CN112521471B

CN112521471B - 一个控制玉米籽粒含水量的基因和分子标记及其应用

Info

Publication number: CN112521471B
Application number: CN202011363996.4A
Authority: CN
Inventors: 严建兵; 李文强; 肖英杰; 许洁婷; 翟照伟; 吴伸伸
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN112521471A

Abstract

本发明涉及控制玉米籽粒含水量基因ZmGAR，相关的分子标记及其在筛选或改良玉米籽粒含水量或脱水速率性状方面的应用，属于分子遗传学领域。本发明提供了ZmGAR基因的序列，且公开了ZmGAR基因内部一个与玉米籽粒含水量或脱水速率显著相关的InDel_8/0位点。本发明公开了基于该InDel_8/0位点开发的分子标记用于筛选玉米籽粒含水量或脱水速率的方法。进一步，本发明公开了通过基因工程手段突变ZmGAR蛋白来改变玉米籽粒含水量或脱水速率的方法。

Description

一个控制玉米籽粒含水量的基因和分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及控制玉米籽粒含水量基因ZmGAR，相关的分子标记及其在筛选或改良玉米籽粒含水量或脱水速率方面的应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

籽粒水分是影响玉米机械收获质量、安全贮藏和经济效益的关键因素。收获时的籽粒含水量对玉米收获、烘干、贮藏、运输和加工利用影响极大，含水量过高常使玉米种植者和经营者遭受经济损失，降低经济效益，还易引起籽粒霉变，影响玉米品质。此外，籽粒机收已经成为限制我国玉米生产的主要因素之一，而玉米籽粒机收最关键的环节就是收获时玉米籽粒含水量无法达到可以籽粒机收的≤25％的标准含水量(Wang Z,Wang X,Zhang L,et al.QTL underlying field grain drying rate after physiological maturity inmaize(Zea Mays L.)[J].Euphytica,2012,185:521-528.)。所以对于收获时籽粒含水量低的玉米品种的选育非常重要。此外，低籽粒含水量可以缩短玉米的生长周期，这对于我国高纬度地区霜期前收获及黄淮海地区不影响小麦种植都有很大的生产意义。

虽然目前有一部分研究得到了一些控制玉米籽粒含水量及脱水速率的QTLs，如位于1、2、10染色体上的q45dGM1-1、qHTGM2-2、qAUDDC2-1和qAUDDC10-1(Zhang J,Zhang F,Tang B,et al.Molecular mapping of quantitative trait loci for grain moistureat harvest and field grain drying rate in maize(Zea mays L.)[J].PhysiolPlant,2020,169(1):64-72.)，以及位于第1染色体上的qGwc1.1和qGwc1.2(Liu J,Yu H,Liu Y,et al.Genetic dissection of grain water content and dehydration raterelated to mechanical harvest in maize[J].BMC Plant Biol,2020,20(1):118.)，但是并没有克隆到控制玉米籽粒含水量及其变化的基因。克隆控制该性状的基因，可以提供有效的基因资源，并且开发分子标记用于分子育种，同时利用基因工程方法加快快速脱水玉米的选育及材料创新。

为解决上述问题，本发明利用玉米关联群体定位到一个控制玉米籽粒含水量和脱水速率性状的基因ZmGAR，并鉴定到与之连锁的分子标记，利用上述基因、标记可以筛选玉米籽粒含水量或脱水速率性状，并培育含水量低、脱水快的玉米品种。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一个影响玉米籽粒含水量性状的基因ZmGAR的核酸序列及其编码的氨基酸序列。

本发明的目的之二在于提供了一个与玉米籽粒含水量性状紧密连锁的分子标记InDel_8/0。

本发明的目的之三在于公开一种利用分子标记鉴定和筛选玉米籽粒含水量或脱水速率性状的方法。

本发明的目的之四在于公开一种改良玉米籽粒含水量或脱水速率性状的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种蛋白，其特征在于：上述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；或所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列经过取代和/或缺失和/或添加一个或多个氨基酸，且具有与SEQ ID NO.1所示的序列相同功能的序列。

本发明还提供了一种核酸，其特征在于，所述的核酸编码上述的蛋白；在一些实施方案中，所述核酸的核苷酸序列或互补序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.4任意一个所示。

本发明还提供了一种分子标记，其特征在于，所述标记位于玉米B73 V4版参考基因组Chromosome7:136900558-136900565位置处的8个碱基GAACATCA。

本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定玉米籽粒含水量或脱水速率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料上述的分子标记；(2)如果检测结果为包含上述标记，待测材料将表现籽粒含水量低或脱水速率快性状；如果检测结果为不包含上述标记，待测材料将表现籽粒含水量高或脱水速率慢性状；

在一些实施方案中，上述分子标记的检测方法采用PCR扩增；

在一些实施方案中，上述PCR扩增采用的引物对由引物F和引物R组成；上述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，上述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

在一些实施方案中，上述的包含上述标记的表现为PCR扩增产物如SEQ ID NO.7所示；不包含上述标记的表现为PCR扩增产物如SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种筛选具有低籽粒含水量或脱水速率快的玉米材料的方法，其特征在于，按照上述的方法检测待测材料中上述的分子标记，筛选包含上述分子标记的材料。

本发明还提供了降低玉米籽粒含水量或提高脱水速率的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中提高上述蛋白的表达和/或活性，选择玉米籽粒含水量低或脱水速率快的植株；

在一些实施方案中，上述增加蛋白表达的方法为使用高活性启动子驱动编码蛋白的核酸序列表达；

在一些实施方案中，上述的高活性启动子为玉米ubiquitin启动子。

本发明还提供了上述的蛋白、核酸、分子标记、方法在改良玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的ZmGAR基因及其编码的蛋白具有调控玉米籽粒含水量或脱水速率性状的功能，该基因的功能是之前的公开资料中未报道的。本发明还提供了与ZmGAR紧密连锁的功能性分子标记InDel_8/0以及标记的检测方法，能够从玉米群体中特异地鉴定出具有不同籽粒含水量或脱水速率表现的基因型，并对玉米品种的籽粒含水量或脱水速率性状进行辅助鉴定和改良，从而获得低含水量或脱水速率快的玉米品种。通过超表达ZmGAR基因可以降低玉米籽粒含水量，提高脱水速率。

附图说明

图1玉米籽粒含水量变化指数(以AUDDC_5_2为例)全基因组关联分析曼哈顿图。纵轴表示每个标记关联分析检验的p-value，取-log10；横轴表示染色体的位置。箭头标注定位位置。

图2与玉米籽粒含水量相关的显著SNP连锁不平衡及其位置图。

图3野生型ZmGAR基因和编辑后基因的核酸序列及编码蛋白结构。WT：野生型；KO：基因编辑。下划线标识靶标序列。“-”表示碱基缺失。

图4 ZmGAR基因超表达载体图。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”、“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

术语“性状”是指植物或特定的植物材料或细胞的生理、形态、生化或物理特性。在一些情况下，此特性对人眼是可见的，诸如种子或植株大小，或者可通过生物化学技术测量，诸如检测种子或叶的蛋白质、淀粉或油含量，或者通过观察代谢或生理过程，例如通过测量对水剥夺或特定盐或糖或氮浓度的耐受性，或者通过观察一个或多个基因的表达水平，或者通过农艺观察结果诸如渗透胁迫耐受性或收率。

