BR112019019030A2 - planta de tabaco e método de produção da mesma - Google Patents
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Abstract
é fornecida uma planta de tabaco que é apropriada para cultivação para colheita de tabacos em folhas. a presente invenção engloba (i) uma planta de tabaco em que uma mutação para suprimir o desenvolvimento de brotos axilares primários é introduzida, (ii) um método de obter a planta de tabaco, (iii) uma colheita a partir da planta de tabaco, e (iv) um produto processado da colheita.
Description
PLANTA DE TABACO E MÉTODO DE PRODUÇÃO DA MESMA
Campo Técnico [001] A presente invenção refere-se a (i) uma planta de tabaco que é apropriada para cultivo para colheita de tabacos em folha, (ii) um método de obter a planta de tabaco, (iii) uma colheita a partir da planta de tabaco, e (iv) um produto processado da colheita.
Fundamentos [002] No processo do crescimento de plantas de semente, embriões em sementes se desenvolvem de modo a formar cotilédones e meristemas apicais (meristemas apicais de rebento). Divisão celular do meristema apical (meristema apical de rebento) leva os primórdios da folha a serem sequencialmente formados, e leva os meristemas axilares a serem formados em um lado adaxial dos primórdios da folha. Os meristemas axilares servem, então, como meristemas apicais (meristemas apicais de rebento) e resultam em brotos axilares. Durante crescimento vegetative de uma planta, geralmente, o desenvolvimento de brotos axilares está temporariamente em um estado dormente (suprimido). Em um caso onde meristemas apicais (meristemas apicais de rebento) de um rebento primário são transicionados de um estado de crescimento vegetative para um estado de crescimento reprodutivo, ou em um caso onde os meristemas apicais (meristemas apicais de rebento) morrem, o desenvolvimento dos brotos axilares não está mais em um estado dormente e é promovido. Com relação ao desenvolvimento de brotos axilares, vários relatórios de pesquisa são encontrados tratando de plantas solanáceas (por exemplo, tomates e tabacos) e outras plantas (por
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2/93 exemplo, arroz e Arabidopsis thaliana.
[003] Uma planta de tabaco, que é cultivada para colheita das folhas, é submetida à poda de topo (corte de uma haste de uma porção apical com uma flor) durante cultivação, para a finalidade de intensificar a qualidade e quantidade de folhas a serem colhidas (por exemplo, para a finalidade de acumular composição das folhas e maturação e expansão das folhas). Poda de topo leva os brotos axilares da planta de tabaco a começar desenvolvimento vigoroso a partir das bases de folhas (axila foliar). O desenvolvimento de brotos axilares naturalmente consome nutrientes e, assim, causa uma diminuição relativa em nutrientes que são supridos para as folhas a serem colhidas. Portanto, o desenvolvimento e a excrescência de brotos axilares leva a uma diminuição em qualidade e rendimento de folhas a serem colhidas. Portanto, no cultivo de uma planta de tabaco para colheita de tabacos em folha, brotos axilares são submetidos a, por exemplo, controle tal como remoção ou supressão do desenvolvimento.
[004] Exemplos de um método de remover um broto axilar englobam um método em que um broto axilar é apanhado à mão ou por máquina. Apanhar um broto axilar à mão envolve (i) uma grande quantidade de trabalho (e, consequentemente, um aumento em custos de mão-de-obra) e (ii) um problema de baixa eficácia. Apanhar um broto axilar por máquina é menos preciso do que apanhar manualmente e, assim, ocasiona o problema de danificar uma planta. Exemplos de um método de suprimir o desenvolvimento de um broto axilar englobam um método em que um agroquímico é usado. O uso de agroquímicos envolve problemas tal como aplicações repetidas para manter
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3/93 um efeito, um impacto sobre o crescimento de uma planta, um impacto sobre folhas a serem colhidas devido a resíduos de agroquímicos, e um aumento em custo de inspeção para resíduos de agroquímicos.
[005] As seguintes são reveladas de literaturas não patentárias 1 a 4 com relação ao desenvolvimento de brotos axilares de plantas diferentes das plantas de tabaco.
[006] Foi relatado que em um mutante em que uma mutação é introduzida em gene de petúnia HAIRLY MERISTRM (HAM), tricomas são ectopicamente formadas em meristemas apicais de rebento (Literatura não patentária 1). Também foi relatado que LOST MERISTEMS (LOM) , que é um ortólogo do gene HAM em Arabidopsis thaliana, é um gene causador de supressão de formação de broto axilar em um mutante (Literatura não patentária 2) . Em Arabidopsis thaliana, pelo menos quatro genes são previstos como homólogos de HAM. Quando HAM1 e outros homólogos de HAM (2 ou 3 homólogos) sofrem mutação simultaneamente, um aumento no número de mutações levou a formação de broto axilar a ser suprimida ainda mais do que no caso de mutação de HAM1 apenas (Literaturas não patentárias 2 e 3). Como um homólogo de gene HAM pimentão, um tipo foi relatado. A mutação de um tal gene levou a formação de brotos axilares a ser completamente suprimida (Literatura não patentária 4) .
Lista de Citações [Literatura não patentária] [Literatura não patentária 1] [007] Stuurman J, Jaggi F, Kuhlemeier C. (2002) Shoot meristem maintenance is controlled by a GRAS-gene mediated
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4/93 signal from differentiating cells. Genes & Development 16: 2213-2218.
[Literatura não patentária 2] [008] Schulze S, Schafer BN, Parizotto EA, Voinnet 0, Theres K. (2010) LOST MERISTEMS genes regulate cell differentiation of central zone descendants in Arabidopsis shoot meristems The Plant Journal 64(4): 668-678.
[Literatura não patentária 3] [00 9] Engstrom EM, Andersen CM, Gumulak-Smith J, Hu J, Orlova E, Sozzani R, Bowman JL. (2011) Arabidopsis homologs of the petunia hairy meristem gene are required for maintenance of shoot and root indeterminacy. Plant Physiology 155(2): 735-750.
[Literatura não patentária 4] [0010] David-Schwartz R, Borovsky Y, Zemach H, Paran I. (2013) CaHAM is autoregulated and regulates CaSTM expression and is required for shoot apical meristem organization in pepper. Plant Science 203-204: 8-16.
Sumário da Invenção
Problema Técnico [0011] No entanto, o que pode ser conhecido a partir da literatura acima é apenas que os brotos axilares podem ser reduzidos em plantas diferentes das plantas de tabaco. Portanto, ainda não está claro como obter uma planta de tabaco em que os problemas resultantes do desenvolvimento de brotos axilares são resolvidos ou reduzidos e que deve ser cultivada para colheita de tabacos em folha.
[0012] Um objeto da presente invenção é fornecer (i) uma planta de tabaco que é apropriada para cultivo para colheita de tabacos em folha, (ii) um método de obter a
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5/93 planta de tabaco, (iii) uma colheita a partir da planta de tabaco, e (iv) um produto processado da colheita.
Solução para o problema [0013] Em vista dos problemas acima, os inventores da presente invenção identificaram um gene que é esperado estar envolvido no desenvolvimento de brotos axilares em plantas de tabaco e, então, buscaram um efeito vantajoso que poderia ser obtido por supressão da função do gene em uma planta de tabaco. Isto levou à conclusão da presente invenção.
[0014] Especificamente, a fim de atingir o objeto, uma planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é uma planta de tabaco em que uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3) é introduzida em um genoma:
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (a) ou um polinucleotideo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (c) ou um polinucleotideo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (e) ou um polinucleotideo (f) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (g) ou um polinucleotideo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (i) ou um polinucleotideo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (k) ou um polinucleotideo (1), a supressão funcional suprimindo desenvolvimento de brotos axilares primários, o polinucleotideo (a) sendo um polinucleotideo
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6/93 codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotideo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo (f) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (g) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotídeo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (i) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos
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7/93 representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotídeo (j) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (k) sendo um polinucleotídeo codificando um poiipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotídeo (1) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.
[0015] Um método de produção de planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é um método de produzir uma planta de tabaco, incluindo a etapa de:
(A) introduzir, em um genoma de uma planta de tabaco, uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3):
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou um polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (k) ou um polinucleotídeo (1), a supressão funcional suprimindo desenvolvimento de
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8/93 brotos axilares primários, o polinucleotideo (a) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotídeo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo (f) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (g) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotídeo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (i) sendo um polinucleotídeo
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9/93 codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotídeo (j) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (k) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotídeo (1) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.
[0016] Um método de determinação de acordo com um aspecto da presente invenção é um método de determinar uma planta de tabaco em que desenvolvimento de brotos axilares primários é suprimido, o método incluindo as etapas de:
(A) obter uma amostra por coleta de uma parte de uma planta de tabaco;
(B) detectar, a partir de um genoma incluído na amostra, uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3) no DNA genômico:
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f); e um gene contendo, como uma região codificante, um
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10/93 polinucleotideo (g) ou um polinucleotideo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (i) ou um polinucleotideo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotideo (k) ou um polinucleotideo (1); e (C) determinar que uma planta de tabaco, em que a mutação foi detectada, é uma planta de tabaco em que o desenvolvimento dos brotos axilares primários é suprimido, o polinucleotideo (a) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotideo (b) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (a) sob condições estringentes, o polinucleotideo (c) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotideo (d) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (c) sob condições estringentes, o polinucleotideo (e) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotideo (f) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (e) sob condições estringentes, o polinucleotideo (g) sendo um polinucleotideo
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11/93 codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotideo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (i) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotídeo (j) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (k) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotídeo (1) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.
Efeitos Vantajosos da Invenção [0017] A presente invenção pode fornecer com vantagem (i) uma planta de tabaco que é apropriada para cultivo para colheita de tabacos em folha, (ii) um método de obter a planta de tabaco, (iii) uma colheita a partir da planta de tabaco, e (iv) um produto processado da colheita.
Breve Descrição dos Desenhos [0018] Figura 1 é uma vista mostrando os resultados de determinar níveis de expressão de mRNA de NtLOMl em uma planta de tabaco (indivíduo Tl).
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12/93 [0019] Figura 2 é uma vista mostrando os resultados de determinar nivel de expressão de mRNA de NtLOM2 e NtLOM3 em uma planta de tabaco (indivíduo Tl).
[0020] Figura 3 é uma vista mostrando os resultados de determinar niveis de expressão de mRNA de NtLOM2 e NtLOM3 em uma planta de tabaco (indivíduo T2).
[0021] Figura 4 é uma vista mostrando os resultados de determinar niveis de expressão de mRNA de NtLOM2 e NtLOM3 em uma planta de tabaco (indivíduo T2).
[0022] Figura 5 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de formação de broto axilar em uma planta de tabaco de acordo com um exemplo da presente invenção.
[0023] Figura 6 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de formação de broto axilar em uma planta de tabaco de acordo com outro exemplo da presente invenção.
[0024] Figura 7 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de formação de broto axilar em uma planta de tabaco de acordo com um exemplo comparativo.
[0025] Figura 8 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de formação de broto axilar em uma planta de tabaco de acordo com outro exemplo comparativo.
[0026] Figura 9 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de formação de broto axilar em uma planta de tabaco de acordo com outro exemplo comparativo.
[0027] Figura 10 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de niveis de expressão de NtLOM2 e NtLOM3 e formação de broto axilar em uma planta de tabaco de acordo com outro exemplo comparativo.
Descrição de Modalidades [1. Planta de tabaco]
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13/93 [0028] Uma modalidade da presente invenção fornece uma planta de tabaco em que uma mutação é introduzida no genoma, cuja mutação causa supressão de funções de, pelo menos, dois genes de três genes específicos. Deve ser notado que a supressão funcional acima é para suprimir o desenvolvimento de brotos axilares primários.
[0029] Exemplos concretos dos três genes específicos englobam (1) a (3) abaixo.
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou um polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (k) ou um polinucleotídeo (1).
[0030] Os polinucleotídeos incluídos nos genes (1) a (3) são como a seguir. O polinucleotídeo (a) é um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1. O polinucleotídeo (b) é um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes. O polinucleotídeo (c) é um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência
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14/93 de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2. 0 polinucleotídeo (d) é um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes. 0 polinucleotídeo (e) é um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3. O polinucleotídeo (f) é um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes. O polinucleotídeo (g) é um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4. O polinucleotídeo (h) é um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes. O polinucleotídeo (i) é um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5. O polinucleotídeo (j) é um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes. O polinucleotídeo (k) é um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6. O polinucleotídeo (1) é um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.
[0031] Em comparação com plantas de tipo selvagem, a planta de tabaco ou exibe (i) brotos axilares primários que
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15/93 são diminuídos em número ou peso (por exemplo, não mais do que 1/2 de plantas de tipo selvagem) ou (ii) sem broto axilar primário (ver Exemplos descritos abaixo). Especificamente, um processo de remover brotos axilares da planta de tabaco é necessário apenas uma única vez ou é desnecessário. Isto permite que a quantidade de mão-deobra, que está envolvida no controle de brotos axilares em cultivo de uma planta de tabaco para colheita de tabacos em folha, seja menor que uma fração da quantidade de mão-deobra envolvida em tal controle convencional de brotos axilares.
[0032] Como usado aqui, planta de tabaco e tabaco englobam (i) um indivíduo completo (tal como uma planta madura, uma plântula, e uma semente), (ii) tecido (tal como uma folha, uma haste, uma flor, uma raiz, um órgão reprodutor, um embrião, e uma parte de qualquer um destes), e (iii) um produto seco de qualquer um destes.
[0033] Como usado aqui, broto axilar refere-se a tanto (i) um broto que é gerado a partir de um meristema axilar formado em uma axila foliar de um primórdio de folha como (ii) um rebento obtido como um resultado do desenvolvimento do broto. Após a poda de topo, brotos axilares se desenvolvem em uma ordem de brotos axilares primários, brotos axilares secundários e, então, brotos axilares terciários, em uma base da mesma folha. Primeiro, após a poda de topo, os brotos axilares primários se desenvolvem. Após os brotos axilares primários serem removidos, os brotos axilares secundários se desenvolvem. O desenvolvimento de um broto axilar significa que o broto axilar, que permaneceu como tecidos diferenciados do
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16/93 meristema axilar, começa um vigoroso desenvolvimento devido a, por exemplo, remoção de um ápice do rebento (poda de topo), de modo que o broto axilar cresce e se estende.
[0034] O número ou peso de brotos axilares significa o número ou um peso total (peso fresco) de brotos axilares primários que se desenvolveram em um indivíduo ou foram colhidos. O número ou peso, principalmente de brotos axilares primários, é aqui medido.
[0035] Como usado aqui, identidade de sequência (de uma sequência de aminoácidos) significa uma razão percentual em que uma sequência (aminoácido) implicada corresponde a uma sequência de referência (aminoácido) . Observa-se que uma parte da sequência, cuja parte não corresponde, é uma parte em que um residue de aminoácido é substituído, adicionado, deletado ou inserido.
[0036] Observa-se que o termo polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por [...], que especifica o polipeptídeo com uso de uma sequência de aminoácidos listada em uma listagem de sequência, significa um polipeptídeo de tipo selvagem. O polipeptídeo de tipo selvagem significa um polipeptídeo que está tipicamente presente em um planta Nicotiana descrita depois. Como usado aqui, os termos polipeptídeo e proteina têm substancialmente o mesmo significado e podem ser, assim, usados de modo interpermutável.
[0037] Portanto, um polipeptídeo, que é diminuído em abundância na planta de tabaco, precisa somente ser um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com cada uma das sequências de aminoácidos listadas
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17/93 na listagem de sequências. A identidade maior de sequência é mais preferível (por exemplo, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% ou maior).
[0038] A diminuição em abundância de um polipeptídeo significa a presença do polipeptídeo em uma quantidade de 70% ou menor, 60% ou menor, 50% ou menor, 40% ou menor, 30% ou menor, 20% ou menor, 10% ou menor, 5% ou menor, ou 1% ou menor, com relação à abundância de um polipeptídeo de tipo selvagem como uma referência. A abundância do polipeptídeo com relação à do polipeptídeo de tipo selvagem como uma referência pode ser selecionada, conforme apropriado, a partir dos valores acima que resultam em uma diminuição no número ou peso de brotos axilares primários.
[0039] É preferível que a diminuição em abundância acima descrita de um polipeptídeo na planta de tabaco seja, com estabilidade, geneticamente herdada por célula cultivada, calo, protoplasto, semente, e descendente, qualquer um sendo obtido a partir da planta de tabaco. Portanto, a planta de tabaco pode ser um indivíduo desenvolvido a partir da célula cultivada, calo, protoplasto, semente, ou descendente, qualquer um sendo produzido através de operação artificial. Em adição, estes materiais, a partir dos quais o indivíduo se desenvolve, são também englobados no escopo da presente invenção.
