CN112724215B

CN112724215B - 改变玉米开花期的基因及方法

Info

Publication number: CN112724215B
Application number: CN202110088377.7A
Authority: CN
Inventors: 金敏亮; 刘相国; 许洁婷; 刘海军; 尹悦佳; 黄磊; 郭嘉; 韩宝柱; 严建兵
Original assignee: Weimi Biotechnology Jiangsu Co ltd; Jilin Academy of Agricultural Sciences; Huazhong Agricultural University
Current assignee: Changzhou Xinmi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112724215A

Abstract

本发明属于分子遗传学领域。具体涉及改变玉米开花期的基因及方法。本发明提供了一个控制玉米开花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以改变开花期的方法。本发明还提供了开花期改变的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米开花期性状。

Description

改变玉米开花期的基因及方法

技术领域

本发明属于分子遗传学领域。具体涉及控制玉米花期的基因及其在改变玉米花期性状方面的应用。本发明提供了一个控制玉米花期基因的序列，且公开了利用基因工程手段突变该基因以延长花期的方法。本发明还提供了花期延长的玉米突变基因序列，该突变基因序列可以用来改良玉米花期性状。

背景技术

在高等植物中，开花代表着从营养生长到生殖生长的转换过程，其在植物体的整个生长发育阶段中具有重要的作用。而何时开花这一生物性状则受到植物体自身遗传因子及外界环境因素的双重作用。在这双重作用的影响下，一系列开花诱导过程在高等植物中具有普遍的规律，即植物体叶片通过感受外界生长条件(光照，温度，湿度等)，在适宜的时间产生成花物质(或叫开花素florigen)，成花物质经过输导组织由叶片运送到茎尖生长点，刺激顶端分生组织成花。

开花期是作物进化和适应过程中的重要性状，理解作物开花期性状的遗传基础、克隆候选基因可以提高作物的环境适应能力和可塑性，这对培育适应不同生态区的优良作物品种具有重要的意义，同时也将促进产量等与开花期密切相关的重要生产性状的遗传改良进程。

CCT(CO、COL和TOC1)家族基因广泛参与植物花期的调控过程，对植物的生长与发育起着至关重要的作用。玉米B73参考基因组中共有53个具有CCT结构的基因，申请人之前利用一个由368份玉米自交系组成的关联群体，定位到34个与玉米开花有关的CCT类基因(金敏亮.玉米泛转录组的构建及玉米开花抑制因子ZmCOL3的功能解析[D].湖北：华中农业大学，2018；Jin M,Liu X,Jia W,et al.ZmCOL3,a CCT gene represses flowering inmaize by interfering with the circadian clock and activating expression ofZmCCT[J].J Integr Plant Biol.,2018,60(6):465-480.)，其中的大部分基因尚没有具体的功能鉴定研究结果，因此具体哪些基因会确实地控制玉米开花性状尚不完全清楚。如果想要更加精准的改变玉米花期，需要具体明确究竟哪些基因会控制玉米花期性状以及这些基因进行了基因工程操作后对花期性状产生了什么程度的变化。

为解决上述问题，本发明利用基因编辑技术对这34个基因中的15个基因进行了突变，通过表型鉴定获得能够影响玉米开花期性状的基因和突变基因，并提供了人工改变玉米花期的方法。这些基因和方法可以用于人工调控玉米花期，培育适应不同生态环境的玉米新材料。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个控制玉米花期性状的基因序列。

本发明的目的之二在于公开一种改变玉米花期的方法。

本发明的目的之三在于提供一个改变玉米花期性状的突变基因。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种蛋白在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种核酸分子在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述核酸分子编码上述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1序列为GRMZM2G179024基因在玉米自交系B73中的氨基酸序列，SEQID NO.2为GRMZM2G179024基因的基因组序列，SEQ ID NO.3为GRMZM2G179024基因的cDNA序列。

本发明还提供了一种延迟玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中上述基因编码蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期延迟的植株。

在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入、物理或化学诱变中任一种。

在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

在一些实施方案中，上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供了一种用于延迟玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示；

(2)所述sgRNA的编码DNA分子；

(3)表达所述sgRNA的载体。

本发明还提供了一种玉米开花期延迟的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10任意一个所示。

通过基因编辑突变靶基因可以得到很多不同的编辑类型，这些不同的编辑类型所对应的植株表现并不是完全一样的。本发明经过筛选鉴定，确定SEQ ID NO.8或SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10所示的突变基因能够使玉米开花期适度延迟。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制晚花玉米新品种。

