404を、エレクトロポレーションによって形質転換した。２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含んでいるＡＢプレートにおいてアグロバクテリウムを増殖させ、単コロニーのアグロバクテリウムを、単離した。
（ｂ）タバコの形質転換、および形質転換体の栽培
播種１０日目のタバコ（品種：ＳＲ－１）から採取した子葉片を、上述の通りに得られた形質転換されたアグロバクテリウムと、３日にわたって共存培養した。それから、抗菌剤（セフォタキシム）を含んでいる蒸留水を用いて、子葉片を洗浄することによって、アグロバクテリウムを子葉片から除去した。洗浄後の子葉片を、抗菌剤を含んでいるLinsmaier and Skoog培地において４日にわたって培養することによって、アグロバクテリウムを完全に除去した。それから、子葉片を、抗生物質（カナマイシン）を含んでいるLinsmaier and Skoog培地に移して培養し、カナマイシン耐性の再分化個体（シュート）を得た。シュートを、Linsmaier and Skoog発根培地に移して発根させた。発根した個体を、移植用土（堆肥：４０Ｌ、原野土：３０Ｌ、赤玉（小）：１０Ｌ、赤玉（中）：１０Ｌ、バーミキュライト：１０Ｌ、肥料（S625）：１０００ｇ）の入った３号鉢に移植し、生育させた。
播種１０日目のタバコ（品種：ＳＲ－１）から採取した子葉片を、上述の通りに得られた形質転換されたアグロバクテリウムと、３日にわたって共存培養した。それから、抗菌剤（セフォタキシム）を含んでいる蒸留水を用いて、子葉片を洗浄することによって、アグロバクテリウムを子葉片から除去した。洗浄後の子葉片を、抗菌剤を含んでいるLinsmaier and Skoog培地において４日にわたって培養することによって、アグロバクテリウムを完全に除去した。それから、子葉片を、抗生物質（カナマイシン）を含んでいるLinsmaier and Skoog培地に移して培養し、カナマイシン耐性の再分化個体（シュート）を得た。シュートを、Linsmaier and Skoog発根培地に移して発根させた。発根した個体を、移植用土（堆肥：４０Ｌ、原野土：３０Ｌ、赤玉（小）：１０Ｌ、赤玉（中）：１０Ｌ、バーミキュライト：１０Ｌ、肥料（S625）：１０００ｇ）の入った３号鉢に移植し、生育させた。
（ｃ）変異の有無および変異配列の確認
生育させたタバコ形質転換体の葉から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、Tks Gflex（商標） DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにおける反応条件およびプライマーの組合せは以下の通りである。
（反応条件）
９４℃で３０～６０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で３０～６０秒＊を１サイクルとして３０～４０サイクル
６８℃で６０秒
（プライマー）
ＮｔＬＯＭ２＿Ｇ２を用いた変異体における変異配列確認
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2_S_Fw：CCTAGCAGGAGCAAAAGGG
NtLOM2_S_Rv：TCTATTATTTGAGTCAATGACAACAG
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2_T_Fw：CAACCTAGCAGTAGCAAAAGGA
NtLOM2_T_Rv：TCTGTTGTTTGAGTCTATGACAGCAT
ＮｔＬＯＭ３＿Ｇ２を用いた変異体における変異配列確認
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM3_S_Fw：ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAACACCTAAAG
NtLOM3_S_Rv：GGGCTGTTCTTGAGTTACATCATAAG
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM3_T_Fw：CCTCAAAGTTTTCCTAAATTCTAACGCCTAAC
NtLOM3_T_Rv：GGGCTGTTCTTGACTTATATCATATG
ＮｔＬＯＭ２－３＿Ｇ１を用いた変異体における変異配列確認
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-3_2_S_Fw2：GTCCACAAATAATGACAAACCAACA
NtLOM2-3_2_S_Rv2：GAAAGCTGCTTCATACGTGAAGAA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-3_2_T_Fw2：GTCCACAAATAGTGGCAAACCAAAC
NtLOM2-3_2_T_Rv2：CTCCTCAGCACCTCCAAGAC
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-3_3_S_Fw2：TATGTTAGGCTCATTATCTTATGATGTAAC
NtLOM2-3_3_S_Rv3：GGCAAAAGGAAAGGCAATAGC
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-3_3_T_Fw2：CATGTTAGGCTCATTATCATATGATATAAG
NtLOM2-3_3_T_Rv3：GGCAAAAGGAAAGGTAACTGC。
生育させたタバコ形質転換体の葉から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、Tks Gflex（商標） DNA polymerase（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにおける反応条件およびプライマーの組合せは以下の通りである。
（反応条件）
９４℃で３０～６０秒
９８℃で１０秒、５５℃で１５秒、６８℃で３０～６０秒＊を１サイクルとして３０～４０サイクル
６８℃で６０秒
（プライマー）