[0040] O escopo da planta de tabaco pode englobar adicionalmente progênie criada obtida por cruzamento. Reprodução com uso de mutantes tem sido feita em muitas espécies de plantas. Exemplos representativos de tais espécies de plantas englobam arroz, trigo, cevada, e soja. Por exemplo, um mutante isolado de uma população de
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18/93 mutantes tratada com uso de um mutagen tem múltiplas mutações diferentes em uma região de um gene alvo. Em geral, assim, retrocruzamento deve ser realizado para remover mutações em excesso. Neste cruzamento, um traço desejado (desenvolvimento suprimido de brotos axilares primários) do mutante pode ser introduzido em um cultivar existente por cruzamento do mutante com o cultivar tendo traço excelente. A progênie criada assim obtida pode ser
| uma variedade obtida | por | adição de | valores | elevados a | um |
| cultivar existente. | |||||
| [0041] Observe-se | que | o traço | desejado | do mutante | é |
| derivado de mutações | introduzidas | em uma | pluralidade | de |
posições (por exemplo, uma pluralidade de genes) em um genoma. Para retrocruzamento eficiente, é necessário, portanto, selecionar previamente os indivíduos tendo as mutações. Na seleção dos indivíduos, é vantajoso ser capaz de detectar facilmente (i) se ou não as mutações estão presentes nos indivíduos e (ii) se as mutações são homozigotas ou heterozigotas. As mutações podem ser detectadas por um método (descrito abaixo) para detectar mutações nos genes. Além da perspectiva acima, é preferível que linhagens tendo uma alta taxa de retorno de cultivar (isto é, a proporção de uma região genômica derivada de cultivar para toda a região genômica) sejam obtidas com menores tempos de cruzamento. É possível obter ainda menos tempos de cruzamento, por exemplo, seleção assistida por marcador (MAS), que usa um marcador de fundo indicativo de um polimorfismo entre o mutante e o cultivar existente. 0 marcador de fundo indicativo de um polimorfismo pode ser, por exemplo, SNP ou repetição de sequência simples (SSR),
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19/93 cada um dos quais é conhecido em tabaco. Além do marcador existente, exemplos de um novo marcador abrangem as seguintes diferenças (a) e (b) que são identificadas pela determinação das respectivas sequências genômicas do mutante e do cultivar existente para uso no cruzamento e, então, fazendo uma comparação entre as sequências genômicas: (a) uma diferença na sequência de nucleotídeos e (b) uma diferença no número de sequências repetidas em um genoma.
[0042] Gene e genoma serão descritos abaixo tomando Nicotians tabacum (N. tabacum) como uma referência. Nicotians tabacum (N. tabacum), que serve como uma referência na descrição abaixo, é um anfidiplóide e tem tanto um genoma S como um genoma T derivados de Nicotians sylvestris e Nicotians tomentosiformis, respectivamente, cada um dos quais é uma espécie ancestral do mesmo. Em N. tabacum, na maioria dos casos, genes indicados por um nome idêntico estão presentes em cada um de um genoma S e um genoma T. Os três genes descritos acima incluem, cada, dois alelos em um genoma S e dois alelos em um genoma T (isto é, o total de 4 alelos no genoma de N. tabacum).
[0043] Observa-se que, em uma região de codificação de uma planta de tabaco, uma sequência de nucleotídeos de parte (não de todos) de genes codificando polipeptideos, que possui substancialmente a mesma função entre espécies, pode ter (i) 1% a vários % de diferença entre cultivares e (ii) aproximadamente 10% ou menor diferença entre um cultivar e espécies selvagens.
[0044] Um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1 é codificado por,
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20/93 por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 7. Um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 8. Estes polinucleotídeos são cada cDNA de NtLOM3 demonstrado em Exemplos descritos depois. SEQ ID NO: 7 representa uma sequência de cDNA de NtLOM3 de um genoma S. SEQ ID NO: 8 representa uma sequência de cDNA de NtLOM3 de um genoma T. SEQ ID NOs: 13 e 14 representam sequências de nucleotídeos de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtLOM3.
[0045] Um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 9. Um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 10. Estes polinucleotídeos são cada cDNA de NtLOM2 demonstrado em Exemplos descritos depois. SEQ ID NO: 9 representa uma sequência de cDNA de NtLOM2 de um genoma S. SEQ ID NO: 10 representa uma sequência de cDNA de NtLOM2 de um genoma T. SEQ ID NOs: 15 e 16 representam sequências de nucleotídeos de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtLOM2.
[0046] Um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 11. Um
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21/93 polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6 é codificado por, por exemplo, um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos representada por SEQ ID NO: 12. Estes polinucleotídeos são cada cDNA de NtLOMl demonstrado em Exemplos descritos depois. SEQ ID NO: 11 representa uma sequência de cDNA de NtLOMl de um genoma S. SEQ ID NO: 12 representa uma sequência de cDNA de NtLOMl de um genoma T. SEQ ID NOs: 17 e 18 representam sequências de nucleotídeos de um genoma S e um genoma T, respectivamente, de gene NtLOMl.
[0047] Existem métodos para isolar ortólogos de genes. Exemplos de tais métodos bem conhecidos dos técnicos no assunto englobam uma técnica de hibridação (Southern, E. M., Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975) e uma técnica de reação de cadeia polimerase (PCR) (Saiki, R. K., et al. Science, vol. 230, 1350-1354, 1985, Saiki, R. K. et al. Science, vol. 239, 487-491, 1988) . Portanto, os técnicos no assunto podem facilmente isolar um gene ortólogo do gene (1) a partir de várias plantas enquanto, por exemplo, (i) um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 7 ou uma parte do polinucleotídeo está servindo como uma sonda ou (ii) oligonucleotídeo hibridando com o polinucleotídeo sob condições estringentes está servindo como um iniciador. Do mesmo modo, os técnicos no assunto podem facilmente isolar um gene ortólogo do gene (1) a partir de várias plantas com uso de (i) um polinucleotídeo tendo uma sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 8 ou (ii) uma parte do polinucleotídeo. Especialistas lendo estas descrições podem
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22/93 facilmente (i) isolar um gene ortólogo do gene (2) com base na sequência de nudeotídeos de SEQ ID NO: 9 ou SEQ ID NO: 10 (ou em uma parte da sequência de nudeotídeos e (ii) isolar um gene ortólogo a partir do gene (3) com base na sequência de nudeotídeos de SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12 (ou em uma parte da sequência de nudeotídeos) .
[0048] Observa-se que as condições estringentes significam, em geral, condições sob as quais (i) um polinucleotídeo fita dupla específico para uma sequência de nudeotídeos é formado e (ii) a formação de um polinucleotídeo fita dupla não específico é marcadamente suprimida. Em outras palavras, as condições estringentes podem ser expressas como condições sob as quais hibridação é realizada a uma temperatura em uma faixa de (i) uma temperatura de fusão (Tm) de um híbrido de ácidos nucleicos que são altamente homólogos a cada outro (por exemplo, um polinucleotídeo fita dupla correspondendo perfeitamente a uma sonda) a (ii) 15°C menor do que a temperatura de fusão (Tm) , preferivelmente 10°C menor do que a temperatura de fusão (Tm), mais preferivelmente 5°C menor do que a temperatura de fusão (Tm) . Exemplos das condições estringentes englobam condições sob as quais hibridação é realizada com uso de uma solução tampão comum para hibridação, a uma temperatura de 68°C, e durante um período de 20 horas. Em um exemplo, hibridação pode ser realizada em uma solução tampão (consistindo de 0,25M Na2HPO4, pH 7,2, 7% SDS, 1 mM EDTA, e 1 x solução de Denhardt) durante 16 horas a 24 horas a uma temperatura em uma faixa de 60°C a 68°C, preferivelmente a 65°C, ainda preferivelmente a 68°C e, então, lavagem pode ser realizada duas vezes em uma
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23/93 solução tampão (consistindo de 20 mM Na2HPC>4, pH 7,2, 1% SDS, e 1 mM EDTA) durante 15 minutos a uma temperatura em uma faixa de 60°C a 68°C, preferivelmente a 65°C, ainda preferivelmente a 68°C. Em outro exemplo, pré-hibridação é realizada durante a noite a 42 °C em uma solução de hibridação (incluindo 25% formamida ou 50% formamida (para uma condição estringente), 4 χ SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), 50 mM Hepes pH 7,0, 10 χ solução de Denhardt, e 2 0 pg/ml DNA de esperma de salmão desnaturado) e, então, hibridação é realizada por adição de uma sonda marcada ao mesmo e mantendo uma resultante solução a 42 °C durante a noite. Em lavagem após a hibridação, condições para uma solução de lavagem e uma temperatura são aproximadamente 1 χ SSC, 0,1% SDS, 37°C, aproximadamente 0,5 χ SSC, 0,1% SDS, 42°C para uma condição mais rigorosa, aproximadamente 0,2 χ SSC, 0,1% SDS, 65°C para uma condição ainda mais severa. Pode ser assim esperado que à medida que condições para a lavagem após a hibridação se tornam mais estringentes, DNA tendo maior homologia para uma sequência de uma sonda é isolado. No entanto, as combinações acima indicadas de condições em SSC, SDS, e temperatura são apenas exemplos. Os técnicos no assunto podem alcançar uma estringência similar ao acima, combinando adequadamente os elementos descritos acima ou outros (por exemplo, uma concentração de sonda, um comprimento de sonda e um período de tempo para uma reação de hibridação) que determinam a estringência da hibridação. Por exemplo, os técnicos no assunto podem facilmente obter tais genes por referência a Molecular Cloning (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2a. ed.,
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Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive
Plainview, NY (1989)).
| [0049] 0 termo | pelo menos um de | gene | (anterior) | .. e | |
| gene | (posterior) | . como usado aqui | para | especificar | um |
| gene | refere-se a | qualquer um dos seguintes genes e | uma |
combinação dos mesmos:
um gene (anterior) (gene em genoma S);
um gene (posterior) (gene em genoma T); e uma combinação do gene (anterior) (gene em genoma S) e do gene (posterior) (gene em genoma T).
[0050] Em uma modalidade específica em que mutações são introduzidas em dois genes dos genes (1) a (3) acima, a planta de tabaco tem as mutações acima descritas em um ou mais alelos, por gene, selecionados dentre (i) pelo menos um (um ou dois) de dois alelos em genoma S e (ii) pelo menos um (um ou dois) de dois alelos em genoma T. Especificamente, a planta de tabaco de acordo com a modalidade especifica tem mutações em dois genes selecionados dentre NtLOMl até NtLOM3 que estão no genoma.
[0051] Como descrito acima, uma planta de tabaco em muitos casos tem um conjunto de genes (isto é, dois genes) em cada de um genoma T e um genoma S. Portanto, a fim de que as funções dos genes desapareçam completamente como um resultado da introdução da mutação em genes, é necessário introduzir as mutações em todos dos (quatro) genes no genoma T e no genoma S. Observa-se, no entanto, que em uma planta de tabaco em que a função de um gene tinha desaparecido completamente devido à mutação, o desenvolvimento de brotos axilares primários não é suprimido (ver Exemplos Comparativos descritos depois).
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25/93 [0052] Observa-se que a planta de tabaco de acordo com uma modalidade da presente invenção preferivelmente tem mutações em, pelo menos, dois genes e, mais preferivelmente, tem mutações em dois genes. Em uma planta de tabaco mais preferível, o número de alelos em que mutações devem ser introduzidas é 8. Em uma planta de tabaco preferível, é desnecessário que a mutação seja introduzida em todos os 8 alelos. Isto é porque a supressão do desenvolvimento de brotos axilares primários pode ser observada em, por exemplo, uma planta de tabaco em que as mutações são introduzidas em 6 ou mais (isto é, 6 ou 7) alelos dentre os 8 alelos.
[0053] Como descritos depois em Exemplos, dois genes da planta de tabaco, em que as mutações são introduzidas, são particularmente preferivelmente uma combinação de NtLOM2 e NtLOM3. Em uma modalidade da combinação destes genes, a planta de tabaco tem mutações em 6 alelos e não tem mutações em 2 alelos, sobre 2 genes. Na modalidade, a planta de tabaco tem mutações em: 4 alelos de NtLOM2 e 2 alelos de NtLOM3; 3 alelos de NtLOM2 e 3 alelos de NtLOM3; ou 2 alelos de NtLOM2 e 4 alelos de NtLOM3.
[0054] Como usado aqui, supressão funcional de um gene significa um estado em que o gene em um genoma não está preenchendo sua função original. Portanto, supressão funcional de um gene é um termo englobando (i) ruptura de gene, (ii) mutação de gene, e (iii) expressão suprimida de gene por outro gene (incluindo um gene exógeno).
[0055] Ruptura de gene significa que (i) um gene, que está originalmente presente em um genoma, não está presente no genoma ou (ii) um produto transcrito não é produzido a
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| partir de | um | gene em um genoma. | Mutação ( | de gene |
| significa, | por | exemplo, (i) uma mutação | de um gene | (isto é, |
| diminuição | ou | deficiência da função) | de modo | que um |
poiipeptídeo funcional original não é produzido, (ii) uma mutação do gene de modo que embora um poiipeptídeo funcional seja produzido, a quantidade do poiipeptídeo funcional produzido é diminuída, ou (iii) uma mutação do gene de modo que, embora um poiipeptídeo funcional seja produzido, a estabilidade do poiipeptídeo funcional é diminuída. Expressão suprimida de gene significa, por exemplo, um estado em que embora nenhuma mudança tenha ocorrido para o nucleotídeo do gene, a função de transcrição ou tradução do gene (a partir da transcrição em mRNA para subsequente tradução em poiipeptídeo) é modificada através de outro fator, de modo que (i) a quantidade de proteína produzida é diminuída ou (ii) nenhum poiipeptídeo é produzido. Expressão suprimida de gene pode ocorrer como um resultado de, por exemplo, degradação de mRNA que é transcrito a partir do gene.
[0056] Como usado aqui, mutação tem o significado comumente entendido no campo técnico ao qual o presente pedido pertence, e significa, por exemplo, qualquer mudança em um nucleotídeo em um genoma de tipo selvagem ou qualquer mudança em um resíduo de aminoácido em um poiipeptídeo de tipo selvagem (exemplos da mudança englobam substituição, deleção, inserção, adição, duplicação, inversão, ou translocação) . Mutação de gene significa, por exemplo, (i) uma mutação de um gene de modo que um poiipeptídeo funcional original não é produzido, (ii) uma mutação do gene de modo que embora um poiipeptídeo seja produzido, a
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27/93 quantidade do polipeptídeo produzido é diminuída, (iii) uma mutação do gene de modo que, embora um polipeptídeo seja produzido, a estabilidade do polipeptídeo é diminuída, ou (iv) uma mutação do gene de modo que o gene (uma região de codificação ou um comprimento completo incluindo uma região não traduzida) é perdido, ou que transcrição do gene é suprimida (por exemplo, uma região regulando transcrição ou uma região iniciando transcrição é deletada).
[0057] Em um caso onde as funções são prejudicadas por substituição, a substituição pode estar presente em pelo menos um dos seguintes: uma sequência de promotor (tal como uma sequência a montante (extremidade 5') e uma sequência a jusante (extremidade 3') com a região codificante como uma referência), uma região não traduzida 5' e uma região não traduzida 3', uma sequência conservada (5'GT-AG3') presente
| em ambas as extremidades de um íntron, | e uma região | de | |||
| codificação. | |||||
| [0058] | Por exemplo, em | um | caso onde | substituição | em |
| sequências | de nucleotídeos | (uma | sequência | de promotor, | uma |
| região não | traduzida 5’, e | uma | região não traduzida 3' | de | |
| um gene), | que são importantes | para regular expressão | de | ||
| gene, leva | a uma diminuição | em | atividade | transerieional | do |
expressão de gene ou a uma diminuição em estabilidade de um produto transcrito. Qualquer uma destas diminuições pode levar a uma redução em produto transcrito a partir do gene. Isto pode levar a uma redução do produto de tradução. Substituição em uma sequência conservada leva a anormalidade de emenda de mRNA. Isto resulta em mRNA anormal em que um íntron desnecessário é adicionado ou inserido. O mRNA anormal ou gera um produto de tradução
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28/93 anormal ou não termina tradução, devido a, por exemplo, deslocamento de quadro.
[0059] Substituição em uma região de codificação pode levar a um produto de tradução que tem um comprimento incompleto ou a um produto de tradução que não mantém uma função original. O produto de tradução tendo um comprimento incompleto é derivado de conversão, pela substituição, de um códon, que está codificando um aminoácido, em um códon de parada (isto é, mutação não senso). Em comparação com o produto de tradução original, o produto de tradução tendo um comprimento incompleto é de modo que um ou mais resíduos consecutivos de aminoácidos incluindo um resíduo de aminoácido em um C-término são deletados. A mutação não senso ocorre a qualquer códon localizado a montante do códon de parada original, e está preferivelmente localizado a montante do códon de parada original com um ou mais códons entre os mesmos. Um produto de tradução tendo perdido a função original pode ocorrer devido a substituição de um aminoácido. O produto de tradução tem, no mesmo, uma mudança em estrutura terciária, deterioração de uma função como um domínio funcional, ou similar. A substituição do aminoácido é preferivelmente uma substituição não conservativa com um alta possibilidade de mudar a função do produto de tradução. Exemplo da substituição não conservativa englobam (i) substituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo uma diferente carga elétrica ou uma diferente hidrofobicidade (por exemplo, substituição de um aminoácido básico por um aminoácido ácido ou substituição de um polar aminoácido por um aminoácido não polar) e (ii) substituição de um
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29/93 aminoácido por outro aminoácido tendo uma cadeia lateral de um volume diferente (tamanho tridimensional).
[0060] Em um caso onde mutações (deleção, inserção, ou similar) diferentes de substituição, ocorrem dentro de uma sequência de promotor, uma região não traduzida 5', e uma região não traduzida 3' , uma diminuição pode ocorrer em atividade transcricional ou estabilidade como no caso da substituição, de modo que (i) a quantidade de produto transcrito pode diminuir e (ii) a quantidade de polipeptídeo pode diminuir. Em adição, uma mutação diferente de substituição em uma sequência conservada de um intron, como no caso da substituição, leva à tradução de polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos diferente da sequência original de aminoácidos. A mutação, que é diferente de substituição em uma região de codificação, leva o polipeptídeo, que tem sequências de aminoácidos diferentes das sequências originais, a ser gerado pela tradução, a diferença em sequências de aminoácidos ocorrendo devido a (i) deleção ou inserção de um residue de aminoácido (causada por deleção ou inserção de nucleotideos consecutivos que são múltiplos de 3) ou (ii) deslocamento de quadro. Em um caso de uma grande deleção do próprio gene completo ou uma inserção de um grande fragmento no gene, a expressão do gene pode ser perdida.