“转基因”是指其基因组因异源核酸(诸如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植株部分或植株。本文所用的术语“转基因”包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性繁殖而产生的那些，并且不涵盖通过常规植物育种方法或通过自然发生的事件(诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变)进行的基因组(染色体或染色体外)改变。

“植物”包括对整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及它们的子代的标引。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚芽、分生区域、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。“子代”包含植物的任何后续世代。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。

阴性或对照植物可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。所述杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用诸如32P的可检测基团或其它可检测标志物来标记。因而，例如，可以通过标记基于实施方案序列的合成寡核苷酸制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA及基因组文库的方法通常为本领域已知。可以在严紧条件下进行所述序列的杂交。如本文所用，术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”表示如下条件，即在该条件下，相对于与其它序列杂交，探针将以可检测的更大程度(例如，背景的至少2倍、5倍或10倍)与其靶序列杂交。严紧条件是序列依赖性的并且在不同环境中有所不同。通过控制杂交严紧性和/或控制清洗条件，可以鉴定与所述探针100％互补的靶序列(同源探针法)。可选择地，可以调节严紧条件，以允许一些序列错配，以便检测较低的相似度(异源探针法)。通常，探针长度少于约1000或500个核苷酸。通常，严紧条件是如下的条件，即在该条件中，盐浓度为pH 7.0至8.3下，少于约1.5M Na离子，通常约0.01M至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，并且温度条件为：当用于短探针时(例如10到50个核苷酸)，至少约30℃；当用于长探针时(例如大于50个核苷酸)，至少约60℃。还可以通过添加诸如甲酰胺的去稳定剂来实现严紧条件。示例性的低严紧条件包括37℃下使用30％至35％的甲酰胺缓冲液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)杂交，50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中清洗。示例性的中度严紧条件包括37℃下在40％至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中清洗。示例性的高严紧条件包括37℃下在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，60℃至65℃下在0.1×SSC中最后清洗至少约20分钟。任选地，清洗缓冲液可以包含约0.1％至约1％SDS。杂交持续时间通常少于约24小时，通常为约4小时至约12小时。特异性通常依赖杂交后的清洗，关键因素在于最后清洗溶液的离子强度和温度。DNA-DNA杂合体的Tm(热力学熔点)可以近似自Meinkoth andWahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的公式：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的克分子浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，“甲酰胺％”是杂交溶液的甲酰胺百分数，而L是杂合体的碱基对长度。Tm是(确定的离子强度和pH下)50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交时的温度。通常将清洗至少进行至达到平衡，并且达到低的杂交背景水平，诸如进行2小时、1小时或30分钟。每1％的错配对应使Tm降低约1℃；因而，可以调节Tm、杂交和/或清洗条件，从而与所需一致性的序列杂交。例如，如果需要≥90％一致性的序列，可以将Tm降低10℃。通常，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下的特异序列及其互补序列的Tm低约5℃。然而，在非常严紧的条件下，可以在比所述Tm低4℃下进行杂交和/或清洗；在中度严紧条件下，可以在比所述Tm低6℃下进行杂交和/或清洗；在低严紧条件下，可以在比所述Tm低11℃下进行杂交和/或清洗。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。

当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“关联”。

本文所用术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群或子代中)，具有与表型性状的差异表达关联的至少一个等位基因的多态基因座。QTL能够通过单基因机制或多基因机制发挥作用。

本文所用术语“QTL定位”指采用类似单基因定位的方法将QTL定位在遗传图谱上，确定QTL与遗传标记间的距离(以重组率表示)。根据标记数目的不同，可分为单标记、双标记和多标记几种方法。根据统计分析方法的不同，可分为方差与均值分析法、回归及相关分析法、矩估计及最大似然法等。根据标记区间数可分为零区间作图、单区间作图和多区间作图。此外，还有将不同方法结合起来的综合分析方法，如QTL复合区间作图(CIM)多区间作图(MIM)、多QTL作图、多性状作图(MTM)等。

本文所用术语“分子标记”指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

本文所用术语“主效基因”指由单个基因决定某一性状的基因称为主效基因，本文所述术语“微效基因”指对于同一性状的表型来讲，几个非等位基因中的每一个都只有部分的影响，这样的几个基因称为累加基因或多基因。在累加基因中每一个基因只有较小的一部分表型效应，所以又称为微效基因。

本文所用术语“自交系”指在人工控制自花授粉情况下，经若干代，不断淘汰不良的穗行，选择农艺性状较好的单株进行自交，从而获得农艺性状较整齐一致、遗传基础较单纯的系。

本文所用术语“回交”指子一代和两个亲本的任一个进行杂交的方法。

本文所用术语“杂交”或“杂交的”指经由授粉产生子代的配子融合(例如细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一株植株被另一株植株授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。术语“杂交”指经由授粉产生子代的配子融合行为。

本文所用术语“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在一个回交方案中，“供体”亲本指具有将被渗入的期望基因或基因座的亲本植株。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植株。初始杂交产生F₁代；然后，术语“BC₁”指轮回亲本的第二次使用，“BC₂”指轮回亲本的第三次使用等。

本文所用术语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10％(即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90％的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10％或更低、优选约9％或更低，更优选约8％或更低，更优选约7％或更低，更优选约6％或更低，更优选约5％或更低，更优选约4％或更低，更优选约3％或更低，更优选约2％或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施方案中，关联基因座显示约1％或更低的重组频率，例如约0.75％或更低，更优选约0.5％或更低，更优选约0.25％或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10％(例如约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。

厘摩(“cM”)是重组频率的量度单位。1cM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1％的概率。

“有利等位基因”是在特定位点的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如提高的玉米长籽粒含水量性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的“有利”等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。

“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。就每个基因图谱而言，基因座之间的距离通过它们间的重组频率进行测量，并且基因座之间的重组可使用多种标记进行检测。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的顺序和遗传距离可能不同。然而，使用常见标记的通用框能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用常见标记的框架来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位置和受关注的基因座。

“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。

“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率的标准遗传原则进行。

“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。

术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成，它与可观察到的性状(表型)形成对照。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或者更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。

“种质”指个体(例如植株)、一组个体(例如植株品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的或从其中得到的遗传物质。种质可为生物或细胞的部分，或者可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植株的细胞、种子或组织，或者植株部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。

“标记”是用作参考点的核苷酸序列或其编码产物(例如蛋白)。对于用于检测重组的标记，它们需要在被监测的种群内检测差异或多态性。对于分子标记，这意味着DNA水平的差异是由于多核苷酸序列差异(例如SSR、RFLP、FLP和SNP)。基因组可变性可为任何一种起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座因子的存在和序列。分子标记可来源于基因组或表达的核酸(例如EST)，并且也可指用作探针或引物对的核酸，所述引物对能够通过使用基于PCR的方法扩增序列片段。

