CN105316344B - 植物花粉发育调控基因Ms1及其编码蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明描述了一个在植物中调控小孢子细胞壁发育进而介导雄花发育能力的Ms1基因核甘酸序列及其编码的蛋白质氨基酸序列。本发明还鉴定了Ms1启动子序列及其必要区域。所述核苷酸序列和蛋白质具有调控植物雄性生殖细胞发育和植物雄花育性的功能，并可用于作物杂交种的不育化制种和生产，具有巨大的应用和经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物花粉发育调控基因Ms1及其编码蛋白序列，属于基因工程领域。
背景技术
植物的生殖生长是一个非常复杂的过程，从造孢细胞到成熟的生殖细胞要经历数十个发育阶段，任何一个发育阶段出现异常都会造成生殖生长的停滞并导致植物育性的丧失。雄性不育（Male Sterile）指因为植物雄性生殖细胞的非正常发育导致雄花的花粉育性丧失。因此对雄性不育的研究有助于理解复杂的植物生殖生长过程，并对作物生产中杂种优势利用和杂交种制种效率的提高具有巨大应用和经济价值。
玉米（Zea mays L.）是我国重要的禾本科粮食作物，具有重要的科研和经济价值。因为其雌雄异花的特点而被视作植物生殖生长的理想研究对象。目前国内通过各种诱变手段发现了大量的玉米雄性不育突变体，这为我们通过正向遗传学手段分析和研究植物花器官的发育调控提供了丰富的实验材料。
发明内容
本发明提供一种新的调控植物花粉发育基因Ms1的DNA序列、cDNA序列、启动子序列和该基因所编码功能蛋白的氨基酸序列，所述基因是一种植物雄穗特异性表达基因，所述基因功能的缺失会特异性导致植物雄花不育。
本发明的第一个发明目的是：提供一种调控植物花粉发育的新基因Ms1，其特征在于，是选自如下1）或2）或3）或4）或5）的DNA分子：
1）SEQ ID NO. 1所示的DNA分子（克隆自玉米自交系B73的基因组DNA）：该DNA分子由1286个核苷酸组成，自5’末端第59-711位核苷酸为第一个外显子，第712-813位核苷酸为内含子，第814-1286位核苷酸为第二个外显子；
2）SEQ ID NO. 2所示的DNA分子（克隆自玉米自交系B73的cDNA）；
3）在SEQ ID NO. 1基础之上经过一至数个碱基替换和\或一至数个碱基的插入和\或缺失以及大片段的核苷酸序列插入\缺失\移位\倒位所形成能够影响植物生育能力的DNA分子；
4）在0.1×SSPE（或 0.1×SSC）、0.1％（w/v） SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜，能够与SEQ ID NO. 2的DNA分子杂交且编码植物花粉发育相关蛋白的DNA分子；
5）与SEQ ID NO. 2的DNA分子具有85%以上的同源性且编码植物花粉发育相关蛋白的DNA分子。
本发明的第二个发明目的是：提供上述基因所编码的调控植物花粉发育的相关蛋白质。
在一个实施方案中，所述基因编码如下1）或2）所述的蛋白质：
1）序列表的SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
2）将序列表的SEQ ID NO. 3经过一个或数个氨基酸残基的取代、和/或缺失、和/或添加且具有影响植物小孢子细胞壁发育功能的相关活性的蛋白质。
本发明的第三个发明目的是：提供在植物雄花器官中调节所述基因序列转录表达的启动子。
在一个实施方案中，所述启动子序列如 SEQ ID NO. 4 所示 DNA 序列，该序列具有在植物雄花器官中特异启动如 SEQ ID NO. 1、2 所述基因序列转录的功能。
序列表的SEQ ID NO. 4为所述基因启动子的序列，总长782个核苷酸对应图4.A所示基因结构-1至-782位，所述启动子含有第747bp-751bp核苷酸（SEQ ID NO. 4）的CCAAT框（CCAAT box）对应图4.A所示基因结构-36至-32，第754bp-759bp核苷酸（SEQ ID NO. 4）的TATA框（TATA box）对应图4.A所示基因结构-29至-24，启动子的必要区域包括TATA框和CCAAT框的-24位至-36位，-1至-55区域是特别必要区域。
本发明的第四个发明目的是：提供含有所述基因和/或启动子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
本发明第五个发明目的是：提供上述基因在用于转基因改良作物的用途。
在一个实施方案中，所述基因用于诱导作物植株雄性不育，以便导入外源基因以获得优质的转基因作物。
在一个具体实施方案中，所述改良包括产量提高、品质提高、抗病虫害、抗逆、抗倒伏等生长性状的改良。
在另一具体实施方案中，所述作物是自花授粉或异花授粉作物。
在一个更加具体的实施方案中，所述作物包括但不限于玉米、小麦、高粱、水稻。
本发明第六个发明目的是：提供了一种在其它植物中获取Ms1基因的直系同源基因的方法，以及利用该方法获得的高粱（Sorghum bicolor）、水稻（Oryza sativa）、短柄草（Brachypodiumdistachyon）的氨基酸序列（图14）。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明提供的植物花器官发育调控基因Ms1直接参与小孢子细胞壁的发育过程，对小孢子的细胞壁起负调控作用，该基因的表达受到抑制后，小孢子细胞壁和花粉囊绒毡层组织均表现肿瘤化增生并最终导致小孢子的凋亡和植物花器官的雄性不育现象。通过植物生物技术途径，本发明在农作物的杂种优势利用和不育化杂交种制种生产中都将发挥重大作用。
术语定义