[0061] Um indivíduo, que foi gerado como um resultado da mutação de gene ou ruptura de gene, é aqui chamado um
| mutante | (aqui a seguir | simplesmente | referido | como | |
| mutante | ) de uma planta | de | tabaco. 0 mutante pode | ter a | |
| mutação | em qualquer de | um | genoma S ou | um genoma | T, e |
preferivelmente tem a mutação em ambos genoma S e genoma T.
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Observa-se que (i) uma única mutação ou uma pluralidade de mutações pode ocorrer em um único gene e (ii) o tipo de mutação para alterar uma função não é limitado. O total de quatro alelos, que incluem dois alelos em um genoma S e dois alelos em um genoma T, pode ter mutações idênticas ou mutações diferentes.
[0062] Exemplos de expressão suprimida de um gene englobam (i) supressão de transcrição a partir do gene para um mRNA, (ii) supressão (por exemplo, degradação do mRNA) de tradução a partir do gene em um polipeptídeo através de um mRNA e (iii) supressão da função do polipeptídeo que é gerado pela tradução. A supressão da transcrição pode ser obtida por, por exemplo, (i) inibição de um fator de transcrição que promove a transcrição a partir do gene ou (ii) inibição de acesso de um fator de iniciação de transcrição para o gene. A supressão da tradução pode ser obtida por uso de uma molécula de RNA antissenso, uma molécula de RNAi, ou uma molécula de co-supressão. A supressão funcional do polipeptídeo pode ser obtida por uma molécula que inibe a função de um polipeptídeo funcional por ligação a um polipeptídeo funcional. Exemplos de tal uma molécula englobam ácido nucleico de isca, ribozima, anticorpo, e peptídeo inibitório.
[0063] A supressão acima descrita (da transcrição, tradução, e função de polipeptídeo) pode ser obtida por, por exemplo, (i) diretamente introduzindo moléculas para alcançar a supressão em uma planta ou (ii) introduzir, em uma planta, moléculas de ácido nucleico codificando as moléculas (isto é, transformação da planta). Como um resultado da transformação da planta, as moléculas de ácido
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31/93 nucleico são incorporadas em uma ou mais de quaisquer regiões de genomas da planta. Desde que a supressão é alcançada, é desnecessário para as moléculas de ácido nucleico serem incorporadas em ambos genoma S e genoma T como um resultado da transformação da planta.
[0064] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente uma diminuição, como comparada com uma planta de tipo selvagem, em abundância dos polipeptídeos que são produtos de expressão dos pelo menos dois genes. Especificamente, a abundância é diminuída com base em mutação que leva a expressão suprimida de um gene
| codificando | o polipeptídeo | de | tipo | selvagem. Como | foi | ||
| descrito, | é | suficiente se a | mutação | está | presente em | um | |
| genoma da | planta de tabaco. | ||||||
| [0065] | Um | polipeptídeo, | que | tem | uma | identidade | de |
sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, é um polipeptídeo que está presente em uma planta de tipo selvagem (ou uma variante da mesma). Portanto, a abundância do polipeptídeo na planta de tabaco é diminuída em comparação com a de uma planta de tipo selvagem. Isto leva a planta de tabaco a ser inferior à planta de tipo selvagem em termos de função. Exemplos da função englobam uma função de uma planta de tipo selvagem, tal como (i) uma função para formar meristema axilar, (ii) uma função para diferenciar um broto axilar do meristema axilar, ou (iii) uma função para manter ou promover a capacidade do desenvolvimento de um broto axilar.
[0066] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente uma diminuição, como comparada com uma
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32/93 planta de tipo selvagem, em uma quantidade de tradução dos polipeptídeos que são produtos de expressão dos pelo menos dois genes. A tradução do polipeptídeo é com base em (i) uma diminuição em mRNA (devido a, por exemplo, a abundância de mRNA, tal como a instabilidade do próprio mRNA, degradação promovida do mRNA, ou supressão da transcrição do mRNA) ou (ii) uma diminuição em uma quantidade de tradução de mRNA (devido a, por exemplo, falta de elementos (tRNA e ribossomo) constituindo tradução, inibição de recrutamento ou prejuizo funcional).
[0067] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente uma diminuição, como comparada com uma planta de tipo selvagem, em uma quantidade de transcrição a partir dos pelo menos dois genes para mRNA. A diminuição na quantidade da transcrição ocorre devido a, por exemplo, supressão de transcrição de um gene para mRNA. A supressão da transcrição pode ser obtida por, por exemplo, inibição de acesso de um fator de iniciação de transcrição para o gene, que ocorre como um resultado de introduzir uma mutação no gene.
[0068] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente promoção de degradação de mRNAs transcritos a partir dos pelo menos dois genes. A degradação do mRNA pode ser causada por, por exemplo, (i) a presença de um fator exógeno levando a degradação do mRNA, (ii) ativação de um elemento constituinte endógeno levando à degradação do mRNA, ou (iii) a presença de uma sequência para promover a degradação do mRNA.
[0069] Na planta de tabaco, a mutação é preferivelmente inserção, em um exterior de uma região em que os pelo menos
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33/93 dois genes estão presentes, de um polinucleotídeo expressando um fator que promove a degradação dos mRNAs transcritos a partir dos pelo menos dois genes.
[0070] O fator é preferivelmente uma molécula de RNA antissenso, uma molécula de RNAi, ou uma molécula de cosupressão.
[0071] As mutações ou ruptura dos pelo menos dois genes preferivelmente ocorrem como um resultado de mutação espontânea, tratamento mutagênico, recombinação gênica, edição do genoma, ou nocaute do gene. A mutação espontânea dos pelo menos dois genes geralmente ocorre devido a (i) erros de replicação e (ii) dano para o gene. A causa do dano é, por exemplo, exposição a mutagens publicamente conhecidos, naturalmente ocorrendo ou mutagens publicamente conhecidos que foram artificialmente produzido e, então, permanecendo em um ambiente natural (por exemplo, radiação, raios ultravioleta, ou substâncias induzindo mutação (tal como EMS)). Os pelo menos dois genes podem ser submetidos a um tratamento mutagênico levando artificialmente o mutagen a ter efeito sobre uma planta de tabaco (como necessário, em combinação com supressão de um função de reparo do gene) . Recombinação dos pelo menos dois genes pode ser realizada por recombinação homóloga de todo ou parte de um gene alvo com uma sequência recombinante de acordo com um método de recombinação genética publicamente conhecido. Edição do genoma do gene pode ser realizada por uma técnica publicamente conhecida (por exemplo, nucleases de dedo de zinco: ZFN, nucleases efetoras de tipo ativador de transcrição: TALEN, e sistema CRISPR/Cas9). O nocaute do gene pode ser realizado por, por exemplo, (i) transferência
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34/93 do gene por uso de uma transposase publicamente conhecida ou (ii) introdução de T-DNA.
[0072] As várias mutações descritas acima podem ser facilmente introduzidas em uma planta de tabaco pelos técnicos no assunto que tem acesso a, por exemplo, sequências de genoma dos genes publicamente conhecidas descritas abaixo. Especificamente, com base nestes trechos de informação de sequências, é possivel determinar, de modo apropriado, uma região que está presente em um genoma de qualquer uma das várias plantas de tabaco englobadas no escopo da presente invenção e em que uma mutação deve ser introduzida.
[0073] NtLOMl: (genoma S) Sol Genomics Network (SOL) acesso #Ntab-TN90-AYMY-SS11024, e (genoma T) Sol Genomics Network (SOL) acesso #Ntab-TN90-AYMY-SS12340 [0074] NtLOM2: (genoma S) Sol Genomics Network (SOL) acesso #Ntab-TN90-AYMY-SS9212, e (genoma T) Sol Genomics Network (SOL) acesso #Ntab-TN90-AYMY-SS8 [0075] NtLOM3: (genoma S) Sol Genomics Network (SOL) acesso #Ntab-TN90-AYMY-SS9212, e (genoma T) Sol Genomics Network (SOL) acesso #Ntab-TN90-AYMY-SS8 [0076] A planta de tabaco não é limitado a qualquer uma em particular, desde que planta de tabaco seja uma planta Nicotians que não é limitada a qualquer uma em particular desde que a planta Nicotians seja uma planta pertencendo a Nicotians. Exemplos da planta de tabaco englobam Nicotians acaulis, Nicotians acuminata, Nicotians acuminata var. multzjlora, Nicotians africana, Nicotians alata, Nicotians amplexicaulis, Nicotians arentsii, Nicotians attenuata, Nicotians benavidesii, Nicotians benthamiana, Nicotians
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35/93 bigelovii
Nicotiana bonariensis
Nicotians cavicola
Nicotians clevelandii
Nicotiana cordifolia
Nicotiana corymbosa
Nicotiana debneyi
Nicotiana excelsior
Nicotiana forgetiana, Nicotiana fragrans, Nicotiana glauca
Nicotiana glutinosa
Nicotiana goodspeedii
Nicotiana gossei, Nicotiana ingulba, Nicotiana kawakamii
Nicotiana knightiana
Nicotiana langsdorfi
Nicotiana linearis
Nicotiana
Nicotiana marítima
Nicotiana megalosiphon
Nicotiana miersii
Nicotiana noctiflora
Nicotiana nudicaulis
Nicotiana obtusifolia
Nicotiana occidentalis
Nicotiana occidentalis subsp.
Hesperis
Nicotiana otophora
Nicotiana paniculata
Nicotiana
Nicotiana petunioides
Nicotiana plumbaginifolia
Nicotiana quadrivalvis
Nicotiana raimondii, Nicotiana repanda, Nicotiana rosulata
Nicotiana rosulata subsp. Ingulba, Nicotiana rotundifolia
Nicotiana rustics
Nicotiana setchellii
Nicotiana simulans
Nicotiana solanifolia
Nicotiana spegauinii
Nicotiana stocktonii
Nicotiana suaveolens
Nicotiana sylvestris
Nicotiana tabacum
Nicotiana thyrsi flora
Nicotiana tomentosa
Nicotiana tomentosifomis
Nicotiana trigonophyl1 a
Nicotiana umbratica
Nicotiana undulata
Nicotiana velutina, Nicotiana wigandioides, e um plantas Nicotiana. Entre estas plantas Nicotiana híbrido de
Nicotiana benthamiana, Nicotiana rustics, e Nicotiana tabacum são mais preferíveis. Nicotiana rustics e Nicotiana tabacum, que são usadas como materiais para produzir tabaco em folhas, são particularmente preferíveis.
[2. Método de produzir planta de tabaco] [0077] Em um aspecto, a presente invenção fornece um
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36/93 método de produzir a planta de tabaco. 0 método de produção inclui a etapa de introduzir, em um genoma de uma planta de tabaco, uma mutação que causa supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos três genes acima descritos.
[0078] Esta etapa de introdução resulta em uma supressão do desenvolvimento de brotos axilares primários através da supressão funcional do gene, que é causada pela mutação. A supressão do desenvolvimento de brotos axilares primários através da supressão funcional dos genes é realizada como esboçado acima. Portanto, como exemplos concretos de realizar a etapa de introdução, a seguinte descrição irá discutir supressão de expressão de gene e introdução de uma mutação em um gene, que são realizados através de transformação de uma planta de tabaco com uso de um vetor.
[0079] O vetor a ser usado para a transformação de uma planta de tabaco para a finalidade da expressão suprimida do gene ou a introdução da mutação no gene não é limitado a um qualquer particular, desde que um polinucleotídeo inserido no vetor pode ser expressado em uma célula de planta. Exemplos de um vetor apropriado englobam vetores pBI, pPZP, e pSMA cada um permitindo introdução de um polinucleotídeo alvo em uma célula de planta via Agrobacterium. Em particular, plasmídeos de vetores binários (por exemplo, pBIG, pBIN19, pBHOl, pBI121, pB!221, e pPZP202) são preferíveis.
[0080] Em um caso onde a expressão suprimida do gene é obtida por RNAi, uma sequência de gatilho de RNAi, que é usada pelo RNAi para suprimir a expressão do gene alvo, é inserida no vetor. Exemplos da sequência de gatilho de RNAi
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37/93 englobam (i) um polinucleotídeo (porção de RNA senso) que é (a) uma parte de um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 ou uma parte de um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) tendo SEQ ID
| NO: 7, | 8, | 9, | 10, | 11, ou | 12 | e (b) representada | por uma | |||
| sequência | de | nucleotídeos | de, | pelo menos, 21 | a | 30 | bases | |||
| consecutivas | (por | exemplo, | 21 | ou mais | bases, | 22 | ou | mais | ||
| bases, | 23 | ou | mais | bases, | 24 | ou mais | bases, | 25 | ou | mais |
| bases, | 26 | ou | mais | bases, | 27 | ou mais | bases, | 28 | ou | mais |
| bases, | 29 | ou | mais | bases, | e 30 ou mais | bases) | e | (ii) um |
polinucleotídeo (porção de RNA antissenso) representado por uma sequência de nucleotídeos que é complementar ao polinucleotídeo (i) . Mais especificamente, a sequência de nucleotídeos de pelo menos 21 a 30 bases consecutivas descrita acima significa uma sequência de nucleotídeos de 21 ou mais bases consecutivas, 23 ou mais bases consecutivas, 25 ou mais bases consecutivas, 30 ou mais bases consecutivas, 35 ou mais bases consecutivas, 40 ou mais bases consecutivas, 45 ou mais bases consecutivas, 50 ou mais bases consecutivas, 60 ou mais bases consecutivas, 70 ou mais bases consecutivas, 80 ou mais bases consecutivas, 90 ou mais bases consecutivas, ou 100 ou mais bases consecutivas.
[0081] Como descrito acima, a supressão do expressão de gene na planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção é preferivelmente geneticamente herdada. Portanto, a sequência de gatilho de RNAi é preferivelmente incorporada com um genoma da planta de tabaco.
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38/93 [0082] Uma planta de tabaco, em que expressão de uma pluralidade de genes é simultaneamente suprimida, pode ser obtida por cruzamento de duas plantas de tabaco em que expressão de diferentes genes é suprimida. Em adição, uma planta de tabaco, em que expressão de uma pluralidade de genes é simultaneamente suprimida, pode ser obtida por (i) realizando transformação que pode causar expressão de uma pluralidade de diferentes genes a serem simultaneamente
| suprimidos | e, então, | (ü) | selecionando a planta | de tabaco | ||
| em que | expressão | de | uma pluralidade | de | genes | é |
| simultaneamente suprimida. | ||||||
| [0083] | Observa-se | que | em um caso onde | uma | planta | de |
tabaco em que uma pluralidade de genes são funcionalmente suprimidos deve ser obtida por uso de cruzamento, (i) uma das plantas de tabaco a ser cruzada pode ser preparada por mutação ou ruptura (descrito abaixo) de um gene e (ii) a outra das plantas de tabaco a ser cruzada pode ser preparada por transformação (que causa expressão suprimida de um gene).
[0084] A introdução de uma mutação no gene da planta de tabaco pode ser alcançada por uma técnica de edição do genoma publicamente conhecida. Exemplos da técnica de edição do genoma englobam sistema CRISPR/Cas9, TALEN, e ZFN. De acordo com o sistema CRISPR/Cas9, a edição do genoma é possível se RNAs guia e uma proteína Cas9 estão presentes em uma célula alvo. De acordo com TALEN e ZFN, a edição do genoma é possível se uma proteína de fusão (em que domínios de ligação a DNA e nuclease são fusionados) está presente em uma célula alvo. Portanto, os RNAs guia, as proteínas Cas9, e as proteínas de fusão podem ser
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39/93 diretamente introduzidos em uma célula alvo. Exemplos de um método de diretamente introduzir qualquer um destes em uma célula alvo englobam um método PEG, um método de eletroporação, e um método de bombardeio de partículas.
[0085] De acordo com o sistema CRISPR/Cas9, (i) uma sequência, que é complementar a uma sequência de nucleotideos localizada imediatamente a montante de XGG em um genoma, forma um par de bases com parte de um RNA guia e (ii) um DNA genômico fita dupla é cortado por Cas9 na sequência de nucleotideos. Exemplos da sequência de nucleotideos reconhecia pelo RNA guia englobam uma parte de (i) um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 ou (ii) um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) tendo SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, ou 12, cuja parte é de 10 ou mais bases consecutivas (por exemplo, 15 ou mais bases consecutivas, preferivelmente 17 ou mais bases consecutivas, mais preferivelmente 18 ou mais bases consecutivas, ainda mais preferivelmente 19 ou mais bases consecutivas, e o mais preferivelmente 20 ou mais bases consecutivas) localizadas imediatamente a montante de XGG.
[008 6] De acordo com o TALEN, um par de dominios de ligação a DNA em nucleases artificiais formando um dimero, cada, liga a uma correspondente das sequências de nucleotideos, que está presente em cada término de um dominio de divagem Fokl de modo a estar afastado do término por um espaçador de 5 a 20 bases. A sequência de nucleotideos está presente em uma e nas outras fitas de DNA
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40/93 genômico fita dupla. Portanto, um do par de domínios de ligação a DNA liga a uma fila, e o outro do par de domínios de ligação a DNA liga à outra fita. O dominio de ligação de DNA é composto de uma unidade de repetição (módulo) que incluem 33 a 34 resíduos de aminoácido. O número de módulos corresponde ao número de nucleotídeos aos quais o domínio de ligação do DNA se liga. Desde que 33 a 34 resíduos de aminoácidos servem como um unidade de repetição (módulo), o domínio de ligação a DNA contém módulos, cujo número corresponde ao número de nucleotídeos para se ligar. A sequência de nucleotídeos à qual o domínio de ligação a DNA se liga é de 10 ou mais bases consecutivas, preferivelmente 14 ou mais bases consecutivas, e mais preferivelmente 18 ou mais bases consecutivas, que estão presentes em cada término de um domínio de clivagem Fokl de modo a estar afastado do término por um espaçador de 5 a 20 bases e que são uma parte de um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, ou um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) tendo SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, ou 12.