ＮｔＬＯＭ２＿Ｇ２を用いた変異体における変異配列確認
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2_S_Fw：CCTAGCAGGAGCAAAAGGG
NtLOM2_S_Rv：TCTATTATTTGAGTCAATGACAACAG
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2_T_Fw：CAACCTAGCAGTAGCAAAAGGA
NtLOM2_T_Rv：TCTGTTGTTTGAGTCTATGACAGCAT
ＮｔＬＯＭ３＿Ｇ２を用いた変異体における変異配列確認
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM3_S_Fw：ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAACACCTAAAG
NtLOM3_S_Rv：GGGCTGTTCTTGAGTTACATCATAAG
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM3_T_Fw：CCTCAAAGTTTTCCTAAATTCTAACGCCTAAC
NtLOM3_T_Rv：GGGCTGTTCTTGACTTATATCATATG
ＮｔＬＯＭ２－３＿Ｇ１を用いた変異体における変異配列確認
ＮｔＬＯＭ２
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-3_2_S_Fw2：GTCCACAAATAATGACAAACCAACA
NtLOM2-3_2_S_Rv2：GAAAGCTGCTTCATACGTGAAGAA
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-3_2_T_Fw2：GTCCACAAATAGTGGCAAACCAAAC
NtLOM2-3_2_T_Rv2：CTCCTCAGCACCTCCAAGAC
ＮｔＬＯＭ３
Ｓゲノム遺伝子
NtLOM2-3_3_S_Fw2：TATGTTAGGCTCATTATCTTATGATGTAAC
NtLOM2-3_3_S_Rv3：GGCAAAAGGAAAGGCAATAGC
Ｔゲノム遺伝子
NtLOM2-3_3_T_Fw2：CATGTTAGGCTCATTATCATATGATATAAG
NtLOM2-3_3_T_Rv3：GGCAAAAGGAAAGGTAACTGC。
ＰＣＲ反応後に、変性／アニーリングを次の条件で行った。変性：95℃5分、アニール：85℃1秒/85℃1秒、60℃1秒、30℃一定であった。８５～６０℃におけるRamp Rateは5%（0.1℃/秒の降下率）であり、６０～３０℃におけるRamp Rateは10%（0.1℃/秒の降下率）であった。変性／アニーリング後の５μｌのＰＣＲ産物を、１０μｌの反応系において１ＵのT7 endonuclease I（New England Biolabs）用いて処理し、電気泳動により分離し、ＰＣＲ産物が酵素による切断を受けたか否かを確認した。別途、ＰＣＲ産物を、直接またはZero Blunt TOPO PCR Cloning Kitを用いてクローニングし、その塩基配列を決定した。
（ｄ）組換え体の選抜
ＳおよびＴゲノムのＮｔＬＯＭ２、またはＳおよびＴゲノムのＮｔＬＯＭ３に変異（１塩基以上の欠失または挿入）を有しているＴ０世代の個体をそれぞれ、自殖させ、かつ採種することによって、Ｔ１系統を得た。Ｔ１系統の個体における遺伝子の変異の有無を、（ｃ）と同様にして確認した。確認した結果から、ＳおよびＴゲノムの両方に遺伝子の変異を有しているＴ１系統の個体を自殖することによって、ＮｔＬＯＭ２または３が、ＳおよびＴゲノムの両方において変異を有しているＴ２系統の個体（１遺伝子変異体）を得た。当該１遺伝子変異体を、後述の比較例に示す試験に供した。
ＳおよびＴゲノムのＮｔＬＯＭ２、またはＳおよびＴゲノムのＮｔＬＯＭ３に変異（１塩基以上の欠失または挿入）を有しているＴ０世代の個体をそれぞれ、自殖させ、かつ採種することによって、Ｔ１系統を得た。Ｔ１系統の個体における遺伝子の変異の有無を、（ｃ）と同様にして確認した。確認した結果から、ＳおよびＴゲノムの両方に遺伝子の変異を有しているＴ１系統の個体を自殖することによって、ＮｔＬＯＭ２または３が、ＳおよびＴゲノムの両方において変異を有しているＴ２系統の個体（１遺伝子変異体）を得た。当該１遺伝子変異体を、後述の比較例に示す試験に供した。
ＮｔＬＯＭ２－３＿Ｇ１をsgRNA発現カセットとして用いた場合は、ＮｔＬＯＭ２、３両方のＳおよびＴゲノムに変異有しているＴ０世代の個体を、自殖させ、かつ採種することによって、Ｔ１系統を得た。Ｔ１系統の個体における変異の有無を、（ｃ）と同様にして確認した。確認した結果から、ＮｔＬＯＭ２、３両方のＳおよびＴゲノムに変異有しているＴ１系統の個体を自殖することによって、ＮｔＬＯＭ２、３両方のＳおよびＴゲノム全てに変異を有しているＴ２系統の個体（２遺伝子変異体）を得た。
１遺伝子変異体および２遺伝子変異体における変異の詳細は、以下の通りである。
（１遺伝子変異体（ＮｔＬＯＭ３）：３系統）
（１）６Ｇ２－２９Ａ－３１
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、７２から９１番目のアミノ酸までの２０アミノ酸が欠失し、９２番目のアラニンがアスパラギンに置換し、９３～６２６番目まで同一のポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、９０アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない３アミノ酸（QVL）が付加されたポリペプチドが生成される。
（２）６Ｇ２－２９Ａ－５５
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、７２から９１番目のアミノ酸までの２０アミノ酸が欠失し、９２番目のアラニンがアスパラギンに置換し、９３～６２６番目まで同一のポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、９０アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない８アミノ酸（CRFFSSYR）が付加されたポリペプチドが生成される。
