CN113943356B

CN113943356B - 蛋白质phd11、其编码基因以及它们在选育玉米雄性不育系中的应用

Info

Publication number: CN113943356B
Application number: CN202110104390.7A
Authority: CN
Inventors: 金危危; 冷国辉; 潘玲玲; 黄伟
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2023-03-10
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN113943356A

Abstract

本发明公开了蛋白质phd11、其编码基因以及它们在选育玉米雄性不育系中的应用。蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类含有精氨酸的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育。蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类仅为谷氨酰胺的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类可以作为检测对象，预测待测玉米雄性育性。本发明具有重大的应用价值。

Description

蛋白质phd11、其编码基因以及它们在选育玉米雄性不育系中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质phd11、其编码基因以及它们在选育玉米雄性不育系中的应用。

背景技术

玉米是全世界种植面积以及产量居于榜首的农作物，是主要粮食作物之一。玉米不仅是畜牧业、养殖业等的重要饲料来源，也是食品、轻工业、化工业等不可或缺的原料之一。因此，提高玉米产量对粮食安全和经济发展具有重要意义。

目前，玉米种是通过杂交制种，传统的母本去雄的方式是人工去雄、机械去雄或者化学杀雄，对母本的伤害大且成本高。应用雄性不育系制种，则避免了这些缺陷，并且制种纯度高有利于集约化经营。玉米是最早利用雄性不育系进行杂交制种的作物，通过选育优良的不育系改善玉米制种效果为玉米高产稳产提供坚实的基础条件。自1950年第一个玉米雄性不育系杂交种问世以来，玉米雄性不育相关研究取得很大的进展，但由于技术等原因，玉米雄性不育系制种在我国的推广利用远远不足。

玉米是典型的雌雄同株异花植物，雄花在顶部，雌花位于植株中部。玉米雄性不育是指玉米雄花无法产生可育花粉，造成雄性不育可能是由于减数分裂出现异常、或者花药壁、绒毡层等组织发育缺陷。植物雄性不育可分为细胞核雄性不育(GMS)和细胞质雄性不育(CMS) 以及核质互作雄性不育。CMS是母系遗传，不符合孟德尔遗传规律。CMS系统已成功用于玉米杂交种子生产，但存在一些严重问题，如易感病、某些环境下雄配子育性的遗传不稳定、恢复系的种质资源狭窄等，限制了玉米制种的广泛应用。GMS是由核基因控制的，分为显性核不育基因和隐性核不育基因，迄今鉴定的大多数突变表型受隐性基因控制。传统的利用GMS 制种是两系法策略，将不育株和杂合可育株杂交，得到一半不育系，一半保持系。这种办法显然需要田间鉴定，繁殖杂交种时需拔除可育株，繁殖保持系时需拔除不育株。为了区分可育种和不育种，早期人们利用与不育基因连锁的胚乳颜色基因、黄绿苗基因进行早期鉴定，但还是存在连锁不紧密导致的鉴定不准确且耗时耗力的问题，从而增加制种成本。2006年美国先锋公司开发了SPT技术，实现了转基因系生产非转基因系。SPT表达盒包含育性恢复基因、花粉致死基因和颜色筛选基因，将SPT表达盒转化到不育系中，通过分子鉴定和性状选择得到阳性植株，阳性植株雄配子50％含有SPT表达盒致死，雌配子50％携带SPT，50％不携带，自交后代50％为不育系不携带转基因原件，50％不育保持系携带SPT表达盒、可育且有颜色可通过种子筛选。将保持系给不育系授粉得到大量不育系，可供制出杂交种。SPT技术成果克服了细胞核雄性不育系和保持系分离的难题，借助胚乳颜色便于分选，不育系和杂交种排除了转基因成分。SPT核心技术之一是表型稳定的核不育基因，因此探索新的优良的GMS 的是利用雄性不育玉米制种的重要环节。

发明内容

本发明的目的是获得玉米细胞核雄性不育相关的蛋白质。

本发明首先保护蛋白质phd11。蛋白质phd11可为如下a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与玉米雄性育性相关的蛋白质；

a4)与SEQ ID NO:1限定的氨基酸序列具有80％或80％以上同源性，来源于玉米且与雄性育性相关的蛋白质。

其中，SEQ ID NO:1由689个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过 10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:3所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′ 端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码上述任一所述蛋白质phd11的核酸分子。

所述编码上述任一所述蛋白质phd11的核酸分子可为b1)或b2)或b3)或b4)或b5)所示的DNA分子：

b1)编码区是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

b3)核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的DNA分子；

b4)与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同源性，来源于玉米且编码所述蛋白质phd11的DNA分子；

b5)在严格条件下与b1)或b2)或b3)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质phd11的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，SEQ ID NO:2由3279个核苷酸组成(基因全长)，SEQ ID NO:3由2070个核苷酸组成(编码区)。SEQ ID NO:3所示的核苷酸编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质phd11的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质phd11的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质phd11，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的所述蛋白质phd11的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物也属于本发明的保护范围。