对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同工酶标记检测、通过等位基因特异性杂交进行的多核苷酸多态性检测(ASH)、植株基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性DNA(RAPD)。

“标记等位基因”或者“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个，它就标记基因座而言是多态的。

“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。

如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或两侧为标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交，核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如KASP技术、PCR扩增。

本发明从一个玉米关联群体中定位到一个影响玉米籽粒含水量和脱水速率性状的基因ZmGAR，该基因位于B73 V4版本参考基因组Chromosome7:136898721-136904152位置处，基因组序列如SEQ ID NO.2所示。通过确定ZmGAR基因的转录本，确定了基因的编码区核苷酸序列和编码的蛋白序列。

本发明进一步分析了不同籽粒含水量表现的玉米材料中的变异位点，找到了与性状连锁的变异位点InDel_8/0，位于SEQ ID NO.2所示序列1838-1845位置处，表现为8个碱基(GAACATCA)的插入缺失。

基于InDel_8/0位点，本发明开发了分子标记检测方法，能够鉴定InDel_8/0基因型，并依据基因型鉴定结果鉴定或辅助鉴定玉米籽粒含水量或脱水速率性状。

本发明提供了利用玉米ubiquitin启动子驱动ZmGAR基因超量表达，降低玉米籽粒含水量或提高脱水速率的方法

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米籽粒含水量基因的克隆

本发明从一个玉米关联群体中定位到一个玉米籽粒含水量QTL。该玉米关联群体包括527份来自热带、亚热带和温带地区具有广泛表型和遗传变异的玉米自交系材料(关联群体的构建方法参照：Yang X,Gao S,Xu S,et al.Characterization of a globalgermplasm collection and its potential utilization for analysis of complexquantitative traits in maize[J].Molecular Breeding,2011,28(4):511-526.)。通过5个环境的籽粒含水量的测量，得到了5个阶段的玉米籽粒含水量(GM)的表型值：分别是授粉后34天，40天，46天，52天，58天，记为34DAP，40DAP，45DAP，52DAP，58DAP。同时应用最优先性无偏估计方法(BLUP)计算出5个环境的BLUP表型值，并且通过表型值推算出了籽粒含水量变化指数(AUDDC；评估方法参照：Yang J,Carena M and Uphaus J.Area under the drydown curve(AUDDC):a method to evaluate rate of dry down in maize[J].CropSci.,2010,50(6):2347-2354.)，分别记为AUDDC_2_1，AUDDC_3_2，AUDDC_4_3，AUDDC_5_4，AUDDC_3_1，AUDDC_4_2，AUDDC_5_3，AUDDC_4_1，AUDDC_5_2，AUDDC_5_1。利用关联群体1.25MSNP标记的基因型数据以及通过该基因型推算出的群体结构和亲缘关系(基因型数据来自Liu H,Luo X,Niu L,et al.Distant eQTLs and Non-coding Sequences Play CriticalRoles in Regulating Gene Expression and Quantitative Trait Variation in Maize[J].Mol Plant,2017,10(3):414-426.)，使用混合线性模型，对上述15个性状进行全基因组关联分析，以阈值为P≤2.0×10^-6的标准下，鉴定到一个QTL位点，与GM(52DAP)，AUDDC(AUDDC_5_2，AUDDC_5_3，AUDDC_4_3，AUDDC_5_4和AUDDC_4_2)性状显著关联(表1、图1)。关联最显著的两个SNP(Chr.7_132808190；Chr.7_132808253)位于基因GRMZM2G137211(V3版本基因编号)第一个外显子上(图2)，这两个SNP改变了编码蛋白的氨基酸，分别为Var-Ala和Thr-Ser，该基因是控制籽粒含水量的候选基因，命名为ZmGAR。

表1最显著SNP与性状关联分析结果

实施例2基因结构和功能位点分析

ZmGAR基因在B73 V4版本参考基因组编号为Zm00001d020929，该基因位于Chromosome7:136898721-136904152位置处，共5432bp，序列如SEQ ID NO.2所示。该基因尚没有功能注释。转录本序列如SEQ ID NO.3所示，该转录本含有7个外显子(结构如图2所示)，编码区序列如SEQ ID NO.4所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过对关联群体中不同性状表现材料的整个基因区进行测序和PCR鉴定，发现在该基因5‘UTR区有一个8bp(GAACATCA)的插入缺失变异(位置如图2所示)，该变异位于Chromosome7:136900558-136900565(SEQ ID NO.2所示序列1838-1845)位置处，与显著关联的SNP存在较强的连锁不平衡(图2)，与脱水性状(AUDDC_5_2)显著关联(表2)。因此该变异可开发为分子标记(记为InDel_8/0)，用以辅助鉴定玉米籽粒含水量和脱水速率。其中含有8bp碱基基因型(标记InDel_8)的玉米籽粒水分较低，脱水较快；不含有8bp碱基基因型(标记InDel_0)的玉米籽粒水分较高，脱水较慢。

表2基因型和脱水性状相关

AUDDC_5_2值越高，脱水速率越低，脱水越慢。

实施例3玉米籽粒含水量相关分子标记检测方法

根据InDel_8/0位置处附近的基因组序列，可采用PCR方法鉴定该分子标记。PCR使用的引物对如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

分子标记检测采用如下的方法：

(1)玉米基因组DNA提取：

1.取玉米叶片1.5g左右于液氮中研磨，转入2mL离心管中。

2.加预热至65℃的CTAB提取缓冲液750μl，迅速混匀。在65℃水浴锅内水浴30分钟左右，中途不时小心柔和摇动2-3次离心管。

3.取出离心管，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，在摇床上摇动试管10分钟，直到溶液分层，下层为墨绿色，上层为浅黄色。

4.室温12000rpm离心10分钟，将上清转移到1.5mL离心管中。

5.向上清液中加入2/3体积预冷的异丙醇，小心混匀。放入-20度冰柜中放置30分钟。

6.然后4℃，12000rpm离心10分钟。

7.倒去上清液体，再加入1mL的75％乙醇，浸泡5分钟。再重复洗涤一次。然后将液体倒去，将离心管子放置30min，在常温吹干，加200μl水溶解DNA。

8.用1％琼脂糖检测DNA质量，并测定DNA浓度。DNA放置在-20℃冰箱备用。

(2)使用M2标记引物对的PCR体系和程序为：

PCR程序：

1.94℃ 5min

(3)凝胶成像

1％琼脂糖凝胶上检测。

其中，基因型为InDel_8的材料扩增出998bp的条带(序列如SEQ ID NO.7所示)，这些材料表现为籽粒含水量低，脱水速率快；基因型为InDel_0的材料扩增出990bp的条带(序列如SEQ ID NO.8所示)这些材料表现为籽粒含水量高，脱水速率慢。