[0087] De acordo com ZFN, como no caso de TALEN, um par de domínios de ligação a DNA em nucleases artificiais formando um dímero se liga, cada, a uma correspondente das sequências de nucleotídeos, que está presente em cada término de um domínio de clivagem Fokl de modo a estar afastado do término por um espaçador de 5 a 20 bases. O domínio de ligação a DNA contém uma pluralidade de módulos de dedo de zinco. A sequência de nucleotídeos é de 9 ou
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41/93 mais bases consecutivas, preferivelmente 12 ou mais bases consecutivas, e mais preferivelmente 18 ou mais bases consecutivas, que estão presentes em términos respectivos de um dominio de clivagem Fokl com um espaçador de 5 a 20 bases entre os mesmos e que são uma parte de um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) codificando um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, ou um polinucleotídeo (que pode ter uma substituição de 0,1% a 1%) tendo SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, ou 12.
[0088] RNAi, sistema CRISPR/Cas9, TALEN, e ZFN, que foram descritos acima, podem ser lidos, cada, de modo que, de acordo com a descrição de cada detalhe, o polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 é substituído com um polipeptídeo ortólogo que (i) tem uma identidade de sequência de 90% ou maior com o polipeptídeo e (ii) está presente em outro tipo incluido na planta Nicotiana. Do mesmo modo, a descrição do parágrafo anterior pode ser lida de modo que um polinucleotídeo tendo SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 é substituído com um polinucleotídeo de gene ortólogo, que (i) tem uma identidade de sequência de 90% ou maior com o polinucleotídeo e (ii) está presente em outro tipo incluido em planta Nicotiana.
[0089] Como descrito acima, a mutação, que é introduzida em pelo menos dois genes da planta de tabaco, de acordo com um aspecto da presente invenção e que causa supressão funcional dos pelo menos dois genes, é preferivelmente geneticamente herdada. No entanto, um polinucleotídeo exógeno, introduzido em uma planta de
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42/93 tabaco por edição do genoma, é preferivelmente eliminado da planta de tabaco após ser confirmado que uma mutação desejada é introduzida na planta de tabaco. Em um caso onde o polinucleotideo exógeno é retido na planta de tabaco, uma mutação indesejada pode (continuar) ser introduzida. Isto pode levar um traço desejado (tal como supressão de brotos axilares primários) a ser perdido, ou pode ameaçar a sobrevivência da planta de tabaco.
[0090] A introdução da mutação em pelo menos dois genes de uma planta de tabaco ou a ruptura dos pelo menos dois genes da planta de tabaco pode ser alcançada através de outro método biotecnológico (por exemplo, um método em que transposon ou Agrobacterium é utilizado). Os exemplos concretos do método englobam um método em que uma planta de tabaco é introduzida com (i) retrotransposon tntl de tabaco ou transposon de outra planta ou (ii) T-DNA de plasmídeo TI de Agrobacterium.
[0091] Alternativamente, a introdução ou a ruptura pode ser alcançada através de outro método (tratamento mutagênico de uma planta de tabaco). Exemplos de uma fonte da mutação englobam compostos de molécula pequena (tal como etil metano sulfonato (EMS), N-etil-N-nitrosoureia (ENU), azida sódica) e radiações (tais como raios gama, feixes de íons pesados, raios X, feixes de nêutrons e raios ultravioleta).
[0092] A mutação pode ser introduzida em qualquer planta de tabaco regenerável. Exemplos da planta de tabaco englobam sementes, raízes, folhas, flores, órgãos reprodutores, e embriões. Um exemplo preferível é sementes.
[0093] O que pode ser obtido pelos métodos acima pode
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43/93 ser uma população de mutantes de uma planta que tem várias mutações (ou nenhuma mutação). Portanto, um indivíduo exibindo um fenótipo desejado pode ser selecionado adicionalmente dentre a população de mutantes. Como um exemplo da seleção de um indivíduo, a seguinte descrição irá discutir um procedimento para selecionar um indivíduo desejado a partir de uma população de mutantes (painel) que é obtida em um caso onde tabaco é tratado com uso de um mutagen.
[0094] Um mutante de tabaco, que é funcionalmente alterado devido a mutações no total de 4 alelos de ambos os genoma T e genoma S para um gene ou devido a ruptura do total de 4 alelos para um gene, pode ser obtido por, por exemplo, um método descrito abaixo. Um tabaco é tratado com um mutagen como descrito acima para preparar uma população (painel) de mutantes de tabacos com mutações no genoma completo do tabaco, e DNAs genômicos são extraídos. Utilizando iniciadores específicos de genes de cada um dos genoma S e genoma T, genes alvos (polinucleotídeos) são amplificados a partir dos DNAs genômicos do painel. Subsequentemente, sequências de nucleotídeos de produtos resultantes são determinadas, e uma linhagem tendo uma mutação é, então, selecionada. A partir de um grupo de indivíduos M2 de uma linhagem selecionada, um indivíduo M2 tendo uma mutação homozigótica em um genoma S e um indivíduo M2 tendo uma mutação homozigótica em um genoma T são preparados e, então, cruzados para obter indivíduos F1. Subsequentemente, uma progênie de autofecundação (F2) é cultivada a partir dos indivíduos Fi. A partir da progênie de autofecundação (F2) , indivíduos tendo mutações
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44/93 homozigóticas em ambos um genoma S e um genoma T são obtidos (tais indivíduos são obtidos a uma probabilidade de 1/16 porque dois elementos são recessivos).
[0095] Alternativamente, o mutante de tabaco tendo mutações nos dois genes pode ser obtido por (i) submetendose, adicionalmente, a um tratamento mutagênico, o mutante de tabaco, tendo a mutação em um gene, que foi obtido pelo método descrito acima, (ii) selecionando, a partir da população de mutantes acima descrita, o mutante de tabaco tendo as mutações nos dois genes, ou (iii) cruzando dois tipos de mutantes de tabaco, que foram obtidos pelo método acima e que têm as mutações em respectivos genes e, então,
| selecionando | uma planta | de | tabaco tendo as | mutações | nos |
| dois genes | desejados. | Em | um caso onde | o método | de |
| introduzir | a mutação | deve | ser mudado, | é suficiente |
substituir o método descrito acima com relação ao mutagen com outro método (por exemplo, o método acima descrito de introduzir uma mutação em uma planta de tabaco com uso de
| edição do | genoma | ou nocaute | do gene, | ou | o método acima | |
| descrito < | de realizar a transformação | de | uma | planta de | ||
| tabaco com | uso de | um vetor). | ||||
| [0096] | Especif | icamente, | através | de, | por | exemplo, |
| estágios | (D a | (4) abaixo, | qualquer | uma das | seguintes | |
| plantas de | tabaco | pode ser obtida: (i) | uma | planta | de tabaco |
tendo mutações em dois genes (primeiro e segundo genes), (ii) uma planta de tabaco em que dois genes são rompidos, e (iii) uma planta de tabaco que tem uma mutação em um primeiro gene e em que um segundo gene é rompido. Observase que os estágios (3) e (4) podem ser omitidos por, por exemplo, introduzindo as mutações nos dois genes
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45/93 simultaneamente no estágio (1) e, então, selecionar, no estágio (2), um mutante de tabaco tendo as mutações nos dois genes.
(1) A população de mutantes é produzida pelo uso de qualquer método de introduzir uma mutação (por exemplo, mutação espontânea, tratamento mutagênico, recombinação gênica, edição do genoma, nocaute do gene, transformação, ou uma combinação de qualquer um destes métodos).
(2) Um primeiro mutante de tabaco, que tem a mutação no primeiro gene (ou em que o primeiro gene é rompido) , é selecionados dentre o mutante de tabaco produzido no estágio (1).
(3) Um segundo mutante de tabaco, que tem a mutação no segundo gene (ou em que o segundo gene é rompido) , é preparado por repetição dos estágios (1) e (2).
(4) A primeira e segunda plantas de tabaco são cruzadas.
[0097] O método de produzir a planta de tabaco de acordo com um aspecto da presente invenção inclui adicionalmente a etapa de selecionar, a partir das plantas de tabaco produzidas pela etapa de produção acima, um indivíduo em que o número ou peso de brotos axilares primários é diminuído a 1/2 ou menor em comparação com uma planta de tipo selvagem. Esta etapa de seleção é realizada com base em, por exemplo, ruptura, mutação, ou expressão suprimida dos pelo menos dois genes descritos acima.
[0098] A mutação ou ruptura dos pelo menos dois genes é determinada por identificação da presença/ausência de uma mutação do gene. Um método de identificar a mutação do gene precisa permitir a determinação da presença/ausência da
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46/93 mutação. Exemplos do método englobam (1) um método em que uma sequência de DNA é diretamente decodificada com uso de um sequenciador comercialmente disponível, (2) um método em que uma diferença em sequência é detectada por uma diferença em distância de eletroforese com uso do método de polimorfismo de conformação de fita única (SSCP), (3) um método em que polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) é detectado pelo método Cycleave PCR, (4) um método em que a presença/ausência de uma mutação é identificada por divagem de um sítio (s) de incompatibilidade com uso de T7 Endonucleasel ou similar, (5) um método de sequência polimórfica amplificada clivada (CAPS) em que a presença/ausência de uma mutação pode ser determinada pela presença/ausência de divagem por um tratamento com enzima de restrição, (6) um método CAPS derivado (dCAPS) em que um conjunto de iniciadores incluindo um incompatível é intencionalmente usado de modo que a presença/ausência de uma mutação pode ser determinada pela presença/ausência de divagem por enzimas de restrição, (7) um método (por exemplo, um método PCR em que uma sonda TaqMan é usada, análise MassARRAY) em que a presença/ausência de uma mutação é determinada por identificação, pelo uso de uma sonda que especificamente hibrida para uma sequência mutante, se ou não uma sonda é hibridada, e (8) um método em que, em um caso onde a mutação é deleção ou inserção, uma diferença no comprimento dos fragmentos de amplificação de PCR (fita dupla) do gene é detectada por uma diferença em mobilidade de eletroforese. Alternativamente, a mutação ou ruptura de um gene pode ser determinada por detecção (por exemplo, Western blotting) de (i) um poiipeptídeo que
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47/93 resulta da modificação do gene ou (ii) um nível de expressão de um polipeptídeo de tipo selvagem.
[0099] Antes da etapa acima descrita de introduzir uma mutação, procedimentos (1 e 2) descritos abaixo são realizados como necessário de modo a determinar (i) um gene cuja expressão deve ser suprimida e/ou (ii) um gene em que uma mutação deve ser introduzida.
1. Isolamento de gene de tabaco que é previsto para regular desenvolvimento de broto axilar [00100] Um gene, que possivelmente regula brotos axilares, pode ser obtido a partir de genes de tabaco por (i) selecionando um gene a partir de outras plantas com base em um documento da técnica anterior (por exemplo, Literatura não patentária em que uma relação entre um gene e um broto axilar é confirmada) e (ii) usando, como um índice, identidade de sequência de nudeotídeos e identidade de sequência de aminoácidos dos genes selecionados. Por exemplo, uma sequência de nudeotídeos e uma sequência de aminoácidos de um gene de tabaco publicamente conhecido ou um gene de uma espécie de planta (por exemplo, tomate) que é intimamente aparentada com tabaco pode ser obtida por condução de uma pesquisa em sequências registradas em uma base de dados publicamente conhecida com uso de ferramenta Basic Local Alignment Search Tool (blast). Em um caso onde uma sequência publicamente conhecida é de um comprimento pardal, um cDNA de comprimento completo pode ser obtido a partir de informação de sequência conhecida por um método comum tal como (i) triagem de uma biblioteca de cDNA ou (ii) método de amplificação rápida de extremidade de cDNA (Race).
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48/93 [00101] Um gene, que possivelmente regula um broto axilar em um modo novo, pode ser obtido por, por exemplo, selecionando um gene que é expressado de acordo com um tecido alvo ou tratamento. O tecido alvo e o tratamento podem ser selecionados com base em informação listada abaixo. Sabe-se que (i) um gene, que está envolvido na formação de um meristema axilar, é expressado antes da formação do meristema axilar e (ii) um gene, que está envolvido na manutenção e crescimento de um meristema axilar, é expressado no meristema axilar (por exemplo, LS, gene Blind) . Sabe-se que um gene, que está envolvido em dormência ou desenvolvimento de um broto axilar, é expressado em uma quantidade aumentada ou diminuída, dependendo da dormência ou não dormência do broto axilar (por exemplo, BRANCHED1) . Também se sabe que alguns hormônios de plantas estão envolvidos na regulação de brotos axilares. Auxina está envolvida em dominância
| apical. Estrigolactona está | envolvida | em | supressão do | ||
| desenvolvimento | de brotos | axilares. | Citocinina está | ||
| envolvida | em | excrescência | de brotos | axilares. Ácido | |
| abscissico | está | envolvido em | dormência. | ||
| [00102] | Nova | seleção de | um gene | que | possivelmente |
regula o desenvolvimento de um broto axilar pode ser realizada por um método comum em que especificidade de expressão é utilizada. Os seguintes (1) a (3) são exemplos do método. (1) Métodos tal como (a) um método em que dados do perfil da expressão de genes são obtidos a partir de uma sequência de nucleotideos de cDNA, (b) um método em que uma biblioteca de cDNA de genes que são expressados em um tecido do indivíduo é preparada e, então, uma sequência
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49/93 terminal é sequenciada, e (c) um método de análise em série de expressão de gene (SAGE) em que fragmentos de restrição são conectados em série e sequenciados. (2) Um método em que dados do perfil da expressão de genes são obtidos por hibridação diferencial. Macro arranjos e chips de DNA são bem conhecidos. (3) Genes (genes diferencialmente expressados: DEGs) que diferem em nível de expressão entre uma pluralidade de amostras podem ser obtidos por um método de exibição diferencial. Exemplos englobam um método em que as quantidades de fragmentos de amplificação PCR são comparados.
Amplificação de genes isolados [00103] Amplificação de um polinucleotídeo pode ser realizada por reação de cadeia polimerase (PCR), mas alternativamente pode ser realizada por, por exemplo, reação de cadeia ligase (LCR) ou amplificação isotérmica mediada por alça (LAMP).
[00104] Um iniciador para amplificar um polinucleotídeo somente precisa ser um iniciador que permite a específica amplificação de um gene alvo de cada genoma a partir de genomas de tabaco em que genes de um genoma S e um genoma T são misturados. Desde que o gene alvo pode ser especificamente amplificado, uma ou mais substituições, deleções, inserções, e adições podem ser incluídas. Em adição, como necessário, o iniciador pode ser marcado com, por exemplo, um substância fluorescente ou uma radiação.
[00105] Extração de DNA genômico a ser usado como um gabarito da amplificação pode ser realizada por um método publicamente conhecido, e pode ser realizada usando um kit de extração comercialmente disponível. DNA genômico pode
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50/93 ser um parcialmente purificado uma vez obtido através de extração simples ou pode ser um purificado obtido através de uma etapa de purificação.
2. Identificação de gene que é esperada estar envolvida em desenvolvimento de broto axilar [00106] Os efeitos de um gene alvo podem ser confirmados por (i) preparação de recombinantes e mutantes nos quais as expressões e funções do gene alvo são suprimidas e (ii) cultivo dos recombinantes e dos mutantes em uma estufa, um 'phytotron', uma estufa de semi-contenção ou um campo. Ao comparar o número e o peso de brotos axilares desenvolvidos com os controles, é possível confirmar os efeitos da excrescência e desenvolvimento dos brotos axilares. Embora o número e o peso dos brotos axilares possam ser realizados sem realizar a poda de topo, o número e o peso dos brotos axilares são preferivelmente realizados enquanto (i) os brotos axilares estão em um estado de não dormência devido à poda de topo e (ii) o desenvolvimento dos brotos axilares são, portanto, promovidos. O exame do número e do peso dos brotos axilares pode ser realizado uma ou mais de uma vez em qualquer estação. Nos casos em que os exames são realizados várias vezes, é preferível realizar exames em intervalos. Por exemplo, é possível realizar o seguinte método uma vez por semana: contar o número de brotos axilares primários, coletar os brotos axilares primários e examinar o peso dos brotos axilares primários.
[00107] O exame pode ser realizado com foco apenas nos brotos axilares específicos (por exemplo, brotos axilares primários) ou o exame pode ser realizado de modo que o
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51/93 exame com foco apenas no número de brotos axilares e o exame com foco apenas no peso sejam realizados separadamente. Nesse caso, é preferível que um número adequado de vezes de exames e intervalos adequados entre os exames sejam determinados de acordo com cada exame.
[3. Outras observações] [00108] Outro aspecto da presente invenção fornece um método de determinar uma planta de tabaco em que o desenvolvimento de brotos axilares primários é suprimido. A supressão dos brotos axilares primários é causada por introdução de uma mutação que causa supressão funcional dos acima descritos pelo menos dois genes em uma planta de tabaco. Deve ser notado que a supressão funcional acima é para suprimir o desenvolvimento de brotos axilares primários. Isto é, o método de determinação pode ser usado para, por exemplo, um método de produzir uma planta de tabaco. Portanto, para detalhes do método de determinação, uma referência pode ser feita para as descrições anteriores com relação ao método de produzir a planta de tabaco.
[00109] Em adição, outros aspectos da presente invenção fornecem (1) um tabaco em folhas colhida de (i) a planta de tabaco, (ii) uma planta de tabaco obtida pelo método de produção descrito acima; (iii) uma planta de tabaco determinada pelo método de determinação descrito acima; (iv) uma planta de tabaco obtida pelo método de reprodução; ou (v) o descendente ou a progênie criada descritos acima, (2) um tabaco curado obtido a partir do tabaco em folhas, e (3) um produto de tabaco obtido a partir do tabaco curado. Portanto, referência pode ser feita à descrição anterior para os detalhes da planta de tabaco e do método de
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52/93 produção de planta de tabaco para obter (1) o tabaco em folhas, (2) o tabaco curado, e (3) o produto de tabaco.
