CN112646013B - 玉米开花期基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子遗传学领域。本发明提供了一个控制玉米开花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以改变开花期的方法。本发明还提供了开花期改变的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米开花期性状。

Description

玉米开花期基因及其应用
技术领域
本发明属于分子遗传学领域。具体涉及一个控制玉米开花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以延长花期的方法。本发明还提供了花期延长的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米花期性状。
背景技术
在高等植物中，开花代表着从营养生长到生殖生长的转换过程，其在植物体的整个生长发育阶段中具有重要的作用。而何时开花这一生物性状则受到植物体自身遗传因子及外界环境因素的双重作用。在这双重作用的影响下，一系列开花诱导过程在高等植物中具有普遍的规律，即植物体叶片通过感受外界生长条件(光照，温度，湿度等)，在适宜的时间产生成花物质(或叫开花素florigen)，成花物质经过输导组织由叶片运送到茎尖生长点，刺激顶端分生组织成花。
开花期是作物进化和适应过程中的重要性状，理解作物开花期性状的遗传基础、克隆候选基因可以提高作物的环境适应能力和可塑性，这对培育适应不同生态区的优良作物品种具有重要的意义，同时也将促进产量等与开花期密切相关的重要生产性状的遗传改良进程。
虽然，现在已经在玉米中鉴定到很多与开花期性状相关的基因，然而由于开花期性状调控的复杂性以及玉米具体种植环境的差异，需要获得更多的开花期基因以深入解析玉米开花期的精细调控，并根据种植地环境的差异精准调节玉米植物的开花时间，从而培育具有更强生态适应性的玉米新品种。
申请人之前构建了一个玉米自交系群体CUBIC，通过全基因组基因型分析和各种不同表型的鉴定可以获得一些与性状相关的候选基因(Liu HJ,Wang XQ,Xiao YJ,etal.CUBIC:an atlas of genetic architecture promises directed maize improvement[J].Genome Biol.,2020,21(1):20.)。通过对一些候选基因的进一步鉴定证明群体中分析出的部分候选基因确实具有相关的功能。
本发明为了进一步挖掘出一些与玉米开花期相关的候选基因，对CUBIC群体中的数据进行了更加深入的分析鉴定，并找到一个新的与开花期相关的显著SNP位点，该SNP位点在以前的资料中并未公开，且该位点所对应的候选基因并未注释具体的功能。本发明进一步利用基因编辑技术对该基因进行了突变，通过表型鉴定确认了该基因对玉米花期的调控作用，并获得了花期延迟的突变基因。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一个控制玉米花期性状的基因序列。
本发明的目的之二在于公开一种改变玉米花期的方法。
本发明的目的之三在于提供一个改变玉米花期性状的突变基因。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种蛋白在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种核酸分子在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述核酸分子编码上述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1序列为GRMZM2G172297基因在玉米自交系B73中的氨基酸序列，SEQID NO.2为GRMZM2G172297基因的基因组序列，SEQ ID NO.3为GRMZM2G172297基因的cDNA序列。
本发明还提供了一种延迟玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中上述基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期延迟的植株。
在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。
在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
在一些实施方案中，上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供了一种用于延迟玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)所述sgRNA的编码DNA分子；
(3)表达所述sgRNA的载体。
本发明还提供了一种玉米开花期延迟的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
通过基因编辑突变靶基因可以得到很多不同的编辑类型，这些不同的编辑类型所对应的植株表现并不是完全一样的。本发明经过筛选鉴定，确定SEQ ID NO.6或SEQ IDNO.7所示的突变基因能够使玉米开花期适度延迟。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制晚花玉米新品种。
本发明还提供了用于检测上述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示的序列或其互补序列。
本发明还提供了上述引物对在检测上述突变基因中的应用。利用上述引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列，如果扩增产物测序后序列与SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示序列的部分序列一致，则待测样品中包含上述突变基因。