使用上述方法检测了465个自交系材料，结果显示对该标记的检测能够很好地区分不同材料间的籽粒含水量或脱水速率性状。部分材料标记检测结果和脱水性状数据见表3。

表3标记检测结果和脱水性状

实施例4突变ZmGAR蛋白，改变玉米籽粒含水量和脱水速率。

ZmGAR基因具有控制玉米籽粒含水量和脱水速率的功能，为了进一步验证基因对籽粒含水量和脱水速率的调控方式，本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术对该基因进行敲除。通过蛋白结构预测，该基因编码蛋白含有两个结构域：PRK05901和Myo5-like_CBD(图3)。针对基因组序列，在第二个外显子和第三个外显子处设计两个靶标序列，分别为GCAGAAAACTAGCACATTGC和GTGTGGATGTTTACCAGTCT(靶标位置见图2)，合成sgRNA(sgRNA_1和sgRNA_2)，并构建基因编辑载体。将载体转化玉米品种KN5585，最终获得了一个基因成功编辑的转化体，该转化体基因翻译提前终止，导致第二个蛋白结构域丢失，编辑后的蛋白结构见图3。该基因编辑材料在海南三亚和吉林公主岭两个环境下调查了第一次含水量、第二次含水量、第三次含水量、AUDDC_2_1、AUDDC_3_2、AUDDC_3_1性状数据，结果表明该基因编辑后，玉米籽粒含水量升高(表4-表6)，变化指数增加，脱水速率变慢(表7-表9)。

表4基因编辑材料的籽粒含水量鉴定结果

WT：野生型；KO：基因编辑

表5 ZmGAR基因编辑影响玉米籽粒第二次含水量

WT：野生型；KO：基因编辑

表6 ZmGAR基因编辑影响玉米籽粒第三次含水量

WT：野生型；KO：基因编辑

表7 ZmGAR基因编辑影响玉米籽粒含水量变化指数AUDDC_2_1

WT：野生型；KO：基因编辑

表8 ZmGAR基因编辑影响玉米籽粒含水量变化指数AUDDC_3_2

WT：野生型；KO：基因编辑

表9 ZmGAR基因编辑影响玉米籽粒含水量变化指数AUDDC_3_1

WT：野生型；KO：基因编辑

实施例5超表达ZmGAR基因降低玉米籽粒含水量，提高脱水速率

ZmGAR基因敲除后，玉米籽粒含水量升高，脱水变慢。为了降低玉米籽粒含水量，提高玉米籽粒脱水速率，对该基因进行超表达。

超表达可选择强启动子(如ubiquitin，或actin，或35S等)驱动ZmGAR基因(SEQ IDNO.2所示的基因组序列，或SEQ ID NO.3所示的cDNA序列，或SEQ ID NO.4所示的编码区序列)表达。本实施例选择玉米强启动子ubiquitin驱动SEQ ID NO.2所示的ZmGAR基因组序列表达，构建超表达载体。构建好的载体图见图4。将超表达载体转化玉米自交系KN5585。对获得的转化苗进行阳性检测，选择表达量提升的转基因植株，调查籽粒的含水量和脱水速率。发现表达上升的植株籽粒含水量降低，含水量变化指数增加，脱水速率变快。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一个控制玉米籽粒含水量的基因和分子标记及其应用

<130> 1

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 792

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Gly Ala Lys Glu Asn Gly Glu Glu Arg Asp Asp His Ser Ser Asp

1 5 10 15

Val Glu Arg Asp Gly Lys Gln Gly Lys Val Thr Glu Ser Asp Tyr Glu

20 25 30

Pro Ala Arg Asn Ser Leu Ser Ser Pro Gly Glu Ala Thr Ser Asn Glu

35 40 45

Asp Thr Lys Val Lys Arg Val Ser Arg Val Pro Lys Lys Leu Ser Arg

50 55 60

Lys Glu Ser Lys Glu Asn Ser Pro Arg Ser Ala Arg Ser Ile Ser Lys

65 70 75 80

Ser Gln Ile His Thr Lys Leu Gln Tyr Ile Ser Ser Asn Ser Asn Gln

85 90 95

Asn Lys Ser Pro Lys Thr Asn Lys Ala Val Asn Gly Ala Lys Thr Val

100 105 110

Glu Ile Lys Arg Pro Glu Thr Pro Lys Ala Pro Ser Cys Ser Ser Ser

115 120 125

Glu Met Ser Glu Glu Thr Asp Asp Lys Ala Ile Glu Asp Arg Pro Thr

130 135 140

Asp Asp Lys Ala Ile Glu Gly Arg Ile Lys Asp Asp Ser Ala Val Glu

145 150 155 160

Gly Arg Ala Thr Asn Asp Lys Ala Val Asp Asp Lys Ala Lys Asn Asp

165 170 175

Lys Asp Ile Glu Asp Gly Met Lys Asp Asp Asn Ala Ile Glu Cys Glu

180 185 190

Val Thr Asp Asp Lys Pro Ile Asp Ser Lys Val Thr Asp Asp Ile Thr

195 200 205

Ile Glu Gly Arg Glu Ile Glu Gly Lys Ala Ile Glu Glu Ala Lys Glu

210 215 220

Ile Asp Ile Leu Asp Glu Ala Pro Lys Ser Asp Gln Ser Thr Gly Thr

225 230 235 240

Asp Asp Glu Ile Val Asp Thr Glu Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Asn

245 250 255

Ser Val Ser Tyr Lys Ile Asn Glu Glu Leu Tyr Ser Lys Ile Glu Lys

260 265 270

Leu Glu Gln Glu Leu Arg Glu Val Ala Ala Leu Glu Val Ser Leu Tyr

275 280 285

Ser Val Val Pro Glu His Gly Cys Ser Ser His Lys Leu His Thr Pro

290 295 300

Ala Arg Arg Leu Ser Arg Val Tyr Ile His Ala Ser Lys Phe Trp Ser

305 310 315 320

Ser Asp Lys Lys Ala Ser Val Ala Arg Asn Ser Val Ser Gly Leu Val

325 330 335

Leu Val Ala Lys Ser Cys Gly Asn Asp Val Ser Arg Leu Thr Phe Trp

340 345 350

Leu Ser Asn Thr Val Val Leu Arg Glu Ile Ile Ala Gln Thr Phe Gly

355 360 365

Thr Ser Gln His Ser Ser Pro Val Lys Val Phe Ser Ser Asn Gly Asn

370 375 380

Ala Asn Lys Pro Asp Arg Ser Phe Thr Ser Ser Gln Trp Lys Ser Asn

385 390 395 400

Tyr Asn Gly Lys Tyr Val Asn Pro Asn Ile Met Gln Leu Pro Asp Asp

405 410 415

Trp Gln Lys Thr Ser Thr Leu Leu Asp Ala Leu Glu Lys Ile Glu Ser

420 425 430

Trp Ile Phe Ser Arg Ile Val Glu Ser Val Trp Trp Gln Ala Met Thr

435 440 445

Pro His Met Gln Thr Pro Val Glu Asp Leu Ser Thr Pro Lys Ile Gly

450 455 460

Arg Leu Leu Gly Gln Ser Leu Gly Asp Gln Gln His Gly Ser Phe Ser

465 470 475 480

Ile Asp Leu Trp Arg Ser Ala Phe Gln Asp Ala Phe Ser Arg Ile Cys

485 490 495

Pro Leu Arg Ala Gly Gly His Glu Cys Gly Cys Leu Pro Val Leu Ala

500 505 510

Lys Leu Val Met Glu His Cys Ile Ala Arg Leu Asp Ile Ala Met Phe

515 520 525

Asn Ala Ile Leu Arg Glu Ser Glu Asn Glu Ile Pro Thr Asp Pro Ile

530 535 540

Ser Asp Pro Ile Val Asp Ser Arg Val Leu Pro Ile Pro Ala Gly Asn

545 550 555 560

Leu Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gln Leu Lys Ser Ser Val Gly Asn Trp