[4. Molécula de ácido nucleico] [00110] Outro aspecto da presente invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que pode ser usada em qualquer aspecto descrito acima. Os exemplos concretos da molécula de ácido nucleico englobam moléculas de ácido nucleico isoladas (1) a (6) abaixo.
(1) uma molécula de ácido nucleico incluindo: um polinucleotídeo (a) codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1; ou um polinucleotídeo (b) complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes;
(2) uma molécula de ácido nucleico incluindo: um polinucleotídeo (c) codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2; ou um polinucleotídeo (d) complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes;
(3) uma molécula de ácido nucleico incluindo: um polinucleotídeo (e) codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3; ou um polinucleotídeo (f) complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes;
(4) uma molécula de ácido nucleico incluindo: um
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53/93 polinucleotideo (g) codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4; ou um polinucleotideo (h) complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes;
(5) uma molécula de ácido nucleico incluindo: um polinucleotídeo (i) codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5; ou um polinucleotídeo (j) complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes; e (6) uma molécula de ácido nucleico incluindo: um polinucleotídeo (k) codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6; ou um polinucleotídeo (1) complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.
[00111] Outro exemplo da molécula de ácido nucleico é uma molécula de ácido nucleico que é isolada de um genoma da planta Nicotians descrito no item 1. Exemplos da molécula de ácido nucleico, que são exemplos mais concretos do que as moléculas de ácido nucleico (1) a (6), englobam NtLOMl até NtLOM3 presente em cada um de genoma S e genoma T discutidos em Exemplos (descritos depois) . Portanto, a molécula de ácido nucleico é uma região de codificação ou um comprimento completo de cada gene presente em um genoma da planta de Nicotians. Por exemplo, a molécula de ácido
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54/93 nucleico pode ser isolada por identificação, de acordo com um método publicamente conhecido no campo técnico em questão, uma sequência de um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com um polinucleotídeo representada por qualquer uma de SEQ ID NOs: 7, 8, 9, 10, 11, e 12. Por exemplo, a molécula de ácido nucleico pode ser isolada por identificação, de acordo com um método publicamente conhecido no campo técnico em questão, uma sequência de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com um polipeptídeo representada por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, e 6.
(Recapitulação) [00112] Com as modalidades acima consideradas em conjunto, a presente invenção pode ser resumida como a seguir.
[00113] Uma planta de tabaco em que uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3) é introduzida em um genoma:
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou um polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um
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55/93 polinucleotídeo (k) ou um polinucleotídeo (1), a supressão funcional suprimindo desenvolvimento de brotos axilares primários, o polinucleotídeo (a) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotídeo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo (f) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (g) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotídeo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o
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56/93 polinucleotideo (g) sob condições estringentes, o polinucleotideo (i) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotideo (j) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que híbrida com o polinucleotideo (i) sob condições estringentes, o polinucleotideo (k) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotideo (1) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que híbrida com o polinucleotideo (k) sob condições estringentes.
[00114] Na planta de tabaco, a supressão funcional preferivelmente leva o número ou peso dos brotos axilares primários a diminuir em não mais do que 1/2 do de uma planta de tipo selvagem.
[00115] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente uma diminuição, como comparada com uma planta de tipo selvagem, em abundância dos polipeptídeos que são produtos de expressão dos pelo menos dois genes.
[00116] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente uma diminuição, como comparada com uma planta de tipo selvagem, em uma quantidade de tradução dos polipeptídeos que são produtos de expressão dos pelo menos dois genes.
[00117] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente uma diminuição, como comparada com uma
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57/93 planta de tipo selvagem, em uma quantidade de transcrição dos pelo menos dois genes para mRNA.
[00118] Na planta de tabaco, a supressão funcional é preferivelmente promoção de degradação de mRNAs transcritos dos pelo menos dois genes.
| [00119] | Na | planta | de | tabaco, a mutação | é |
| preferivelmente | introduzida em | cada um dos pelo menos | dois | ||
| genes. | |||||
| [00120] | Na | planta | de | tabaco, a mutação | é |
preferivelmente introduzida por mutação espontânea, tratamento mutagênico, recombinação gênica, edição do genoma, ou nocaute do gene.
[00121] Na planta de tabaco, a mutação é preferivelmente inserção, em um exterior de uma região em que os genes estão presentes, de um polinucleotídeo expressando um fator que promove a degradação do mRNA.
[00122] Em planta de tabaco, o fator é preferivelmente uma molécula de RNA antissenso, uma molécula de RNAi, ou uma molécula de co-supressão.
[00123] Na planta de tabaco, a planta de tabaco preferivelmente pertence a Nicotiana tabacum ou Nicotiana rústica.
[00124] Um método de produzir uma planta de tabaco, incluindo a etapa de:
(A) introduzir, em um genoma de uma planta de tabaco, uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3):
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um
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58/93 polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou um polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (k) ou um polinucleotídeo (1), a supressão funcional suprimindo desenvolvimento de brotos axilares primários, o polinucleotídeo (a) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotídeo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo (f) sendo um polinucleotídeo
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59/93 complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (g) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotídeo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (i) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotídeo (j) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (k) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotídeo (1) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.
[00125] O método de produção de planta de tabaco preferivelmente inclui adicionalmente a etapa de: (B) selecionar, a partir de indivíduos produzidos pela etapa (A) , um indivíduo em que desenvolvimento dos brotos axilares primários é suprimido.
[00126] No método de produção de planta de tabaco, na etapa (B), um indivíduo, em que o número ou peso dos brotos
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60/93 axilares primários é diminuído em comparação com o de uma planta de tipo selvagem, é preferivelmente selecionado.
[00127] Na planta de tabaco, na etapa (A), preferivelmente inclui introduzir a mutação em cada um dos pelo menos dois genes.
[00128] No método de produção de planta de tabaco, a etapa (A) é preferivelmente realizada por mutação espontânea, tratamento mutagênico, recombinação gênica, edição do genoma, ou nocaute do gene.
[00129] No método de produção de planta de tabaco, a etapa (A) preferivelmente inclui inserir, em um exterior de uma região em que os pelo menos dois genes estão presentes, um polinucleotídeo expressando um fator que promove a degradação dos mRNAs transcritos a partir dos pelo menos dois genes.
[00130] No método de produção de planta de tabaco, o fator é preferivelmente uma molécula de RNA antissenso, uma molécula de RNAi, ou uma molécula de co-supressão.
[00131] Um método de determinar uma planta de tabaco em que desenvolvimento de brotos axilares primários é suprimido, o método incluindo as etapas de:
(A) obter uma amostra por coleta de uma parte de uma planta de tabaco;
(B) detectar, a partir de um genoma incluido na amostra, uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3) no DNA genômico:
(1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um
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61/93 polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);
(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou um polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (k) ou um polinucleotídeo (1); e (C) determinar que uma planta de tabaco, em que a mutação foi detectada, é uma planta de tabaco em que o desenvolvimento dos brotos axilares primários é suprimido, o polinucleotídeo (a) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotídeo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3,
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62/93 o polinucleotideo (f) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (e) sob condições estringentes, o polinucleotideo (g) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotideo (h) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (g) sob condições estringentes, o polinucleotideo (i) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotideo (j) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (i) sob condições estringentes, o polinucleotideo (k) sendo um polinucleotideo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotideo (1) sendo um polinucleotideo complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (k) sob condições estringentes.
[00132] Um método de reprodução de uma planta de tabaco, incluindo a etapa de: cruzar as plantas de tabaco que são determinadas pelo método de determinação as plantas de tabaco em que desenvolvimento de brotos axilares primários é suprimido.
[00133] Um descendente ou uma progênie criada, em que:
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63/93 o descendente é de (i) a planta de tabaco, (ii) a planta de tabaco produzida pelo método de produção; (iii) a planta de tabaco determinada pelo método de determinação; ou (iv) a planta de tabaco criada pelo método de reprodução; e a progênie criada é obtida por cruzamento (i) da planta de tabaco, (ii) da planta de tabaco produzida pelo método de produção; (iii) da planta de tabaco determinada pelo método de determinação; ou (iv) da planta de tabaco criada pelo método de reprodução.
[00134] Um tabaco em folhas colhido a partir (i) da planta de tabaco, (ii) da planta de tabaco produzida pelo método de produção; (iii) da planta de tabaco determinada pelo método de determinação; (iv) da planta de tabaco obtida pelo método de reprodução; ou (v) do descendente ou da progênie criada.
[00135] Um tabaco curado obtido a partir do tabaco em folhas.
[00136] Um produto de tabaco obtido a partir do tabaco curado.
[Exemplos] [1. Gene candidato envolvido em desenvolvimento de brotos axilares de planta de tabaco] (a) Análise blast [00137] Com uma sequência de aminoácidos de gene LOM1 de Arabidopsis thaliana servindo como um sequência de consulta, busca tblastn foi conduzida em uma página de web de NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Como um resultado, a partir de cada uma das bases de dados de sequência de genoma (contigs de shotgun de genoma completo (wgs)) de Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis,
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64/93 os seguintes foram obtidos: (i) duas sequências de genes (ASAF01021035, ASAGO1097213) tendo uma identidade de aminoácido de 54%; e (ii) duas sequências de genes (ASAF01015857, ASAGO1076972) tendo uma identidade de aminoácido de 41%. Entrementes, sequências similares foram obtidas também a partir da busca tblastn com relação aos resultados de análise de tag de sequência expressada (EST)) de biblioteca de cDNA (derivada de brotos axilares de SR1) .
(b) Preparação de cDNA e isolamento de gene LOM [00138] RNA total foi extraido como a seguir. Um ápice do rebento, uma plântula, e um broto axilar de tabaco foram cada imersos em RNAlater (Ambion) e, então, crioconservados. Então, estas amostras foram descongeladas e, então, 0,5 ml de um tampão RTL (QIAGEN), ao qual 20 μΐ de 1 M DTT tinham sido adicionados, foi adicionado à amostra descongelada. Uma mistura resultante foi triturada (2.500 rpm, 1 minuto) com uso de multicontas Shocker (Yasui Kikai Corporation). O homogenado após a trituração foi submetido à separação centrifuga (15.000 rpm, 10 minutos), de modo que um sobrenadante foi obtido. A partir do sobrenadante, RNA total foi purificado com uso de Magtration (Precision System Science Co., Ltd.) ou kit RNeasy (QIAGEN), na presença de DNase.
[00139] A partir do RNA total, cDNA foi preparado com
| USO | de qualquer um dos | seguintes kits | de acordo | com o |
| manual incluido no kit. | ||||
| • kit de sintese de | primeira fita de | cDNA PrimeScript | ||
| II | (Takara-Bio Inc.) | |||
| • kit de reagente | RT PrimeScript | com gDNA | Eraser |
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65/93 (Takara-Bio Inc.) [00140] Com uso de RNA total extraído como descrito acima e kit de Amplificação de cDNA SMARTer RACE (Clonetech) , cDNA foi sintetizado, e Race foi realizado de acordo com o manual incluído no kit. Para PCR aninhado de Race, os produtos de primeiro PCR, que tinham sido diluídos 300 vezes, foram usados como um gabarito. As condições de reação no Race foram definidas como a seguir.
(Io. PCR) ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98°C e 10 segundos a 72°C ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98°C, 5 segundos a 70°C, e 5 segundos a 72°C
| 25 ciclos enquanto | cada ciclo | inclui | 10 | segundos | a | |
| 98 | °C, 5 segundos a 60°C, | e 5 segundos | a 72°C | |||
| (PCR aninhado) | ||||||
| 25 ciclos enquanto | cada ciclo | inclui | 10 | segundos | a | |
| 98 | °C, 5 segundos a 55°C, | e 5 segundos | a 72°C. | |||
| [00141] Como iniciadores para | Race, | iniciadores | ||||
| incluídos no kit e | iniciadores | específico | s para | os |
seguintes genes foram usados.
(NtLOMl)
LOM1_5R-1: ACCCATCCAAGACCTCAAGCAGGGCT (SEQ ID NO: 19)
LOM_5R-nestl: TGATTGAGCCGCGCCAATATC (SEQ ID NO: 20) (NtLOM2 e NtLOM3)
LOM2_5R-1: GGCCTTATAAGCATCCATCTTAAGCACAC (SEQ ID NO: 21)
LOM_5R-nestl: TGATTGAGCCGCGCCAATATC (SEQ ID NO: 20) [00142] RT-PCR foi realizado enquanto o cDNA acima descrito foi usado como um gabarito. Em um caso onde DNA
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66/93
Polimerase PrimeSTAR Max (Takara-Bio Inc.) foi usado como uma enzima, as condições de reação foram definidas como a seguir. Trinta (30) segundos a 94°C, 30 ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98°C, 5 segundos a 55°C, e 10 segundos a 72°C, 10 segundos a 72°C* * Uma reação de extensão a 72°C foi definida a 10 segundos por kb do comprimento de um fragmento de amplificação.
[00143] Em um caso onde DNA Polimerase Tks Gflex (Takara-Bio Inc.) foi usado como uma enzima, as condições de reação foram definidas como a seguir.
segundos a 94°C ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98°C, 15 segundos a 55°C, e 60 segundos a 68°C segundos a 68°C * Uma reação de extensão a 68 °C foi definida em 60 segundos por kb do comprimento de um fragmento de amplificação.
[00144] Combinações de um gene alvo e um iniciador para RT-PCR são como a seguir.
NtLOMl gene de genoma S
LOM1_RT-F1: AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG (SEQ ID NO: 22)
LOM1 —1_RT—RI : GAATGTTGGATTGTTCACCG (SEQ ID NO: 23) gene de genoma T
LOM1_RT-F1: AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG (SEQ ID NO: 22)
LOM1 —2_RT—RI : GTTTGATTGTTCTTATAACACCGA (SEQ ID NO: 24) NtLOM2 gene de genoma S
LOM2_RT-F1: CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTCA (SEQ ID NO: 25)
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LOM2_RT-R1: ACACATAAGGAGAAAATGACGC (SEQ ID NO: 26)
NtLOM2-2-l_Fl: TTCAGATGATTGTAATACCTCAAAGT (SEQ ID NO: 27)
NtLOM2-2-l_Rl: AACACACTGATATTTAAACAGGGA (SEQ ID NO: 28) gene de genoma T
NtLOM2-l-l_Fl: TTTGTAGTGGGTTTAGCTGATTT (SEQ ID NO: 29) NtLOM2-l-l_Rl: ACACATACGGAGAAAATGACATAG (SEQ ID NO: 30) NtLOM3 gene de genoma S
LOM2_RT-F1: CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTCA (SEQ ID NO: 25)
LOM2_RT-R2: ACAGGCAATAGTGGAGGTGATA (SEQ ID NO: 31)
NtLOM2-2-2_Fl: ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAAC (SEQ ID NO: 32)
NtLOM2-2-2_Rl: TCTGTTTACACGTAGGAATGCTT (SEQ ID NO: 33) gene de genoma T
NtLOM2-l-2_Fl: CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTC (SEQ ID NO: 34)
NtLOM2-l-2_Rl: ATGCTGAAAGATACTACGCAGATT (SEQ ID NO: 35) (b) Preparação de DNA genômico fragmento e isolamento de gene LOM [00145] Fragmentos de DNA genômico foram extraidos das folhas de tabaco (SR-1) de acordo com um método de extração simples ou um método CTAB. O CTAB método é publicamente conhecido e, assim, não será descrito em detalhes. O método de extração simples foi realizado de acordo com o seguinte procedimento. Um segmento de folha, que foi colocado em 0,3 a a 0,5 ml de tampão de extração (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,4 M NaCl, 25 mM EDTA, e 0,5% SDS), foi triturado (2.500 rpm, 1 minuto) com uso de multi-contas Shocker (Yasui Kikai Corporation). Um sobrenadante é retirado de um homogenado
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68/93 após a trituração. Então, fragmentos de DNA genômico são purificados a partir do sobrenadante através de precipitação em etanol.
[00146] Por PCR genômico em que o fragmento de DNA genômico descrito acima foi usado como um gabarito, três genes foram amplificados. Porque as enzimas usadas e as condições de reação usadas para as enzimas são similares às em RT-PCR, combinações de um gene alvo e um iniciador são como a seguir.
NtLOMl gene de genoma S
LOM1_RT-F1: AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG (SEQ ID NO: 22)
LOM1 —1_RT—RI : GAATGTTGGATTGTTCACCG (SEQ ID NO: 23) gene de genoma T
LOM1_RT-F1: AGAAAGAAGTCATTTTGTGGACTG (SEQ ID NO: 22)
LOM1 —2_RT—RI : GTTTGATTGTTCTTATAACACCGA (SEQ ID NO: 24)
NtLOM2 gene de genoma S
NtLOM2-2-l_Fl: TTCAGATGATTGTAATACCTCAAAGT (SEQ ID NO: 27)
NtLOM2-2-l_Rl: AACACACTGATATTTAAACAGGGA (SEQ ID NO: 28) gene de genoma T
NtLOM2-l-l_Fl: TTTGTAGTGGGTTTAGCTGATTT (SEQ ID NO: 30) NtLOM2-l-l_Rl: ACACATACGGAGAAAATGACATAG (SEQ ID NO: 28) NtLOM3 gene de genoma S
NtLOM2-2-2_Fl: ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAAC (SEQ ID NO: 32)
NtLOM2-2-2_Rl: TCTGTTTACACGTAGGAATGCTT (SEQ ID NO: 33) gene de genoma T
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NtLOM2-l-2_Fl: CTATGTTCAGATGATTGTAATACCTC (SEQ ID NO: 34)
NtLOM2-l-2_Rl: ATGCTGAAAGATACTACGCAGATT (SEQ ID NO: 35) (d) Determinação de sequência de genes obtidos [00147] Cada um dos produtos de PCR, que foram obtidos por amplificação dos três genes, foram clonados com uso de kit de clonagem PCR Zero Blunt TOPO para o kit de sequenciamento (Life Technologies Corporation). Como necessário, os produtos de PCR foram purificados antes da clonagem por um método comum em que eletroforese de gel agarose gel e coluna MiniElute (QIAGEN) foram combinados. As respectivas sequências de nucleotídeos dos DNAs clonados foram determinadas por um analisador de DNA 3730x1 com sequenciador capilar (ABI) com uso de kit BigDye (marca registrada) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI) . Ο iniciador de sequência foi planejado como apropriado a partir informação de sequência e foi usado.
