CN115960950A - 番茄SlBBX31基因、InDel标记及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄SlBBX31基因、InDel标记及应用，所述SlBBX31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用基因编辑技术CRISPR‑Cas9和农杆菌介导的稳定番茄遗传转化方法将SlBBX31从番茄MT（micro‑Tom）中敲除进行功能验证，得出SlBBX31基因缺失导致番茄植株的耐冷性降低，同时SlBBX31超量表达植株表现出耐冷性增加的表型，表明SlBBX31在调控番茄响应低温胁迫应答中起着重要功能。对SlBBX31基因变异位点分析发现，在番茄群体中不同的抗感材料中，SlBBX31基因的启动子区域有27 bp的插入/缺失（Indel）变异，有27 bp碱基片段插入的品种对冷胁迫敏感，无27 bp碱基片段插入的品种抗冷胁迫能力强，利用该缺失突变位点开发了1个共显性InDel标记，该标记的应用将加速番茄抗冷的育种进程。

Description

番茄 SlBBX31基因、InDel标记及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及番茄 SlBBX31基因、InDel标记及应用。

背景技术

番茄（ Solamum lycopersicum）作为世界普遍栽培的重要果蔬之一，也作为植物科学研究中的重要的模式植物之一，在栽培过程中，常常遇到低温胁迫的影响，导致番茄减产。因此，利用番茄揭示植物耐低温的分子机制，获得低温耐受性新品种具有重要的理论意义和实用价值。

 2012年番茄的基因组测序以及重测序数据的公布，使得科学家采用全基因组关联分析（GWAS）的方法寻找低温耐受性相关基因，并解析其功能成为可能。截至目前，通过全基因组关联分析的方法，番茄果实大小、果实风味和柱头长度等发育相关基因相继被报道。最近研究表明，番茄的果实大小选择驯化伴随着其耐盐性降低，通过全基因组关联分析发现，钾离子转运体 SlHAK20基因的自然变异与番茄根中钠钾比高度关联，敲除 SlHAK20基因造成番茄对盐的敏感性增加。随着基因工程技术的不断发展，可通过基因工程技术对番茄响应低温胁迫相关基因进行精确编辑，研究基因编辑株系对低温处理的表型变化。

通过基因工程手段来提高蔬菜作物在不良环境条件下的抗性，将对提高蔬菜产量、品质和经济效益，保障我国蔬菜均衡供应具有十分重要的科学和现实意义。同时，通过分子标记辅助育种，能够加速番茄抗冷的育种进程，找到与番茄耐低温相关的更多的基因或者分子标记，对番茄抗冷育种具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种番茄 SlBBX31基因。

本发明的目的之二在于提供上述番茄 SlBBX31基因在提高植物抗冷胁迫中的应用。

本发明目的之三在于提供与番茄抗冷胁迫相关的InDel标记。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：

番茄 SlBBX31基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述番茄 SlBBX31基因编码的蛋白选自，

（1）其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）将SEQ ID NO.2氨基酸序列经过一个或多个（如1-30个；较佳地1-20个；更佳地1- 10个；如5个，3个）氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有（1）蛋白功能的由（1）衍生的蛋白；或

（3）与（1）限定的蛋白序列有80％（较佳地90％以上，如95％，98％，99％或更高）以上同源性且具有（1）蛋白功能的由（1）衍生的蛋白。

也就是说本发明所保护的基因的功能，不仅包括上述番茄 SlBBX31基因，还包括与SEQ ID NO.1具有较高同源性（如同源性高于40％；较佳地高于50％；较佳地高于60％；更佳地高于70％；更佳地高于80％；更佳地高于90％；更佳地高于95％；更佳地高于98％）的同源基因。

其中，序列中的SEQ ID NO.1由774个碱基组成，自5’端第1位碱基为转录起始位点，第772-774位碱基为终止密码子，编码框为771个碱基，共编码257个氨基酸。

并且含有上述基因的表达载体、重组载体或转基因细胞系以及含有所述载体的宿主细胞的获得方法也落入本发明的保护范围之内。

本发明最主要的目的在于上述 SlBBX31基因在提高植物抗冷胁迫中的应用。通过在分子水平上对番茄 SlBBX31进行克隆和鉴定，得出 SlBBX31基因在提高植物抗冷胁迫中起着重要的作用，从而为解析番茄冷胁迫响应调控机理提供理论基础。