（３）６Ｇ２－６５－１
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、９１アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない８アミノ酸（CRFFSSYR）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、９０番目のアラニンが欠失した６２３アミノ酸からなるポリペプチドが生成される。
（１）６Ｇ２－２９Ａ－３１
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、７２から９１番目のアミノ酸までの２０アミノ酸が欠失し、９２番目のアラニンがアスパラギンに置換し、９３～６２６番目まで同一のポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、９０アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない３アミノ酸（QVL）が付加されたポリペプチドが生成される。
（２）６Ｇ２－２９Ａ－５５
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、７２から９１番目のアミノ酸までの２０アミノ酸が欠失し、９２番目のアラニンがアスパラギンに置換し、９３～６２６番目まで同一のポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、９０アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない８アミノ酸（CRFFSSYR）が付加されたポリペプチドが生成される。
（３）６Ｇ２－６５－１
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、９１アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない８アミノ酸（CRFFSSYR）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、９０番目のアラニンが欠失した６２３アミノ酸からなるポリペプチドが生成される。
（１遺伝子変異体（ＮｔＬＯＭ２）：１系統）
２２Ｇ２－５８－２６
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、８３アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５８アミノ酸（MAGKRSWLLSCSHFHLSWSQKNLILDLGIWIICCRNLPAPTRPFSGGSPAIWRTHQLA）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、８５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない１８アミノ酸（NCVNRLEIMSIVLITYNL）が付加されたポリペプチドが生成される。
２２Ｇ２－５８－２６
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、８３アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５８アミノ酸（MAGKRSWLLSCSHFHLSWSQKNLILDLGIWIICCRNLPAPTRPFSGGSPAIWRTHQLA）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、８５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない１８アミノ酸（NCVNRLEIMSIVLITYNL）が付加されたポリペプチドが生成される。
（２遺伝子変異体（ＮｔＬＯＭ２および３）：３系統）
（１）Ｇ１－１７９－２
ＮｔＬＯＭ２における変異
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６１番目のロイシンが欠失した７１３アミノ酸からなるポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDISQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。ＮｔＬＯＭ３における変異
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、２７５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５７アミノ酸（GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、２７２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDNSQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。（２）Ｇ１－１７９－１７
ＮｔＬＯＭ２における変異
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６１番目のロイシンが欠失した７１３アミノ酸からなるポリペプチド、および、３６２番目まで同一のアミノ酸に加えて関係のない５７アミノ酸（GRTFLKRANDIGAAQSTALSHWQTLQEGCFLLQRGSAVTFPFALYIHIFSTKNSHPI）が付加したポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDISQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。ＮｔＬＯＭ３における変異