565 570 575

Ser Arg Trp Leu Thr Asp Thr Phe Gly Met Asp Ala Ala Glu Ser Glu

580 585 590

Lys Gly Gly Gln Asp Val Glu Val Asn Gly Asp Asp Arg Arg Asp Ala

595 600 605

Ala Glu Ser Thr Cys Phe Lys Leu Leu Asn Glu Leu Ser Asp Leu Leu

610 615 620

Met Leu Pro Lys Asp Met Leu Leu Glu Lys Ala Ile Arg Lys Glu Val

625 630 635 640

Cys Pro Ser Ile Gly Leu Pro Leu Val Thr Arg Ile Leu Cys Asn Phe

645 650 655

Thr Pro Asp Glu Phe Cys Pro Asp Pro Val Pro Gly Met Val Leu Glu

660 665 670

Glu Leu Asn Ser Glu Ser Leu Leu Asp Arg Ser Thr Glu Ile Asp Met

675 680 685

Val Ser Thr Phe Pro Val Thr Ala Ala Pro Val Val Tyr Trp Ala Pro

690 695 700

Thr Leu Glu Asp Val Arg Glu Lys Val Ala Asp Thr Ala Cys Gly Asn

705 710 715 720

Pro Glu Leu Asp Arg Arg Gly Ser Met Val Gln Arg Arg Gly Tyr Thr

725 730 735

Ser Asp Asp Asp Leu Asp Ala Leu Glu Phe Pro Leu Ala Ser Leu Tyr

740 745 750

Asp Lys Ser Asn Pro Pro Ser Pro Cys Asn Asn Gly Val Ala His Phe

755 760 765

Ser Thr Arg Gln Val Ala Ser Met Glu Asn Val Arg His Glu Leu Leu

770 775 780

Arg Glu Val Trp Cys Glu Arg Leu

785 790

<210> 2

<211> 5432

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

atctcgatcc tttcatggtc accggtttat tactaggagc gcgatagatg gtgatctagc 60

attagcaatg ggagtgcttt ccaactccaa ttgctggcaa catgttggcg gtaacttgca 120

ttgacaggcc acgtcccaag gagcccggcg gttgctaggg tcaccgtgcg gtgagcagat 180

tcggcggcct ccaaacacac gttgctataa gcaaagcagc agcaacggcc accaagccga 240

cgcccaagcg gtggcactcc ccttggcctg cctgcctcgc cgtagcccgc cgcccctcct 300

ctacaagact acaagaggcc gacgtatcag ccaagtggcc ggtgaccgcc tcgtcccctc 360

tcgcgccgac cgccccacgc gccgccgctc cgcaccgaca ttccctcggg agtcgcgggt 420

accacggcgc cgacttccac accgcgttaa gcttaaaccc cgcgcaggcg cgccattgta 480

gttacaaaaa gaaggaacaa cagtaacaga tagagcaacc gcctccccgg tcctcgctcc 540

tcgtccccgc tcccgccggc gtcgcgaggg actgagccgg cgcggcggca accgcgagaa 600

ccccggtgag caccagccac ttctgctctg cttaccgttt cgccttcctc ctcatcccat 660

cgacccccgg aatctcgtcc tcgcgcattg ggggagattg gaatgccgtc gtgttcgaat 720

cgagatttgg aagttgtatt tccctttttt cggttctgct ggtcttgcgc cgcaacgtct 780

cgttgctgaa agcctgaaac tggtgggatc ttggtccgat gagctctgcg tttcgtgcgt 840

gcgcttgcat attggttgca ggtacatctg atcagcattg gccgaccgac taagccaaat 900

tgttggtttc tgggcgtgcg aggttattat attcatttcc tgttcttgtt cttgctcctg 960

taccgtctga gcatcccccc cctgcaatgt cagtcactat atcttataat ttccacacgg 1020

attaggctgg cactgtagac tgaagttctg gtccatttgt gggtggtaga ctgtgattcc 1080

catttctttt ttgttagctg tctggcaatt attgttttct caactttctt ggacttctcc 1140

gtgctgaaaa atcgaattgt tgcaacggtg taaatcgaat tgatggacct gcctgttttg 1200

tcgggtggtt ggtaatttcg aggaacggac taggacatag tgattcttgt ggaatcaagt 1260

actgccgcac atgctcagta tcagcggcgt ccacacccac catggatcgt aattaccttt 1320

gccataacag tggcttgtca gatctctctg tagttaagtt atggcgcagc tttatgtctg 1380

gggctctctc atcgccctgg gttctgggac ctccttctcg aatgcaatcc aggggcaccg 1440

tggtccaaga tcagctggag ccccatggcc atgtgcttcc caactaccgt ctgtccaagc 1500

gaattacttg cttgtcctgt agacaatatt atttgtccca gattctctta ttaagttgtt 1560

atagaatttt caattttgct tgcaagacag aaatcttgct cagctgtcca attcatgatt 1620

tgagttgctg tcctgtcgct tgttttatga tgtgaacata tgcttgtcag gaccaaagat 1680

tagaggactc actgtcatgc tccgtggtga atgctttatt gtaagctgca ctttttatta 1740

atttattagg atgcagggga tggatctgtg tgcaactata ttttatagtg gatgtctcca 1800

tggtgaacac tttcttagaa tgcatgtcag tatttaggaa catcagaaca tgcttttaag 1860

tggatttctt actggaagct gcgttttaaa tcttgggggt gcagatggtt ctacatatca 1920

gctctgaact tcaactgcat cttttatttt ctttaataca agttgctact catgtgccta 1980

tgcctttttt tccttttaat tcttcttttt ttcatttcat aatcatttga gtttgttaaa 2040

ccatcatgga aattccctat tgactttcgt aagctgatag gactttgctg gtgtttctaa 2100

ttatgttggt gatctgtcca ggtaccaaag ttctagtgca tcacaaagga tactgaaatg 2160

ggtgccaaag agaatgggga agagagagat gatcattcaa gtgatgtgga aagagatggt 2220

aaacaaggga aggtaactga atcagactat gaaccagcta gaaattccct ttcatcaccg 2280

ggtgaggcta ccagtaacga agacactaaa gtgaaaagag tctcaagggt tccaaagaag 2340

ctatcaagga aagagtctaa agaaaacagc ccacgctcag caagaagcat ttccaaaagt 2400

caaatccaca ctaaactgca gtatatatcg tcaaacagta accagaacaa atcacccaaa 2460

acaaacaaag cggttaatgg tgctaaaact gttgaaatta agaggccaga gactccgaaa 2520

gctccttctt gttcttcatc tgagatgtct gaggaaacag atgacaaagc tattgaggat 2580

agacccacag atgacaaagc aattgagggc agaatcaagg atgatagcgc tgttgaaggc 2640

agagccacca atgataaagc cgttgatgac aaagcaaaga atgataaaga cattgaggac 2700

ggaatgaagg atgataatgc cattgaatgt gaagtcactg atgataagcc tattgacagc 2760

aaagtaactg atgatattac cattgaggga agagagattg aaggtaaagc cattgaagag 2820

gcaaaggaga ttgatatatt ggatgaagct ccaaaatctg atcagagtac tggcactgat 2880