本发明的优点及有益效果如下：本发明对CUBIC群体基因型和开花期表型数据的进一步挖掘，为了最大程度地挖掘玉米中与开花期相关的候选基因，降低因为前期全基因组关联分析中控制群体结构而造成的假阴性影响，将阈值进行了降低，找到一个新的与开花期相关的显著SNP位点，该SNP位点在以前的资料中并未公开，且该位点所对应的候选基因并未注释具体的功能。进一步利用基因编辑技术对该基因进行了突变，通过表型鉴定确认了该基因对玉米花期的调控作用，并获得了花期延迟的突变基因。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法可以改变玉米开花期，编辑后的突变基因能够用于创制晚花玉米新品种。本发明为人工调控玉米开花期以培育适应不同生态环境的玉米新材料提供了新的基因和方法。
附图说明
图1花期QTL定位结果。纵轴表示每个标记关联分析检验的p-value，取-log10，横轴表示染色体的位置。箭头指示显著的SNP位点信号。
图2基因编辑载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：
RB T-DNA repeat T-DNA右边界重复序列
M13 fwd M13引物序列(正向)
p000204_1F 靶标gRNA序列
Ubi promoter 泛素启动子
3×FLAG 标签序列
SV40NLS 猿猴病毒40核定位信号
Cas9 cas9基因序列
Nucleoplasm in NLS 核定位信号
NOS terminator 胭脂碱合成酶终止子
lac promoter 乳糖启动子
M13 rev M13引物序列(反向)
lac operator 乳糖操纵子
CAP biding site CAP结合位点
CaMV35S promoter(enhanced) 增强的花椰菜花叶病毒35S启动子
BlpR 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性
CaMV35S polyA single 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列
LB T-DNA repeat T-DNA左边界重复序列
Kan R 卡那霉素抗性序列
Ori 起始区序列
Bom 骨架区序列
pVS1 RepA pVS1复制子
pVS1 StaA pVS1转录起始区
具体实施方式
提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。
如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。
如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。
在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。
本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。
在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。
在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
实施例1玉米开花期显著SNP定位过程
1、群体构建
本发明将24个中国的优良玉米自交系，通过两代双列杂交、六代开放授粉及六代自交的方式获得了1404个子代组成的多亲本高世代自交系群体(CUBIC)。这24个中国优良玉米自交系包括LV28(旅28)、E28、DAN340(丹340)、F349、ZI330(自330)、ZONG3(综3)、ZONG31(综31)、HUANGC(黄C)、HZS(黄早四)、HYS(黄野四)、TY4(天涯4)、YUANGFH(原辅黄)、CHANG7-2(昌7-2)、K12、XI502(西502)、LX9801、H21、SHUANG741(双741)、Q1261、JI853(吉853)、JI53(冀53)、5237、81515、NX110(农系110)，该群体的24个亲本及1404子代自交系全部进行基因组测序，获得了超过14M的SNP和InDel变异。
2、表型分析
所有24个亲本和1404子代自交系在黄淮海及东北5个地点种植，表型变异丰富。所考查农艺表型包括植株高度、花期、开花期、穗重等产量性状等。将所有环境重复计算出每个自交系的最佳线性无偏预测因子(BLUP)值用于后续分析，包括基本表型统计、相关性分析和GWAS。
3、基于单标记的GWAS分析(sGWAS)
根据最小等位基因频率(MAF)过滤后，共计1180万个高质量SNP用于下游分析。前十个主成分(PC)共解释了8.76％的遗传方差，同时整合了亲缘关系K矩阵作为随机效应一起用于sGWAS分析。关联的显着性阈值设置为8.46E-8，等于1/Ne，其中Ne是用于分析的总标记数。
4、获得显著SNP位点
利用上述的定位方法，本发明找到了玉米开花期性状的1个显著SNP，位于第2染色体223,954,416bp处(图1)。该SNP经MaizeGDB数据库(https://www.maizegdb.org/)的查询位于1个有注释的基因内，编号为GRMZM2G172297，数据库中并未明确该基因的功能。该基因在B73中的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因组序列如SEQ ID NO.2所示，cDNA序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例2基因编辑敲除候选基因分析基因功能
本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对上述区间内的基因进行定点突变。实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：
1、基因编辑载体的构建
本发明的基因编辑载体为G08943-CPB-ZmUbi-hspCas9，其载体图如图1所示。该载体的基础载体为CPB-ZmUbi-hspCas9。本发明通过OverlapPCR获得双靶U6-sgRNA进而通过同源重组克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：