本发明还保护Z1)或Z2)。

Z1)上述任一所述蛋白质phd11、上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，在调控玉米雄性育性中的应用。

Z2)上述任一所述蛋白质phd11、上述任一所述核酸分子、或、含有上述任一所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，在选育玉米雄性不育系和/或玉米雄性不育保持系中的应用。

本发明还保护A1)或A2)。

A1)一种玉米雄性不育系的选育方法，可为抑制雄性可育玉米表达上述任一所述蛋白质 phd11，获得转基因玉米；所述转基因玉米即为玉米雄性不育系。

上述方法中，所述抑制雄性可育玉米表达上述任一所述蛋白质phd11可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到抑制雄性可育玉米表达上述任一所述蛋白质phd11的目的。

上述方法中，所述玉米雄性不育系可为玉米突变体phd11-d(即玉米雄性不育突变体 phd11-d)或phd11-mu突变体。

A2)一种玉米雄性不育保持系的选育方法，可为使雄性不育玉米表达上述任一所述蛋白质phd11，获得转基因玉米；所述转基因玉米即为玉米雄性不育保持系；所述雄性不育玉米的不育性状是由于表达上述任一所述蛋白质phd11的能力丧失或降低引起的。

上述方法中，所述使雄性不育玉米表达上述任一所述蛋白质phd11可通过转基因、多拷贝、改变启动子、调控因子等本领域熟知的方法，达到使雄性不育玉米表达上述任一所述蛋白质phd11的效果。

上述方法中，所述使雄性不育玉米表达上述任一所述蛋白质phd11可通过向雄性不育玉米中导入编码上述任一所述蛋白质phd11的核酸分子实现。所述“向雄性不育玉米中导入编码上述任一所述蛋白质phd11的核酸分子”可通过向雄性不育玉米中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码上述任一所述蛋白质phd11的核酸分子，得到的重组质粒。

本发明还保护预测待测玉米雄性育性的方法。

本发明所保护的预测待测玉米雄性育性的方法，具体可为S1)：检测待测玉米的蛋白质 phd11自N末端起第396位的氨基酸残基种类；“蛋白质phd11自N末端起第396位的氨基酸残基种类含有精氨酸”的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育；“蛋白质phd11自N末端起第 396位的氨基酸残基种类仅为谷氨酰胺”的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。所述蛋白质phd11的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。

本发明所保护的预测待测玉米雄性育性的方法，具体可为S2)：检测待测玉米总RNA的特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列；所述特定转录本为蛋白质phd11的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子；“特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列可以编码精氨酸”的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育；“特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列仅编码谷氨酰胺”的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。

本发明所保护的预测待测玉米雄性育性的方法，具体可为S3)：检测待测玉米总DNA中蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第1988位的核苷酸种类；“蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第1988位的核苷酸种类含有G”的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育；“蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第1988位的核苷酸种类仅为A”的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。所述蛋白质phd11的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。

本发明还保护B1)或B2)或B3)。

B1)蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类作为检测对象在预测待测玉米雄性育性中的应用。所述蛋白质phd11的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。

B2)特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列作为检测对象在预测待测玉米雄性育性中的应用；所述特定转录本为所述蛋白质phd11的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子。

B3)蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第1988位的核苷酸种类作为检测对象在预测待测玉米雄性育性中的应用。所述蛋白质phd11的氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示。

本发明还保护物质甲、物质乙或物质丙在预测待测玉米雄性育性中的应用。

所述物质甲可为用于检测所述蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类的物质。

所述物质乙可为用于检测特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列的物质；所述特定转录本为所述蛋白质phd11的编码基因转录得到的RNA，其第1个密码子为起始密码子。

所述物质丙可为用于检测所述蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第1988位的核苷酸种类的物质。

本发明还保护成套产品甲、成套产品乙或成套产品丙在预测待测玉米雄性育性中的应用。

所述成套产品甲可为所述物质甲和记载有方法甲的载体；

所述方法甲可为：“蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类含有精氨酸”的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育；“蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类仅为谷氨酰胺”的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。

所述成套产品乙可为所述物质乙和记载有方法乙的载体；

所述方法乙可为：“特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列可以编码精氨酸”的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育；“特定转录本中第396个密码子的核苷酸序列仅编码谷氨酰胺”的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。

所述成套产品丙可为所述物质丙和记载有方法丙的载体；

所述方法丙可为：“蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第396位的核苷酸种类含有G” 的待测玉米的雄性育性为或疑似为可育；“蛋白质PHD11的编码基因自5’末端起第1988位的核苷酸种类仅为A”的待测玉米的雄性育性为或疑似为不育。

实验证明，蛋白质PHD11自N末端起第396位的氨基酸残基种类可以作为检测对象，预测待测玉米雄性育性。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为玉米突变体phd11-d的表型鉴定结果。A为野生型；B为玉米突变体phd11-d；C为野生型雄穗；D为玉米突变体phd11-d雄穗；E为野生型花药，Bar＝0.5mm；F为玉米突变体phd11-d花药，Bar＝0.5mm；G为野生型可育花粉，I2-KI染色；H为玉米突变体phd11-d 不育花粉，I2-KI染色。