术语“调控植物花粉发育的基因”指一段具有编码蛋白能力的核苷酸序列，该序列特异编码具有调控植物花粉发育功能的蛋白活性多肽，如SEQ ID NO. 2的第1-1184位核苷酸序列及其简并序列。
术语“简并序列”是指，位于SEQ ID NO. 2的编码框第1-1184位核苷酸序列中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 2的第1-1184位核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 2所编码的氨基酸序列。
所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括在中度严格条件下，更佳的在高度严格条件下可以与SEQ ID NO. 2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。其中，中等严格条件可以是0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％ SDS（w/v）的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜的条件。
所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括与SEQ ID NO. 2中从第1-1184位核苷酸序列的同源性至少70%，较佳地具有至少80%、82%、85%、86%、88%、89%同源性，更佳地具有至少90%、91%、92%、93%、94%同源性，最佳地具有至少95%、96%、97%、98%、99%同源性的核苷酸序列。
所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括能编码具有与天然的调控玉米花粉发育基因Ms1基因相同功能蛋白的、SEQ ID NO. 2开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1个或几个核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’或3’端添加几个（通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内）核苷酸。
所述“调控植物花粉发育的基因”，还包括能够翻译一类具备调控玉米花粉发育功能的氨基酸序列，如SEQ ID NO. 3的氨基酸序列。该类氨基酸序列还包括具有与天然调控玉米花粉发育蛋白相同功能的SEQ ID NO. 3的变异形式。这些变异形式包括（但并不限于）：1个或 几个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或几个（通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内）氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能；在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
另外，所述的“调控植物花粉发育的基因”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员己知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，然后细胞转化等常规方法从增殖的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入实施例蛋白序列中。除了用重组法产生之外，实施例蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成多肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用人工或自动进行，可以分别化学合成实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的蛋白质分子。
附图说明
图1为正常发育玉米B73和Ms1基因突变型ms1-6050花药发育情况的观察（白色标尺代表1毫米）：A，野生型B73和突变体ms1-6050的小花整体发育情况，图中左侧为正常小花，右侧为Ms1基因突变植株ms1-6050的小花；B，野生型B73花药经1%KI-I2染色结果；C，Ms1基因突变体ms1-6050的花药经1%KI-I2染色结果。
图2为Ms1基因的精细定位和图位克隆结果：A，Ms1基因基于利用654株的不育单株定位群体和7对分子标记的遗传定位结果；B，Ms1基因的物理定位结果，一个白色长矩形代表一个BAC重叠群（BAC contig），基因被精细定位在233Kb的物理距离区（sj10-sj30标记之间，白色标尺代表100Kb）；C，Ms1基因所在物理图谱区间内功能基因示意图，白色框代表候选基因GRZM2G180139。
图3为Ms1基因在野生型B73中的基因组DNA序列、cDNA序列、编码DNA序列（CodingDNA Sequence，CDS）的序列比对。
图4为Ms1基因在野生型B73和两个等位突变体中的结构示意图：A：Ms1基因在野生型B73中的基因结构；B：Ms1基因在突变体ms1-6050中的基因结构；C：Ms1基因在突变体ms1- Alb中的基因结构。其中，ms1-6050突变基因与野生型基因Ms1相比，在第一个外显子+468~+474处存在一个碱基G的缺失，导致编码区移码突变，造成基因的翻译在 +494处终止。而在突变体ms1-Alb中克隆的Ms1基因编码区序列与B73不存在任何差异，但是在Ms1基因上游-51处插入了一段长度为3980bp的转座子DTA_ZM00023。