gatgaaattg ttgatactga agaaaacata gctgataatg gcaactcagt ttcttataaa 2940

attaacgagg aattatattc aaaaattgag aagttggagc aggagctacg tgaagttgct 3000

gccctcgagg tttctctcta ctctgtggtg ccagagcacg gttgttcatc acataagttg 3060

catacaccag ctcgccgtct atctagggtt tacattcatg catcaaaatt ttggtcctca 3120

gataagaaag cttcagttgc aagaaattca gtttctgggc ttgtgcttgt tgcaaagtct 3180

tgtggcaatg atgtttcaag gtaaattatg actaccttct actgcttgtt gccccttatt 3240

gtcattacca tcaattcctt cagatcaaaa tttaagtgag aatctaattt tgatgtaggt 3300

tgacattttg gctatcgaac acagttgtcc tgagagaaat catcgcacaa acatttggta 3360

cttcacaaca ctcaagtcca gttaaggttt tcagctcaaa tggcaatgca aacaagcctg 3420

acaggagttt cacttcatcg caatggaaaa gtaactacaa tggcaagtat gtgaacccca 3480

atatcatgca gctgccagat gattggcaga aaactagcac attgctggat gcattggaga 3540

agattgaatc ttggatcttt tctcggattg ttgagtctgt gtggtggcag gtaaaaagtt 3600

caccctatta ctgtctcagc attttccaga aagccgggta tggcttctgt aaaacagtga 3660

tggttaaaac ctattgcaga ttaattcatg ttttcagttt tcttaagggt ttttttattt 3720

ctcaggcaat gacaccccac atgcaaaccc ctgtagaaga tttgtcaact ccaaagatag 3780

ggaggttgtt agggcagtct ttgggtgatc agcaacatgg gagtttttct attgatctct 3840

ggagaagtgc atttcaagat gcattcagca gaatctgtcc tcttcgtgct ggtgggcatg 3900

agtgtggatg tttaccagtc ttggcaaaac tggtatgctt tcagatgctt atttttgttt 3960

ctttggtaat ggtatctttt atgtgaagag tatctctact catgagcttt ttccgtttct 4020

atcaggtgat ggagcactgc atagcccggt tagatattgc tatgtttaat gccatccttc 4080

gtgaatcaga gaatgagata cccactgatc ctatatccga cccaattgtg gactcaagag 4140

ttctgccgat tccagctggc aacttaagct ttggatcagg cgcacagctg aagagctctg 4200

tatgttctta aactacgaaa tgcttgcaat ggcatgatga acaaacaacc tagaataggg 4260

accatgcatg acctctccct tgcaatcaca ctactgattg ttaaacacat ggttatatac 4320

ttctgtaggt tgggaattgg tccagatggt tgactgatac atttggcatg gatgctgctg 4380

aatctgaaaa gggtggtcaa gatgtggaag ttaatggcga tgacagaaga gacgcagccg 4440

aatcaacttg ttttaagcta cttaacgagt tgagtgatct tctgatgctc ccgaaggaca 4500

tgcttctcga gaaagccatt aggaaagagg tatgcatcca tccgcagttc ctgtctcatt 4560

cccaggtcct aatatgtgct tcagtaagtt ttgagcattc ctgttttgca tcaggtctgc 4620

ccttccattg gccttccact agtaacaaga atactctgta acttcactcc ggacgagttc 4680

tgccctgatc ctgttcctgg catggttcta gaggagctga attctgaggt atacttgcta 4740

agattgtctg ttttgccttc aacttggaag aatcttgtag tatgtcaaat ggctcagatg 4800

gtattgcgac taatgccttg cagagcttgc tggatcgatc cacagagata gacatggtga 4860

gcacgttccc agtgaccgct gctccagtgg tgtactgggc ccctacgctg gaggacgtta 4920

gggagaaagt ggctgacacg gcatgtggca acccagagct ggaccggagg ggttcaatgg 4980

tgcagaggag gggctacacc agcgatgacg atctggatgc cctggagttc ccgctggcgt 5040

ccctgtacga caagagcaac cccccgtccc cgtgcaacaa tggcgtcgcc catttcagca 5100

ctcggcaggt agcctccatg gagaacgtga ggcacgagct cctgcgagaa gtatggtgcg 5160

agcggctatg atctcgataa atacggcctg tggagccttt ttgatctatg tgaacagtgg 5220

aaatggtggg aaagacgtga agaaactgca atcgaaaagc gatgacaaaa atgctattca 5280

attcttcgtg tatatccatc cgttccttgt cagcccgtgc attggttgtt tccccttttt 5340

tatatgatat agtagaactg tattgtacag tggctatgaa tgaatgtgat gtgatcatga 5400

aagattggga gacatagcat cattttaacc tt 5432

<210> 3

<211> 3200

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

agcattagca atgggagtgc tttccaactc caattgctgg caacatgttg gcggtaactt 60

gcattgacag gccacgtccc aaggagcccg gcggttgcta gggtcaccgt gcggtgagca 120

gattcggcgg cctccaaaca cacgttgcta taagcaaagc agcagcaacg gccaccaagc 180

cgacgcccaa gcggtggcac tccccttggc ctgcctgcct cgccgtagcc cgccgcccct 240

cctctacaag actacaagag gccgacgtat cagccaagtg gccggtgacc gcctcgtccc 300

ctctcgcgcc gaccgcccca cgcgccgccg ctccgcaccg acattccctc gggagtcgcg 360

ggtaccacgg cgccgacttc cacaccgcgt taagcttaaa ccccgcgcag gcgcgccatt 420

gtagttacaa aaagaaggaa caacagtaac agatagagca accgcctccc cggtcctcgc 480

tcctcgtccc cgctcccgcc ggcgtcgcga gggactgagc cggcgcggcg gcaaccgcga 540

gaaccccggt accaaagttc tagtgcatca caaaggatac tgaaatgggt gccaaagaga 600

atggggaaga gagagatgat cattcaagtg atgtggaaag agatggtaaa caagggaagg 660

taactgaatc agactatgaa ccagctagaa attccctttc atcaccgggt gaggctacca 720

gtaacgaaga cactaaagtg aaaagagtct caagggttcc aaagaagcta tcaaggaaag 780

agtctaaaga aaacagccca cgctcagcaa gaagcatttc caaaagtcaa atccacacta 840

aactgcagta tatatcgtca aacagtaacc agaacaaatc acccaaaaca aacaaagcgg 900

ttaatggtgc taaaactgtt gaaattaaga ggccagagac tccgaaagct ccttcttgtt 960

cttcatctga gatgtctgag gaaacagatg acaaagctat tgaggataga cccacagatg 1020

acaaagcaat tgagggcaga atcaaggatg atagcgctgt tgaaggcaga gccaccaatg 1080

ataaagccgt tgatgacaaa gcaaagaatg ataaagacat tgaggacgga atgaaggatg 1140

ataatgccat tgaatgtgaa gtcactgatg ataagcctat tgacagcaaa gtaactgatg 1200

