CN114685634A

CN114685634A - 一种调控结实率的基因及其应用

Info

Publication number: CN114685634A
Application number: CN202011613796.XA
Authority: CN
Inventors: 韩斌; 刘坤; 陈二旺; 戴冰馨; 顾周林; 王阿红
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本发明涉及一种调控结实率相关基因及其应用。本发明提供一种调控植物结实率的方法，所述方法包括调节植物中PSSR1基因的表达。

Description

一种调控结实率的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种植物结实率的调控基因及其应用。

背景技术

对于水稻，单株有效穗数、每穗粒数、千粒重以及结实率是产量的四大构成要素，解析这些重要性状的分子遗传机制，一直是人们的研究重点。目前对粒重、穗粒数、有效分蘖数等产量性状的调控基因及机理都有了比较深入的研究。水稻从种子萌发至新种子的形成包含了营养生长期和生殖生长期。生殖生长期包括水稻花的诱导、幼穗的发育、性细胞的形成、开花、授粉与受精直至结实。在生殖生长阶段，雌雄配子体的正常发育及有效地传粉受精才能保证水稻正常的结实，其中任意一个环节出现异常都会影响水稻结实率，甚至造成完全不育。水稻的结实率不仅仅受到基因的遗传调控，也极易受到外界因素的影响。影响水稻结实率的外界环境因素主要包括温度、光照、水分等，目前关于各种外界因素对于水稻结实率的影响研究报道也很多。

水稻是原始的粮食作物中发现最多、持续时间最长的一种农作物。水稻驯化的实质是对驯化性状控制基因的选择。目前，利用野生稻(Orzya rufipogon)和亚洲栽培稻(O.sativa)的基因组信息及数量性状基因座(QTL)分析，已经定位并克隆了很多与驯化性状相关的基因。此外，一些水稻与驯化性状包括落粒性、株型、种子化眠、种皮颜色等相关的基因也相继被克隆。水稻结实率是水稻产量的重要构成要素。总体上，野生稻种质资源的结实率普遍偏低，而栽培稻的结实率明显提高，推测水稻驯化过程中对于结实率的选择也是驯化选择的重要内容。

虽然有关结实率QTL鉴定的报道很多，对于直接控制水稻结实率的主效QTL、相关基因克隆和功能还鲜有详细报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结实率的调控基因及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调控植物结实率和/和/或产量的方法，所述方法包括：调节植物中PSSR1基因的表达。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括调控OsPMS1和/或OsMLH3基因的表达。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。

在一个或多个实施方案中，所述水稻包括籼稻、粳稻、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因来自禾本科植物，优选来自水稻。在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因编码：

(a)具有如SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)限定的多肽序列有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个优选地1-30，更优选地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个优选实施方案中，所述调控植物结实率和/和/或产量的方法包括：上调植物中PSSR1基因的表达；从而增加结实率。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中PSSR1基因的表达包括：将PSSR1基因或针对PSSR1基因中插入序列的敲除、编辑或转座载体转入植物，获得转化的植物。所述载体将插入序列删除。

在一个或多个实施方案中，所述插入序列位于PSSR1编码序列(例如SEQ ID NO:2)的第271位处。

在一个或多个实施方案中，所述插入序列如SEQ ID NO:3所示。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中PSSR1基因的表达的方法包括：

(1)提供携带可上调基因表达的载体的农杆菌，所述的载体选自下组：

(a)PSSR1基因的表达载体，和

(b)针对PSSR1基因中插入序列的敲除、编辑或转座载体；

(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中PSSR1基因的表达的方法还包括：

(3)选择出转入了所述载体的植物组织、器官或种子；和

(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在另一优选实施方案中，所述调控植物结实率和/和/或产量的方法包括：下调植物中PSSR1的表达；从而降低结实率。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中PSSR1基因的表达包括：将下调PSSR1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的下调剂转入植物中。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是特异性干扰PSSR1基因转录和/或表达的抑制分子。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以PSSR1基因或其转录本作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SEQ ID NO:1或2作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述的抑制分子是以PSSR1基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA、sgRNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA、sgRNA的构建物；优选地，所述的抑制分子是以SEQ ID NO:2或其转录本作为沉默靶标的抑制分子，例如dsRNA或构建物。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子是以SEQ ID NO:2作为靶标的sgRNA。优选地，所述sgRNA如SEQ ID NO:4或5所示。