图2为野生型和玉米突变体phd11-d不同发育时期花药半薄切片观察结果。A-C、G-I为野生型；D-F、J-L为玉米突变体phd11-d。A和G为stage 8a；B和H为stage 8b；C和I 为stage 9；G和J为stage 10；H和K为stage 11；I和L为stage 12。DMsp为降解的小孢子(degenerated microspores)；Ep为表皮层(epidermis)；En为内皮层(endothecium)； ML为中间层(middle layer)；Mp为成熟花粉(mature pollen)；Msp为小孢子(microspore)； T为绒毡层(tapetum)，Tds为四分体(tetrads)。Bars＝50μm。

图3为Phd11基因克隆和基因结构。A为Phd11基因的定位；B为Phd11基因结构；C为玉米突变体phd11-d突变位点；D指示phd11-d突变位点在被子植物的基因家族中保守性为100％。

图4为phd11-Mu突变体的等位测验表型。A为野生型植株；B为phd11-mu突变体；C为野生型雄穗；F为phd11-mu突变体雄穗；D为野生型花药；G为phd11-mu突变体花药；E为野生型可育花粉，I2-KI染色；H为phd11-mu突变体败育花粉，I2-KI染色。

图5为玉米突变体phd11-d与phd11-mu等位测验后代分离群体表型统计结果。

图6为Phd11基因组织表达模式分析。A为Phd11基因qRT-PCR分析，Mean±SD(n＝3)； B-G为Phd11基因在野生型不同发育时期花药中的原位杂交；B为Stage 6；C为Stage 7；D 为Stage 8a；E为Stage 10；F为Stage 11；G为PHD11正义探针杂交，Stage 8a。B-F为反义探针，用以直接检测基因表达；G中的正义探针作为对照使用；H-J为S5、S8b和S11时期用正义探针在花药切片中没有检测到表达信号。Msp为小孢子(microspore)；T为绒毡层(tapetum)；Tds为四分体(tetrads)。Bar＝50μm。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

本发明的发明人在大量田间实验过程中，发现了玉米雄性不育突变体phd11-d。玉米雄性不育突变体phd11-d已于2021年01月07日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：中国武汉武汉大学)，保藏编号为CCTCC NO：P202110。玉米雄性不育突变体phd11-d 的全称为玉米雄性不育突变体phd11-d CCTCC NO：P202110，简称玉米突变体phd11-d。

phd11-mu突变体为美国种质资源库(https://maizecoop.cropsci.uiuc.edu/request/) 保存，编号为UFMu-09590.。

实施例1、与玉米雄性核不育相关的Phd11基因的图位克隆

一、玉米突变体phd11-d的表型鉴定

1、观察玉米突变体phd11-d(以下简称突变体)和玉米自交系B73(以下简称野生型) 的表型。

结果表明，玉米突变体phd11-d和玉米自交系B73的营养生长状态无显著差异(见图1 中A和B)；散粉期，玉米突变体phd11-d的花药不能自然开裂(见图1中C和D)；通过显微解剖，发现玉米突变体phd11-d花药出现严重的萎缩(见图1中E和F)。

2、花药育性鉴定

取玉米突变体phd11-d或玉米自交系B73的花药，碾碎(目的为获得花粉粒)，用1％I2-KI 溶液染色。

结果表明，玉米自交系B73的花粉粒为黑色且饱满，玉米突变体phd11-d的花粉粒未被染成黑色且不规则(不是饱满状态)(见图1中G和H)。玉米突变体phd11-d表现完全的雄性不育。

3、本发明的发明人用玉米自交系Mo17玉米自交系B73的花粉对玉米突变体phd11-d的雌穗进行授粉，玉米突变体phd11-d的结实率正常。

由此可见，玉米突变体phd11-d的雌性育性正常。

4、本发明的发明人将玉米突变体phd11-d分别在北京和海南种植，观察雄性育性。

结果表明，无论在北京还是在海南，玉米突变体phd11-d均为雄性不育。由此可见，玉米突变体phd11-d的雄性不育表型表型稳定，不受环境影响。

5、为了进一步观察玉米突变体phd11-d为何具有雄性不育表型，本发明的发明人用半薄切片分别对玉米突变体phd11-d和玉米自交系B73S8a-S12期的花药进行观察。

观察结果见图2。结果表明，在S8b期(图2中E)，玉米突变体phd11-d开始出现异常，主要表现为绒毡层液泡化，四分体胼胝层增厚；S9期花粉囊内释放出野生型小孢子(图2中C)，而玉米突变体phd11-d小孢子不能正常形成(图2中F)，表现为液泡化，绒毡层空泡化较严重；在S10时，野生型绒毡层显著降解(图2中G)，小孢子液泡化，玉米突变体phd11-d 绒毡层降解不显著，小孢子液泡化异常(图2中J)；S11期，野生型花粉形成，绒毡降解(图 2中H)，玉米突变体phd11-d的异常小孢子被降解成碎片，绒毡层保持完整(图2中K)； S12期，野生型花粉粒充满淀粉，绒毡层几乎完全降解(图2中I)，玉米突变体phd11-d小孢子几乎完全降解，但绒毡层仍存在(图2中L)。