本发明还提供了用于检测上述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQID NO.11和SEQ ID NO.12所示的序列或其互补序列。

本发明还提供了上述引物对在检测上述突变基因中的应用。利用上述引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列，如果扩增产物测序后序列与SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示序列的部分序列一致，则待测样品中包含上述突变基因。

本发明的优点及有益效果如下：本发明利用关联群体定位到34个与玉米开花期性状有关的CCT类基因，然而并不知道这些候选基因中具体哪些基因会确实地控制玉米开花性状以及对开花期性状的影响程度。本发明利用基因编辑技术对这34个基因中的15个进行了突变，通过表型鉴定确定GRMZM2G179024确实能够影响玉米开花期性状。利用CRISPR/Cas9基因编辑的方法可以改变玉米开花期，编辑后的突变基因能够用于创制晚花玉米新品种。本发明为人工调控玉米开花期以培育适应不同生态环境的玉米新材料提供了新的基因和方法。

附图说明

图1基因编辑载体图。各元件英文及缩写含义列举如下：

RB T-DNA repeat T-DNA右边界重复序列

M13 fwd M13引物序列(正向)

p000204_1F 靶标gRNA序列

Ubi promoter 泛素启动子

3×FLAG 标签序列

SV40NLS 猿猴病毒40核定位信号

Cas9 cas9基因序列

Nucleoplasm in NLS 核定位信号

NOS terminator 胭脂碱合成酶终止子

lac promoter 乳糖启动子

M13 rev M13引物序列(反向)

lac operator 乳糖操纵子

CAP biding site CAP结合位点

CaMV35S promoter(enhanced) 增强的花椰菜花叶病毒35S启动子

BlpR 编码Bar蛋白赋予植物具有草铵膦耐性

CaMV35S polyA single 花椰菜花叶病毒35S多聚腺苷酸序列

LB T-DNA repeat T-DNA左边界重复序列

Kan R 卡那霉素抗性序列

Ori 起始区序列

Bom 骨架区序列

pVS1 RepA pVS1复制子

pVS1 StaA pVS1转录起始区

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1基因编辑敲除候选基因后鉴定玉米开花期的变化情况

本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对关联分析结果显示的与玉米开花期相关的34个基因中的15个基因进行定点编辑。

实施方式包括基因编辑载体的构建、玉米的遗传转化以及编辑效果的功能验证。具体如下：

1、基因编辑载体的构建

本发明的基因编辑载体为G08943-CPB-ZmUbi-hspCas9，其载体图如图1所示。该载体的基础载体为CPB-ZmUbi-hspCas9。本发明通过OverlapPCR获得双靶U6-sgRNA进而通过同源重组克隆到基础载体中，具体的构建流程如下：

(1)U6启动子的克隆。从B73中克隆U6启动子。

(2)靶标gRNA的设计。将受体材料B73参考基因组序列输入http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/进行靶标设计。

(3)通过Overlap PCR获得U6-sgRNA。引物对U6F1/U6R用于扩增第一个靶标的U6启动子，产物长度为515bp；引物对gR-1F(3F)/gRR1用于扩增第一个靶标的sgRNA，产物长度为127bp；引物对U6F1/gRR1用于进行Overlap PCR第2步扩增(U6-sgRNA)，产物长度为634bp。Overlap PCR第1步分别扩增U6和sgRNA，PCR产物分别稀释50倍后混合作为模板进行Overlap PCR第2步扩增。扩增产物电泳切胶回收并测序确认序列。Overlap PCR体系和条件如下：Overlap PCR第1步的15μL的反应体系如下，模板DNA(U6或sgRNA，≥30ng/μL)：0.5μL，Primer F/R：各1.2μL，灭菌ddH₂O：3.7μL，2×phanta max Buffer：7.5μL，dNTP mix：0.6μL，Phanta酶(产品编号：P505-d1/d2/d3)：0.3μL。Overlap PCR第2步的反应体系为30μL体系。U6吸1μL，加49μL ddH₂O稀释；sgRNA吸1μL，加49μL ddH2O稀释各吸10μL，混匀。具体如下：混合模板DNA(U6+sgRNA)：1.5μL，Primer F/R：各2.4μL，灭菌ddH2O：6.9μL，2×phanta maxBuffer：15μL，dNTP mix：1.2μL，Phanta酶：0.6μL。Overlap PCR程序如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃30秒，(3)62℃35秒，(4)72℃30秒，第(5)步是从(2)步－(4)步循环32次，(6)72℃10分钟，(7)25℃5分钟。载体构建所需的引物序列见表1。