图5为Ms1基因的编码区（Coding DNA Sequence，CDS）在野生型B73和突变体ms1- 6050中的核苷酸序列比较。
图6为Ms1基因在野生型B73和突变体ms1-6050中所翻译的氨基酸序列比较。
图7为利用引物组合EP161F和EP339R在ms1-Alb、B73和作图群体亲本昌7-2 进行PCR扩增并经1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳结果：M，DNA Ladder ；1， ms1-Alb；2，B73；3，昌7-2；4，阴性对照。
图8为使用引物组合EP231F、EP544F、EP339R扩增的PCR产物，经浓度3%琼脂糖凝胶电泳鉴定不育突变特异的分子量条带（黑色箭头标注为可育基因型和不育基因型的特异扩增条带）：M，DNA Ladder（250bp和100bp）；1，纯合不育株（基因型ms1-Alb/ms1-Alb）；2，杂合可育株（基因型Ms1/ms1-Alb）；3: B73；4，昌7-2。
图9为Ms1基因在B73中的半定量反转录PCR的表达谱分析：IMT，未成熟雄穗；Quartets，小孢子母细胞减数分裂四分体时期雄穗；MV，中期大液泡小孢子时期雄穗；LV，后期大液泡小孢子时期雄穗；H，抽雄期雄穗；Leaf，叶片； Ear，幼嫩雌穗；Root，根。
图10为Ms1基因在B73不同发育时期雄穗的表达检测：IMT，未成熟雄穗；Quartets，小孢子母细胞减数分裂四分体时期雄穗；EV，早期大液泡小孢子时期雄穗；MV，中期大液泡小孢子时期雄穗；LV，后期大液泡小孢子时期雄穗；VP，大液泡花粉粒时期雄穗；Heading，抽雄期雄穗。
图11为Ms1基因在B73和突变体ms1-Alb的不同发育时期雄穗的表达检测比较结果：白色柱子为B73，灰色柱子为ms1-Alb；IMT，未成熟雄穗；Quartets， 小孢子母细胞减数分裂四分体时期雄穗；EV，早期大液泡小孢子时期雄穗；MV，中期大液泡小孢子时期雄穗；Heading，抽雄期雄穗。
图12为B73和突变体ms1-Alb单株花药的细胞遗传学观察（黑色三角型标注为细胞壁，黑色阴影箭头标注为芽孔，黑色标尺代表30微米）：A，B73小孢子母细胞减数分裂四分体时期；B， ms1-Alb小孢子母细胞减数分裂四分体时期； C，B73中期大液泡期小孢子；D，ms1- Alb中期大液泡小孢子。
图13为B73和突变体ms1-Alb单株花药石蜡切片观察图（白色三角型标注为花粉囊绒毡层细胞，黑色阴影箭头标注为小孢子细胞壁，黑色标尺代表30微米）：A，B73小孢子母细胞减数分裂四分体时期；B，ms1-Alb小孢子母细胞减数分裂四分体时期； C，B73中期大液泡小孢子；D，ms1-Alb中期大液泡小孢子。
图14为玉米Ms1基因翻译的氨基酸序列与其在高粱、水稻、短柄草中直系同源基因翻译产物的比较结果，虚线框注内为DUF260结构域。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明的应用范围。下述实施例中的所有技术和科学术语，如无特殊说明，均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。除非有相反指明，本发明所使用或提及的技术均为本领域普通技术人员公认的标准技术。所述试验材料，如无特别注明，均为本发明领域通用的试验材料。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。材料、方法和实施例谨作阐述用，而非加以限制。
本发明所述的雄性不育，特指由植物细胞核基因发生功能变化导致植物雄花发育出现异常（无法产生雄花、花药或者正常的雄性配子体）并出现育性的丧失，即通常所说的雄性核不育（Genic male sterility）而非细胞质核不育（Cytoplasmic male sterility）。雄花育性的异常和恢复均由细胞核内的基因加以控制。
因此，本发明也包括利用序列表所述序列调控植株的生育能力，即利用本发明提供的基因序列在基因组、和/或转录组、和/或蛋白质组水平影响其它植物中相同或同源基因的功能来达到控制雄花育性的目的。例如，下述方法但不限于下述方法：通过天然序列的变异导致基因表达抑制或蛋白质功能的丧失、通过向植物中转入所述基因的反义序列或引入发卡结构、或将所述基因与其它序列（DNA或RNA）相结合产生新的具有功能活性的DNA或RNA链，来影响或改变植物基因的功能。或其它本领域技术人员已知的可用于影响植物雄花育性的技术方法中的任何一种技术方法。
本发明包括玉米Ms1基因，其显性等位基因对植物雄花育性具有关键作用，功能缺失性的隐性等位基因会导致雄性不育。该基因位于玉米6号染色体，其基因具体位置如图2所示。
该基因序列及其同源序列可从任何显花植物中获得，包括但不限于玉米（Zea mays）、普通小麦（Triticumaestivum）、高粱（Sorghum bicolor）、水稻（Oryza sativa）、短柄草（Brachypodiumdistachyon）、谷子（Setariaitalica）、大麦（Hordeumvulgare）、黑麦（Secalecereale）、粗山羊草（Aegilopstauschii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、甘蓝（Brassica oleracea）、大豆（Glycine max）、番茄（Lycopersiconesculintum）等。获得方法包括但不限于：通过玉米Ms1基因序列利用blastx、blastn或通过氨基酸序列利用blastp从其它植物的基因组序列数据库、和/或cDNA序列数据库、和/或蛋白质序列数据库中调取；以Ms1基因的DNA或cDNA或RNA序列为参考序列设计引物，直接从其它植物的基因组DNA或cDNA或RNA中利用PCR的方法直接获得；以玉米Ms1的基因序列设计探针，利用核酸杂交的方法从基因组文库中分离含有同源基因序列的DNA或cDNA或RNA片段。