上述结果表明，玉米突变体phd11-d中造成其雄性不育表型可能是由于Phd11基因参与绒毡层发育，从而影响小孢子的发育过程。

二、玉米突变体phd11-d遗传分析及与玉米雄性核不育相关的Phd11基因的图位克隆

为了鉴定控制雄性不育表型的突变基因，采用图位克隆策略。具体如下：

1、本发明的发明人用玉米自交系B73的花粉对玉米突变体phd11-d的雌穗进行授粉，获得F1代种子。

2、种植F1代种子，自交，获得F2群体。

3、将F2群体中的212个不育株，根据分子标记连锁分析，在第5染色体IDP1和SNP2之间的1.05Mb区域定位了Phd11基因位点(见图3中A)。在该区域发现了拟南芥雄性不育基因MMD1/Phd11的同源基因GRMZM2G408897。GRMZM2G408897基因有三个外显子，全长3279bp(图3中B)。

4、对玉米突变体phd11-d和玉米自交系B73的GRMZM2G408897基因进行全长测序。比较测序结果，发现玉米突变体phd11-d与玉米自交系B73的GRMZM2G408897基因之间存在很多 SNPs。

由于GRMZM2G408897基因序列较长，分为四个片段扩增并测序。扩增四个片段的引物对具体如下：

97-1-f：5’-TCGCACCTTCACTCGCAAG-3’，97-1-r：5’-CGCATTTCTCAACAGGTAGCA-3’；

97-2-f：5’-CTCTGTGTGATTTATGGGCTT-3’，97-2-r：5’-GAAACTCGCGGACTGTAACCA-3’；

97-3-f：5’-GTCTCCGTAGTCGTCATGTCC-3’，97-3-r：5’-GCCCAGTCTCCATGTCAGC-3’；

97-4-f：5’-GAATTTCCAGGCCGAGTCAC-3’，97-4-r：5’-ACAACTGCACACTAATGGCAA-3’。

5、进一步，比较玉米突变体phd11-d和玉米自交系B73的GRMZM2G408897基因编码的氨基酸序列。

结果表明，与玉米自交系B73相比，玉米突变体phd11-d从第三个外显子开始的第513 个碱基对处有一个非常保守的碱基G突变为A，导致氨基酸R突变为Q(该位点的氨基酸在 90个被子植物成员中为R (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！showCluster？search＝1&detail＝0&me thod＝5197&searchtext＝clusterID:93520786)(见图3中C和D)。

由此认为由于这个保守的氨基酸突变，最终导致了玉米突变体phd11-d的突变表型，推测GRMZM2G408897基因即为要克隆的Phd11基因。

玉米自交系B73中，Phd11基因的全长如SEQ ID NO:2所示，编码区如SEQ ID NO:3所示。Phd11基因编码Phd11蛋白，Phd11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

实施例2、玉米Phd11基因等位测验

为了进一步证明确认玉米突变体phd11-d的表型由Phd11基因突变导致，本发明的发明人研究了phd11-mu突变体。phd11-mu突变体的全称为phd11-mu(Mu1081314::Mu)，也是一个雄性不育系。

1、观察phd11-mu突变体和玉米自交系B73的表型。

结果表明，phd11-mu突变体和玉米自交系B73(以下简称野生型)的营养生长状态无显著差异(见图4中A和B)；散粉期，phd11-mu突变体的花药不能自然开裂(见图4中C和F)；通过显微解剖，发现phd11-mu突变体花药出现严重的萎缩(见图4中D和G)。

2、花药育性鉴定

取phd11-mu突变体或玉米自交系B73的花药，碾碎(目的为获得花粉粒)，用1％I2-KI 溶液染色。

结果表明，玉米自交系B73的花粉粒为黑色且饱满，phd11-mu突变体的花粉粒未被染成黑色且不规则(不是饱满状态)(见图4中E和H)。phd11-mu突变体表现完全的雄性不育。

3、按照实施例1步骤二中4的方法对phd11-mu突变体的GRMZM2G408897基因进行全长测序。

结果表明，Mu转座子插入在phd11-mu第三外显子起始的第93个碱基对处。

4、用杂合的phd11-mu植株(+/phd11-mu)与杂合的phd11-d植株(+/phd11-mu)杂交，得到的分离群体出现了3:1育性分离(雄性可育：雄性不育＝58:22，χ2＝0.27<χ2(0.05，1) ＝3.84)，符合孟德尔分离规律(见图5)。

等位基因测试确认phd11-mu与phd11-d是等位基因，验证了GRMZM2G408897基因(即 Phd11基因)与玉米突变体phd11-d的雄性不育表型有关。