表1载体构建所需的引物序列

(4)通过重组克隆构建到骨架载体。将CPB-Ubi-hspcas9载体用HindIII消化，回收。通过同源重组将U6-gRNA和载体二者连接。配反应液前保证各Overlap产物浓度接近一致，20μL的同源重组体系如下：Cas Hind III：3μL，T-1F Overlap：1μL，灭菌ddH2O：10μL，5×CE MultiS buffer：4μL，Exnase MultiS(产品编号：C113-01/02)：2μL。

2、玉米遗传转化

将载体通过电击法转入农杆菌EHA105中，PCR进行鉴定。以新鲜剥离的1mm左右的玉米自交系KN5585(未米生物科技(江苏)有限公司选育的自交系)的幼胚为材料，将剥取的玉米胚放入含有1.8mL悬浮液的2mL塑料离心管中，30min内大约处理未成熟幼胚150个；吸去悬浮液，余下玉米胚在管中然后加入1.0mL农杆菌悬浮液，放置5min。将离心管中的幼胚悬浮后倒入共培养基上，并用移液器吸去表面多余的农杆菌菌液，于23℃黑暗共培养3天。共培养后，将幼胚转移到休息培养基中，于28℃黑暗培养6天后，放至含5mg/L Bialaphos的筛选培养基上，开始筛选培养2周，然后转到含8mg/L Bialaphos筛选培养基上筛选培养2周。将抗性愈伤组织转移至分化培养基1中，25℃，5000lx，光照培养1周。再将愈伤转移至分化培养基2中，光照培养2周；将分化生出的小苗转移至生根培养基上，25℃，5000lx，光照培养直到生根；将小苗转入小盆中生长，一定生长阶段后移栽于温室中，3-4个月后收获后代种子。

3、基因编辑植株的性状鉴定

对获得的基因编辑材料的开花期性状进行鉴定，发现这些基因中，有的编辑后确实能够造成玉米开花期的显著改变，而有些基因编辑后不能观察到明显的开花期变化，具体的变化方式见表2。

表2各基因编辑后的开花期变化情况

实施例2玉米开花期性状的深入分析和突变基因的鉴定

对开花性状有变化的基因编辑材料进行更深入的性状鉴定，并分析具体的编辑位点。GRMZM2G179024这个基因编辑后，T0代材料的玉米开花期比受体对照KN5585延迟。对这个转化体的T1代材料的开花期进行更深入地鉴定，并分析具体的编辑位点。

GRMZM2G179024这个基因编辑时设计的靶标位点有两个，分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。含有这两个靶标的载体所表达的gRNA序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示。

提取苗期DNA检测基因编辑情况。设计引物，引物序列如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示。扩增靶标编辑区段，扩增体系为：DNA：3μL，双向引物各1μL，2×TaqMix：7.5μL，ddH₂O：2.5μL，总体积10μL。PCR反应条件如下：(1)94℃5分钟，(2)94℃40秒，(3)57℃30秒，(4)72℃60秒，(5)从(2)步－(4)步循环35次，(6)72℃7分钟，(7)4℃保存。PCR产物交由武汉擎科生物科技有限公司进行Sanger测序。将转化株与受体KN5585的PCR扩增测序结果进行比较，发生碱基替换、插入或缺失的材料即为阳性编辑材料，否则为阴性材料。

序列比较后发现有3种不同编辑类型的材料。其中A1材料在靶点1处的A变为G，A2材料在靶点1处删除了6个碱基并在靶点2处插入了一个T，A3材料在靶点1处删除了一个A(表3)。因此，编辑后，A1、A2、A3三个材料的基因组序列由SEQ ID NO.2分别变为SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10。

表3基因编辑玉米材料的花期性状数据

“-”表示删除序列，黑体表示插入序列，方框表示PAM序列，下划线表示编辑靶标。

2018年夏季在云南省试验地调查了A1和A2材料的开花期性状，并在2020年夏季的吉林省试验地调查了A3材料的开花期性状(包括抽雄期、散粉期、吐丝期)，结果如表4所示。A1、A2和A3已编辑的材料比未编辑的对照材料的花期均有不同程度的延迟，证明该基因控制花期性状，基因编辑后花期延迟。