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、２７５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５７アミノ酸（GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、２７２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDNSQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。（３）Ｇ１－１７９－２６
ＮｔＬＯＭ２における変異
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２番目まで同一のアミノ酸に加えて関係のない５７アミノ酸（GRTFLKRANDIGAAQSTALSHWQTLQEGCFLLQRGSAVTFPFALYIHIFSTKNSHPI）が付加したポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDISQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。ＮｔＬＯＭ３における変異
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、２７５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５７アミノ酸（GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、２７２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDNSQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。
（１）Ｇ１－１７９－２
ＮｔＬＯＭ２における変異
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６１番目のロイシンが欠失した７１３アミノ酸からなるポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDISQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。ＮｔＬＯＭ３における変異
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、２７５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５７アミノ酸（GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、２７２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDNSQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。（２）Ｇ１－１７９－１７
ＮｔＬＯＭ２における変異
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６１番目のロイシンが欠失した７１３アミノ酸からなるポリペプチド、および、３６２番目まで同一のアミノ酸に加えて関係のない５７アミノ酸（GRTFLKRANDIGAAQSTALSHWQTLQEGCFLLQRGSAVTFPFALYIHIFSTKNSHPI）が付加したポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDISQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。ＮｔＬＯＭ３における変異
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、２７５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５７アミノ酸（GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、２７２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDNSQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。（３）Ｇ１－１７９－２６
ＮｔＬＯＭ２における変異
Ｓゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２番目まで同一のアミノ酸に加えて関係のない５７アミノ酸（GRTFLKRANDIGAAQSTALSHWQTLQEGCFLLQRGSAVTFPFALYIHIFSTKNSHPI）が付加したポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが７１４アミノ酸からなるのに対し、３６２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDISQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。ＮｔＬＯＭ３における変異
Ｓゲノム：ＷＴが６２６アミノ酸からなるのに対し、２７５アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない５７アミノ酸（GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI）が付加されたポリペプチドが生成される。
Ｔゲノム：ＷＴが６２４アミノ酸からなるのに対し、２７２アミノ酸まで同一アミノ酸に加えて、関係のない９アミノ酸（RPDNSQTRK）が付加されたポリペプチドが生成される。
〔３．候補遺伝子のわき芽発達に対する影響の評価〕
上記変異体および組換え体のわき芽発達を、以下のように評価した。
上記変異体および組換え体のわき芽発達を、以下のように評価した。
上記変異体および組換え体、ならびにそれらの野生株の種子のそれぞれを、播種して、閉鎖系温室またはコイトトロン（小糸製作所）において栽培した。閉鎖系温室を、２３～２５℃の室温に保った自然日長の条件、コイトトロンを、１２時間日長の、２５℃（明期）および１８℃（暗期）の条件に設定した。個体を、５００ｍＬ／鉢の肥土を詰めた５号鉢において栽培した。肥土の組成は、堆肥：４０Ｌ、原野土：３０Ｌ、赤玉（小）：１０Ｌ、赤玉（中）：１０Ｌ、バーミキュライト：１０Ｌ、肥料（S625）：１０００ｇであった。