上述结果表明，玉米突变体phd11-d的雄性不育表型是由GRMZM2G408897基因(即Phd11 基因)突变导致的。

实施例3、玉米Phd11基因在各器官中的表达分析

1、提取玉米自交系B73组织(根、茎、叶、叶耳、雄穗、1.0-1.5mm的花药、1.5-2.0mm的花药、2.0-2.5mm的花药、2.5-3.0mm的花药、大于3.0mm的花药、授粉后3天的籽粒、授粉后6天的籽粒或授粉后9天的籽粒)的RNA，之后反转录，得到玉米自交系B73组织的cDNA。

2、以玉米自交系B73组织的cDNA为模板，实时荧光定量PCR检测PHD11基因的相对表达水平(以玉米Action为内参)。

用于检测PHD11基因的引物为5’-TCTCTGTCGCTGCGCCGGTTG-3’和5’-GGAGCCACCAACACGACCA-3’。

用于检测玉米Action的引物为5’-GAGATGCCTGATGGTCAGGTCA-3’和 5’-AGTTGTACGTGGCCTCATGGAC-3’。

检测结果见图6中A。结果表明，Phd11基因在授粉后的籽粒中表达较高，表现为授粉后 3天最高，6天时表达量下降，到第9天下降到较低的程度，故PHD11基因在籽粒初始形成时表达量较高，随着籽粒的发育表达量慢慢下降；Phd11基因在根、叶片、叶耳、雄穗组织中表达很低；随着花药发育的进行，Phd11基因表达量逐步升高，在2.0-2.5mm的花药中达到最高，随后开始下降。

3、采用RNA原位杂交技术检测Phd11蛋白在花药不同组织中的表达分布。

正义探针为：

INPHD11_1F_T7：TAATACGACTCACTATAGGG CCTGTTGATTGTCTCCGTA；

INPHD11_1R：ATTTGCAGCACTAAGCAGA。

反义检测探针为：

INPHD11_2F：CCTGTTGATTGTCTCCGTA；

INPHD11_2R_SP6：ATTTAGGTGACACTATAGATTTGCAGCACTAAGCAGA。

检测结果表明，Phd11蛋白最初主要在S6期(MMC)的小孢子母细胞中表达(图6C)，然后在S8b期至S11期的绒毡层和小孢子中检测到强表达信号(图6D-G)；而且，在S5， S8b和S11(图6中H-J)，用正义探针在花药切片中没有检测到表达信号。这种表达模式完全支持Phd11蛋白在绒毡层发育和花粉形成中的特定作用。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110>中国农业大学

<120>蛋白质phd11、其编码基因以及它们在选育玉米雄性不育系中的应用

<160>3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 689

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Pro Ser Arg Arg Ala Leu Arg Arg Ser Pro Pro Pro Arg Gln Ser

1 5 10 15

Pro Gln Ala Ala Ala Asp Ala Lys Glu Ala Ala Ser Pro Trp Leu Pro

20 25 30

Ser Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ala Ser Ala Leu Val

35 40 45

Arg Arg Ser Ala Ala Phe Ser Ala Ala Gly Pro Arg Gly Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Arg Val Tyr Pro Leu Arg Asp Phe Pro Gly Gly Asp Ala Ala Ala

65 70 75 80

Leu Gly Gly Ala Phe Arg Asp Asn Val Arg Trp Leu Leu Lys Gln Trp

85 90 95

Ser Cys Val Pro Gly Ser Val Ser Ala Trp Arg Ala Leu Leu Ser Asp

100 105 110

Glu Arg Thr Gly Ala Leu Val Pro Val Ile Ala Val Glu Glu Leu Ala

115 120 125

Ala Ser Ser Pro Leu Pro Leu Cys Asp Leu Cys Arg Cys Ala Gly Trp

130 135 140

Ser His His Trp Val Ser Lys Arg Lys Tyr His Phe Ile Ile Pro Ala

145 150 155 160

Val Val Asp Trp Asp Gln Pro Phe Arg Ala Asp Gly Leu Leu Gly His

165 170 175

Ser Glu His Leu Leu His Gly Leu Ile His Ser Asn Gly Phe Gly His

180 185 190

Leu Leu Thr Leu Arg Gly Arg Val Gly Gly Ser Thr Phe Leu Ser Gly

195 200 205

Cys Gln Ile Met Asp Ile Trp Asp Gln Leu Cys Thr Ala Leu Arg Val

210 215 220

Arg Ala Val Ser Val Val Asp Leu Thr Gln Lys Tyr Ser Val Asp Leu

225 230 235 240

Arg Leu Leu Leu Gly Val Ala Gln Ser Lys Thr Trp Phe Thr Arg Trp

245 250 255

Gly Tyr Cys Leu Ala Lys Gly Cys Phe Ser Val Ser Arg Ser Thr Tyr

260 265 270

Thr Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ala Ala Leu Pro Val Asp Cys Leu Arg