表4基因编辑玉米材料的花期性状数据

花期数据以平均值±标准差表示，单位：天。“CK”表示未编辑的对照材料。“**”表示与对照相比有极显著差异(P<0.01)；“*”表示与对照相比有显著差异(P<0.05)。

因此SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的突变基因能够使玉米开花期适度延迟。该突变基因可以通过有性杂交的方式导入不同遗传背景的玉米材料中，从而创制晚花玉米新品种。

在导入的过程中，利用SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示序列的引物对可以检测玉米基因组中是否含有上述突变基因，用该引物对对待测样品的基因组DNA进行PCR扩增，并测序分析扩增产物序列。如果扩增产物与SEQ ID NO:8第4443-5385位所示序列一致，则包含SEQ ID NO.8所示的突变基因；如果扩增产物与SEQ ID NO:9第4443-5380位所示序列一致，则包含SEQ ID NO.9所示的突变基因；如果扩增产物与SEQ ID NO:10第4443-5384位所示序列一致，则包含SEQ ID NO.10所示的突变基因；如果扩增产物与SEQ ID NO:2第4443-5385位所示序列一致，则为未编辑的基因型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学，吉林省农业科学院，未米生物科技（江苏）有限公司

<120> 改变玉米开花期的基因及方法

<130> 1

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 629

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Gly Gly Gly Leu Asp Glu Ala Val Lys Val Val Asp Leu Glu Asp

1 5 10 15

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Ala Glu Ala Ala Ala Ala Glu Gly Ser Ser