“Ms1基因同源序列”指在与SEQ ID NO. 3的氨基酸进行blastx比较分析后，Identities大于或等于35%、Positives大于或等于50%，且识别区域位于SEQ ID NO. 3的8至108位氨基酸即保守的DUF260结构域内的植物基因的DNA序列。进行blastx时，所有参数均遵照http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/所示的默认设置进行。
Ms1基因的调控区域已被鉴定为上游的782bp序列（见序列表SEQ ID NO. 4）。如图4. A所示启动子的必要序列包括-24至-29的TATA框以及-32至-36处的CCAAT框，-1至-51处序列能够起始基因的表达，而-52至-782则行使特异调控功能。
下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，但这并非意欲对本发明的范围加以限制。
实施例1. Ms1基因突变体的鉴定和基因精细定位
雄性不育是由于控制雄花发育的基因发生变异导致雄花败育，通常表现为没有雄花或雄花花药干瘪、花药中没有花粉或只有有少量非正常发育的花粉。与正常发育的花器官相比，Ms1基因突变体花药表现为体积变小、花药干瘪、1%KI-I2染色后颜色因为没有花粉导致呈棕色而非正常花药的紫色（图1）。
以昌7-2为父本、Ms1基因隐性不育突变体ms1-6050（选自专利权人单位北京首佳利华科技有限公司的玉米育种材料的天然突变体）为母本，构建了995个单株的F2分离群体。2012年冬季种植于海南南繁实验田并按上述性状特征进行育性调查，共有218个F2单株表现出雄性不育表型，卡方测验结果显示可育株和不育株符合3:1的分离比（X2=4.745, P=0.029）。所有不育单株均以提取叶片基因组总DNA的方式进行保存，用于Ms1基因突变位点ms1的遗传分析。
已有研究发现，ms1位点与位于6号染色体的Y1基因紧密连锁（参考文献1-4），因此在Y1基因附近选取了位于玉米6号染色体6.02bin的4个多态性SSR分子标记，通过在218株不育单株中进行PCR扩增和凝胶电泳的结果分析，研究这4个SSR标记是否与ms1基因存在连锁关系。结果显示：4个多态性SSR标记在218个不育单株群体中，表现为ms1-6050基因型的个体数均超过90%（表1），表明它们与ms1基因紧密连锁。
于2013年夏季将定位群体扩大至654个不育单株，并基于B73基因组序列开发了8对与这4对标记相邻的多态性标记（表2），构建了ms1位点所在区间的连锁图谱（图2.A）。结合表型数据，进行连锁交换分析，最终将ms1位点定位在sj10-sj30之间233Kb的区间内（图2.A、图2.B），并与基因GRMZM2G180319开发的多态性标记ep90共分离。
表1.
| 标记名称： | umc1031 | bnlg1538 | y1-ssr | umc1006 |
| 不育株基因型比例 | 91.3% | 93.1% | 95.4% | 95.4% |
表2.
从Maize GDB调取B73的基因组序列，在去除假基因和转座子序列后，在该233Kb区间共有11个功能基因（图2. C），其中基因GRMZM2G180319具有与花器官发育相关的功能。基于玉米B73基因组序列信息，该基因全长1286bp（SEQ ID NO. 1），与玉米B73基因组序列进行blastn分析，表明其在玉米基因组内为单拷贝基因。通过基因cDNA序列（SEQ ID NO. 2）进行模拟翻译，该基因编码一个218个氨基酸的蛋白，将该蛋白序列与GenBank SwissProt蛋白质数据库进行blastx分析，显示该蛋白含有一个DUF260保守结构域，属于次生器官发育相关基因（Lateral Organ Boundary，LOB）家族。LOB蛋白家族在拟南芥中广泛参与了花、根、芽尖、叶片等次生组织器官的发育，因此将GRMZM2G180319作为Ms1的候选基因。
Ms1的候选基因结构：通过Ms1候选基因在野生型B73中的基因组序列（SEQ ID NO.1）、cDNA序列（SEQ ID NO. 2）及其编码DNA序列的比对分析（图3），发现该基因的结构特征如下（图4.A）：含有2个外显子（Exon）和1个内含子（Intron），其中第一个外显子位于+1~+711bp处，内含子位于+712~+813bp处，第二个外显子位于+814~+1286处。编码DNA序列（Coding DNA Sequence，CDS）位于+59~+711和+814~816处，共657bp。
实施例2. ms1基因在突变体中的克隆
引物EP336F（5’-CACCTGCAGCCGCGGGATGAC-3’）和EP232R（5’-TTATGTGCTTCGAGAAAGTCCT-3’） 可用于在B73和Ms1位点的两个隐性突变体ms1-6050、ms1- Alb （遗传背景分别为OH43和B73）中特异克隆GRMZM2G180319基因全长。三个引物组合OGF167、EP156、EP162（信息见表3）能分别扩增该基因的+19~+448、+442~+1150、+1006~+1286片段，通过测序对扩增的基因序列进行验证。所有PCR扩增均使用KOD FX DNAPolymerase（TOYOBO CO., LTD. Life Science Department, Osaka, Japan），并按照产品说明的反应体系和条件，在Bio-radMyCycler PCR仪进行PCR扩增。PCR产物送往上海生工生物工程公司进行测序。
表3.