具体地，可以通过超量表达 SlBBX31基因的方式来获得抗冷胁迫强的植物。

根据其功能，可以通过转基因的方式来获得抗冷胁迫的植株，具体地，可以通过将 SlBBX31基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株抗冷胁迫高于目的植物。

具体地， SlBBX31基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

另外，通过抑制 SlBBX31基因的功能在获得低温处理敏感症状的植物方面的应用。具体地，可以选择通过敲除 SlBBX31基因的方式来获得低温处理敏感症状的植物。更加具体地，所述植物为番茄。

具体地，为了提高植物的优良性状，本发明还公开一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）或（3）：

（1）通过增加目的植物中 SlBBX31蛋白的活性，获得抗冷胁迫强于目的植物的植株；

（2）通过促进目的植物中 SlBBX31基因的表达，获得抗冷胁迫强于目的植物的植株；

（3）通过抑制目的植物中的 SlBBX31基因的表达，获得低温处理敏感症状高于目的植物的植株；

所述 SlBBX31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述 SlBBX31蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，优选地，所述目的植物为番茄。

“促进目的植物中 SlBBX31基因的表达”的实现方式可为如下（1）或（2）或（3）:

（1）将 SlBBX31基因导入目的植物；

（2）引入强启动子和/或增强子；

（3）本领域内的其它常见方法。

“抑制目的植物中的 SlBBX31基因的表达”的实现方式可以通过敲除 SlBBX31基因的方式来实现，具体的，可以通过基因编辑的方式获得 SlBBX31基因缺失的突变体植物。更加具体地，将多核苷酸通过常规的方法克隆到CRISRP载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述SlBBX31蛋白到植物细胞中，使所述的植物细胞中SlBBX31蛋白缺失。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得 SlBBX31基因缺失的突变体植物。并利用农杆菌转化法将重组质粒转入植物中。

本发明还利用 SlBBX31基因的遗传变异开发了1个共显性InDel标记，该标记的应用将极大地加速番茄抗冷的育种进程。所述分子标记的引物为：

上游引物F：GTCGCCATAACGAAATGACAC；

下游引物R：TGGGGTTGAGCTGATGTGGAG。

其中，不同品种的 SlBBX31基因5’端上游2k的启动子区域内有一个27 bp碱基片段的插入/缺失变异，有27 bp碱基片段插入的品种对冷胁迫较敏感，无27 bp碱基片段插入的品种抗冷胁迫能力强。

利用上述分子标记，可以有效的对耐冷品种进行选择，极大的提高了番茄育种效率，缩短耐冷种质育种周期。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是（不限于）：双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。

作为一种优选方式，所述的“植物”包括但不限于：番茄，凡是具有该基因或者与之同源的基因均适用。

本发明中所说的“植物”包括整株植物，其亲本和子代植株以及植物的不同部位，包括种子、果实、芽、茎、叶、根（包括块茎）、花、组织和器官，在这些不同的部分均有我们目的基因或者核酸。这里所提及的“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。

本发明包括任何植物细胞，或任何由其中的方法获得或可获得的植物，以及所有的植物部分及其繁殖体。本专利也包含由任何前述方法所获得的转染细胞、组织、器官或完整植物。唯一的要求是子代表现出相同的基因型或表型特征，使用本专利中的方法获得的子代特性相同。

本发明还扩展到如上所述的植物的可收获的部分，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根茎、块茎和球茎。同时进一步涉及植株收获后的其他衍生物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。本发明还涉及由相关植物获得的食品或食品添加剂。

本发明的优点：

（1）本发明首次通过植物基因组克隆获得 SlBBX31基因，利用农杆菌介导的方法将 SlBBX31从番茄MT中敲除和过表达进行功能验证，有利于从分子机制上阐明 SlBBX31在调控冷胁迫响应方面的作用，对培育低温耐受性番茄新品种具有积极的指导作用。

（2）可以通过转基因的方式来获得抗冷胁迫强的植株，具体地，可以通过将 SlBBX31基因导入目的植物，得到转基因植物，该植株抗冷胁迫能力高于目的植物，为植物抗冷育种提供一种新的途径。

（3）对于一些番茄品种耐冷胁迫的遗传改良，可以利用该基因启动子区域的InDel标记设计育种方案，该标记的应用将极大地加速番茄抗冷育种的进程。

附图说明

图1 （A）番茄317份自然群体冷处理后叶片电导率性状的Manhattan图及候选基因变异分析；（B）4℃处理0、6和24小时， SlBBX31基因在不同品种中的表达模式分析；（C）不同品种冷处理前后的电解质渗透率。