発蕾から開花前の期間の、１２～１３枚の本葉が生じた時点で心止めし、地上部にある下から４枚目以上にあたる本葉に生じたわき芽を評価対象に選んだ。心止めの日から１週間目ごとに、約５ｍｍ以上の長さの茎を有しているわき芽の数を記録し、記録した対象のわき芽を芽元から手作業でもぎ取り、もぎ取ったわき芽の新鮮重量（ＦＷ）を測定した。新たなわき芽の発達が認められなくなるまで、ほぼ５回にわたって、わき芽の数および新鮮重量を調べた。
結果を、図５および６に示す。図５は、上記２遺伝子変異体におけるわき芽発達を評価した結果を示す図である。図６は、上記２遺伝子抑制組換え体におけるわき芽発達を評価した結果を示す図である。
図５に示すように、上記２遺伝子変異体のうち、Ｇ１－１７９－２は、１次わき芽の新鮮重量（ＦＷ）において、ＷＴと比べて顕著な減少を示した。また、上記２遺伝子変異体のうち、Ｇ１－１７９－１７は、１次わき芽の数および新鮮重量において、野生株（ＷＴ）と比べて統計的に有意な減少を示した。特に図示していないが、上記２遺伝子変異体およびＷＴの間に、その生育に関して顕著な差異を認めなかった。また、図５には示していないが、上記２遺伝子変異体と同様にして得られたＧ１－１７９－２６では、発蕾前（花芽が形成されなかった）に茎頂を切除しても、葉腋から１次わき芽の形成および発達がまったく認められなかった。
ＦＷは、１次わき芽の成長にしたがって増大するので、ＦＷの有意な減少は、１次わき芽の成長を有意に抑制することを意味する。１次わき芽が発生しても、その成長が遅ければ、１次わき芽の除去が不要であったり、１次わき芽に対する農薬の散布が不要であったり、農薬の散布回数が減少したりする。したがって、ＦＷの有意な減少は、わき芽を抑制する処理にともなう労力を実質的に軽減する。なお、２個体の上記２遺伝子変異体は、２次わき芽を生じなかった。
図６に示すように、上記２遺伝子抑制組換え体（７Ｈ）は、１次わき芽の数およびＦＷの両方において、ＮｔＬＯＭ２および３の発現が抑制されていない個体（７Ｎ）およびＷＴと比べて統計的に有意な減少を示した。特に図示していないが、７Ｈ、７ＮおよびＷＴ上記２遺伝子変異体およびＷＴの間に、その生育に関して顕著な差異を認めなかったが、７Ｈにおいて花芽数の減少が認められた。
〔比較例〕
項目３．の記載と同様に、２種類の、１遺伝子の発現抑制組換え体（３個体）および２種類の１遺伝子変異体（計４固体）のわき芽発達を評価した。その結果を、図７～９に示す。図７および９に示すように、１遺伝子の機能抑制（発現抑制および変異）は、１次わき芽発達を抑制しなかった。図８に示すように、ＮｔＬＯＭ２遺伝子に変異を導入した１遺伝子変異体において、平均すると１次わき芽の重量が約半数に減少しているように認められた（ＳＲ－１との有意差はなし）。この結果を追認するために、変異体ではなく、１遺伝子（ＮｔＬＯＭ２）の発現抑制組換え体を上述の通りに作製した。
項目３．の記載と同様に、２種類の、１遺伝子の発現抑制組換え体（３個体）および２種類の１遺伝子変異体（計４固体）のわき芽発達を評価した。その結果を、図７～９に示す。図７および９に示すように、１遺伝子の機能抑制（発現抑制および変異）は、１次わき芽発達を抑制しなかった。図８に示すように、ＮｔＬＯＭ２遺伝子に変異を導入した１遺伝子変異体において、平均すると１次わき芽の重量が約半数に減少しているように認められた（ＳＲ－１との有意差はなし）。この結果を追認するために、変異体ではなく、１遺伝子（ＮｔＬＯＭ２）の発現抑制組換え体を上述の通りに作製した。
１遺伝子（ＮｔＬＯＭ２）の発現抑制組換え体（２個体）における、ＮｔＬＯＭ２のｍＲＮＡ発現レベルおよびわき芽発達を確認した結果を図１０に示す。図１０の上段に示す通り、上記組換え体において、ＮｔＬＯＭ２のｍＲＮＡは特異的に発現抑制されており、ＮｔＬＯＭ３のｍＲＮＡ発現レベルは抑制されていなかった。図１０の下段に示す通り、図８の結果とは逆に、いずれの系統でも、ホモは、ヌルと比べてわき芽の重量の増加を示した。したがって、１遺伝子の機能抑制では、わき芽発達を安定して抑制できないため、２遺伝子の機能抑制が、わき芽発達の抑制に非常に好ましいことが分かった。
以上のことから、例えわき芽形成への関与が、他の植物において示唆されているタバコのオルソログ遺伝子であろうと、当該遺伝子を単独に操作しただけでは、１次わき芽発達を抑制することができないことが明らかになった。
〔参考文献〕
１．Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J. (2013) Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol. 31(8), 688-91.
２．Waibel F, Filipowicz W. (1990) U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribedby RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNApolymerase II-transcribed U-snRNA genes. Nucleic Acids Res. 25;18(12), 3451-8.
１．Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J. (2013) Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol. 31(8), 688-91.
２．Waibel F, Filipowicz W. (1990) U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribedby RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNApolymerase II-transcribed U-snRNA genes. Nucleic Acids Res. 25;18(12), 3451-8.