| 引物名称 | 正向引物 | 反向引物 |
| OGF167 | CAATTCAATTCAGTGGGCGCGTGCGCGGTGTGC | CGGGGATCCTGCTACTCGCCGTCAGAAGC |
| EP156 | AGTAGCAGAGCTCATCATGCAC | CCCTATGCGAGCTATCTGGT |
| EP162 | ATTCGAGCAGCATATGACGAC | TTATGTGCTTCGAGAAAGTCCT |
测序结果显示：ms1-6050突变基因与B73中野生型基因Ms1相比，在+468~+474处存在一个碱基的缺失，导致编码区移码突变，造成基因的翻译在 +494处终止（图4.B、图5）。这造成了Ms1基因在ms1-6050突变体中编码的蛋白质比其在野生型B73中编码的蛋白减少了74个氨基酸，从而造成其功能的丧失（图6）。
从突变体ms1-Alb克隆的Ms1基因序列并未发现与B73存在任何序列差异，然而在使用引物组合EP161F（5’-CTAGCTGGATTACCCATGTCT-3’）和EP339R（5’-GTCATCCCGCGGCTGCAGGTG-3’）对基因的启动子区进行扩增时，发现ms1-Alb携带了一段4Kb左右的未知片段（图7），进一步测序发现，ms1-Alb突变体的Ms1基因在-51处插入了一段长度为3980bp的转座子DTA_ZM00023（图4.C）。
综合上述结果， Ms1基因的两个等位突变体ms1-6050、ms1-Alb在基因GRMZM2G180319的不同位置均存在造成基因功能缺失的结构变异，证明GRMZM2G180319为Ms1基因（下述实施例中所指Ms1基因均指基因GRMZM2G180319）。
实施例3. 利用诊断标记进行纯合隐性不育植株苗期鉴定
Ms1位点为纯合隐性突变基因型（如ms1-Alb/ms1-Alb）的单株才能表现雄性不育的性状。因此不育基因的保留只能用携带突变基因的杂合可育单株（基因型为Ms1/ms1- Alb）作为父本，为雄性不育单株授粉的方式，后代中会有约半数植株表现出雄性不育的表型。为此根据ms1-Alb在Ms1位点的序列突变，可使用下述引物组合：EP231F（5’－CCTTACTGTCTTGCACGTCCT－3’），EP544F（5’－TGCTGGGCCTCTATTTTAGCCTA－3’），EP339R（5’－GTCATCCCGCGGCTGCAGGTG－3’），作为诊断标记在苗期鉴定Ms1位点纯合隐性基因型为ms1-Alb/ms1-Alb的单株。该诊断标记在Ms1位点纯合隐性不育株（基因型ms1-Alb/ms1- Alb）可特异扩增一条255bp（引物组合EP544F+EP339R）的条带，纯合可育株（基因型Ms1/Ms1）基因组DNA的PCR扩增产物分子量大小为158bp（引物组合EP231F+EP339R），杂合可育株（基因型Ms1/ms1-Alb）则能够同时检测出上述两种分子量大小的条带（图8，黑色箭头标注条带）。在温室种植的67株ms1-Alb/ms1-Alb×Ms1/ms1-Alb杂交后代中，用诊断标记筛选出31株ms1-Alb/ms1-Alb纯合基因型单株，这些单株经表型鉴定均表现为雄性不育，进一步证明GRMZM2G180319就是Ms1的候选基因。
实施例4. Ms1基因在B73及突变体中的转录水平分析
使用上述诊断标记在苗期鉴定ms1-Alb/ms1-Alb纯合隐性单株，按未成熟雄穗期（Immature tassels, IMT）、减数分裂四分体时期（Quartets）、早期大液泡小孢子期（Early-vacuolate microspore, EV）、中期大液泡小孢子期（Mid-vacuolate microspore，MV）、抽雄期（Heading）五个雄穗发育时期，分别采集纯合隐性单株的雄穗，每个完整雄穗取一半经液氮速冻保存，用于提取总RNA，剩余雄穗的小花在卡诺固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小时，再经1%醋酸洋红（1g洋红溶于100ml 45%醋酸）染色进行细胞遗传学观察，确定准确的发育时期。
用相同方法分别提取B73的IMT、Quartets、EV、MV、晚期大液泡小孢子期（Late-vacuolate microsoire, LV）、大液泡花粉粒期（Vacuolate pollen, VP）、抽雄期（Heading, H）成熟花粉期七个时期雄穗总RNA（所有雄穗均提前经细胞遗传学观察，确定准确的发育时期）。另外提取B73减数分裂期植株的叶片、根以及抽雄期的幼嫩雌穗总RNA，用于分析基因在不同组织中的表达水平。
每一个样本均采取半定量反转录PCR（Semi-quantitative ReverseTranscription PCR, qRT-PCR）和实时定量PCR（Real-time PCR, RT-PCR）两种方法进行Ms1基因的表达量检测。qRT-PCR和RT-PCR均以ZmActin基因作为内参报告基因，引物EP695F（5’－CGTGTGGGGGCAATAATAATG－3’）和EP695R（5’－CGTCCGCTGTCATAGTAATAG－3’）用于在qRT-PCR和RT-PCR反应中检测Ms1基因表达，引物OGF49（5’－GGCCACAAGCTGCTCAACCT－3’）、OGF50（5’－ATGTGGTTGCCCAGGGACTT－3’）用于检测ZmActin基因的表达。RT-PCR中每个样品的Ms1基因和ZmActin基因的PCR反应均设置3个独立重复试验。