(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子。
(2)靶标gRNA的设计。将受体材料B73参考基因组序列输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。
(3)通过Overlap PCR获得U6-sgRNA。引物对U6F1/U6R用于扩增第一个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对gR-1F(3F)/gRR1用于扩增第一个靶标的sgRNA，产物长度为127bp；引物对U6F1/gRR1用于进行Overlap PCR第2步扩增(U6-sgRNA)，产物长度为634bp。Overlap PCR第1步分别扩增U6和sgRNA，PCR产物分别稀释50倍后混合作为模板进行Overlap PCR第2步扩增。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR第1步的15μL的反应体系如下，模板DNA(U6或sgRNA，≥30ng/μL)：0.5μL，Primer F/R：各1.2μL，灭菌ddH2O：3.7μL，2×phanta max Buffer：7.5μL，dNTP mix：0.6μL，Phanta酶(产品编号：P505-d1/d2/d3)：0.3μL。Overlap PCR第2步的反应体系为30μL体系。U6吸1μL，加49μL ddH2O稀释；sgRNA吸1μL，加49μL ddH2O稀释各吸10μL，混匀。具体如下：混合模板DNA(U6+sgRNA)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta maxBuffer：15μL，dNTP mix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃30秒，(3)62℃35秒，(4)72℃30秒，第(5)步是从(2)步－(4)步循环32次，(6)72℃10分钟，(7)25℃5分钟。载体构建所需的引物序列见表1。
表1载体构建所需的引物序列
Figure GDA0003527961110000111
(4)通过重组克隆构建到骨架载体。将CPB-Ubi-hspcas9载体用HindIII消化，回收。通过同源重组将U6-gRNA和载体二者连接。配反应液前保证各Overlap产物浓度接近一致，20μL的同源重组体系如下：Cas Hind III：3μL，T-1FOverlap：1μL，灭菌ddH2O：10μL，5×CE MultiS buffer：4μL，Exnase MultiS(产品编号：C113-01/02)：2μL。
2、玉米遗传转化
将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。
实施例3靶标位点和玉米开花期性状鉴定
GRMZM2G172297基因编辑时设计的靶标位点如SEQ ID NO.4所示。含有这个靶标的载体所表达的gRNA序列分别如SEQ ID NO.5所示。在靶标区域两侧设计引物，通过PCR扩增并测序的方式分析编辑后的基因序列。引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
提取苗期DNA检测基因编辑情况。扩增靶标编辑区段，扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH2O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步－(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。PCR产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。将转化株与受体KN5585的PCR扩增测序结果进行比较，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。
序列比较后发现有2种不同编辑类型的材料。其中A1材料在靶点处插入了一个A，A2材料在靶点处删除了3个碱基(表3)。因此，编辑后，A1、A2材料的基因组序列分别由SEQID NO.2变为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
表3基因编辑玉米材料的花期性状数据
Figure GDA0003527961110000121
“-”表示删除序列，黑体表示插入序列，方框表示PAM序列，下划线表示编辑靶标。
2018年夏季在吉林省试验地调查了A1和A2材料的开花期性状(包括抽雄期、散粉期、吐丝期)，结果如表4所示。A1和A2已编辑的材料比未编辑的对照材料的花期均有不同程度的延迟，证明该基因确实控制花期性状，基因编辑后花期延迟。
表4基因编辑玉米材料的花期性状数据
Figure GDA0003527961110000122
花期数据以平均值±标准差表示，单位：天。“CK”表示未编辑的对照材料。“**”表示与对照相比有极显著差异(P<0.01)；“*”表示与对照相比有显著差异(P<0.05)。
因此SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的突变基因能够使玉米开花期适度延迟。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制晚花玉米新品种。
在导入的过程中，利用SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示序列的引物对可以检测玉米基因组中是否含有上述突变基因，用该引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列。如果扩增产物与SEQ ID NO:6第793-1829位所示序列一致，则包含SEQ ID NO.6所示的突变基因；如果扩增产物与SEQ ID NO:7第793-1825位所示序列一致，则包含SEQ ID NO.7所示的突变基因；如果扩增产物与SEQ ID NO:2第793-1828位所示序列一致，则为未编辑的基因型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 华中农业大学，吉林省农业科学院，未米生物科技（江苏）有限公司