本発明によれば、タバコ植物の栽培時における不要なわき芽の発達を抑制できるので、栽培の手間およびコストを減らすとともに、収穫される葉の品質の向上につながる。
Claims (24)
- （１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異が、ゲノムに導入されており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体。 - 上記機能抑制が、上記１次わき芽の数または重量を、野生株植物と比べて１／２以下に減少させる、請求項１に記載のタバコ植物体。
- 上記機能抑制が、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子の発現産物であるポリペプチドの存在量の減少である、請求項１または２のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
- 上記機能抑制が、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子の発現産物であるポリペプチドの翻訳量の減少である、請求項３に記載のタバコ植物体。
- 上記機能抑制が、野生株植物と比べたときの、上記少なくとも２遺伝子からのｍＲＮＡの転写量の減少である、請求項３に記載のタバコ植物体。
- 上記機能抑制が、上記少なくとも２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解の促進である、請求項３に記載のタバコ植物体。
- 上記変異が、上記少なくとも２遺伝子に導入されている、請求項１～６のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
- 上記変異が、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって導入されている、請求項７に記載のタバコ植物体。
- 上記変異が、上記ｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドの、上記遺伝子の存在する領域外への挿入である、請求項６に記載のタバコ植物体。
- 上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項９に記載のタバコ植物体。
- ニコチアナ・タバカムまたはニコチアナ・ルスチカに属する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のタバコ植物体。
- タバコ植物体の製造方法であって、
（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異を、タバコ植物体のゲノムに導入するステップを包含しており、
上記機能抑制が、１次わき芽の発達を抑制し、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、タバコ植物体の製造方法。 - 上記導入するステップにおいて生成される個体から、上記１次わき芽の発達が抑制されている個体を選抜するステップをさらに包含している、請求項１２に記載の製造方法。
- 上記選抜するステップにおいて、上記１次わき芽の数または重量が野生株植物と比べて減少している個体を選抜する、請求項１３に記載の製造方法。
- 上記導入するステップが、上記少なくとも２遺伝子に上記変異を導入することを含んでいる、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 上記導入するステップが、自然突然変異、変異原処理、遺伝子の組換え、ゲノム編集または遺伝子ノックアウトによって実施される、請求項１５に記載の製造方法。
- 上記導入するステップが、上記少なくとも２遺伝子から転写されたｍＲＮＡの分解を促進する因子を発現するポリヌクレオチドを、当該少なくとも２遺伝子の存在する領域外に挿入することを含んでいる、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の製造方法。
- 上記因子が、アンチセンスＲＮＡ分子、ＲＮＡｉ分子または共抑制分子である、請求項１７に記載の製造方法。
- １次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体の決定方法であって、
タバコ植物体の一部を採取することによって、サンプルを入手する工程と、
当該サンプルに含まれているゲノム上にある以下の（１）～（３）の遺伝子：
（１）（ａ）ポリヌクレオチドもしくは（ｂ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｃ）ポリヌクレオチドもしくは（ｄ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；
（２）（ｅ）ポリヌクレオチドもしくは（ｆ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｇ）ポリヌクレオチドもしくは（ｈ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方；ならびに
（３）（ｉ）ポリヌクレオチドもしくは（ｊ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子、および（ｋ）ポリヌクレオチドもしくは（ｌ）ポリヌクレオチドを、コード領域として含んでいる遺伝子の、少なくとも一方
のうち少なくとも２遺伝子の機能抑制を引き起こす変異をゲノムから検出する工程と、
上記変異が検出されたタバコ植物体を、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体として決定する工程とを包含しており、
上記（ａ）ポリヌクレオチドは、配列番号１に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｂ）ポリヌクレオチドは、上記（ａ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｃ）ポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｄ）ポリヌクレオチドは、上記（ｃ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｅ）ポリヌクレオチドは、配列番号３に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｆ）ポリヌクレオチドは、上記（ｅ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｇ）ポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｈ）ポリヌクレオチドは、上記（ｇ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｉ）ポリヌクレオチドは、配列番号５に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｊ）ポリヌクレオチドは、上記（ｉ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドであり、
上記（ｋ）ポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列に対する９０％以上の配列同一性を有しているポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであり、
上記（ｌ）ポリヌクレオチドは、上記（ｋ）ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件においてハイブリダイズするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドである、決定方法。 - 請求項１９に記載の決定方法によって決定された、１次わき芽の発達が抑制されているタバコ植物体を交配させることを包含している、タバコ植物体の育種方法。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載のタバコ植物体、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ植物体、請求項１９に記載の決定方法によって決定されたタバコ植物体、または請求項２０に記載の育種方法によって得られたタバコ植物体の、子孫または当該タバコ植物体の交配によって得られた育種後代。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載のタバコ植物体、請求項１２～１８のいずれか１項に記載の製造方法によって得られたタバコ植物体、請求項１９に記載の決定方法によって決定されたタバコ植物体、請求項２０に記載の育種方法によって得られたタバコ植物体、または請求項２１に記載の子孫もしくは育種後代から収穫された、葉たばこ。