(e) Resultados [00148] Os três genes candidatos determinados a partir do isolamento do gene e análise de sequência foram denominados NtLOMl até NtLOM3.
[2. Preparação de plantas tendo supressão funcional de genes candidatos] [00149] Para a finalidade de examinar os efeitos de supressão funcional de NtLOMl até NtLOM3 no desenvolvimento de brotos axilares das plantas de tabaco, os seguintes foram preparados: (i) plantas de tabaco recombinantes tendo expressão suprimida de NtLOMl até NtLOM3 foram preparadas (aqui a seguir referidas simplesmente como recombinante(s)) e (ii) plantas de tabaco em que mutações
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70/93 foram introduzidas em genes estruturais de NtLOMl até NtLOM3 (aqui a seguir referidos simplesmente como mutante (s) .
(2-1. Preparação de recombinantes) (a) Preparação para transformação [00150] A fim de preparar os recombinantes, vetores para transformação foram primeiro preparados como descrito abaixo.
[00151] Os iniciadores para amplificação PCR de sequências de gatilho de RNAi (1) a (3) foram planejados de modo que (i) um lado de extremidade 5' foi adicionado com CCAC e (ii) as sequências de gatilho de RNAi tinham comprimentos de 270 bp a 500 bp. As seguintes sequências de gatilho de RNAi (1) a (3) foram amplificadas por PCR em que DNA Polimerase PrimeSTAR Max (Takara-Bio Inc.) foi usada, enquanto cDNA derivado de SR-1 produzido com base nos resultados do item 1 foi usado como um gabarito: uma sequência de gatilho de RNAi (1) para suprimir a expressão de NtLOM2 e NtLOM3; uma sequência de gatilho de RNAi (2) para suprimir expressão de NtLOMl; e uma sequência de gatilho de RNAi (3) para suprimir expressão de NtLOM2. As condições de PCR, a combinação de iniciadores, e sequências de gatilho de RNAi assim obtidas são como a seguir.
(Condições de PCR) segundos a 94°C ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98°C, 5 segundos a 55°C, e 10 segundos a 72°C segundos a 72°C (Iniciador para sequência de gatilho de RNAi (1))
LOM2_Tr_Fl: CACCTCCAATCAAGCTATTCTTG (SEQ ID NO: 36)
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L0M2_Tr_Rl: GTATCTCATAATATTGGAGGGCGT (SEQ ID NO: 37) (Iniciador para sequência de gatilho de RNAi (2))
LOMl_Tr_Fl: CACCAGCTATTCAAAGCTGCAG (SEQ ID NO: 38)
LOMl_Tr_Rl: AACTTTCTCTAGTGAGTCCAAGCTC (SEQ ID NO: 39) (Iniciador para sequência de gatilho de RNAi (3))
D-NsSCL22_Fl: CACCCCTAGCAGGAGCAAAAGGG (SEQ ID NO: 40)
NsSCL22_R3: ATGGCTGCAGCTCAGTAACC (SEQ ID NO: 41) (Sequência de gatilho de RNAi (1)) (SEQ ID NO: 42)
CACCTCCAATCAAGCTATTCTTGAAGCTCTTGGGGATGCCAAGCAAATTCACATA ATAGATTTTGACATTGGCTGTGGTGCTCAATGGTCCTCATTTATGCAAGAACTCCCGAG CAGCAATAGAAAGGCAACTTCTCTAAAGATTACTGCCTTTGTATCTCCTTCAACCCACC ACTCCGTTGAGATTGGCATCATGCACGAAAGTTTAACGCTGTTTGCTAATGATGTGGGA ATCAGATTTGAGCTGGAAGTTATTAACTTGGATTCCTTTGACCCTAAGACTTATCCCTT ATCCTCCTTGAGGTCATCTGAGTGTGAGGCTATTGCTATTAATTTCCCCATCTGGTCTA TTTCAAGTTGTCTATTTGCATTTCCTTCACTTCTTCACTGTATGAAGCAGCTTTCACCA AAAGTTGTTGTATCATTGGAACGTGGATGTGAACGTACTGAACTCCCCTTAAAGCATCA CCTCCTCCACGCCCTCCAATATTATGAGATAC (Sequência de gatilho de RNAi (2)) (SEQ ID NO: 43) cACCAGCTATTCAAAGCTGCAGAGCTGGTCCAGACAGGGAATCCAGTACTCGCGC AAGGGATATTGGCGCGGCTCAATCACCAGCTCTCTCCAATTGGTAAGCCTTTCTATAGG GCTGCTTTTTATTGCAAGGAAGCTTTACAATTGCTACTTCATACCAACACCAACAACTT GAACAACCCCTCTATACCATCTTCTTCACCTTTTAATCTCATCTTCAAGATTGGTGCCT ATAAGTCCTTCTCTGAGATCTCACCAGTTGCACAGTTTGCTAATTTCACTTGTAACCAA GCCCTGCTTGAGGTCTTGGATGGGTTTGAAAGAATTCATATTGTTGATTTTGATATCGG CTATGGCAGGCAATGGGCTTCTCTTATGCAAGAGCTTGCCTTGAGAAGTGGTGGCGCAC CTACCCTGAAAATAACTGCATTGGCCTCACCCTCCACACATGACCAACTAGAGCTTGGA CTCACTAGAGAAAGTT (Sequência de gatilho de RNAi (3)) (SEQ ID NO: 44) caccCCTAGCAGGAGCAAAAGGGGTACTTGGTGTTTCAGGTTATGTACCTTCAAT TTCTTCTTCACCAGAAGCAGCAATTTGTAATAAAGGTTTAAACTTTACAAGAAACGAAT
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CTGTCTCAGTGTTGGATGCAAGAAGTCCTAGTCCTTCAGCTTCATCTTCCTCGTGTTCT TATGGTGGACAATATGCTGGAAATAATGGAGTTCCCGGCGCCGGAGCTGGAAAAATTGA CGGCCGGAAAGAGGAGTTGGTTACTGAGCTGCAGCCAT [00152] A(s) letra(s) mínúscula(s) c(2) ou cacc(3) na extremidade 5' foi(foram) artificialmente adicionada (s) para construir um vetor.
[00153] Os produtos PCR foram clonados em vetores pENTR (marca de comércio)/D-TOPO (Life Technologies Corporation). Então, a sequência de nudeotídeos de cada sequência de gatilho de RNAi foi verificada. Então, com uso de Gateway LR Clonase II Enzyme Mix (Life Technologies Corporation), cada sequência de gatilho de RNAi foi introduzida em um vetor pSP231. O vetor pSP231 é um vetor em que um cassete de expressão GFP (gene de proteína fluorescente verde) foi inserido em um sítio Saci de pHellsgate 12 (ver Wesley et al., 2001, Plant J., 27, 581-590) . Em adição, o vetor pSP231 é um vetor binário que pode expressar, com um promotor de gene RNA 35S do vírus mosaico da couve-flor, uma sequência de RNAi formada com um intron pdk/cat localizado entre sequências de repetição invertida da sequência de gatilho de RNAi. A fim de verificar a sequência introduzida no vetor pSP231, uma fita senso e uma fita antissenso de cada sequência de gatilho de RNAi foram individualmente amplificadas por PCR em que DNA Polismerases TakaRa Ex Taq e PrimeSTAR Max (Takara-Bío Inc.) foram usadas. Os produtos PCR foram purificados com uso de MiniElute (QIAGEN) e, então, submetidos ao sequenciamento. Por uso de um sequenciador, foi confirmado que a sequência de gatilho de RNAi (1), (2), ou (3) descrita acima foi introduzida no vetor pSP231.
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73/93 [00154] Com uso do vetor pSP231 contendo a sequência de gatilho de RNAi, Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) LBA4404 foi transformado por eletroporação. Após ser confirmado por PCR que cada sequência de gatilho de RNAi foi amplificada em LBA4404, o Agrobacterium foi usado para a transformação de tabaco.
(b) Transformação de tabaco e coleção de sementes transformadas [00155] O tabaco (variedade: SR-1) foi transformado de acordo com um método comum como descrito abaixo. Uma seção de uma folha de tabaco foi infectada com o Agrobacterium assim transformado, e foi cultivada em meio de Linsmaier e Skoog contendo canamicina, de modo que calos foram obtidos. A partir dos calos assim obtidos, indivíduos rediferenciados, que são resistentes a canamicina, foram obtidos. A partir destes indivíduos re-diferenciados, os seguintes indivíduos foram selecionados: o indivíduo em que (i) fluorescência intensa com base em GFP na folha completa foi confirmada e (ii) expressão de alto nível em uma porção de espaçador (PPDK intron) foi confirmada. Os indivíduos assim selecionados (indivíduos TO) foram transplantados para vasos de 9 cm, e foram cultivados sob condições fixas em uma estufa de contenção a 23°C a 25°C. Os indivíduos TO foram autofecundados, de modo que sementes TI foram coletadas.
(c) Seleção de recombinantes TI [00156] Primeiro, as TI sementes foram semeadas assepticamente em meio de Linsmaier e Skoog, e fluorescência com base em GFP de plântula foi observada. Com base nos resultados da observação, indivíduos foram
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74/93 selecionados, que foram previstos como sendo (i) indivíduos tendo mutações homozigóticas (aqui a seguir simplesmente referido como homo) como um resultado da transformação e (ii) indivíduos não tendo nenhuma mutação (aqui a seguir simplesmente referido como nula) como um resultado da transformação.
[00157] Por qPCR em que RNA total isolado de uma folha de um indivíduo de linhagem TI foi usado, os níveis de expressão de NtLOMl até NtLOM3 foram determinados. Os detalhes do qPCR são como a seguir.
[00158] Sigma-Aldrich Japan foi solicitada a realizar o desenho de iniciadores e sondas do qPCR. Como descrito em (b) do item 1, cDNA foi sintetizado a partir de RNA total isolado da folha. O qPCR foi realizado com uso de (i) cDNA que foi diluído 2 a 5 vezes, (ii) os iniciadores obtidos como descrito acima, e (iii) Taq Man Fast Advanced Master Mix (ABI). Como uma referência de quantificação, gene fator-ία de alongamento eucariótico (acesso No. AF120093, efla) foi amplificado. Como uma sonda de quantificação, uma combinação de corante repórter e corante extintor (FAMTAMURA (gene a ser analisado) e VIC-TAMURA (referência)) foi usada. Na sequência alvejando cada gene abaixo, o primeiro é um iniciador dianteiro, o segundo é um iniciador reverso, e o terceiro é uma sonda.
(NtLOM2 e NtLOM3 (comum))
Comum para NtLOM2 e NtLOM3 (Figura 2)
LOM2-1-F: CGAGAAGCGCCAGACGTCA (SEQ ID NO: 45)
LOM2-1-R: TGTTGTTGTTAAAAGAAAGAGTCATCA (SEQ ID NO: 46)
LOM2-1-P: AGCAGCAGGAACTCTTGTCAGCTTTGTCTT (SEQ ID NO: 47)
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NtL0M2 (Figuras 3, 4, e 10) gene de genoma S
NtLOM2_S-F: CCCATCAGTTAGCTTGAAACAAC (SEQ ID NO: 48)
NtLOM2_S-R: TTATTTGAGTCAATGACAACAGAACC (SEQ ID NO: 49)
NtLOM2_S-P: AAGAACCTGCAACTGAAACTCCACAACCCA (SEQ ID NO: 50) gene de genoma T
NtLOM2_T-F: CCCATCAGTCAGCTTGAAACAA (SEQ ID NO: 51)
NtLOM2_T-R: TGTTTGAGTCTATGACAGCATAACC (SEQ ID NO: 52)
NtLOM2_T-P: AGAACCTGCCACTGAAACTCCACCACCC (SEQ ID NO: 53)
NtLOM3 (Figuras 3, 4, e 10) gene de genoma S
NtLOM3_S-F: CTTAAGCGCACTATTGCCTGAG (SEQ ID NO: 54)
NtLOM3_S-R: CCTCAAGCTTAGGTACAATTAATGGT (SEQ ID NO: 55)
NtLOM3_S-P: CTTGCTGCCGCGTTTGTCCCAATG (SEQ ID NO: 56) gene de genoma T
NtLOM3_T-F: GCTTAAGTGCTCTATTGCCTGAA (SEQ ID NO: 57)
NtLOM3_T-R: TCAAGCTTAGGTACAATTAATGGCT (SEQ ID NO: 58)
NtLOM3_T-P: CTTGCTGCCGCATTTGTCCCAATGG (SEQ ID NO: 59) (NtLOMl)
Comum para genoma S e genoma T (Figura 1)
LOM1-F: CTACCATTTCCAAACCATGTAATTCAA (SEQ ID NO: 60)
LOM1-R: CTCTCAATTCTTGGTTGGAGCA (SEQ ID NO: 61)
LOM1-P: CTCAAACCTTCTTGAGTCGTTAGATGCCGT (SEQ ID NO: 62) [00159] Com base nos resultados de qPCR, os níveis de expressão de NtLOMl até NtLOM3 foram cada calculados como uma razão do nível de expressão em linhagens 'homo' para o nível de expressão em linhagens nulas quando o nível de expressão em linhagens nulas é definido como 1. Figura 1 é
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76/93 uma vista mostrando os resultados de determinar o nivel de expressão de mRNA de NtLOMl. Figura 2 é uma vista mostrando os resultados de determinar o nivel de expressão de mRNA de NtL0M2 e NtL0M3. Observa-se que Figuras 1 e 2 mostram somente os resultados das linhagens selecionadas como recombinantes alvo.
[00160] Como mostrado em Figura 1, as linhagens 11, 20, e 24 aparentada com NtLOMl cada exibiu um nivel de expressão menor do que 1/2 do da linhagem nula. Como mostrado em Figura 2, a linhagem 7 aparentada com NtLOM2 e NtLOM3 exibiu um nivel de expressão aproximadamente 1/3 do da linhagem nula. Cada uma destas linhagens foi selecionada como uma linhagem 'homo' em que NtLOMl até NtLOM3 têm expressão suprimida.
(d) Recombinante T2 [00161] Indivíduos TI (nulo e homo) aparentados com NtLOM2 e NtLOM3 foram autofecundados como no caso onde as sementes TI foram coletadas. Isto permitiu que as sementes T2 fossem coletadas. As sementes T2 foram cultivadas como descrito no item (c) , e os niveis de expressão de NtLOM2 e NtLOM3 foram determinados. Figuras 3 e 4 mostram os resultados. Em Figuras 3 e 4, os niveis de expressão em linhagens nulas foram definidos em 1 como no caso de Figuras 1 e 2. Figura 3 é uma vista mostrando os resultados de determinar o nivel de expressão de cada gene em genoma S e em genoma T. Figura 4 corresponde aos resultados de colocar os resultados de cada gene de Figura 3 juntos. Como mostrado em Figura 3, existiu uma diferença em nivel de expressão entre o genoma S e genoma T. No entanto, como mostrado em Figura 4, o nivel total não mais do que 1/2 do
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77/93 nível de expressão em linhagens nulas. As sementes dos indivíduos T2 (recombinantes em que dois genes foram suprimidos) foram submetidas ao exame de avaliação de broto axilar em Exemplos.
(2-1. Preparação de mutantes) [00162] Com o uso de sistema CRISPR/Cas9, mutantes, em que mutações foram introduzidas em NtLOMl até NtLOM3, foram preparados.
(a) Preparação para transformação [00163] Como um vetor para transformar Agrobacterium, um vetor binário pRI-201-AN (Takara-Bio Inc.) foi usado. Entre Ndel-Sall de pRI-201-AN, pcoCas9 (Referência 1) que tinha sido submetido à otimização de códon para plantas foi introduzido. Entre Kpnl-BamHI, um cassete de expressão de sgRNA foi introduzido. Como um promotor para sequência guia GN20GG, AtU6-l (Referência 2) foi usado. Como uma sequência suporte-polyT, a sequência relatada em Referência 2 foi usada. Especificamente, o cassete de expressão de sgRNA foi designado de modo que a sequência guia, excluindo sequência PAM (NGG) na extremidade 3', é inserida entre o promotor e a sequência suporte-polyT. Life Technologies Corporation ficou encarregada da síntese, através de fragmentos de DNA Strings (marca de comércio) de GeneArt (marca registrada) de cassete de expressão de sgRNA em que sítio Kpnl e sítio BamHI são adicionados na extremidade 5' e extremidade 3', respectivamente. Cas9, em que sítio Ndel e sítio Sail são adicionados na extremidade 5' e extremidade 3', respectivamente, foi obtida através de encarregar a TakaraBio Inc. de realizar a síntese da Cas9.