275 280 285

Ser Arg His Val Arg Arg Val Val Thr Ile Tyr Arg Arg Leu Ser Ser

290 295 300

Lys Pro Leu Val Thr Val Arg Glu Phe Leu Leu Cys Leu Leu Asp Trp

305 310 315 320

Lys His Arg Glu Pro Pro Leu Ser Pro Pro Pro Val Lys Ala Ser Ser

325 330 335

Arg Leu Met Phe Leu Leu Pro Lys Ser Cys Met Met Lys Arg Pro Arg

340 345 350

Gln Pro Cys Gln Arg Phe Glu Asp Val Val Asp Leu Leu Glu Cys Arg

355 360 365

Trp Ser Lys Lys Arg Leu Leu Ser Ala Ala Asn Val Val Val Ala Lys

370 375 380

Leu Arg Glu His Ala Asp Gly Thr Lys Ile Thr Arg Gln Ala Val Arg

385 390 395 400

Asp Ala Ala Arg Gly Gly Ile Gly Asp Thr Gly Leu Leu Asp Phe Val

405 410 415

Ile Lys Ser Leu Asn Asn Thr Val Val Gly Asn His Ile Val Arg Arg

420 425 430

Val Pro Asp Pro Glu Asn Arg Val Leu His Phe Ser Leu Glu Glu Tyr

435 440 445

Ala Glu Pro Glu Pro Gln Pro Gln Ala Asp His Glu Leu Glu Pro Val

450 455 460

Glu Leu Asp Ala Glu Asn Thr Pro Pro Ala Val Arg Trp Pro Asn Ala

465 470 475 480

Ala Glu Ala Glu Arg Asp Leu Arg Ala Val Tyr Arg Ala Met Val Gly

485 490 495

Ala Arg Ser Glu Ala Ala Gln Ala Val Leu Asp Cys Lys His Trp Val

500 505 510

Lys Trp Trp Gly Leu Arg Asp Glu Ser Asp Asp Gln Leu Arg Phe Leu

515 520 525

Val Glu Trp Arg Pro Gln Pro Trp Glu Ala Thr Glu Leu Thr Arg Pro

530 535 540

Met Pro Pro Gly Asp Ile Val Val Val Pro Leu His Ala Ser Ile Gly

545 550 555 560

Glu Leu Leu Val Glu Ala Glu His Ala Leu Arg Asp Thr Tyr Cys Phe

565 570 575

Phe Glu Asn Phe Gln Ala Glu Ser Leu Asp Gly Ile Thr Gly Asp Lys

580 585 590

Trp Asp Pro Val Met Leu Gly Gly Ala Glu Ser Gly Asp Thr Ile Gly

595 600 605

Val His Gly His Gly Ala Asp Met Glu Thr Gly Leu Arg Cys Gln Gly

610 615 620

Gly Ala Asp Ala Trp Glu Val Gln Cys Val Cys Gly Ala Gln Asp Asp

625 630 635 640

Asp Gly Glu Arg Met Val Ala Cys Asp Ala Cys Asn Val Trp His His

645 650 655

Thr Arg Cys Val Gly Ile Ala Asp Gly Ala Pro Val Pro Pro Leu Phe

660 665 670

Leu Cys Ile Ser Cys Ser Gly Ala Leu Met Ala Ala Gly Pro Ile Ser

675 680 685

Gly

<210> 2

<211> 3279

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgccgtcca ggcgcgcgct acggcggtct ccgccgccac gacagagccc gcaggcagcg 60