在一个或多个实施方案中，所述下调剂还包含Cas酶(例如Cas9)、其编码序列、和/或表达所述Cas酶的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中PSSR1基因的表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的载体的农杆菌，所述含有或产生所述抑制分子；

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中PSSR1基因的表达的方法还包括：

(iii)选择出转入了所述载体的植物组织、器官或种子；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

本发明还提供一种物质的用途，所述物质选自下组：PSSR1基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的结实率和/或产量。

在一个或多个实施方案中，所述物质为PSSR1基因或其编码蛋白、或其促进剂，并且所述调控植物的结实率和/或产量是增加结实率和/或产量。

在一个或多个实施方案中，所述物质为PSSR1基因的抑制剂，并且所述调控植物的结实率和/或产量是降低结实率和/或产量。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂是针对PSSR1基因中插入序列的敲除、编辑或转座载体。所述载体将插入序列删除。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂是PSSR1基因中不含插入序列的互补载体。

在一个或多个实施方案中，所述插入序列如SEQ ID NO:3所示。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因来自禾本科植物，优选来自水稻。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因的氨基酸序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种PSSR1基因的用途，用于作为鉴定植物结实率和/或产量的分子标记。

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供一种复合物，所述复合物为PSSR1蛋白结合于OsPMS1和/或OsMLH3蛋白所形成的复合物。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1蛋白来自水稻。

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1蛋白的氨基酸序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

本发明还提供一种表达PSSR1基因的表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、PSSR1基因的ORF序列、和终止子，

在一个或多个实施方案中，所述5’UTR区如SEQ ID NO:6所示。

在一个或多个实施方案中，PSSR1基因的ORF序列编码：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述PSSR1基因的ORF序列包含选自以下的核酸序列：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供核酸构建物，其包含本文所述的表达盒或其互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。

本发明还提供宿主细胞，其(1)包含核酸构建物，所述核酸构建物包含本文所述的表达盒或其互补序列，或(2)染色体中整合有本文所述的表达盒。

在一个或多个实施方案中，所述的宿主细胞为植物细胞，优选为禾本科植物细胞，更优选为水稻细胞。

本发明还提供了本文所述的表达盒的用途，用于改良作物的选自下组的农艺性状：结实率和/或产量。

本发明还提供靶向PSSR1基因的抑制分子或能产生所述抑制分子的核酸构建物。

附图说明

图1是水稻结实率QTL的LOD曲线图。

图2是PSSR1精细定位图。

图3是GLA4和NIL-PSSR1植株中PSSR1位点及附近7个基因的表达量比较。

图4是PSSR1单倍型及关联分析。A，GLA4和NIL中基因结构差异比较。基因编码区用黑色矩形框表示；B，113份水稻材料中PSSR1基因单倍型分析；C，不同单倍型的结实率情况；D，三类启动子的活性比较。

图5是GLA4中PSSR1敲除株系和NIL-PSSR1中PSSR1互补转基因育性鉴定。A，PSSR1敲除后的突变基因型；B，GLA4，NIL-PSSR1，CP-PSSR1和CR-PSSR1转基因株系植株及花粉育性表型；C，GLA4，NIL-PSSR1，CP-PSSR1和CR-PSSR1转基因株系穗子表型及结实率统计。

图6是GLA4和NIL-PSSR1减数分裂和胚囊发育情况比较。A，GLA4和NIL-PSSR1花粉母细胞减数分裂比较；B，GLA4和NIL-PSSR1胚囊发育比较。

图7是PSSR1在水稻原生质体中的亚细胞定位。A，35S::GFP作为正对照；B，PSSR1定位。

图8显示PSSR1与OsPMS1和OsMLH3互作。

具体实施方式

发明人首次揭示通过在禾谷类植物(作物)中定向调控PSSR1基因表达水平，可显著调节植物的结实率，进而达到改良禾谷类作物、增加产量等目的。

如本文所用，“禾谷类作物”可以是禾本科植物或有芒植物(作物)。优选地，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。有芒植物是指种子壳上存在针状物植物。如本文所用，术语“农作物”或“作物”没有特别的限制，包括但不限：水稻、小麦、大麦等。

如本文所用，PSSR1基因编码的多肽命名为“PSSR1”。在本发明中，术语“PSSR1”指具有PSSR1活性的SEQ ID NO:1序列的多肽。该术语还包括具有与PSSR1相同功能的、SEQ IDNO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，优选地1-30个、1-20个、1-10个、1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，优选地为10个以内，更优选地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乳酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。该术语还包括PSSR1的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。