atattaccat tgagggaaga gagattgaag gtaaagccat tgaagaggca aaggagattg 1260

atatattgga tgaagctcca aaatctgatc agagtactgg cactgatgat gaaattgttg 1320

atactgaaga aaacatagct gataatggca actcagtttc ttataaaatt aacgaggaat 1380

tatattcaaa aattgagaag ttggagcagg agctacgtga agttgctgcc ctcgaggttt 1440

ctctctactc tgtggtgcca gagcacggtt gttcatcaca taagttgcat acaccagctc 1500

gccgtctatc tagggtttac attcatgcat caaaattttg gtcctcagat aagaaagctt 1560

cagttgcaag aaattcagtt tctgggcttg tgcttgttgc aaagtcttgt ggcaatgatg 1620

tttcaaggtt gacattttgg ctatcgaaca cagttgtcct gagagaaatc atcgcacaaa 1680

catttggtac ttcacaacac tcaagtccag ttaaggtttt cagctcaaat ggcaatgcaa 1740

acaagcctga caggagtttc acttcatcgc aatggaaaag taactacaat ggcaagtatg 1800

tgaaccccaa tatcatgcag ctgccagatg attggcagaa aactagcaca ttgctggatg 1860

cattggagaa gattgaatct tggatctttt ctcggattgt tgagtctgtg tggtggcagg 1920

caatgacacc ccacatgcaa acccctgtag aagatttgtc aactccaaag atagggaggt 1980

tgttagggca gtctttgggt gatcagcaac atgggagttt ttctattgat ctctggagaa 2040

gtgcatttca agatgcattc agcagaatct gtcctcttcg tgctggtggg catgagtgtg 2100

gatgtttacc agtcttggca aaactggtga tggagcactg catagcccgg ttagatattg 2160

ctatgtttaa tgccatcctt cgtgaatcag agaatgagat acccactgat cctatatccg 2220

acccaattgt ggactcaaga gttctgccga ttccagctgg caacttaagc tttggatcag 2280

gcgcacagct gaagagctct gttgggaatt ggtccagatg gttgactgat acatttggca 2340

tggatgctgc tgaatctgaa aagggtggtc aagatgtgga agttaatggc gatgacagaa 2400

gagacgcagc cgaatcaact tgttttaagc tacttaacga gttgagtgat cttctgatgc 2460

tcccgaagga catgcttctc gagaaagcca ttaggaaaga ggtctgccct tccattggcc 2520

ttccactagt aacaagaata ctctgtaact tcactccgga cgagttctgc cctgatcctg 2580

ttcctggcat ggttctagag gagctgaatt ctgagagctt gctggatcga tccacagaga 2640

tagacatggt gagcacgttc ccagtgaccg ctgctccagt ggtgtactgg gcccctacgc 2700

tggaggacgt tagggagaaa gtggctgaca cggcatgtgg caacccagag ctggaccgga 2760

ggggttcaat ggtgcagagg aggggctaca ccagcgatga cgatctggat gccctggagt 2820

tcccgctggc gtccctgtac gacaagagca accccccgtc cccgtgcaac aatggcgtcg 2880

cccatttcag cactcggcag gtagcctcca tggagaacgt gaggcacgag ctcctgcgag 2940

aagtatggtg cgagcggcta tgatctcgat aaatacggcc tgtggagcct ttttgatcta 3000

tgtgaacagt ggaaatggtg ggaaagacgt gaagaaactg caatcgaaaa gcgatgacaa 3060

aaatgctatt caattcttcg tgtatatcca tccgttcctt gtcagcccgt gcattggttg 3120

tttccccttt tttatatgat atagtagaac tgtattgtac agtggctatg aatgaatgtg 3180

atgtgatcat gaaagattgg 3200

<210> 4

<211> 2379

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 4

atgggtgcca aagagaatgg ggaagagaga gatgatcatt caagtgatgt ggaaagagat 60

ggtaaacaag ggaaggtaac tgaatcagac tatgaaccag ctagaaattc cctttcatca 120

ccgggtgagg ctaccagtaa cgaagacact aaagtgaaaa gagtctcaag ggttccaaag 180

aagctatcaa ggaaagagtc taaagaaaac agcccacgct cagcaagaag catttccaaa 240

agtcaaatcc acactaaact gcagtatata tcgtcaaaca gtaaccagaa caaatcaccc 300

aaaacaaaca aagcggttaa tggtgctaaa actgttgaaa ttaagaggcc agagactccg 360

aaagctcctt cttgttcttc atctgagatg tctgaggaaa cagatgacaa agctattgag 420

gatagaccca cagatgacaa agcaattgag ggcagaatca aggatgatag cgctgttgaa 480

ggcagagcca ccaatgataa agccgttgat gacaaagcaa agaatgataa agacattgag 540

gacggaatga aggatgataa tgccattgaa tgtgaagtca ctgatgataa gcctattgac 600

agcaaagtaa ctgatgatat taccattgag ggaagagaga ttgaaggtaa agccattgaa 660

gaggcaaagg agattgatat attggatgaa gctccaaaat ctgatcagag tactggcact 720

gatgatgaaa ttgttgatac tgaagaaaac atagctgata atggcaactc agtttcttat 780

aaaattaacg aggaattata ttcaaaaatt gagaagttgg agcaggagct acgtgaagtt 840

gctgccctcg aggtttctct ctactctgtg gtgccagagc acggttgttc atcacataag 900

ttgcatacac cagctcgccg tctatctagg gtttacattc atgcatcaaa attttggtcc 960

tcagataaga aagcttcagt tgcaagaaat tcagtttctg ggcttgtgct tgttgcaaag 1020

tcttgtggca atgatgtttc aaggttgaca ttttggctat cgaacacagt tgtcctgaga 1080

gaaatcatcg cacaaacatt tggtacttca caacactcaa gtccagttaa ggttttcagc 1140

tcaaatggca atgcaaacaa gcctgacagg agtttcactt catcgcaatg gaaaagtaac 1200

tacaatggca agtatgtgaa ccccaatatc atgcagctgc cagatgattg gcagaaaact 1260

agcacattgc tggatgcatt ggagaagatt gaatcttgga tcttttctcg gattgttgag 1320

tctgtgtggt ggcaggcaat gacaccccac atgcaaaccc ctgtagaaga tttgtcaact 1380

ccaaagatag ggaggttgtt agggcagtct ttgggtgatc agcaacatgg gagtttttct 1440

attgatctct ggagaagtgc atttcaagat gcattcagca gaatctgtcc tcttcgtgct 1500

ggtgggcatg agtgtggatg tttaccagtc ttggcaaaac tggtgatgga gcactgcata 1560

gcccggttag atattgctat gtttaatgcc atccttcgtg aatcagagaa tgagataccc 1620

actgatccta tatccgaccc aattgtggac tcaagagttc tgccgattcc agctggcaac 1680

ttaagctttg gatcaggcgc acagctgaag agctctgttg ggaattggtc cagatggttg 1740

actgatacat ttggcatgga tgctgctgaa tctgaaaagg gtggtcaaga tgtggaagtt 1800