图2 （A）两种不同编辑类型的敲除系 slbbx31 #1（+1 bp）和 slbbx31 #2（-2 bp）；（B）过表达株系 SlBBX31-OX #1和 SlBBX31-OX #2中 SlBBX31基因表达模式分析；（C）野生型、Cas9对照、敲除系 slbbx31 #1（+1 bp）和 slbbx31 #2（-2 bp）低温处理表型分析；（D）野生型、Cas9对照、敲除系 slbbx31 #1（+1 bp）和 slbbx31 #2（-2 bp）电解质渗透率测定；（E）野生型、Cas9对照、过表达株系 SlBBX31-OX #1和 SlBBX31-OX #2低温处理表型分析；（F）野生型、Cas9对照、过表达株系 SlBBX31-OX #1和 SlBBX31-OX #2电解质渗透率测定。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明进行详细的描述。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。如无特殊说明，所采用的试剂及材料，均可以通过商业途径获得。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

除非另有说明，本发明的实施将使用本领域技术人员显而易见的植物学常规技术、微生物、组织培养、分子生物学、化学、生物化学、DNA重组及生物信息学技术。这些技术均在已经公开的文献中进行了充分解释，另外，本发明所采用的DNA提取、系统发育树的构建、基因编辑方法、基因编辑载体的构建、基因编辑植物获得等方法，除了下述实施例采用的方法外，采用现有文献中已经公开的方法均能实现。

此处使用的“核酸”、“核酸序列”、“核苷酸”、“核酸分子”或“多聚核苷酸”术语意思是指包括分离的DNA分子(例如，cDNA或者基因组DNA)，RNA分子(例如，信使RNA)，自然类型，突变类型，合成的DNA或RNA分子，核苷酸类似物组成的DNA或RNA分子，单链或是双链结构。这些核酸或多聚核苷酸包括基因编码序列、反义序列及非编码区的调控序列，但不仅限于此。这些术语包括一个基因。“基因”或“基因序列”广泛用来指一有功能的DNA核酸序列。因此，基因可能包括基因组序列中的内含子和外显子，和/或包括cDNA中的编码序列，和/或包括cDNA及其调控序列。在特殊实施方案中，例如有关分离的核酸序列，优先默认其为cDNA。

另外，为了对本发明技术方案更直观的理解，对于本发明涉及到的一些专业术语解释如下：

“突变体”（Mutant），是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。

“表达载体”（Expression vectors），是指在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。

发明人通过生物信息学技术在番茄基因组基础上得到番茄 SlBBX31基因序列。本发明将其与植物编辑载体连接后导入野生型番茄进行表型鉴定。并且通过农杆菌介导进行番茄遗传转化，获得番茄SlBBX31过表达转化苗来鉴定其功能。

实施例1 番茄自然群体冷胁迫处理全基因组关联分析（GWAS）

全基因组关联分析使用的材料是实验室收集的317份番茄材料，并对基因组进行了重测序。对自然群体进行4℃低温处理后，对叶片进行电解质渗透率测定。对电解质渗透率进行全基因组关联分析，结果显示：在7号染色体上有一个关联区段，结合连锁SNP位点和转录组数据，最后确定一个低温响应基因BBX类转录因子 SlBBX31为候选基因（ Solyc07g053140）（图1A）。关联分析结果显示： SlBBX31基因的启动子区域存在一个27 bp（GTTTGGGTCCTACACCAGTGATTTGAG，SEQ ID NO.5）碱基片段的插入/缺失（Indel）变异，该变异与冷处理后植株表型紧密连锁。有27 bp碱基片段插入的品种该基因表达量较低（图1B），且电解质渗透率较高（图1C），该品种对冷胁迫较敏感；无27 bp碱基片段插入的品种该基因表达量较高（图1B），且电解质渗透率较低（图1C），该品种较抗冷胁迫。

并且利用该缺失突变位点开发了1个共显性InDel标记，所述分子标记的引物为：

上游引物F：GTCGCCATAACGAAATGACAC（SEQ ID NO.3）；

下游引物R：TGGGGTTGAGCTGATGTGGAG（SEQ ID NO.4）。

实施例2  SlBBX31基因的分离

MT番茄幼苗总RNA的提取：按照Trizol提取试剂（Takara）说明进行，第一链cDNA合成按照反转录试剂盒PrimerScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Takara）说明进行。以番茄的cDNA为模板，使用Primer STAR Max高保真酶扩增（Takara），退火温度为58℃。