20 25 30

Met Glu Met Gly Met Leu Pro Arg Met Pro Val Arg Val Leu Leu Ala

35 40 45

Glu Gly Asp Asp Ser Thr Arg His Val Ile Ser Ala Leu Leu Arg Lys

50 55 60

Cys Gly Tyr Arg Val Ala Ala Ala Ser Asp Gly Val Lys Ala Trp Asp

65 70 75 80

Leu Leu Lys Glu Lys Ser Phe Asn Val Asp Leu Val Leu Thr Glu Val

85 90 95

Glu Leu Pro Leu Met Ser Gly Phe Leu Leu Leu Ser Thr Ile Met Glu

100 105 110

His Asp Ala Ser Lys Asn Ile Pro Val Ile Met Met Ser Ser His Asp

115 120 125

Ser Val Ser Met Val Phe Lys Cys Met Leu Lys Gly Ala Ala Asp Phe

130 135 140

Leu Val Lys Pro Ile Arg Lys Asn Glu Leu Arg Asn Leu Trp Gln His

145 150 155 160

Val Trp Arg Lys Gln Leu Ala Asn Gly Gly Pro Asn Val Gln His Ile

165 170 175

Gln Arg Glu Glu Asn Leu Ala Glu Arg Ile Gln Gln Lys Thr Gly Val

180 185 190

Thr Lys Ser Asp Asn Leu Asp Arg Asp Val Pro Cys Lys Asn Arg Glu

195 200 205

Cys Ser Glu Gln Glu Ser Asp Ala Gln Ser Ser Cys Thr Arg Ser Glu

210 215 220

Leu Glu Ala Glu Ser Lys Gln Thr Asp Asn Ile Leu Glu Tyr Lys Gln

225 230 235 240

Ser Thr Gln Arg His Leu Ser Ile Pro Ser His Lys Asn Val Glu Leu

245 250 255

Asn Gly Gln Thr Lys Ile Gln Arg Ala Glu Gly Asn Asn Leu Ile Pro

260 265 270

Ala Arg Glu Asp Asp Leu Ser Pro Lys Lys Arg Thr Cys Leu Asn Glu

275 280 285

Asn Asn Ser Glu Arg Ala Ser Arg Asp Met Glu Leu Val His Ile Met

290 295 300

Glu Asn Gln Gln Lys Tyr Asn Thr Gln Trp Glu Val Asp Thr Met Arg

305 310 315 320

Thr Thr Ser Arg Gly Asn Asp Glu Lys Gly Ser Ile Pro Ala His Gln

325 330 335

Leu Glu Leu Ser Leu Arg Arg Thr Asp Tyr Gly Lys Leu Glu Asn His

340 345 350

Glu Lys Asn Asp Arg Arg Thr Leu Asn His Ser Thr Ser Ser Ala Phe

355 360 365

Ser Leu Tyr Asn Cys Arg Ala Val Pro Thr Leu Gly Asn Ala Gly Asp

370 375 380

Gly Gln Leu Cys Ser Thr Ser Glu Thr Leu Val Asp Val Glu Asn Lys

385 390 395 400

Asn Gly Asp Ser Ala Asp Pro Ser Gln Asp Met Thr Glu Thr Asn Arg

405 410 415

Pro Pro Ile Arg Val Val Pro Val Pro Val Gln Gly Leu Thr Phe Asp

420 425 430

Gly Gln Pro Phe Trp Asn Gly Thr Pro Val Ala Ser Leu Phe Tyr Ser

435 440 445

Gln Ser Thr Pro Pro Ile Trp Asn Ser Lys Thr Ser Met Trp Gln Glu

450 455 460

Ser Thr Pro Gln Ala Thr Ser Leu Pro Gln Lys Ser Pro Gln Asn Glu

465 470 475 480

Pro Asn Glu Met Gly Ala Lys Pro Val Ile Asn Ala Gly Glu Gln Phe

485 490 495

Ala Met Gly Pro Pro Ser Ala Ser Gly Lys Gln Leu His Val Glu Ile

500 505 510

Leu Asn Asp Asp Pro Arg His Ile Ser Pro Met Thr Gly Glu Ser Gly

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Ile Ser Thr Val Leu Asp Ser Thr Arg Asn Thr Leu Ser Ser Ser Gly

530 535 540

Cys Asp Ser Ile Ser Asn Gln Ile Thr Ala Pro Thr Glu Ser Ser Asn

545 550 555 560

Val Tyr Lys Asp Val Pro Glu Thr Pro Ser Ala Glu Gly Ser Arg His

565 570 575

Leu Ser Gln Arg Glu Ala Ala Leu Asn Lys Phe Arg Leu Lys Arg Lys

580 585 590

Asp Arg Cys Phe Glu Lys Lys Val Arg Tyr Gln Ser Arg Lys Leu Leu

595 600 605

Ala Glu Gln Arg Pro Arg Val Lys Gly Gln Phe Val Arg Gln Asp His

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Ser Ile Gln Gly Ser

625

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actgaacaag ttccggctaa agaggaagga taggtgcttt gagaagaagg taagcaacta 4980

agtgcgcatt tttatttcga tccgattttt atgccaccta ctaggacctg tgattcacgc 5040

ttttacaatc atttgcaggt tcgataccag agccggaaat tactcgcaga gcagcgtcca 5100

cgggtcaagg gccagtttgt tcgtcaagat catagcatcc aaggaagcta gggtccagtt 5160

actgagctgg aactctattc tattatctaa aaaaagtcac tgcaagtgac tccactgcgg 5220

tctgcgggta tcctgatgtc agattttgcc gaagagttgg aagcagtcac actgagttac 5280

agtttgctct gtatatttgc tgaagtttgt aatatatgta tgtataggct aacgctgttc 5340

tttcctaggt taggcacagg acctggcacg tttgaaggtt tgtcagtagg cgttagaaaa 5400

tacaggcata ctttgtttca ggtcaagatg agatgtgacc ttcagtagcg catgtgtgct 5460

ttaagtcttg tattacgtaa ttaagttgtt tgatgtttcg ggttagatgt acgctccgtg 5520

gatgaaatgt aaaggatgtc caccaaaaca tgcttgtttc cgtgcagctt gttgcaatga 5580

acatcgttgg cctggtttct gtcaatgctc tcatgccgtg tgtactactg tgaa 5634

<210> 9

<211> 5629

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

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tgcgagcttc caagtggcga ctgcccgagt gcgagaagag ggagagaagc ggttgtcgga 120

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cgggaaaatt agaagttggg attgggagtt gttagtgaac attttttttc aatcttatat 1080

aaggaaatct agactagtag ttttggaaac tcccgtagat gctcaaattt tgggagatct 1140

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catttggtaa ccatttaaca actccctaaa caaaaatgtt gactgcatta tatagttttt 3180