[Fórmula Química 1] (SEQ ID NOs: 63 a 65)
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N t LOM2_G 2 aattggtaccAGAAATGTCAAAATTCCGGCAGAACAATTTTGAATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCATTGTTT
TAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATTTACGTGAGTGTGAGTGAGACTTGCATAAGAAAATAAAATCTTTAGTTGG
GAAAAAATTCAATAATATAAATGGGCTTGAGAAGGAAGCGAGGGATAGGCCTTTTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGC
TATTAACAATCTTCAAAAGTACCACAGCGCTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTA
GTGATTgagctggaaaaattgacggcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACT
TGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTggatçcaatt
NtLOM3_G2 aattggtaccAGAAATCTCAAAATTCCGGCAGAACAATTTTGAATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCATTGTTT TAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATTTACGTGAGTGTGAGTGAGACTTGCATAAGAAAATAAAATCTTTAGTTGG
GAAAAAATTCAATAATATAAATGGGCTTGAGAAGGAAGCGAGGGATAGGCCTHTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGC
TATTAACAATCITCAAAAGTACCACAGCGCTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTA
GTGATTggttttgaggtctcagctgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACT TGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTggatccaatt
NtLOM2-3_Gl aattggtaccAGAAATCTCMAATTCCGGCAGAACAATTTTGAATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCATTGTTT TAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATITACGTGAGTGTGAGTGAGACTTGCATAAGAAAATAAAATCTTTAGTTGG
GAAAAAATTCAATAATATAAATGGGCTTGAGAAGGAAGCGAGGGATAGGCCTTTTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGC
TATTAACAATCTTCAAAAGTACCACAGCGÇTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTA
GTGATTgcctctgaattattactggcGiTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACT TGAAAAAGTGGCAC'CGAGTCGGTGCTTTTTTTggatocaatt [00164] A porção sublinhada indica a sequência guia. A porção a montante da porção sublinhada indica a sequência do promotor AtU6-l. A porção a jusante da porção sublinhada indica a sequência de suporte-polyT. As letras minúsculas no término indicam sequências de enzimas de restrição de Kpnl e BamHI.
[Fórmula Quimica 2] (SEQ ID NO: 66)
Sequência de Cas9
WHGGMI^C^AGTWCWTOGATMGMGTÃCTaATCGGACrTaaiCG^ÂCCAACTCT^nGGÂT
GGÓGTGnAfoACCGÃTaÊTACAÁGÜTTCCATtTÃMtóGTTmtoTKTTÚÇAÁÀCCCGATtóACÁeWATC
AAGAAGM€CTTATa^GTGCTCncmTCWTCTWAGASACCG{m}M«ACCWrTaAamCCG^
M®TWmATGAGGramACC4C&AGMmCXXA^ (^ATMGGCTGAtCTTAGAOTATCTACOTGCTCTTGCTCAC^TGATCAAGnCAGAC^ACACTTOCTTATCGAGG
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GAGACCTTAACTCMGATMCOGATGnGAT&AGT^^^^
GAGAACCCAATCAACGCFTCGGGAGTIGATGCTAAGGCTATCCTnCTGCTAGAüTnCTâÃGTCTCGTAGACTTGA GA^VrW’CGCrGAGGHCCAGGAGAGAAGMGAACGGACTTnCGGAAAGCnATCGCTCrnCTCTlGGACTTA. CC(XAAACTTCAAGTCWGTWAWTGCTGAGGAlWmGTTG(MCTnmAGGATAaTACGAIGATGÀT CTTGATAA£GTTCTTGGTCAGATCSGAGATCAGlA€(XTGATCTnTOCTTGCTGCTAAGAACCTTTCTGATGCTAI CCTTÜTnCTGOTCCTTAGAGTlÃAGAWGÁGMCACCAAGGCTCCACITTCTGCXTCTATGATCAAGAGATACG MGA<OaÀaAG6ÀWÀ^OTTWC<^€Tmmô«A^C^Aa4GMGTÃaA6GWTCTTC ttçgatcagtcwgaacggataogct^atacatggatggaím^chc^ggaggagttctaçáágitcàtcáã GCCAMaTTGAGM&ATGGATGGAAGCG^GAGCTTC'TTGnAAGnGAAGAGAGAGGATCWCnAGAAAGCAGA. GAACGTWÀ?AACGGATmiC<XACACCAGATCCACCnGGOGQTTCACG(TAWrTGGTÂGACAGGAGGAT TTeWCàlT€nGMGGÂTÁÁCAGAGÃGAAGAKC^GÂÁGÀiaTIACm:ÜAGAATOCÇATAÇTACGTTGGACC àÇTTGCIAGAGGAAACTCTCGHKXX?TGGâTGAGCAGÁAAO?TGAWA.GAOTCÃÕXCTTGGAãCTTCGÃGG ®TÁAGTH€WnCTACmiWATÁWATAATAMTATCATHATTAGBÕBATAWTATnCÂMTÀT iTrTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCAATTGGOTTCTGTAGITTATAMTGTGTATATTTTAArrTATAA CTTnmAlAWGAGCÀAAATHGTTCATGTKOTlOUWAÀGGGAGGTTÇTGCTCAGTCTTTCAKGÀGA GAÁTGACmmCGA>AGMCm'ÍXÀAACGAGAÂÍWaÍàMAGCÁCTOCTTCTnACGAGTAmCACC GTnAüAAGGAGüTTÁCCAAGGTTAAGTACGTTAOCGAGGGAAWAGAAAGCG^GCTTICCTTTCTGGAGAGCAGAA GÃAGGarATCGnGÁTÜTTCTTITCÁAGACGAACAGÀAâGGnACCGTTAAGÇAGTIGAAGGAGGÀmCTTCÀAGA AGAA^GAGTGCTTCSATTCTOnGAMTGTCTGGAGTTGAGGAlAGATFCAACGCTTCTCTTGGAACCTACCACGAT CnTlI}AAGATCATCAAGGATAACOTTTCCTTGATAACGAGGAG.AACGAGGACAKCTTGAGGACATCSTKHAC (XJTTACCCnTTCGÁGGATAGAGAGATGATÜGAGGAGÁGAGTCAAGACCTAnXITCACOTTCGATGÂTAÁGGTTA TGAAGSGTTGAAGAGAAGAAGATACACCGGATGGGGTAGACTrfCTCGTAAGnGATCAACGGAATCAGAGAiAAG ÇAGIOTGGAAAGAüCATWHGAnTCTTGAAGTOiGATfôÁTICõCTAACAíMAACTTCÃTGCAGCTTATCGACGA TfíATTCTCnACCrTCAAGGÁGÔACATWAGMGG€TCAGGTWWOGGGAGAn€?COCÁ£GAG€ÃCATCG CTAÀCCTTGCTGGATCIWA^TATCÁAGA^GMTCCnCAGACmHAAGGnGTTGCTGAGaTGTTAAGGrr [00165] A sequência continua na próxima página.
[Fórmula Química 3]
Continuação da sequência de Cas9
ÁTGGGTAGACACMGÜCAGMAACAlÇGÍTÃTCGAGATGGCTAGáGAGAACCAGÀCCACCCAGAAGGGACÁGAAGÁA CTCTCGTÔAGAGAATGAAGAGÂATCGAGGAGGGÂATCMGGAGCTTGGAKTCAMiCnGâAGàGCACCCAGTK ÃGAãACCCÃGCTKAGAÁCGAaAGTWTAÈenlMTAGGTTCAGAAOGGAAGAGATATGTACGTimTÍWAG CTTGACâTCÁACAGACTTTCfGÀTTÃCGATGTTGÃTCAGATCOTÜCÁCAGTCTTTünfíAÀGGATGAnCTATCGA WCAAGmCnMXJCGnCWTMGAACAGÁGGAAAGTCnWMCGTTCmGTGAGGAGGnGnAAGAAGA TGAAGAACnClGaGACAGCTTCnAACGGTAAGTTWCACGCAGAGAMGnCGATAACCTTACCAAGGCTGAG AGAGGAGGACKTmAGOTTmAAGGCTGGATTGATGAAGAGACAGCTTGnGAGACCAGACAGATCACCAAGCA (XínGCTCÁGATCCWGÁTTCTOTATGÁACACCÃÁõTAGÊATGÃGÁAüGÀTÃÀGTTGATÜÀGAGAGGTTAAGGTTA TCáCCTTGAAG:TnAAGnGGTrOGATTTCÀGAAAGGAniíXAGTTCTÁCAAGGTTÀGÁGAGA7GÁACAACTMÍ' CAàACG€ÍCAOTGOTAGmAACGC1WmGGAA€CGaaTATCAAGMGWXCAAA(/FTGGAGTCrGA
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GTTCGTTTAfôGAGATTÁCAAGGTTTâCGAIGTTAfiAAÂGATGAK^TÁAGTCTGAGCAGGAÔAT^GAMG^TA (^TAAGTA€TWaA^CTMaMlWCnCnCAAGACCGAGATCAaxrrGCTM(mGAGAKAGA MGAGAO^mATC^GACCMCGGAGAGAO»AGAGATCOTGGGATMGGGA^AGA1TOXTA€CGTTAG AMGGnCTnCTAlWCACAGGTTAACATCGFTMCMMCCGAaGnCAGACCGGASGATTCiaAAGGAGOTA TÇmCGÁAAGÁGÀÃACTaWAÁGWGAlWIÁfíAÀÂGÁÀGGÀnG6GÁCCCAMGÀAG'rACG6ÀGGAITOAT TCTWWCGTTGCnACTCTGncrTGnGTTGCTAAGGTIXJAGAAGGGAAAGICTAAGAAGlTGSGTCTGTT® GGAfíavCnGGAMCACCATmGGAGCGnCTTCTnCGAGAMAAGCGAAJCGATnAXTIGAGGCTAAGGGAT ÀCAAGGAGGGIWÁAGGOmiOJCtóGTTGmAAGTAaXIWrmCGAGW^GAACGGAAGAMGÀGA ATGGTTGCnCTGCTGGAGÁGmCAGAAGGGWCGAGCTTKTCTTCCATCTÀAGIACGnAACnCCTTTACCT TGCTTin'GAGIYCGAGAAGTTGMGGGATCTCCAGAGGAWGGAGCAGAAGCAGCnTTCGTTGAGCAGGACAAGC ACTACÜTÍGATGAGATmWÁGCÀAATCOGAGTTCT(^AGAGAGTÍATeCTTGCrGABCmCCTrQÂTAÁG GmmCTGaTOMUGaaGAGATA^CCAATCAMGACO.GGCTGAGAAGATCAlÜCÀCCn'TOGCÇT TAÇOACÓlGGTGCTCCAGCTGCTnmGTMTTCGÁTÁCacaTCGATAGAAAÁAGABCACÇTCWÇAAGG AGGTTnWAWCTAGGCWlfôA(^GTaAWAa»ACmACGÁGA0aGAATaATCmcra»T8ôA GGAGATAAGAGACCA(MnGCrAÍX^AGÁA(^CTGGAGAGGCTAAGA4GAAGAAGTUAgte^^ [00166] Na sequência de Cas9 acima, com mais de 2 páginas, as porções sublinhadas indicam a sequência Ndel e a sequência Sail.
[00167] Com uso de pRl201-AN em que a Cas9 e o cassete de expressão de sgRNA foram introduzidos, Agrobacterium
LBA4404 foi transformada por eletroporação. Agrobacterium foi cultivada em uma placa AB contendo canamicina a 25 pg/ml. Então, a Agrobacterium de uma colônia única foi isolado.
(b) Transformação de tabaco e cultivação de transformante [00168] Segmentos de um cotilédone coletado de tabaco (variedade: SR-1) 10 dias após a semeadura foram cocultivados durante 3 dias com a Agrobacterium transformada obtida como descrito acima. Então, a Agrobacterium foi então removida dos segmentos do cotilédone por lavagem dos segmentos com uso de água destilada contendo um agente antibacteriano (cefotaxime). Então, a Agrobacterium foi completamente removida por cultivo, durante 4 dias, dos
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81/93 segmentos lavados do cotiledone em meio de Linsmaier e Skoog contendo um agente antibacteriano. Então, os segmentos do cotiledone foram transferidos para e cultivados em meio de Linsmaier e Skoog contendo antibiótico (canamicina) , de modo que indivíduos rediferenciados (rebentos) tendo resistência a canamicina foram obtidos. Os rebentos foram transferidos para o meio de criação de raiz de Linsmaier e Skoog, então, enraizados. Os indivíduos enraizados foram selecionados e, então, transplantados em e cultivados em um vaso de 9 cm contendo solo para transplante (Compostagem: 40 L, solo selvagem: 30 L, solo Akadama (pequeno) : 10 L, solo Akadama (médio) : 10 L, vermiculite: 10 L, fertilizante (S625) : 1.000 g) .
(c) Confirmação de presença/ausência de mutação e sequência de mutante [00169] PCR foi realizado por uso de DNA polimerase Tks Gflex (marca de comércio) (Takara-Bio Inc.) com DNA genômico como um gabarito, que DNA genômico foi extraído de uma folha de um transformante de tabaco que tinha crescido. As condições de reação e as combinações de iniciadores do PCR são como a seguir.
(Condições de reação) segundos a 60 segundos a 94°C ciclos a 40 ciclos enquanto cada ciclo inclui 10 segundos a 98°C, 15 segundos a 55°C, e 30 segundos a 60 segundos* a 68°C segundos a 68°C (Iniciadores) [00170] Exame da sequência de mutante em mutante em que
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NtLOM2_G2 foi usado
NtL0M2 gene de genoma S
NtL0M2_S_Fw: CCTAGCAGGAGCAAAAGGG (SEQ ID NO: 67)
NtL0M2_S_Rv: TCTATTATTTGAGTCAATGACAACAG (SEQ ID NO: 68) gene de genoma T
NtL0M2_T_Fw: CAACCTAGCAGTAGCAAAAGGA (SEQ ID NO: 69)
NtL0M2_T_Rv: TCTGTTGTTTGAGTCTATGACAGCAT (SEQ ID NO: 70) [00171] Exame de sequência de mutante em mutante em que NtLOM3_G2 foi usado
NtLOM3 gene de genoma S
NtLOM3_S_Fw: ACCTCAATGTATTCCTAAATCCTAACACCTAAAG (SEQ ID NO: 71)
NtLOM3_S_Rv: GGGCTGTTCTTGAGTTACATCATAAG (SEQ ID NO: 72) gene de genoma T
NtLOM3_T_Fw: CCTCAAAGTTTTCCTAAATTCTAACGCCTAAC (SEQ ID NO: 73)
NtLOM3_T_Rv: GGGCTGTTCTTGACTTATATCATATG (SEQ ID NO: 74) [00172] Exame de sequência de mutante em mutante em que NtLOM2-3_Gl foi usado
NtLOM2 gene de genoma S
NtLOM2-3_2_S_Fw2: GTCCACAAATAATGACAAACCAACA (SEQ ID NO:
75)
NtLOM2-3_2_S_Rv2: GAAAGCTGCTTCATACGTGAAGAA (SEQ ID NO:
76) gene de genoma T
NtLOM2-3_2_T_Fw2: GTCCACAAATAGTGGCAAACCAAAC (SEQ ID NO:
77)
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NtLOM2-3_2_T_Rv2: CTCCTCAGCACCTCCAAGAC (SEQ ID NO: 78)
NtLOM3 gene de genoma S
NtLOM2-3_3_S_Fw2: TATGTTAGGCTCATTATCTTATGATGTAAC (SEQ ID NO: 79)
NtLOM2-3_3_S_Rv3: GGCAAAAGGAAAGGCAATAGC (SEQ ID NO: 80) gene de genoma T
NtLOM2-3_3_T_Fw2: CATGTTAGGCTCATTATCATATGATATAAG (SEQ ID NO: 81)
NtLOM2-3_3_T_Rv3: GGCAAAAGGAAAGGTAACTGC (SEQ ID NO: 82) [00173] Após as reações de PCR, desnaturação e anelamento foram realizados sob as seguintes condições. Desnaturação: 5 minutos a 95°C, anelamento: 1 segundo a 85°C/1 segundo a 85°C, 1 segundo a 60°C, constante a 30°C. A taxa de rampa a 85°C a 60°C foi 5% (taxa de queda de 0, l°C/segundo) , e a taxa de rampa a 60°C a 30°C foi 10% (taxa de queda de 0, l°C/segundo) . Os produtos PCR de 5 μΐ após a desnaturação e anelamento foram tratados em um sistema de reação de 10 μΐ com uso de T7 endonuclease I (New England Biolabs) de 1 U e, então, foram separados por eletroforese. Então, foi verificado se ou não os produtos PCR foram clivados pela enzima. Separadamente, os produtos PCR foram diretamente sequenciados ou clonados com uso de kit Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, e o clone foi sequenciado.
(d) Seleção de recombinantes
| [00174] | Indivíduos | de | geração | T0 tendo | mutações | |
| (deleção ou | inserção | de 1 | ou mais | bases) | em | NtLOM2 de |
| genoma S e | genoma T | e em | NtLOM3 de | genoma | S e | genoma T |
| foram cada | autofecundados | e coletados, | de | modo que |
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84/93 linhagens TI foram obtidas. A presença/ausência das mutações do gene nos indivíduos das linhagens TI foi confirmada como no item (c) acima. Com base nos resultados da confirmação, indivíduos das linhagens TI tendo mutações nos genes de ambos genoma S e genoma T foram autofecundados. Isto produziu indivíduos de linhagem T2 (mutante de um gene) que tinham mutações em NtL0M2 ou NtL0M3 de ambos genoma S e genoma T. Os mutantes de um gene foram submetidos ao exame discutido em Exemplos Comparativos (descritos depois).
[00175] Em um caso onde NtLOM2-3_Gl foi usado como um cassete de expressão de sgRNA, os indivíduos de geração TO, que tinham mutações em ambos NtLOM2 e NtLOM3 de genoma S e genoma T, foram autofecundados e coletados, de modo que a linhagem TI foi obtida. A presença/ausência das mutações nos indivíduos da linhagem TI foi confirmada como em (c) acima. Com base nos resultados da confirmação, indivíduos das linhagens Tl, que tinham mutações em ambos NtLOM2 e NtLOM3 de genoma S e genoma T, foram autofecundados. Isto produziu indivíduos de linhagem T2 (mutante de dois genes) que tinham mutações em ambos NtLOM2 e NtLOM3 de genoma S e genoma T.