任何与所述的PSSR1同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有PSSR1相同功能的多肽也包括在本发明内。所述“相同或相似功能”主要是指调控农作物(如水稻)的落粒性。

本发明还包括所要求保护的多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:1差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

此外，任何一种PSSR1的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PSSR1的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PSSR1的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长PSSR1的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PSSR1的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明还涉及编码本发明PSSR1或其变体、类似物、衍生物的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。如本文所用，简并变异体在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2或4所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:1所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的PSSR1的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的PSSR1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。所述多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加PSSR1表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强PSSR1的表达。或者通过增强子来增强该PSSR1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本文所述多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的PSSR1基因的用途，用于调控植物结实率和/或产量；或用于筛选对于调控植物结实率和/或产量有用的物质(即：所述物质通过调节PSSR1基因的表达来调节植物结实率和/或产量)。作为一种优选方式，所述的PSSR1基因可用于增加结实率。

本发明还涉及PSSR1上调剂或下调剂及其用途。由于PSSR1的上调剂或下调剂可调节PSSR1的表达和/或活性等，因此，所述的上调剂或下调剂也可通过对PSSR1的影响来调控植物结实率和/或产量，从而达到改良植物的目的。

在一个方面，任何可提高PSSR1的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调控植物结实率和/或产量的物质。例如提高PSSR1基因的转录、表达或活性的表达载体。

此外，发明人发现，结实率低的野生稻(例如W1943)的PSSR1基因相比结实率高的驯化稻(例如籼稻GLA4)的PSSR1基因(SEQ ID NO:2第271位处)中插入有转座子(例如SEQID NO:3)。不含转座子的基因即为有活性的PSSR1基因。经实验验证，野生稻的PSSR1基因(插入有转座子)是导致野生稻结实率低的目标基因，其影响减数分裂及胚囊发育从而降低结实率。本文中，“PSSR1基因”通常指不含转座子(插入序列)的基因序列。

因此，本发明还包括将所述转座子敲除以恢复PSSR1基因表达或活性的载体。为了恢复PSSR1基因表达或活性，可在细胞中转入基因敲除载体，以敲除转座子，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等敲除该转座子，和/或通过干扰RNA介导的基因沉默敲除该转座子。适用于本发明的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过DNA识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除。此外，为了恢复PSSR1基因表达或活性，可在细胞中转入互补载体。因此，本发明还包括不含所述转座子序列以恢复PSSR1基因表达或活性的互补载体。示例性的互补载体包含野生稻的PSSR1基因(含转座子)的5’UTR或者驯化稻的PSSR1基因(不含转座子)的5’UTR、PSSR1蛋白的编码序列和终止子等。

在另一方面，任何可降低PSSR1的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、或降低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为PSSR1的下调剂、拮抗剂或抑制剂，如干扰所述PSSR1基因表达的抑制分子(如可形成microRNA的抑制分子)。所述的下调剂、拮抗剂或抑制剂可用于调控植物结实率和/或产量。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的抑制分子的方法是本领域人员熟知的。

本发明还涉及一种调控植物结实率和/或产量的方法，该方法包括调节所述植物中PSSR1基因的表达。任选地，所述方法还包括上调OsPMS1和/或OsMLH3基因的表达。

一方面，本发明提供了一种调控植物(如作物)结实率和/或产量的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达PSSR1基因或使植物自身的PSSR1基因恢复表达或活性，从而增加结实率。在得知了所述的PSSR1基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的PSSR1基因的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带PSSR1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的PSSR1。

作为本发明的一种实施方式，将PSSR1基因(不含转座子)的通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到植物组织或器官中，使所述的植物表达PSSR1基因。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达PSSR1基因的植物。

或者，可通过本领域人员已知的途径敲除低活性PSSR1基因中的转座子(插入序列)，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等编辑该转座子。将具有敲除、编辑或转座功能的载体导入到植物组织或器官中，从而恢复PSSR1基因表达或活性。可将所述植物组织或器官再生成植物，获得恢复表达PSSR1基因的植物。本领域知晓所述敲除、编辑或转座载体的结构，例如同源臂、sgRNA序列、Cas9酶编码序列、转座酶编码序列等。本领域技术人员可根据需敲除、编辑或转座的序列(例如插入序列)设计并构建所需载体。