以下述序列为引物，通过PCR扩增获得 SlBBX31基因的全长序列。 SlBBX31基因的全长序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，共774 bp，共编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.2所示，共257个。

引物序列为：

SlBBX31-F：5'- ATGAAGAACTGTGAGCTTTGT -3'；

SlBBX31-R：5'- CTACGATGTCTCTGAGCTTTT -3'。

实施例3 SlBBX31基因的功能鉴定试验

为研究 SlBBX31基因是否调控番茄对低温的耐受性，通过基因敲除株系和过表达株系番茄来鉴定其功能。

1.构建重组载体

在 SlBBX31基因CDS区域选取靶位点，即ACGGCTTGGTCGGCTGCCGG。回收纯化sgRNA- SlBBX31片段并与酶切后的载体链接，从而获得 SlBBX31-CRISPR重组质粒。并通过农杆菌介导进行番茄遗传转化，获得番茄 SlBBX31-CRISPR的转化苗。

将 SlBBX31基因的CDS序列插入pCAMBIA1300-35S-GFP超表达载体中，重组引物序列为：

35S-SlBBX31-GFP-F：

5'- ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGAAGAACTGTGAGCTTTGT -3'；

35S-SlBBX31-GFP-R：

5'- GCCCTTGCTCACCATGTCGACTTTTGGTAC AACATCATATGA -3'。

回收纯化片段并与酶切后的载体链接，从而获得pCAMBIA1300-35S-SlBBX31-GFP重组质粒。并通过农杆菌介导进行番茄遗传转化，获得番茄 SlBBX31过表达转化苗。

2. 转基因阳性株的筛选及表型分析

取抗性植株叶片100 mg，采用CTAB法提取基因组总DNA。并根据靶基因序列设计特异性引物，进行PCR扩增，并送样测序。

引物序列为：

SlBBX31-g1-F： 5'- ATGAAGAACTGTGAGCTTTG -3'；

SlBBX31-g1-R： 5'- ATCTGACTGAAGATCCGGAT -3'。

经测序鉴定，共获得2种不同编辑类型的 SlBBX31敲除株系，如 slbbx31 #1 (+1bp)和 slbbx31 #2(-2 bp)（图2A）。

另外，通过过表达共获得两种 SlBBX31过表达株系SlBBX31-OX #1和SlBBX31-OX #2（图2B）。

将 SlBBX31敲除株系、 SlBBX31过表达株系以及野生型进行对比，从图2C可以看出， SlBBX31敲除株系与野生型相比，4℃低温处理敏感，电解质渗透率比野生型（对照）显著升高（图2D）。从图2E可以看出， SlBBX31过表达株系与野生型相比，更抗低温胁迫，电解质渗透率比对照显著降低（图2F）。可见 SlBBX31基因在调控番茄响应低温胁迫应答中起着重要功能。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理上所作的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims (10)

1.番茄SlBBX31基因在提高植物抗冷胁迫中的应用，其特征在于，所述SlBBX31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，番茄SlBBX31基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过超量表达SlBBX31基因的方式来获得抗冷胁迫的植物。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。

5.抑制番茄SlBBX31基因的功能在获得低温处理敏感症状的植物方面的应用，其特征在于，所述SlBBX31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过敲除SlBBX31基因的方式来获得低温处理敏感症状的植物。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。

8.一种植物育种方法，其特征在于，所述方法为以下（1）或（2）或（3）：

（1）通过增加目的植物中SlBBX31蛋白的活性，获得抗冷胁迫强于目的植物的植株；

（2）通过促进目的植物中SlBBX31基因的表达，获得抗冷胁迫强于目的植物的植株；

（3）通过抑制目的植物中的SlBBX31基因的表达，获得低温处理敏感症状高于目的植物的植株；

所述SlBBX31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SlBBX31蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述目的植物为番茄。

9.与番茄抗冷胁迫相关的InDel标记，其特征在于，所述InDel标记的引物为：

上游引物F：GTCGCCATAACGAAATGACAC；

下游引物R：TGGGGTTGAGCTGATGTGGAG。

10.根据权利要求9所述的与番茄抗冷胁迫相关的InDel标记，其特征在于，不同品种的SlBBX31基因5’端上游2k的启动子区域内有一个27 bp碱基片段的插入/缺失变异，有27 bp碱基片段插入的品种对冷胁迫敏感，无27 bp碱基片段插入的品种抗冷胁迫能力强。

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