gcggacgcga aggaggcggc gagcccgtgg ctaccgtcct catcctccac ctcgtcgtct 120

tcctcctcag cctccgcgct cgtcaggcgc tccgccgcct tctcggcggc tgggccgagg 180

ggcggatcgg ggacgcgcgt gtacccgttg cgggacttcc cgggcgggga cgcggccgcg 240

ctcggcggtg cgttccggga caacgtgcgg tggctcctga agcagtggag ctgcgttccg 300

ggttccgtgt cggcgtggcg cgcgctgctg tcagacgagc ggacgggcgc cttagtcccc 360

gtcatcgccg tggaggagct cgcggcatcg tcgcccttgc cgctctgcga tctctgtcgc 420

tgcgccggtg agttggcttc gcttccctgg gccatcatcg cttatttggg cgcaacacgc 480

gcctgtttcg ttcgtggggt tttgaacgct tgatggatgc gcggattagg ttttaatcgg 540

gagttcttcc cgatttttgc tgattctttg ggtggattag tagaactgtt gttataaatg 600

ctccgtctct gtgtgattta tgggcttcgt gatcttagag agattcttgg gattctttgg 660

gggatatttt tcagtaatag ttacttgcaa ttattgttgc tacctgttga gaaatgcgct 720

gaatgagagt taaaaatact cctaattctg attacataca atttgggggt gaacaatagg 780

aattgcattt ctgttcaaca ttcttgcact tatgaccgtt attttcctct gcgcaattgc 840

caggaattga cgaccccatg ttgcttgttt caaattattt taaaccactt ccaaaaatac 900

caatgcagtt atgatggtgg tccctagcct cttaaagttt ctttcttctt ctggaaaaga 960

tgttgtttcg tgcattgatt tacttcctac tagttgtgtg aatgccaact caccagtggt 1020

cgaaataagt acatgatctg gaccgcaatt tcaggttgga gccaccactg ggtgtcaaag 1080

cggaagtacc atttcatcat tccggcagtg gtcgactggg accagccatt cagggctgat 1140

gggttacttg ggcacagcga gcacctccta catggtctga tccatagtaa tggctttggt 1200

caccttctca ccctccgtgg tcgtgttggt ggctccactt tcctctctgg ctgccagatc 1260

atggatatat gggatcaact ttgcacagct ctccgtgtaa ggtaacaata tactcttccc 1320

tgttcagaaa tactcttcag taagtacctg ttagctagct gtggtttaag tacactagca 1380

aattctgaac tttggtaact tcatgaacgc tgtaaactcg agaaagataa ttcaccttgt 1440

ttctatcttc tgagctttgg aaggtttctg tgcagagccg tctctgttgt ggacttgacc 1500

cagaagtact ctgtggacct ccgcctcctg cttggagtgg cacaaagcaa gacttggttc 1560

actcgctggg ggtactgcct tgccaagggt tgtttcagcg tgtctaggtc cacttatact 1620

gctgcacttg aagcccttgc tgccctgcct gttgattgtc tccgtagtcg tcatgtccgt 1680

cgtgtggtca ccatctaccg ccgcctctcc agcaaacctc tggttacagt ccgcgagttt 1740

ctcctctgcc tgcttgattg gaagcaccgt gagcccccgc tttctcctcc tcccgtgaag 1800

gcatcctcgc ggctgatgtt cttgctgcca aagtcatgta tgatgaagag gcccaggcag 1860

ccatgtcaac gctttgagga cgtagttgac ctgcttgagt gtcggtggtc aaagaagcgt 1920

ctgcttagtg ctgcaaatgt tgttgttgca aagctgcgag agcatgcgga tggcacaaag 1980

ataacacggc aagcagtgcg agatgctgca aggggtggca tcggtgacac tggtctcctg 2040

gacttcgtca tcaagtccct caataacact gttgttggta accacattgt gcgccgcgtg 2100

cctgaccctg agaatcgtgt gcttcacttc agccttgagg aatatgctga gcctgagcca 2160

cagccacagg cagatcatga gcttgaacca gtggaacttg atgcagagaa cacccctcct 2220

gcagtccgat ggccaaacgc agccgaggcg gagcgggatc tgcgtgctgt gtaccgagca 2280

atggtggggg cacgcagtga agcagcacag gctgtactgg actgcaagca ctgggtgaaa 2340

tggtggggcc tcagggacga gtctgatgac cagctaaggt tccttgttga gtggcgacca 2400

cagccatggg aggctactga acttacaagg ccaatgccgc ctggggatat tgtggtagta 2460

ccactgcatg catccatagg cgagctgctt gttgaggcag agcatgcact gagggataca 2520

tactgcttct ttgagaattt ccaggccgag tcactggatg gcattactgg ggataaatgg 2580

gatccggtga tgcttggtgg agcagagtct ggtgacacca ttggtgtgca cggccacgga 2640

gctgacatgg agactgggct gcggtgccag ggaggtgcag atgcgtggga ggtgcagtgc 2700

gtttgtggtg cacaggacga cgatggggag cgcatggtgg catgcgatgc atgcaatgtc 2760

tggcaccata cacgctgtgt cggcattgca gatggtgctc cggtgccacc attgtttctc 2820

tgcatatcct gcagtggcgc gctaatggcc gctggaccaa tttctggatg agacactaac 2880

ggtacctgaa gttaagtgac aattcttttg cacctttttc agttcatgcc tgacaggtag 2940

gtgtctgact agtaaaccag atactattga gacctcgtgt gtaaagtgcg ttgctgtagt 3000

agtatgtgat gagtttagta acgatggagt aataccgaat gctatctgta ctaagtcgac 3060

tagtcgtagt agagtagaga ggattaggca gtagaaaggg aagcactatc cttgtcgtta 3120

gcaatccgac tggaaatttt gtacatggac atattacaga atagacgcgg taaatagctg 3180

tcctgtgatt tgcgcctttc taccgtctgt gaatcttggc aacgaagttt aacttgttca 3240

ttgtgttata agaatttatt tattgtgaga caaaacaag 3279