另一方面，本发明提供了另一种调控植物(如作物)结实率和/或产量的方法，所述的方法包括：降低所述植物中PSSR1基因的表达(包括使PSSR1基因不表达或低表达)；从而降低结实率。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低PSSR1基因的表达或使之缺失表达，比如将携带反义PSSR1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达PSSR1。或者，可采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等编辑该基因，从而使得细胞或植物组织不表达或降低表达PSSR1。本领域知晓所述敲除、编辑载体的结构，例如同源臂、sgRNA序列、Cas9酶编码序列等。本领域技术人员可根据需敲除、编辑的序列设计并构建所需载体。

在一些实施方案中，增加植物结实率和/或产量，和/或上调植物中PSSR1基因的表达的方法包括：

(a)PSSR1基因的表达载体，和

(b)针对PSSR1基因中插入序列的敲除、编辑或转座载体；

(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官；

(3)选择出转入了所述载体的植物组织、器官或种子；和

(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在另外的实施方案中，降低植物结实率和/或产量，下调植物中PSSR1基因的表达的方法包括：

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述载体转入植物组织或器官；

(iii)选择出转入了所述载体的植物组织、器官或种子；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

PSSR1蛋白的编码基因的另一个应用作为鉴定禾本科植物结实率的分子标记。可通过分析待测植物(如植物的种子或幼苗)中PSSR1蛋白的表达情况，来判断其结实率。例如，鉴定到植物中PSSR1蛋白的表达低或无，则该植株可呈现结实率低的表型；而若鉴定到PSSR1蛋白的较高表达(过量表达)，则该植株可呈现结实率高的表型。

在具体实施方案中，发明人利用野生稻W1943和籼稻GLA4构建的重组自交系BIL和单片段替换系CSSL群体，通过群体结实率统计和WinQTL分析，目标基因的初定位及精细定位，得到了位于1号染色体控制结实率的PSSR1这一位点。又结合表达分析及转基因，鉴定了PSSR1基因，确定了基因PSSR1是造成野生稻W1943育性低的一个主要基因。通过对GLA4和NIL-PSSR1的PSSR1基因及其启动子区序列进行测序，并对序列进行比对发现，PSSR1基因在GLA4和NIL的编码区及启动子区仅有3个位点存在序列差异，通过对113份不同水稻材料中PSSR1基因序列的变异位点及单倍型与育性情况进行关联分析，发现NIL-PSSR1中结实率的降低是由第二外显子区转座子插入导致的。此外，在酵母双杂分析基础上，通过双分子荧光素酶互补分析方法检测体内蛋白互作情况证实PSSR1与MutL家族蛋白OsPMS1和OsMLH3之间存在互作关系，它们之间可能形成复合体在DNA修复及减数分裂过程中起作用。因此，在利用野生稻资源时，可以通过导入栽培稻中结实率高的PSSR1来提交后代结实率。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、材料和方法

1.1材料

大田种植以野生稻W1943为供体亲本、籼稻GLA4为轮回亲本构建的重组自交系BIL和单片段替换系CSSL群体共计250个株系，每个株系种植48株。

1.2群体结实率统计及WinQTL分析

群体结实率统计方法为：(1)对于种子不落粒的株系：每个株系选择6株，每株统计3个穗子结实率，6株结实率的平均值作为该株系最终的结实率。(2)对于种子落粒的株系：选择1或2株套袋的植株，统计该株种子的总饱粒数和总瘪粒数。结实率＝总饱粒数/(总饱粒数+总瘪粒数)。运用WinQTLCart软件，通过全基因组SNP marker在结实率性状上进行连锁分析，计算与结实率性状相关的QTL位点。

1.3PSSR1初定位及精细定位

用结实率低的重组自交系BIL86与籼稻GLA4进行杂交获得F1代，自交得到F2群体，以F2代小群体进行初定位及结实率表型考察，再进一步扩大群体进行精细定位和构建近等基因系(NIL)。采用Indel和SNP引物对群体基因型进行鉴定。结合生物学相关网站的基因预测功能，对定位区进行基因预测，综合功能预测和表达谱分析，锁定候选基因。

1.4实时定量PCR

新鲜植物组织或者-80℃冻存的组织用Trizol Reagent提取。cDNA的反转采用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover试剂盒。定量PCR采用TakaraTOYOBO公司的THUNDERBIRD

qPCR Mix试剂盒，在Applied Biosystems7500real time PCR仪上进行。根据基因序列设计特异基因引物，选择水稻基因Actin作为内参。