一、Ms1基因在B73中的表达谱分析
Ms1基因是一个雄穗特异表达基因，且仅在特定的生理时期（小孢子母细胞减数分裂期至花粉的形成）行使功能。qRT-PCR结果显示，除花器官外，在其它组织中均未检测到Ms1基因的表达（图9）；此外，在花器官中，Ms1基因从减数分裂时期的雄穗中始观察到微弱表达，至中期大液泡小孢子时期其表达量明显增强，在后期大液泡小孢子出现后其表达量开始降低，在抽雄期成熟花粉中几乎很难检测到明显的表达。RT-PCR分析也获得了类似的结果（图10）。
二、Ms1基因在B73和突变体的差异表达检测
Ms1基因在ms1-Alb突变体中的表达明显被抑制，RT-PCR的结果如图11所示：Ms1基因在ms1-Alb中的表达均显著低于同时期的B73雄穗，尤其在减数分裂四分体时期和早期大液泡小孢子时期，ms1-Alb突变体中Ms1基因仅表现微弱的表达。
实施例5. Ms1基因突变对花粉发育的影响
从野生型B73和ms1-Alb突变体中分别取不同发育时期的雄穗，每个完整雄穗取一半经液氮速冻保存用于提取总RNA，剩余雄穗的小花在卡诺固定液（酒精：冰乙酸＝3:1）中固定48小时，再经1%醋酸洋红（1g洋红溶于100ml 45%醋酸）染色进行细胞遗传学观察，以确定准确的发育时期。与B73类似，Ms1位点为纯合突变基因型（ms1-Alb/ms1-Alb）的单株花粉发育在小孢子母细胞减数分裂至四分体时期均表现正常（图12.A、B）；但是之后的小孢子时期，突变体小孢子在显微镜下呈矩形而非正常的圆形并表现出明显的细胞壁加厚（图12.C、D），并且具有双层的细胞壁，同时在细胞中无法观察到芽孔（Germ Pore），部分小孢子还可以观察到小囊泡，这表明突变体的小孢子在该时期已经出现细胞质的降解。
突变体在该时期花药的石蜡切片显示，花粉囊在四分体时期未发现与B73存在明显差异（图13.A、B）；但在小孢子时期可以明显观察到突变体单株花粉囊的绒毡层出现肿瘤状组织，矩形的小孢子通过加厚的细胞壁相互粘连在一起（图13. D）；而正常的花粉囊此时绒毡层开始降解，小孢子呈饱满的椭圆形也没有相互粘连的现象（图13.C）。
结合Ms1基因在ms1-Alb突变体中的表达结果可以发现，该基因参与了小孢子从四分体释放后的细胞壁再生的过程，因而在四分体时期表达量的急剧降低（图11），直接导致了四分体后释放的小孢子出现加厚的双层细胞壁（图12.D），在中期大液泡小孢子时期进一步导致绒毡层细胞的肿瘤化，并最终导致细胞死亡降解（图13.D）。Ms1基因是一个特异控制花器官形态建成的关键调控因子，该基因功能的缺失将导致小孢子的非正常发育并触发小孢子细胞的降解，因此在突变体的成熟花药中无法观察到花粉（图1. C、图13.D）。
实施例6. Ms1基因在玉米、高粱、水稻、短柄草中的同源性分析
如前文所述，Ms1基因在玉米中特异调控雄穗的花粉粒发育。当其功能被抑制时将导致玉米雄花育性丧失即雄性不育。利用Ms1基因的cDNA序列，通过blastx在genebank获得了该基因在高粱、水稻、短柄草中的直系同源基因（编号分别为：SORBIDRAFT_10g029595、Os01g0242400、XP_003565566.1）。
如图14所示，Ms1基因在玉米、高粱、水稻、短柄草的19-124位氨基酸表现出高度保守性，而这一区域正是DUF260结构域的位置，在124位后的氨基酸变异较大，因此，Ms1在其它植物中同样存在，并且在关键结构域上保持高度的保守性特点。即该基因对植物保持正常的雄花生育力而言具有关键作用，是必不可少的，当基因发生序列变异时会极大地影响植物的雄花育性。
实施例7. Ms1基因启动子区序列的鉴定
根据softberry TSSP数据库（http://linux1.softberry.com）分析，发现Ms1基因上游 -24至-36处为基因启动子的TATA框和一个CCAAT框的增强子（Activator），-37至-782为上游调控序列。
Ms1基因突变体ms1-Alb在花粉母细胞减数分裂期和小孢子期的表达量均显著低于野生型B73，说明ms1-Alb在基因-51处的转座子插入影响了基因的表达（图4.C 、图13）。自基因转录起始位点至上游-782处总长782bp的核苷酸序列为Ms1基因的启动子序列。其中-1至-51能够起始基因的表达，该段序列包括-24至-29的TATA框以及-32至-36处的CCAAT框。而-52至 -782则行使特异调控功能，这部分序列结构的破坏将使Ms1基因表达受到抑制。
相关文献:
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3、李竞雄、周洪生、孙荣锦等（1998）玉米雄性不育生物学，中国农业科学出版社。
4、吴锁伟、方才臣、邓联武、万向元（2012）玉米隐性核雄性不育基因研究进展及其育种应用途径分析，分子植物育种(网络版)，第 10 卷，第 1001-1011 页。
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<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> SEQ ID NO.1
<211> 1286
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> SEQUENCE: 1