<120> 玉米开花期基因及其应用
<130> 1
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 519
<212> PRT
<213> Zea mays
<400> 1
Met Leu Pro Pro Phe Gly Asn Pro Leu Trp Val Pro Glu Asp Met Asp
1 5 10 15
Asp Gln Gln Gln His Ala Pro Pro Pro Thr Pro Met Glu Leu Leu Thr
20 25 30
Val Pro Ala Gln Gly His Glu Glu Gln Asn Leu Leu Ala Leu Ala Ser
35 40 45
Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala Gly Cys Val Phe Ser Ser Pro Ala Met
50 55 60
Leu Asp Asp Asp Trp Tyr Phe Asp Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala Thr
65 70 75 80
Gly Ala Gln Gly His Leu Leu Leu Ala Pro Pro Gly Pro Val Pro Gly
85 90 95
Pro Gly Ala Gly Ser Gln Met Phe Ser Leu Phe Asn Val Gly Gly Ala
100 105 110
Ala Thr Phe Asp Val His Gly Phe Asp Ile Gly Leu Gly Thr Leu Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Asp Leu Val Pro Leu Ala Gly Ala Gly Asn Thr
130 135 140
Ser Asn Ser Ala Ser Phe Ser Met Ser Leu Asn Ala Gly Leu Leu Ala
145 150 155 160
Ser Ser Phe Gly Gly Phe Gly Thr Ala Pro Ala Gln Met Pro Asp Phe
165 170 175
Gly Gly Leu Gly Gly Phe Asp Met Phe Asn Asn Gly Ala Gly Ser Ser
180 185 190
Ser Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Ala Ser Leu Thr Val Pro Phe Ser
195 200 205
Gly Arg Gly Lys Pro Ala Val Leu Arg Pro Leu Glu Thr Phe Pro Pro
210 215 220
Val Gly Ala Gln Pro Thr Leu Phe Gln Lys Arg Ala Leu Arg Arg Asn
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Asp Tyr Asp Lys Lys Arg Lys Ala Glu Ala Thr Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Gly Ala Ser Ser Ala Cys Gly Gly Asp Asp Ala Glu Asp
260 265 270
Asp Asp Gly Gly Ser Ile Asp Ala Ser Gly Leu Asn Tyr Asp Ser Glu
275 280 285
Asp Ala Cys Arg Gly Val Glu Asp Ser Gly Lys Lys Asp Gly Lys Gly
290 295 300
Ser Asn Ala Asn Ser Ala Gly Asp Gly Lys Gly Lys Arg Lys Arg Leu
305 310 315 320
Pro Ala Lys Asn Leu Met Ala Glu Arg Arg Arg Arg Lys Lys Leu Asn
325 330 335
Asp Arg Leu Tyr Met Leu Arg Ser Val Val Pro Lys Ile Ser Lys Met
340 345 350
Asp Arg Ala Ser Ile Leu Gly Asp Ala Ile Glu Tyr Leu Lys Glu Leu
355 360 365
Leu Arg Lys Ile Glu Glu Leu Gln Asn Glu Val Glu Ser Ser Ala Ser
370 375 380
Pro Ala Ser Thr Ala Ser Leu Pro Pro Thr Pro Thr Ser Phe Arg Pro
385 390 395 400
Leu Thr Pro Thr Leu Pro Ala Leu Pro Ser Arg Val Lys Glu Glu Leu
405 410 415
Cys Pro Ser Ala Leu Pro Ser Pro Thr Ser Lys Gln Pro Arg Val Glu
420 425 430
Val Arg Thr Thr Arg Glu Gly Arg Glu Val Asn Ile His Met Leu Cys
435 440 445
Ala Arg Arg Pro Gly Leu Leu Leu Ala Thr Met Arg Ala Ile Glu Gly
450 455 460
Leu Gly Leu Asp Val Gln Gln Ala Val Ala Ser Cys Phe Asn Gly Phe