1.5PSSR1的亚细胞定位

以GLA4的cDNA为模板，用Phanta高保真酶扩增PSSR1的全长ORF，正反向引物除了分别添加酶切位点Xba1和BamH1外还有部分载体的重叠序列。p1300-GFP载体也用相同的酶进行酶切后，采用In-Fusion重组酶与片段进行重组连接，转化大肠杆菌。测序确认无误的质粒进行大抽后瞬时转化水稻原生质体，使用Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜观察GFP在细胞内的定位情况。

1.6.双分子荧光素酶互补

1)载体的构建

JW771载体和JW772载体分别融合了luciferase荧光蛋白酶基因的N端和C端序列。将扩增好的PSSR1的全长CDS序列片段与线性化的JW771进行重组连接，从而将PSSR1融合到荧光素酶的N端，形成PSSR1-nLUC融合蛋白。而通过筛库筛选到的互作蛋白PMS1和MLH3则分别与JW772进行重组连接，融合到荧光素酶的C端，形成cLUC-PMS1/MLH3融合蛋白。

2)农杆菌介导瞬时转化烟草叶片

(1)挑取转化目标质粒的GV3101(pSoup-p19)农杆菌单菌落于5mL YEP液体培养基(加Kana²⁵–Rif ⁵-Tet⁵)中，28℃，250rpm过夜培养12-16h；

(2)室温，5,000rpm离心8min，菌体用转化液重悬(10mM MgCl2，10mM MES PH5.7和150μM乙酰丁香酮)，调整OD₆₀₀＝0.8-1.0，室温静置活化3h；

(3)将含有PSSR1-nLUC质粒的农杆菌悬浮液分别与cLUC-PMS1/MLH3以及nLUC和cLUC空载的农杆菌悬浮液等体积混合，室温孵育10min；

(4)农杆菌混合液侵染生长4周的烟草叶片，用1ml不带针头的注射器吸取农杆菌混合液，紧贴叶片背面，轻轻推压活塞，而在叶片的另一面用手指施加压力，将菌液慢慢注入，用记号笔标记好注射区域。

(5)黑暗培养72h后，将底物0.94mM的荧光素D-luciferin(PerkinElmer122799)注射入烟草叶片中，避光放置5min后，用Tanon 5200检测荧光素酶的活性。

实施例1，结实率性状WinQTL分析

对250个BIL和CSSL株系进行结实率性状考察，并进行WinQTL分析，计算与结实率相关的QTL位点。发现有两个主效QTL位点，分别位于1号(43.9～44.3Mb)和9号染色体上，其中9号染色体QTL位点为已知基因(图1)。

实施例2，图位克隆

通过在1号染色体末端的14对Indel和SNP分子标记，将未知结实率相关基因初定位在染色体长臂末端44.042cM～44.091cM之间49Kb范围内。在这49Kb范围内共有7个预测基因(图2)。

通过q-PCR对7个预测的基因在GLA4和NIL-PSSR1植株穗部的表达量进行分析，发现orf4的表达量在GLA4和NIL-PSSR1植株之间有极显著差异，orf4在NIL-PSSR1中几乎不表达。此外，orf6和orf7在GLA4和NIL-PSSR1的穗子中表达量极低，且没有显著差异；orf1、orf2、orf3和orf5等4个基因的表达量虽然都是NIL-PSSR1略高于GLA4，但没有极显著性差异(P>0.01)(图3)。因此，我们将orf4作为候选基因。

实施例3，PSSR1候选基因测序及关联分析

PSSR1基因全长6012bp，包含16个CDS区，编码一个由725个氨基酸组成的含MutL结构域的蛋白。通过Smart和Pfam数据库预测该蛋白包含1个HATPase_c结构域和1个DNA mis_repair结构域，以及1个C端MutL结构域。通过对GLA4和NIL-PSSR1的PSSR1基因及其启动子区序列进行测序，并对序列进行比对发现，PSSR1基因在GLA4和NIL的编码区及启动子区仅有3个位点存在序列差异，且在5’-UTR和3’-UTR没有碱基差异，其中启动子区有2个SNP位点，分别是位于-215(T→C)和-171(Deletion A)，以及第二外显子区域的5.4kb转座子插入(图4，A)。