[0017 6] As mutações no mutante de um gene e no mutante de dois genes serão descritas em detalhes abaixo.
(Mutante de um gene (NtLOM3): 3 linhagens) (1) 6G2-29A-31 [00177] genoma S: Enquanto WT consiste de 626 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que (i) 20 aminoácidos (72° até 91° aminoácidos) são deletados, (ii) 92° alanina é substituído com asparagina, e (iii) 93° até
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626° são idênticos aos de WT.
[00178] genoma T: Enquanto WT consiste de 624 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 3 aminoácidos (QVL) não aparentados são adicionados além de até 90 aminoácidos idênticos aos de WT.
(2) 6G2-29A-55 [00179] genoma S: Enquanto WT consiste de 626 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que (i) 20 aminoácidos (72° até 91° aminoácidos) são deletados, (ii) 92° alanina é substituído com asparagina, e (iii) 93° até 626° são idênticos aos de WT.
[00180] genoma T: Enquanto WT consiste de 624 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 8 aminoácidos não aparentados (CRFFSSYR (SEQ ID NO: 83)) são adicionados além de até 90 aminoácidos idênticos aos de WT.
(3) 6G2-65-1 [00181] genoma S: Enquanto WT consiste de 626 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 8 aminoácidos não aparentados (CRFFSSYR (SEQ ID NO: 83)) são adicionados além de até 91 aminoácidos idênticos aos de WT.
[00182] genoma T: Enquanto WT consiste de 624 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 90° alanina é deletado de modo a constituir 623 aminoácidos.
(Mutante de um gene (NtLOM2): 1 linhagem)
22G2-58-26 [00183] genoma S: Enquanto WT consiste de 714 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 58 aminoácidos não aparentados (MAGKRSWLLSCSHFHLSWSQKNLILDLGIWIICCRNLPAPTRPFSGGSPAIWRTHQLA (SEQ ID NO: 84)) são adicionados além de até 83 aminoácidos
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86/93 idênticos aos de WT.
[00184] genoma T: Enquanto WT consiste de 714 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 18 aminoácidos não aparentados (NCVNRLEIMSIVLITYNL (SEQ ID NO: 85)) são adicionados além de até 85 aminoácidos idênticos aos de WT.
(Mutante de dois genes (NtLOM2 e NtLOM3): 3 linhagens) (1) Gl-179-2
Mutação em NtLOM2 [00185] genoma S: Enquanto WT consiste de 714 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 361° leucina é deletado de modo a constituir 713 aminoácidos.
[00186] genoma T: Enquanto WT consiste de 714 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 9 aminoácidos não aparentados (RPDISQTRK (SEQ ID NO: 86)) são adicionados além de até 362 aminoácidos idênticos aos de WT.
Mutação em NtLOM3 [00187] genoma S: Enquanto WT consiste de 626 aminoácidos, um polipeptídeos é produzido de modo que 57 aminoácidos não aparentados (GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI
| (SEQ ID NO: 87)) | são adicionados | além de | até | 275 | |
| aminoácidos idênticos | aos de WT. | ||||
| [00188] genoma T | : Enquanto | WT | consiste | de | 624 |
aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 9 aminoácidos não aparentados (RPDNSQTRK (SEQ ID NO: 88)) são adicionados além de até 272 aminoácidos idênticos aos de WT.
(2) Gl-179-17
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Mutação em NtL0M2 [00189] genoma S: Enquanto WT consiste de 714 aminoácidos, os seguintes polipeptídeos são produzidos: (i) um polipeptídeo consistindo de 713 aminoácidos em que 361° leucina é deletado; e (ii) um polipeptídeo em que 57 aminoácidos não aparentados (GRTFLKRANDIGAAQSTALSHWQTLQEGCFLLQRGSAVTFPFALYIHIFSTKNSHPI
| (SEQ ID NO: 89)) | são adicionados | além de | até | 362 | |
| aminoácidos idênticos | aos de WT. | ||||
| [00190] genoma T | : Enquanto | WT | consiste | de | 714 |
aminoácidos, um polipeptídeos é produzido de modo que 9 aminoácidos não aparentados (RPDISQTRK (SEQ ID NO: 86)) são adicionados além de até 362 aminoácidos idênticos aos de WT.
Mutação em NtLOM3 [00191] genoma S: Enquanto WT consiste de 626 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 57 aminoácidos não aparentados (GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI
| (SEQ ID NO: 87)) | são adicionados | além de | até | 275 | |
| aminoácidos idênticos | aos de WT. | ||||
| [00192] genoma T | : Enquanto | WT | consiste | de | 624 |
aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 9 aminoácidos não aparentados (RPDNSQTRK (SEQ ID NO: 88)) são adicionados além de até 272 aminoácidos idênticos aos de WT.
(3) Gl-179-26
Mutação em NtLOM2 [00193] genoma S: Enquanto WT consiste de 714 aminoácidos, um polipeptídeo é produzido de modo que 57
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88/93 aminoácidos não aparentados (GRTFLKRANDIGAAQSTALSHWQTLQEGCFLLQRGSAVTFPFALYIHIFSTKNSHPI (SEQ ID NO: 89)) são adicionados além de até 362°
| aminoácidos | idênticos aos de WT. |
| [00194] | genoma T: Enquanto WT consiste de 714 |
| aminoácidos | , um polipeptídeo é produzido de modo que 9 |
| aminoácidos | não aparentados (RPDISQTRK(SEQ ID NO: 86)) são |
| adicionados | além de até 362 aminoácidos idênticos aos de |
WT.
| Mutação | em NtLOM3 |
| [00195] | genoma S: Enquanto WT consiste de 626 |
| aminoácidos | , um polipeptídeo é produzido de modo que 57 |
| aminoácidos | não aparentados |
(GRTILKRANDIGAAQSTALSPWQTLQEVCFLLQRGSAIAFPFALYIHIFSTKNSHAI (SEQ ID NO: 87)) são adicionados além de até 275
| aminoácidos | idênticos aos de WT. |
| [00196] | genoma T: Enquanto WT consiste de 624 |
| aminoácidos | , um polipept ideos é produzido de modo que 9 |
| aminoácidos | não aparentados (RPDNSQTRK (SEQ ID NO: 88)) são |
| adicionados | além de até 272 aminoácidos idênticos aos de |
WT.
[3. Avaliação do efeito de genes candidatos no desenvolvimento de brotos axilares]
| [00197] | 0 desenvolvimento de brotos axilares dos |
| mutantes e | dos recombinantes foi avaliado como descrito |
abaixo.
| [00198] | As sementes dos mutantes e recombinantes e |
tipos selvagens dos mesmos foram semeadas e cultivadas em um estufa de contenção ou cabine de crescimento sob luz
| artificial, | Koitotron (Koito Manufacturing Co., Ltd.). As |
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89/93 condições da estufa de contenção foram definidas de modo que a temperatura foi mantida em temperatura ambiente de 23°C a 25°C, e a extensão do dia foi de um dia natural. As condições de Koitotron foram definidas de modo que a extensão do dia foi 12 horas, e a temperatura foi 25°C (periodo com luz) e 18°C (período escuro). Os indivíduos foram cultivados em vasos de 15 cm que foram cheios com solo enriquecido tendo um volume de 500 mL/vaso. A composição do solo enriquecido foi a seguinte. Compostagem: 40 L, solo selvagem: 30 L, solo Akadama (pequeno) : 10 L, solo Akadama (médio): 10 L, vermiculite: 10 L, fertilizante (S625) : 1.000 g.
[00199] Poda de topo foi realizada quando 12 a 13 folhas verdadeiras foram produzidas durante um período começando na brotação e terminando antes da floração. O alvo selecionado para ser avaliado foi um broto axilar que foi produzido em uma quarta folha verdadeira do fundo de uma parte aérea ou uma folha maior. Cada semana desde a poda de topo, o número de brotos axilares com uma haste tendo um comprimento de aproximadamente 5 mm ou mais longa foi registrado. Os brotos axilares assim registrados foram apanhados manualmente de sua base, e o peso fresco (FW) dos brotos axilares assim apanhados foi medido. Até o desenvolvimento de novos brotos axilares não ser mais encontrado, o número e o peso fresco de brotos axilares foram medidos durante substancialmente 5 vezes.
[00200] Figuras 5 e 6 mostram os resultados. Figura 5 é uma vista mostrando os resultados de avaliação de desenvolvimento de broto axilar nos mutantes de dois genes. Figura 6 é uma vista mostrando os resultados de avaliação
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90/93 de desenvolvimento de broto axilar nos recombinantes em que dois genes foram suprimidos.
[00201] Como mostrado em Figura 5, Gl-179-2 dos mutantes de dois genes exibiu uma notável diminuição em peso fresco (FW) de brotos axilares primários em comparação com WT. Em adição, Gl-179-17 dos mutantes de dois genes exibiu uma diminuição estatisticamente significante no número e peso fresco de brotos axilares primários em comparação com o tipo selvagem (WT) . Embora não particularmente mostrado em Figura 5, nenhuma diferença notável foi observada em termos de crescimento entre os mutantes de dois genes e WT. Em adição, embora não mostrado em Figura 5, Gl-17 9-26, que foi obtido como o mutante de dois genes, não exibiu formação ou desenvolvimento de brotos axilares primários a partir da axila foliar, mesmo se o ápice do rebento foi cortado antes da brotação (isto é, brotos de flores não foram formados).
[00202] Porque FW aumenta junto com o crescimento de brotos axilares primários, uma diminuição significante em FW significa que o crescimento dos brotos axilares primários é significativamente suprimido. Embora brotos axilares primários sejam formados, lento crescimento dos brotos axilares primários provoca o seguinte: (i) é desnecessário remover os brotos axilares primários; (ii) é desnecessário aplicar agroquímicos aos brotos axilares primários, e (iii) o número de vezes de aplicação de agroquímicos diminui. Portanto, a diminuição significante em FW substancialmente reduz a mão-de-obra resultante de um processo de suprimir brotos axilares. Observa-se que os mutantes de dois genes dos 2 indivíduos não produziram
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91/93 brotos axilares secundários.
[00203] Como mostrado em Figura 6, os recombinantes em que dois genes foram suprimidos (7H) exibiram diminuições estatisticamente significantes no número e peso fresco (FW) de brotos axilares primários em comparação com (i) indivíduos (7N) em que nem a expressão de NtLOM2, nem de NtLOM3 foi suprimida e (ii) WT. Embora não particularmente mostrado em Figura 6, não foi notada nenhuma diferença notável observada em termos de crescimento entre 7H, 7N, e WT os mutantes de dois genes e WT. No entanto, a diminuição no número de brotos de flores em 7H foi observada.
[Exemplos Comparativos] [00204] Como no item 3, o desenvolvimento de brotos axilares dos seguintes foi avaliado: dois tipos de recombinantes em que um gene tinha expressão suprimida (3 indivíduos), e dois tipos de mutantes em que um gene tinha mutação (4 indivíduos). Figuras 7 até 9 mostram os resultados. Como mostrado em Figuras 7 e 9, supressão funcional de um gene (expressão suprimida e mutação) não suprimiu o desenvolvimento de brotos axilares primários. Como mostrado em Figura 8, apareceu que mutante de um gene, em que a mutação foi introduzida no gene NtLOM2, exibiu uma diminuição em peso de brotos axilares primários em aproximadamente 50% em média (sem diferença significante de SR-1) . Para a finalidade de confirmar estes resultados, recombinantes em que um gene (NtLOM2) tinha expressão suprimida, em vez de mutantes, foram preparados como descrito acima.
[00205] Figura 10 mostra os resultados de confirmação dos niveis de expressão de mRNA e desenvolvimento de broto
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92/93 axilar de NtL0M2 nos recombinantes (2 individuos) em que um gene (NtLOM2) tinha expressão suprimida. Como mostrado na fileira superior de Figura 10, (i) a expressão do mRNA de
NtLOM2 dos recombinantes foi especificamente suprimida e (ii) os niveis de expressão de mRNA de NtLOM3 dos recombinantes não foram suprimidos. Como mostrado na fileira inferior da Figura 10, em contraste com os resultados mostrados em Figura 8, uma linhagem 'homo' de cada linhagem exibiu um aumento em peso de brotos axilares em comparação com uma linhagem nula. Portanto, verificou-se que a supressão funcional de um gene é insuficiente para suprimir de modo estável o desenvolvimento de brotos axilares, e que a supressão funcional de dois genes é extremamente preferível para suprimir o desenvolvimento de brotos axilares.
[00206] Assim, se tornou evidente que o desenvolvimento de brotos axilares primários não pode ser suprimido simplesmente por manipulação de apenas um gene ortólogo de tabaco, embora seja sugerido que o gene ortólogo esteja envolvido na formação de brotos axilares em outras plantas.
[Referências ]
1. Li JF, Norville JE, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church GM, Sheen J. (2013) Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol. 31(8), 688-91.
2. Waibel F, Filipowicz W. (1990) U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribed by RNA polymerase III but contain the same two upstream promoter elements as RNApolymerase Il-transcribed U-snRNA genes. Nucleic Acids
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93/93
Res. 25,-18(12), 3451-8.
Aplicabilidade Industrial [00207] Com uma modalidade da presente invenção, é possivel suprimir o desenvolvimento de brotos axilares desnecessários durante cultivação de planta de tabaco. Isto permite uma redução em mão-de-obra e custos durante cultivação, e leva a um aumento na qualidade das folhas a serem colhidas.
Claims (11)
- (1) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d);1. Método de produzir uma planta de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de:(A) introduzir, em um genoma de uma planta de tabaco, uma mutação causando supressão funcional de, pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3):
- (2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (k) ou polinucleotídeo (1) ; e (C) determinar que uma planta de tabaco, em que a mutação foi detectada, é uma planta de tabaco em que o desenvolvimento dos brotos axilares primários é suprimido, o polinucleotídeo (a) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotídeo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com oPetição 870190091161, de 13/09/2019, pág. 219/2242. Método, de acordo a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de:(B) selecionar, a partir de indivíduos produzidos pela etapa (A) , um indivíduo em que desenvolvimento dos brotos axilares primários é suprimido.2/6 representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo (f) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (g) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotídeo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (i) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotídeo (j) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (k) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotídeo (1) sendo um polinucleotídeoPetição 870190091161, de 13/09/2019, pág. 217/224(2) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (e) ou um polinucleotídeo (f); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (g) ou um polinucleotídeo (h); e (3) pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (i) ou um polinucleotídeo (j); e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (k) ou um polinucleotídeo (1), a supressão funcional suprimindo desenvolvimento de brotos axilares primários, o polinucleotídeo (a) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, o polinucleotídeo (b) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidosPetição 870190091161, de 13/09/2019, pág. 216/224
- 3. Método de acordo a reivindicação 13 caracterizado pelo fato de na etapa (B), um indivíduo, em que o número ou peso dos brotos axilares primários é diminuído em comparação com o de uma planta de tipo selvagem, é selecionado.3/6 complementar a um polinucleotideo que hibrida com o polinucleotideo (k) sob condições estringentes.
- 4/64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa (A) inclui introduzir a mutação em cada um dos pelo menos dois genes.
- 5/6 polinucleotídeo (a) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (c) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, o polinucleotídeo (d) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (c) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (e) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 3, o polinucleotídeo (f) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (e) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (g) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4, o polinucleotídeo (h) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (g) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (i) sendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 5, o polinucleotídeo (j) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que hibrida com o polinucleotídeo (i) sob condições estringentes, o polinucleotídeo (k) sendo um polinucleotídeoPetição 870190091161, de 13/09/2019, pág. 220/2245.Método, de acordo a reivindicação15, caracterizado pelo fato de que a etapa (A) é realizada por mutação espontânea, tratamento mutagênico, recombinação gênica edição do genoma, ou nocaute do gene.
- 6/6 codificando um polipeptídeo tendo uma identidade de sequência de 90% ou maior com uma sequência de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 6, e o polinucleotídeo (1) sendo um polinucleotídeo complementar a um polinucleotídeo que híbrida com o polinucleotídeo (k) sob condições estringentes.6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa (A) inclui inserir, em um exterior de uma região em que os pelo menos dois genes estão presentes, um polinucleotideo expressando um fator que promove a degradação dos mRNAs transcritos a partir dos pelo menos dois genes.
- 7. Método, de acordo a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que fator é uma molécula de RNA antissenso, uma molécula de RNAi, ou uma molécula de co-supressão.Petição 870190091161, de 13/09/2019, pág. 218/224
- 8. Método de determinar uma planta de tabaco em que desenvolvimento de brotos axilares primários é suprimido, o
método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (A) obter uma amostra por coleta de uma parte de uma planta de tabaco; (B) detectar, a partir de um genoma incluido na amostra , uma mutação causando supressão funcional de , pelo menos, dois genes dos seguintes genes (1) a (3) no genoma: (D pelo menos um de: um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (a) ou um polinucleotídeo (b) ; e um gene contendo, como uma região codificante, um polinucleotídeo (c) ou um polinucleotídeo (d); - 9. Método de reprodução de uma planta de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de:cruzar as plantas de tabaco que são determinadas pelo método, conforme definido na reivindicação 19, como plantas de tabaco em que desenvolvimento de brotos axilares primários é suprimido.
- 10. Tabaco curado, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir do tabaco em folhas colhido de (i) a planta de tabaco produzida pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 18; (ii) a planta de tabaco determinanda pelo método conforme definido na reivindicação 19; ou (iii) a planta de tabaco obtida pelo método conforme definido na reivindicação 20.
- 11. Produto de tabaco, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir do tabaco curado, conforme definido na reivindicação 23.
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