agctctctct ccgttccgtt ccgttccgtc ccctccaccc cgcacctgca gccgcgggat 60
gaccggcggc ggccgcggcg cgtgcgcggt gtgcaagcac cagcggcgca agtgcgagcc 120
caactgcgag ctggccgcct acttcccggc gcacaggatg aacgacttcc gcgcgctgca 180
cctcgtcttc ggggtggcca acctcaccaa gctcatcaag gccaacgcca gcgaggccgg 240
ccggcgccgc gccgccgaga cgctcacctg ggaggcccgc tggagggagt gcgacccctc 300
ggacgggtgc taccgcgagg tggcctgcct gcgccgcgac aacgccgtgc tgcgcgccga 360
gaacgccgcg ctgcggcggc agctggccga gcagcagctg ctctggtcca gcgcctgcag 420
cactggcggc agcgcgcttc tggccgagca gcagctgctg ccgccgtgtg ggggcaataa 480
taatgggctt ctgacggcga gtagcagagc tcatcatgca ccggcagcag ctctggcggc 540
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ctcagatcga ttccttgtgc tctcagctac tgcaaaagat agctgtgtgt ggatacttgc 780
attggcttct ctccattgtt tatgcaactg caggtgatgc tagctggccg gctatactgc 840
taattaacaa ctgcaaagaa aggaagatac ccatacccta ccgtcgtcct aaagtgtaga 900
tttttggtta ctcgtgtact gatgacagca agggcaaggc ggctcaatat atagaaatat 960
atcaacgaga gctagactac ttctatatgt atattggttg ctacttcagt tatatgatcc1020
tagaaattac atgaaccaca agaccatcaa agatcgatcg agtattcgag cagcatatga1080
cgacccagcc cctcagcaag tttttttttt catccagcat cactcagcgg ctgctatata1140
cagtgcttcc tggcagctta ccagctgggt tgttgtgtca tttcacgaac cagatagctc1200
gcatagggaa gaagggatga atataaaact tgtctttcat ctagaatcag agatccaata1260
tatacacttg taggccttgg tattcc 1286
<210> SEQ ID NO.2
<211> 1184
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> SEQUENCE:2
agctctctct ccgttccgtt ccgttccgtc ccctccaccc cgcacctgca gccgcgggat 60
gaccggcggc ggccgcggcg cgtgcgcggt gtgcaagcac cagcggcgca agtgcgagcc 120
caactgcgag ctggccgcct acttcccggc gcacaggatg aacgacttcc gcgcgctgca 180
cctcgtcttc ggggtggcca acctcaccaa gctcatcaag gccaacgcca gcgaggccgg 240
ccggcgccgc gccgccgaga cgctcacctg ggaggcccgc tggagggagt gcgacccctc 300
ggacgggtgc taccgcgagg tggcctgcct gcgccgcgac aacgccgtgc tgcgcgccga 360
gaacgccgcg ctgcggcggc agctggccga gcagcagctg ctctggtcca gcgcctgcag 420
cactggcggc agcgcgcttc tggccgagca gcagctgctg ccgccgtgtg ggggcaataa 480
taatgggctt ctgacggcga gtagcagagc tcatcatgca ccggcagcag ctctggcggc 540
aacgcacacc gcgctggcct gctaccgtgg cagcatgccg gtgtgtacta ttactatgac 600
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gagtggtgct caggtcgacg cttctaggga taacaagagc agcgcctgca ggtgatgcta 720
gctggccggc tatactgcta attaacaact gcaaagaaag gaagataccc ataccctacc 780
gtcgtcctaa agtgtagatt tttggttact cgtgtactga tgacagcaag ggcaaggcgg 840