为了进一步验证具体的作用位点，我们对实验室1092份栽培稻和250份野生稻的启动子区域进行了测序，并对第二外显子区转座子的插入情况进行了检测。在这1342份水稻种质材料中未发现有转座子的插入，推测来源于W1943的5.3kb的转座子插入是一个稀有等位变异。同时我们选择了112份栽培稻，并根据PSSR1基因位点变异将这些材料分为4类，外加NIL(Type5)，将这些材料中PSSR1基因序列的变异位点及单倍型与结实率情况进行关联分析，发现启动子区域-215和-171位点的碱基替换和缺失对结实率没有显著影响(图4，B和C)。NIL中结实率的降低是由第二外显子区转座子插入导致的。此外，通过定点突变，将NIL中PSSR1基因启动子区SNP2位点加上“A”碱基，通过荧光素酶实验检测GLA4、NIL和NIL(Mutant)三类启动子的活性，发现三类启动子活性之间没有显著差异(图4，D)。

实施例4，PSSR1的遗传转化验证

我们首先通过构建互补载体CP-PSSR1，转化NIL，与近等基因系NIL相比，互补转基因植株的花粉育性和结实率显著提高，与GLA4没有显著差异(图5)。此外，利用CRISPR-Cas9技术，对GLA4中的PSSR1进行了基因敲除，转化结果显示，CR-PSSR1的花粉育性降低，结实粒也显著降低，与NIL相当(图5)。从而进一步确定PSSR1是导致NIL结实率低的目标基因。

实施例5，PSSR1影响减数分裂及胚囊发育从而降低结实率

研究发现，NIL中花粉母细胞的减数分裂过程出现异常，在终变期和中期I的部分细胞中会出现单价体，后期I出现染色体拖曳和滞后的现象，减II中会出现数目不等的微核(图6，A)，从而导致花粉的育性仅有55％左右。另外，与GLA4相比，NIL中约有45％的胚囊出现败育，不能正常分化为七细胞八核的成熟胚囊(图6，B)。因此，与GLA4相比，NIL的雌、雄配子表现出半不育特性。

实施例6，PSSR1蛋白的亚细胞定位

将PSSR1全长CDS接在p1300-GFP上游，构建了p1300-PSSR1-GFP载体，将此融合蛋白和空载分别在水稻原生质体进行瞬时表达，进行亚细胞定位观察。结果显示，PSSR1-GFP融合蛋白定位在细胞核中(图7)。

实施例7，PSSR1与MutL家族蛋白互作

在酵母筛库及双杂验证的基础上，进一步利用双分子荧光素酶互补分析方法检测体内蛋白互作情况。结果显示，PSSR1与MutL家族蛋白OsPMS1和OsMLH3之间存在互作关系(图8)，它们之间可能形成复合体，在DNA修复及减数分裂过程中起作用。该基因及其复合体功能的丧失会导致减数分裂异常，从而引起结实率降低。

本文序列

PSSR1蛋白	SEQ ID NO:1
		PSSR1基因编码序列	SEQ ID NO:2
PSSR1基因插入序列	SEQ ID NO:3
		U3-sgRNA	SEQ ID NO:4
U6a-sgRNA	SEQ ID NO:5
		5’UTR	SEQ ID NO:6

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种调控结实率的基因及其应用

<130> 20A630

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 724

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Asp Glu Pro Ser Pro Arg Gly Gly Gly Cys Ala Gly Glu Pro Pro

1 5 10 15

Arg Ile Arg Arg Leu Glu Glu Ser Val Val Asn Arg Ile Ala Ala Gly

20 25 30

Glu Val Ile Gln Arg Pro Ser Ser Ala Val Lys Glu Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Ser Leu Asp Ala Gly Ala Ser Ser Val Ser Val Ala Val Lys Asp Gly

50 55 60

Gly Leu Lys Leu Ile Gln Val Ser Asp Asp Gly His Gly Ile Arg Phe

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Ile Leu Cys Glu Arg His Thr Thr Ser Lys Leu Ser