aatggcgatg acagaagaga cgcagccgaa tcaacttgtt ttaagctact taacgagttg 1860

agtgatcttc tgatgctccc gaaggacatg cttctcgaga aagccattag gaaagaggtc 1920

tgcccttcca ttggccttcc actagtaaca agaatactct gtaacttcac tccggacgag 1980

ttctgccctg atcctgttcc tggcatggtt ctagaggagc tgaattctga gagcttgctg 2040

gatcgatcca cagagataga catggtgagc acgttcccag tgaccgctgc tccagtggtg 2100

tactgggccc ctacgctgga ggacgttagg gagaaagtgg ctgacacggc atgtggcaac 2160

ccagagctgg accggagggg ttcaatggtg cagaggaggg gctacaccag cgatgacgat 2220

ctggatgccc tggagttccc gctggcgtcc ctgtacgaca agagcaaccc cccgtccccg 2280

tgcaacaatg gcgtcgccca tttcagcact cggcaggtag cctccatgga gaacgtgagg 2340

cacgagctcc tgcgagaagt atggtgcgag cggctatga 2379

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 5

ttcttggact tctccgtgct 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(unknown)

<400> 6

acctggacag atcaccaaca 20

<210> 7

<211> 998

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 7

ttcttggact tctccgtgct gaaaaatcga attgttgcaa cggtgtaaat cgaattgatg 60

gacctgcctg ttttgtcggg tggttggtaa tttcgaggaa cggactagga catagtgatt 120

cttgtggaat caagtactgc cgcacatgct cagtatcagc ggcgtccaca cccaccatgg 180

atcgtaatta cctttgccat aacagtggct tgtcagatct ctctgtagtt aagttatggc 240

gcagctttat gtctggggct ctctcatcgc cctgggttct gggacctcct tctcgaatgc 300

aatccagggg caccgtggtc caagatcagc tggagcccca tggccatgtg cttcccaact 360

accgtctgtc caagcgaatt acttgcttgt cctgtagaca atattatttg tcccagattc 420

tcttattaag ttgttataga attttcaatt ttgcttgcaa gacagaaatc ttgctcagct 480

gtccaattca tgatttgagt tgctgtcctg tcgcttgttt tatgatgtga acatatgctt 540

gtcaggacca aagattagag gactcactgt catgctccgt ggtgaatgct ttattgtaag 600

ctgcactttt tattaattta ttaggatgca ggggatggat ctgtgtgcaa ctatatttta 660

tagtggatgt ctccatggtg aacactttct tagaatgcat gtcagtattt aggaacatca 720

gaacatgctt ttaagtggat ttcttactgg aagctgcgtt ttaaatcttg ggggtgcaga 780

tggttctaca tatcagctct gaacttcaac tgcatctttt attttcttta atacaagttg 840

ctactcatgt gcctatgcct ttttttcctt ttaattcttc tttttttcat ttcataatca 900

tttgagtttg ttaaaccatc atggaaattc cctattgact ttcgtaagct gataggactt 960

tgctggtgtt tctaattatg ttggtgatct gtccaggt 998

<210> 8

<211> 990

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 8

ttcttggact tctccgtgct gaaaaatcga attgttgcaa cggtgtaaat cgaattgatg 60

gacctgcctg ttttgtcggg tggttggtaa tttcgaggaa cggactagga catagtgatt 120

cttgtggaat caagtactgc cgcacatgct cagtatcagc ggcgtccaca cccaccatgg 180

atcgtaatta cctttgccat aacagtggct tgtcagatct ctctgtagtt aagttatggc 240

gcagctttat gtctggggct ctctcatcgc cctgggttct gggacctcct tctcgaatgc 300

aatccagggg caccgtggtc caagatcagc tggagcccca tggccatgtg cttcccaact 360

accgtctgtc caagcgaatt acttgcttgt cctgtagaca atattatttg tcccagattc 420

tcttattaag ttgttataga attttcaatt ttgcttgcaa gacagaaatc ttgctcagct 480

gtccaattca tgatttgagt tgctgtcctg tcgcttgttt tatgatgtga acatatgctt 540

gtcaggacca aagattagag gactcactgt catgctccgt ggtgaatgct ttattgtaag 600

ctgcactttt tattaattta ttaggatgca ggggatggat ctgtgtgcaa ctatatttta 660

tagtggatgt ctccatggtg aacactttct tagaatgcat gtcagtattt aggaacatgc 720

ttttaagtgg atttcttact ggaagctgcg ttttaaatct tgggggtgca gatggttcta 780

catatcagct ctgaacttca actgcatctt ttattttctt taatacaagt tgctactcat 840

gtgcctatgc ctttttttcc ttttaattct tctttttttc atttcataat catttgagtt 900

tgttaaacca tcatggaaat tccctattga ctttcgtaag ctgataggac tttgctggtg 960

tttctaatta tgttggtgat ctgtccaggt 990

Claims

1.蛋白在控制玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用，其特征在于：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.核酸在控制玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用，其特征在于，所述的核酸编码权利要求1所述的蛋白。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-SEQID NO.4任意一个所示。

4.分子标记，其特征在于，所述标记位于玉米B73 V4版参考基因组Chromosome7:136900558-136900565位置处的8个碱基GAACATCA。

5.一种鉴定或辅助鉴定玉米籽粒含水量或脱水速率性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)检测待测材料权利要求4所述的分子标记；(2)如果检测结果为包含上述标记，待测材料将表现籽粒含水量低或脱水速率快性状；如果检测结果为不包含上述标记，待测材料将表现籽粒含水量高或脱水速率慢性状。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的分子标记的检测方法采用PCR扩增。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增采用的引物对由引物F和引物R组成；所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的包含上述标记的表现为PCR扩增产物如SEQ ID NO.7所示；不包含上述标记的表现为PCR扩增产物如SEQ ID NO.8所示。

9.一种筛选具有低籽粒含水量或脱水速率快性状的玉米材料的方法，其特征在于，按照权利要求5-8任一项所述的方法检测待测材料权利要求4所述的分子标记，筛选包含权利要求4所述分子标记的材料。

10.降低玉米籽粒含水量或提高脱水速率的方法，其特征在于，在待改良玉米材料中提高权利要求1中所述蛋白的表达和/或活性，选择玉米籽粒含水量低或脱水速率快的植株。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述增加蛋白表达的方法为使用高活性启动子驱动编码蛋白的核酸序列表达。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的高活性启动子为玉米ubiquitin启动子。

13.权利要求4所述的分子标记，或权利要求5-12任一所述的方法在改良玉米籽粒含水量或脱水速率性状中的应用。