465 470 475 480
Ser Leu Asp Ile Phe Lys Ala Glu Leu Cys Lys Asp Gly Pro Ala Leu
485 490 495
Leu Leu Leu Pro Glu Glu Glu Ile Lys Ser Val Leu Leu Gln Ser Ala
500 505 510
Gly Leu His Gly Val Ala Pro
515
<210> 2
<211> 2420
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 2
tcctctgcag ctctgccacc cccaagaaag cgaggacgac ggctcgccct cgcgcggcgc 60
cttcatcatg ctcccgccgt tcggcaaccc gctctgggta ccggaggaca tggacgacca 120
gcagcagcac gcgcctccgc cgacgcccat ggagttgctg acggtgccgg cgcaggggca 180
cgaggagcag aacctcctag ccctggcctc ggccgccgcc gttgccgggg ccggatgtgt 240
tttcagctca ccggcgatgc tcgatgacga ctggtacttc gaccccgtgg ctgcggccgc 300
cgccaccggc gcgcaggggc acctgctcct ggcgccgccg gggccggtgc ccggccccgg 360
cgccggctcg cagatgttct ccctcttcaa cgttggcggc gccgcgacgt tcgacgtcca 420
tgggttcgac attggcctcg gcacgctcgg cggcgggtcc ggtggcgacc tggtcccgtt 480
ggcgggtgca gggaacacat cgaattccgc gtccttttcc atgtccctga acgccggcct 540
cctcgcctcc tcgttcggcg gctttggcac agcgccggcg caaatgccgg acttcggcgg 600
cctgggcggg ttcgacatgt tcaacaacgg cgccggctcc tcctccgcgg cgccccctcc 660
tgcctcggcg tcccttacgg tgccgttctc cgggcgcggg aagcccgccg tgctccgccc 720
gctggagacc ttcccgcccg tgggcgcgca gccgacgctg ttccagaagc gcgcgctgcg 780
ccgcaacggc ggcggggagg actacgacaa gaagcgcaag gcggaggcca ccgccgcggc 840
tgcgggagct tcgtcggcct gtggcggtga cgacgctgag gacgatgacg gcgggagcat 900
cgacgcgtcc gggctcaact acgactcgga ggacgcctgc aggggcgtcg aggatagtgg 960
aaagaaggac ggcaagggtt ccaacgccaa cagcgcgggc gacgggaaag gtaagaggaa 1020
gaggttgccg gccaagaacc tcatggcgga gcgccgtcgc cggaagaagc ttaatgaccg 1080
gctctacatg ctccgatccg tcgtgcccaa gatcagcaag gtgagaattg taccctttca 1140
tccatttgtt aatcggctac tatgaattgt agctcgtaat ttagatgaat tctccgaatt 1200
ttggtagcaa ttagcatctg gcattagtgc attactatgt gtgcttatat tggtatatgt 1260
ttcatggaat taattatgtg aagctagtgt actccctcca tggcgcacta taaattgttg 1320
tagagatgtt gcgcacataa gctgcagctg ttcccataga attgtagatg cccttgttgt 1380
ctctgactgc atccttcact gcattcatag atatcactag tgtaactttc tctggctgtt 1440
tctgtaaaga tggacagggc ctccattctc ggcgacgcga tcgagtacct gaaggagctg 1500
ctgcggaaga tcgaggagct ccagaacgag gtggagtcat cagcatcccc agcttccacg 1560
gcctcgctgc ctccgacgcc cacgagcttc cgccctctga ctcccacgct gcccgcccta 1620
ccatctcgcg tgaaggaaga gctgtgcccg agcgcgttgc ctagccctac ttccaagcaa 1680
ccaagggtca gtatatatac atacttctct ctgaaaccac gcttcatcgg cagcgttctt 1740
tcagatgaaa tggttcgaca aaaaaaaaac atgtcgtatt gattcgaatg tagcttcttc 1800
agctgtgact gtgagtgaca tggacgattt agctgacttg ttgtgtgcga caggttgagg 1860
tgaggacgac gagggaaggg cgggaggtga acatccacat gctctgcgct cgcaggcctg 1920
ggcttctgct cgctaccatg agggcaatcg aagggctcgg gctcgacgtc cagcaagctg 1980
ttgccagttg cttcaacggg ttttccttgg acatcttcaa ggctgaggta aacgtaatgt 2040