ctcaatatat agaaatatat caacgagagc tagactactt ctatatgtat attggttgct 900
acttcagtta tatgatccta gaaattacat gaaccacaag accatcaaag atcgatcgag 960
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agaatcagag atccaatata tacacttgta ggccttggta ttcc 1184
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<211> 218
<212> PRT
<213> Zea mays
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Met Thr Gly Gly Gly Arg Gly Ala Cys Ala Val Cys Lys His Gln Arg
1 5 10 15
Arg Lys Cys Glu Pro Asn Cys Glu Leu Ala Ala Tyr Phe Pro Ala His
20 25 30
Arg Met Asn Asp Phe Arg Ala Leu His Leu Val Phe Gly Val Ala Asn
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100 105 110
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130 135 140
Leu Thr Ala Ser Ser Arg Ala His His Ala Pro Ala Ala Ala Leu Ala
145 150 155 160
Ala Thr His Thr Ala Leu Ala Cys Tyr Arg Gly Ser Met Pro Val Cys
165 170 175
Thr Ile Thr Met Thr Ala Asp Asp Gly Ser Gly Arg Arg Pro Ala Ser
180 185 190
Asp Ala Ala Ala Ile Ala Gly Arg Gly Ser Gly Ala Gln Val Asp Ala
195 200 205
Ser Arg Asp Asn Lys Ser Ser Ala Cys Arg
210 215
<210> SEQ ID NO.4
<211> 782
<212> DNA
<213> Zea mays
<400> SEQUENCE:4
ctagctggat tacccatgtc tcggtagtga ttacaacttt ttttaataat ctaaaatctt 60
tttggttcag cttttctcta acaagttttt tcaatctgga tataaaaaaa tctagcttta 120
aagagaatct aaatatcgtg agatttacgt atagaaaaag atgaagcagt ctataggatt 180
taggatctaa gaagtgacgg attctacatt ccatggatta ttctatgcaa gcaaggaacg 240
aaggaaacat gggtttgtac cctcgtggaa gctcaatgtt tgctagattg cactccatgg 300
gtgagctatt gatatgtaca catgcatgca tgttgaaaga aaatggtttt ttgtcgatct 360
atataatctt tgctctcact ttaacaagtg ctaatttagc ttaacagttg cttttcaagg 420
aactaaaaca aaataaggca tgcaagatag agtttagcta aagaattgga agatcttaaa 480
gcgaagatta gctattgagc ggcttgttgg gcgagaggcc tgacaataat cttggacttg 540
aaagatggag atgacatatc ctttccattt tccgacctgg cagggtattt gtcgtccaac 600
aatgcaaccg catcattaga agtttccatg cccctgaaac ctgaactctt gctgtgagca 660
acctagaaag ccgtgaccct cctttcacct tactgtcttg cacgtccttt cttgttccac 720
gtacgcactc cggtccgcgt ccaagtccaa tccatatatg cacgcacacg gccacgcagg 780
gc 782
Claims (2)
1.一种调控玉米花粉发育的基因Ms1用于改良玉米的用途，其特征在于：
抑制所述基因Ms1的表达用于诱导玉米植株雄性不育，所述基因Ms1的DNA序列如SEQID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其中抑制所述基因Ms1的表达，以诱导玉米植株雄性不育，以便获得玉米雄性不育系，用于杂交玉米育种和制种及玉米生产。
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