<210> 3

<211> 2070

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

atgccgtcca ggcgcgcgct acggcggtct ccgccgccac gacagagccc gcaggcagcg 60

gcggacgcga aggaggcggc gagcccgtgg ctaccgtcct catcctccac ctcgtcgtct 120

tcctcctcag cctccgcgct cgtcaggcgc tccgccgcct tctcggcggc tgggccgagg 180

ggcggatcgg ggacgcgcgt gtacccgttg cgggacttcc cgggcgggga cgcggccgcg 240

ctcggcggtg cgttccggga caacgtgcgg tggctcctga agcagtggag ctgcgttccg 300

ggttccgtgt cggcgtggcg cgcgctgctg tcagacgagc ggacgggcgc cttagtcccc 360

gtcatcgccg tggaggagct cgcggcatcg tcgcccttgc cgctctgcga tctctgtcgc 420

tgcgccggtt ggagccacca ctgggtgtca aagcggaagt accatttcat cattccggca 480

gtggtcgact gggaccagcc attcagggct gatgggttac ttgggcacag cgagcacctc 540

ctacatggtc tgatccatag taatggcttt ggtcaccttc tcaccctccg tggtcgtgtt 600

ggtggctcca ctttcctctc tggctgccag atcatggata tatgggatca actttgcaca 660

gctctccgtg taagagccgt ctctgttgtg gacttgaccc agaagtactc tgtggacctc 720

cgcctcctgc ttggagtggc acaaagcaag acttggttca ctcgctgggg gtactgcctt 780

gccaagggtt gtttcagcgt gtctaggtcc acttatactg ctgcacttga agcccttgct 840

gccctgcctg ttgattgtct ccgtagtcgt catgtccgtc gtgtggtcac catctaccgc 900

cgcctctcca gcaaacctct ggttacagtc cgcgagtttc tcctctgcct gcttgattgg 960

aagcaccgtg agcccccgct ttctcctcct cccgtgaagg catcctcgcg gctgatgttc 1020

ttgctgccaa agtcatgtat gatgaagagg cccaggcagc catgtcaacg ctttgaggac 1080

gtagttgacc tgcttgagtg tcggtggtca aagaagcgtc tgcttagtgc tgcaaatgtt 1140

gttgttgcaa agctgcgaga gcatgcggat ggcacaaaga taacacggca agcagtgcga 1200

gatgctgcaa ggggtggcat cggtgacact ggtctcctgg acttcgtcat caagtccctc 1260

aataacactg ttgttggtaa ccacattgtg cgccgcgtgc ctgaccctga gaatcgtgtg 1320

cttcacttca gccttgagga atatgctgag cctgagccac agccacaggc agatcatgag 1380

cttgaaccag tggaacttga tgcagagaac acccctcctg cagtccgatg gccaaacgca 1440

gccgaggcgg agcgggatct gcgtgctgtg taccgagcaa tggtgggggc acgcagtgaa 1500

gcagcacagg ctgtactgga ctgcaagcac tgggtgaaat ggtggggcct cagggacgag 1560

tctgatgacc agctaaggtt ccttgttgag tggcgaccac agccatggga ggctactgaa 1620

cttacaaggc caatgccgcc tggggatatt gtggtagtac cactgcatgc atccataggc 1680

gagctgcttg ttgaggcaga gcatgcactg agggatacat actgcttctt tgagaatttc 1740

caggccgagt cactggatgg cattactggg gataaatggg atccggtgat gcttggtgga 1800

gcagagtctg gtgacaccat tggtgtgcac ggccacggag ctgacatgga gactgggctg 1860

cggtgccagg gaggtgcaga tgcgtgggag gtgcagtgcg tttgtggtgc acaggacgac 1920

gatggggagc gcatggtggc atgcgatgca tgcaatgtct ggcaccatac acgctgtgtc 1980

ggcattgcag atggtgctcc ggtgccacca ttgtttctct gcatatcctg cagtggcgcg 2040

ctaatggccg ctggaccaat ttctggatga 2070

Claims

1.蛋白质phd11在调控玉米雄性育性中的应用；

所述蛋白质phd11为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

a2）在SEQ ID NO:1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码权利要求1中所述蛋白质phd11的核酸分子在调控玉米雄性育性中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述编码权利要求1中所述蛋白质phd11的核酸分子为b1）或b2）或b3）所示的DNA分子：

b1）编码区是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

b3）核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在调控玉米雄性育性中的应用。

5.蛋白质phd11在选育玉米雄性不育系和/或玉米雄性不育保持系中的应用；

所述蛋白质phd11为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

6.编码权利要求5中所述蛋白质phd11的核酸分子在选育玉米雄性不育系和/或玉米雄性不育保持系中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述编码权利要求5中所述蛋白质phd11的核酸分子为b1）或b2）或b3）所示的DNA分子：

b1）编码区是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

b2）核苷酸序列是SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

b3）核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的DNA分子。

8.含有权利要求6或7中所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物在选育玉米雄性不育系和/或玉米雄性不育保持系中的应用。

9.一种玉米雄性不育系的选育方法，为抑制雄性可育玉米表达蛋白质phd11，获得转基因玉米；所述转基因玉米即为玉米雄性不育系；

所述蛋白质phd11为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；

10.一种玉米雄性不育保持系的选育方法，为使雄性不育玉米表达蛋白质phd11，获得转基因玉米；所述转基因玉米即为玉米雄性不育保持系；所述雄性不育玉米的不育性状是由于表达蛋白质phd11的能力丧失或降低引起的；

所述蛋白质phd11，为如下a1）或a2）：

a1）氨基酸序列是SEQ ID NO:1所示的蛋白质；