catgttattt cgttgccacg tgaaaaaaaa atctactgac gaggagagag ggcctgctgg 2100
tttttgctca atgctggcag ctgtgcaagg acggcccagc gctcctcctc ctgccagaag 2160
aagagatcaa gtccgtcctc ctgcagtctg ccgggctcca tggcgtggcg ccgtgacgcc 2220
ggacggcagg actgcgtgct cacccagccg ccaaagaaga aaataaaaag ggaacgatgt 2280
agcttctgtc agatctgtcc cttctccctg tcctgtatac attggatggc tctttctgtt 2340
tgccgtggtg gctggctctg cccggccaaa acagtcgcgt ggttgtggtt cgctgcagcc 2400
gagagaactg ttccctttct 2420
<210> 3
<211> 1831
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 3
tcctctgcag ctctgccacc cccaagaaag cgaggacgac ggctcgccct cgcgcggcgc 60
cttcatcatg ctcccgccgt tcggcaaccc gctctgggta ccggaggaca tggacgacca 120
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cgaggagcag aacctcctag ccctggcctc ggccgccgcc gttgccgggg ccggatgtgt 240
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cgccaccggc gcgcaggggc acctgctcct ggcgccgccg gggccggtgc ccggccccgg 360
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> 4
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<210> 5
<211> 103
<212> RNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 5
gcccuacuuc caagcaacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuu 103
<210> 6
<211> 2421
<212> DNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 6
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ttgccgtggt ggctggctct gcccggccaa aacagtcgcg tggttgtggt tcgctgcagc 2400
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<210> 7
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<400> 7
tcctctgcag ctctgccacc cccaagaaag cgaggacgac ggctcgccct cgcgcggcgc 60
cttcatcatg ctcccgccgt tcggcaaccc gctctgggta ccggaggaca tggacgacca 120
gcagcagcac gcgcctccgc cgacgcccat ggagttgctg acggtgccgg cgcaggggca 180
cgaggagcag aacctcctag ccctggcctc ggccgccgcc gttgccgggg ccggatgtgt 240
tttcagctca ccggcgatgc tcgatgacga ctggtacttc gaccccgtgg ctgcggccgc 300
cgccaccggc gcgcaggggc acctgctcct ggcgccgccg gggccggtgc ccggccccgg 360
cgccggctcg cagatgttct ccctcttcaa cgttggcggc gccgcgacgt tcgacgtcca 420
tgggttcgac attggcctcg gcacgctcgg cggcgggtcc ggtggcgacc tggtcccgtt 480
ggcgggtgca gggaacacat cgaattccgc gtccttttcc atgtccctga acgccggcct 540
cctcgcctcc tcgttcggcg gctttggcac agcgccggcg caaatgccgg acttcggcgg 600
cctgggcggg ttcgacatgt tcaacaacgg cgccggctcc tcctccgcgg cgccccctcc 660
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gctggagacc ttcccgcccg tgggcgcgca gccgacgctg ttccagaagc gcgcgctgcg 780
ccgcaacggc ggcggggagg actacgacaa gaagcgcaag gcggaggcca ccgccgcggc 840
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gaggttgccg gccaagaacc tcatggcgga gcgccgtcgc cggaagaagc ttaatgaccg 1080
gctctacatg ctccgatccg tcgtgcccaa gatcagcaag gtgagaattg taccctttca 1140