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tgtttgaatg agaataattc tgagagagct tcaagagata tggagctagt ccacattatg 3720

gaaaatcagc agaagtataa cacacagtgg gaggtggata ctatgagaac aacatctagg 3780

ggaaatgatg agaagggctc catcccagca catcagttgg agctttctct tagaagaact 3840

gactacggaa aattagagaa ccacgagaaa aatgatagaa gaacactgaa ccattcaact 3900

tcctctgcgt tttccttgta agtgcacctt tctttggctt ttcgtgatcc taaaaatttc 3960

tgtaaagtcg ataagtctag tacagatctt gatattattt ttgtgtcagt gttttttttg 4020

ttccaagtgt aggtacaggc taactgaaaa ttttccaata acttttgaca tttatctttt 4080

cttttccaag catagttata gtgacttacc atgagatgat cttgaagcat aaaagttcca 4140

actaatgtag ccgcaacata aactttgaca tggaacttca agttcgcatt gctgctgtat 4200

cttattgcac aatttgcttg tattcgaagt tccacaagtg tccattattg tatcttactg 4260

ttggaaatat cttgtcgaca ggtataattg cagggctgtg ccaaccttag gaaatgctgg 4320

tgatggtcaa ttatgcagca cctcagaaac actagtggat gttgaaaata aaaatggaga 4380

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catttttatt tcgatccgat ttttatgcca cctactagga cctgtgattc acgcttttac 5040

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ctggaactct attctattat ctaaaaaaag tcactgcaag tgactccact gcggtcttgc 5220

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tcttgtatta cgtaattaag ttgtttgatg tttcgggtta gatgtacgct ccgtggatga 5520

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<210> 10

<211> 5633

<212> DNA

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atccactccg gccaggggtg cggaggtcgg aatgggggga ggattggatg aggcggtgaa 180

ggtggtggat ttggaggacg gtgaagggga ggaggaggca gaggccgccg cggcggaggg 240

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cgacgactcc acgcgccacg tcatctccgc gctgctccgc aagtgcggct accgaggtgc 360

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cttttccaag catagttata gtgacttacc atgagatgat cttgaagcat aaaagttcca 4140

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tgtccctgtc caaggtctca catttgatgg gcagccattc tggaatggta caccagtggc 4500

atccctattc tactcacagt caactcctcc catttggaat agcaaaacat caatgtggca 4560

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tttacaatca tttgcaggtt cgataccaga gccggaaatt actcgcagag cagcgtccac 5100

gggtcaaggg ccagtttgtt cgtcaagatc atagcatcca aggaagctag ggtccagtta 5160

ctgagctgga actctattct attatctaaa aaaagtcact gcaagtgact ccactgcggt 5220

ctgcgggtat cctgatgtca gattttgccg aagagttgga agcagtcaca ctgagttaca 5280

gtttgctctg tatatttgct gaagtttgta atatatgtat gtataggcta acgctgttct 5340

ttcctaggtt aggcacagga cctggcacgt ttgaaggttt gtcagtaggc gttagaaaat 5400

acaggcatac tttgtttcag gtcaagatga gatgtgacct tcagtagcgc atgtgtgctt 5460

taagtcttgt attacgtaat taagttgttt gatgtttcgg gttagatgta cgctccgtgg 5520

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<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 11

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<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> unknown(人工合成)

<400> 12

tgacaaacct tcaaacgtgc c 21

Claims

1.一种蛋白在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种核酸分子在控制玉米开花期性状中的应用，其特征在于：所述核酸分子编码权利要求1中所述的蛋白。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.3所示。

4.一种延迟玉米开花期的方法，其特征在于：抑制玉米中权利要求1中所述蛋白的表达和/或活性，选择玉米开花期延迟的植株。

5.根据权利要求4所述延迟玉米开花期的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰或T-DNA插入中任一种。

6.根据权利要求5所述延迟玉米开花期的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

7.根据权利要求6所述延迟玉米开花期的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域为SEQ ID NO.4所示序列；或SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列的组合。

8.一种用于延迟玉米开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)sgRNA分子，其序列如SEQ ID NO.6所示；或SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的组合；

(2)编码(1)所述sgRNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述sgRNA的载体。

9.一种玉米开花期延迟的突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.10任意一个所示。

10.用于检测权利要求9所述突变基因的引物对，其特征在于：所述引物对为SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示的序列。

11.权利要求10所述的引物对在检测权利要求9所述突变基因中的应用。