- 請求項２２に記載の葉たばこから得られた、乾燥たばこ。
- 請求項２３に記載の乾燥たばこから得られた、たばこ製品。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP17900586.3A EP3597743A4 (en) | 2017-03-16 | 2017-09-12 | TOBACCO PLANT AND MANUFACTURING METHOD FOR IT |
| BR112019019030A BR112019019030A2 (pt) | 2017-03-16 | 2017-09-12 | planta de tabaco e método de produção da mesma |
| US16/569,045 US11591606B2 (en) | 2017-03-16 | 2019-09-12 | Tobacco plant and production method thereof |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2017-051976 | 2017-03-16 | ||
| JP2017051976 | 2017-03-16 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| US16/569,045 Continuation US11591606B2 (en) | 2017-03-16 | 2019-09-12 | Tobacco plant and production method thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2018168016A1 true WO2018168016A1 (ja) | 2018-09-20 |
Family
ID=63522860
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2017/032871 WO2018168016A1 (ja) | 2017-03-16 | 2017-09-12 | タバコ植物体とその製造方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11591606B2 (ja) |
| EP (1) | EP3597743A4 (ja) |
| BR (1) | BR112019019030A2 (ja) |
| WO (1) | WO2018168016A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022181478A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 日本たばこ産業株式会社 | タバコ属植物体およびその製造方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7465974B2 (ja) * | 2020-07-17 | 2024-04-11 | 日本たばこ産業株式会社 | ニコチアナ属ｆ１ハイブリッドおよびその利用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016057515A2 (en) * | 2014-10-06 | 2016-04-14 | Altria Client Services Llc | Genetic control of axillary bud growth in tobacco plants |
-
2017
- 2017-09-12 WO PCT/JP2017/032871 patent/WO2018168016A1/ja unknown
- 2017-09-12 EP EP17900586.3A patent/EP3597743A4/en active Pending
- 2017-09-12 BR BR112019019030A patent/BR112019019030A2/pt unknown
-
2019
- 2019-09-12 US US16/569,045 patent/US11591606B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016057515A2 (en) * | 2014-10-06 | 2016-04-14 | Altria Client Services Llc | Genetic control of axillary bud growth in tobacco plants |
Non-Patent Citations (22)
| Title |
|---|
| DATABASE Uniprot [o] 2014, "PREDICTED: scarecrow-like protein 22 isoform XI [Nicotiana sylvestris", Database accession no. XP_009803487 * |
| DATABASE Uniprot [o] 2016, "PREDICTED: scarecrow-like protein 22 [Nicotiana tabacum", Database accession no. XP_016487313 * |
| DATABASE Uniprot [o] 2016, "PREDICTED: scarecrow-like protein 22 [Nicotiana tabacum", Database accession no. XP_016491014 * |
| DATABASE Uniprot [o] 2016, "PREDICTED: scarecrow-like protein 22 isoform XI [Nicotiana tabacum", Database accession no. XP_016481267 * |
| DATABASE Uniprot [o] 2016, "PREDICTED: scarecrow-like protein 6 [Nicotiana tabacum", Database accession no. XP_016487314 * |
| DATABASE Uniprot [o] 2016, "PREDICTED: scarecrow-like protein 6 isoform XI [Nicotiana tabacum", Database accession no. XP_016437509 * |
| DAVID-SCHWARTZ RBOROVSKY YZEMACH HPARAN I.: "CaHAM is autoregulated and regulates CaSTM expression and is required for shoot apical meristem organization in pepper", PLANT SCIENCE, 2013, pages 203 - 204 |
| ENGSTROM EMANDERSEN CMGUMULAK-SMITH JHU JORLOVA ESOZZANI RBOWMAN JL.: "Arabidopsis homologs of the petunia hairy meristem gene are required for maintenance of shoot and root indeterminacy", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 155, no. 2, 2011, pages 735 - 750, XP055541298, doi:10.1104/pp.110.168757 |
| ENGSTROM, E. M. ET AL.: "Arabidopsis Homologs of the Petunia HAIRY MERISTEM Gene Are Required for Maintenance of Shoot and Root Indeterminacy", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 155, 2011, pages 735 - 750, XP055541298 * |
| LI JFNORVILLE JEAACH JMCCORMACK MZHANG DBUSH JCHURCH GMSHEEN J.: "Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9", NAT BIOTECHNOL., vol. 31, no. 8, 2013, pages 688 - 91 |
| SAIKI, R. K. ET AL., SCIENCE, vol. 230, 1985, pages 1350 - 1354 |