tccatttgtt aatcggctac tatgaattgt agctcgtaat ttagatgaat tctccgaatt 1200
ttggtagcaa ttagcatctg gcattagtgc attactatgt gtgcttatat tggtatatgt 1260
ttcatggaat taattatgtg aagctagtgt actccctcca tggcgcacta taaattgttg 1320
tagagatgtt gcgcacataa gctgcagctg ttcccataga attgtagatg cccttgttgt 1380
ctctgactgc atccttcact gcattcatag atatcactag tgtaactttc tctggctgtt 1440
tctgtaaaga tggacagggc ctccattctc ggcgacgcga tcgagtacct gaaggagctg 1500
ctgcggaaga tcgaggagct ccagaacgag gtggagtcat cagcatcccc agcttccacg 1560
gcctcgctgc ctccgacgcc cacgagcttc cgccctctga ctcccacgct gcccgcccta 1620
ccatctcgcg tgaaggaaga gctgtgcccg agcgcgttgc ctagccctac ttccaagcaa 1680
agggtcagta tatatacata cttctctctg aaaccacgct tcatcggcag cgttctttca 1740
gatgaaatgg ttcgacaaaa aaaaaacatg tcgtattgat tcgaatgtag cttcttcagc 1800
tgtgactgtg agtgacatgg acgatttagc tgacttgttg tgtgcgacag gttgaggtga 1860
ggacgacgag ggaagggcgg gaggtgaaca tccacatgct ctgcgctcgc aggcctgggc 1920
ttctgctcgc taccatgagg gcaatcgaag ggctcgggct cgacgtccag caagctgttg 1980
ccagttgctt caacgggttt tccttggaca tcttcaaggc tgaggtaaac gtaatgtcat 2040
gttatttcgt tgccacgtga aaaaaaaatc tactgacgag gagagagggc ctgctggttt 2100
ttgctcaatg ctggcagctg tgcaaggacg gcccagcgct cctcctcctg ccagaagaag 2160
agatcaagtc cgtcctcctg cagtctgccg ggctccatgg cgtggcgccg tgacgccgga 2220
cggcaggact gcgtgctcac ccagccgcca aagaagaaaa taaaaaggga acgatgtagc 2280
ttctgtcaga tctgtccctt ctccctgtcc tgtatacatt ggatggctct ttctgtttgc 2340
cgtggtggct ggctctgccc ggccaaaaca gtcgcgtggt tgtggttcgc tgcagccgag 2400
agaactgttc cctttct 2417
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 8
cggggaggac tacgacaaga 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> unknown(人工合成)
<400> 9
atcgtccatg tcactcacag t 21

Claims (11)

1.一种蛋白在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种核酸分子在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1中所述的蛋白。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。
4.一种延迟玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中权利要求1中所述蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期延迟的植株。
5.根据权利要求4所述延迟玉米开花期的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰或T-DNA插入中任一种。
6.根据权利要求5所述延迟玉米开花期的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。
7.根据权利要求6所述延迟玉米开花期的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。
8.一种用于延迟玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：
(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.5所示；
(2)编码(1)所述sgRNA的DNA分子；
(3)表达(1)所述sgRNA的载体。
9.一种玉米开花期延迟的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。
10.用于检测权利要求9所述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示的序列。
11.权利要求10所述的引物对在检测权利要求9所述突变基因中的应用。
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