| SAIKI, R. K. ET AL., SCIENCE, vol. 239, 1988, pages 487 - 491 |
| SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS |
| SCHULZE SSCHAFER BNPARIZOTTO EAVOINNET OTHERES K., LOST MERISTEMS GENES REGULATE CELL DIFFERENTIATION OF CENTRAL ZONE DESCENDANTS IN ARABIDOPSIS SHOOT MERISTEMS THE PLANT JOURNAL, vol. 64, no. 4, 2010, pages 668 - 678 |
| SCHULZE, S. ET AL.: "LOST MERISTEMS genes regulate celJ differentiation of central zone descendants in Arabidopsis shoot meristems", THE PLANT JOURNAL, vol. 64, no. 4, 2010, pages 668 - 678, XP055031760 * |
| SCHWARTZ, D. R. ET AL.: "CaHAM is autoregulated and regulates CaSTM expression and is required for shoat apical meristem organization in pepper", PLANT SCIENCE, vol. 203, no. 204, 2013, pages 8 - 16, XP028978706 * |
| See also references of EP3597743A4 |
| SIERRO, N. ET AL.: "The tobacco genome sequence and its comparison with those of tomato and potato", NAT. COMMUN., vol. 5, 2014, pages 3833, XP055378379 * |
| SOUTHERN, E. M., JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY, vol. 98, 1975, pages 503 |
| STUURMAN JJAGGI FKUHLEMEIER C.: "Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated signal from differentiating cells", GENES & DEVELOPMENT, vol. 16, 2002, pages 2213 - 2218 |
| WAIBEL FFILIPOWICZ W.: "U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribedby RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNApolymerase II-transcribed U-snRNA genes", NUCLEIC ACIDS RES. 25, vol. 18, no. 12, 1990, pages 3451 - 8 |
| WESLEY ET AL., PLANT J., vol. 27, 2001, pages 581 - 590 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022181478A1 (ja) * | 2021-02-26 | 2022-09-01 | 日本たばこ産業株式会社 | タバコ属植物体およびその製造方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3597743A1 (en) | 2020-01-22 |
| EP3597743A4 (en) | 2020-12-23 |
| US20200002711A1 (en) | 2020-01-02 |
| BR112019019030A2 (pt) | 2020-04-22 |
| US11591606B2 (en) | 2023-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11578336B2 (en) | Tobacco plant and method for manufacturing same | |
| JP6445006B2 (ja) | ウイルス抵抗性タバコおよびその作出方法 | |
| US11591610B2 (en) | Tobacco plant and production method thereof | |
| WO2021210688A1 (ja) | 低アルカロイド含量のタバコ属植物体およびその製造方法 | |
| Dunemann et al. | Using CRISPR/Cas9 to produce haploid inducers of carrot through targeted mutations of centromeric histone H3 (CENH3) | |
| US11591606B2 (en) | Tobacco plant and production method thereof | |
| EP3095863B1 (en) | Parthenocarpy regulation gene and use thereof | |
| EA029226B1 (ru) | Дефект гена ckx3 и по крайней мере одного другого гена ckx в растении или растительной клетке, которые приводят к улучшенным признакам | |
| CN107779456B (zh) | 蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其在提高种子脂肪酸含量中的应用 | |
| JP2021519098A (ja) | 植物におけるアミノ酸含有量の調節 | |
| JP6012016B2 (ja) | 単為結果制御遺伝子およびその利用 | |
| US20240032498A1 (en) | Plant body of genus nicotiana and production method therefor | |
| US20230183725A1 (en) | Method for obtaining mutant plants by targeted mutagenesis | |
| JP2023111899A (ja) | 短葯形質を有するイネ、及びその製造方法 | |
| JP2021519064A (ja) | 植物体における還元糖含有量の調節 | |
| JP2007060979A (ja) | システインプロテアーゼ遺伝子を導入した葯の裂開を抑制する植物 | |
| JP2019126339A (ja) | 種子のサイズが増大した植物の製造方法 | |
| Weinhold | Manipulation of the plant microbiome: Antimicrobial peptide expression in Nicotiana attenuata |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 17900586 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| REG | Reference to national code |
Ref country code: BR Ref legal event code: B01A Ref document number: 112019019030 Country of ref document: BR |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2017900586 Country of ref document: EP Effective date: 20191016 |
|
| ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 112019019030 Country of ref document: BR Kind code of ref document: A2 Effective date: 20190913 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: JP |