85 90 95

Ala Tyr Glu Asp Leu Gln Thr Ile Lys Ser Met Gly Phe Arg Gly Glu

100 105 110

Ala Leu Ala Ser Met Thr Tyr Val Gly His Val Thr Val Thr Thr Ile

115 120 125

Thr Glu Gly Gln Leu His Gly Tyr Arg Val Ser Tyr Arg Asp Gly Val

130 135 140

Met Glu Asn Glu Pro Lys Pro Cys Ala Ala Val Lys Gly Thr Gln Val

145 150 155 160

Met Val Glu Asn Leu Phe Tyr Asn Met Val Ala Arg Lys Lys Thr Leu

165 170 175

Gln Asn Ser Asn Asp Asp Tyr Pro Lys Ile Val Asp Phe Ile Ser Arg

180 185 190

Phe Ala Val His His Ile Asn Val Thr Phe Ser Cys Arg Lys His Gly

195 200 205

Ala Asn Arg Ala Asp Val His Ser Ala Ser Thr Ser Ser Arg Leu Asp

210 215 220

Ala Ile Arg Ser Val Tyr Gly Ala Ser Val Val Arg Asp Leu Ile Glu

225 230 235 240

Ile Lys Val Ser Tyr Glu Asp Ala Ala Asp Ser Ile Phe Lys Met Asp

245 250 255

Gly Tyr Ile Ser Asn Ala Asn Tyr Val Ala Lys Lys Ile Thr Met Ile

260 265 270

Leu Phe Ile Asn Asp Arg Leu Val Asp Cys Thr Ala Leu Lys Arg Ala

275 280 285

Ile Glu Phe Val Tyr Ser Ala Thr Leu Pro Gln Ala Ser Lys Pro Phe

290 295 300

Ile Tyr Met Ser Ile His Leu Pro Ser Glu His Val Asp Val Asn Ile

305 310 315 320

His Pro Thr Lys Lys Glu Val Ser Leu Leu Asn Gln Glu Arg Ile Ile

325 330 335

Glu Thr Ile Arg Asn Ala Ile Glu Glu Lys Leu Met Asn Ser Asn Thr

340 345 350

Thr Arg Ile Phe Gln Thr Gln Ala Leu Asn Leu Ser Gly Ile Ala Gln

355 360 365

Ala Asn Pro Gln Lys Asp Lys Val Ser Glu Ala Ser Met Gly Ser Gly

370 375 380

Thr Lys Ser Gln Lys Ile Pro Val Ser Gln Met Val Arg Thr Asp Pro

385 390 395 400

Arg Asn Pro Ser Gly Arg Leu His Thr Tyr Trp His Gly Gln Ser Ser

405 410 415

Asn Leu Glu Lys Lys Phe Asp Leu Val Ser Val Arg Asn Val Val Arg

420 425 430

Ser Arg Arg Asn Gln Lys Asp Ala Gly Asp Leu Ser Ser Arg His Glu

435 440 445

Leu Leu Val Glu Ile Asp Ser Ser Phe His Pro Gly Leu Leu Asp Ile

450 455 460

Val Lys Asn Cys Thr Tyr Val Gly Leu Ala Asp Glu Ala Phe Ala Leu

465 470 475 480

Ile Gln His Asn Thr Arg Leu Tyr Leu Val Asn Val Val Asn Ile Ser

485 490 495

Lys Glu Leu Met Tyr Gln Gln Ala Leu Cys Arg Phe Gly Asn Phe Asn

500 505 510

Ala Ile Gln Leu Ser Glu Pro Ala Pro Leu Gln Glu Leu Leu Val Met

515 520 525

Ala Leu Lys Asp Asp Glu Leu Met Ser Asp Glu Lys Asp Asp Glu Lys

530 535 540

Leu Glu Ile Ala Glu Val Asn Thr Glu Ile Leu Lys Glu Asn Ala Glu

545 550 555 560

Met Ile Asn Glu Tyr Phe Ser Ile His Ile Asp Gln Asp Gly Lys Leu

565 570 575

Thr Arg Leu Pro Val Val Leu Asp Gln Tyr Thr Pro Asp Met Asp Arg

580 585 590

Leu Pro Glu Phe Val Leu Ala Leu Gly Asn Asp Val Thr Trp Asp Asp

595 600 605

Glu Lys Glu Cys Phe Arg Thr Val Ala Ser Ala Val Gly Asn Phe Tyr

610 615 620

Ala Leu His Pro Pro Ile Leu Pro Asn Pro Ser Gly Asn Gly Ile His

625 630 635 640

Leu Tyr Lys Lys Asn Arg Asp Ser Met Ala Asp Glu His Ala Glu Asn

645 650 655

Asp Leu Ile Ser Asp Glu Asn Asp Val Asp Gln Glu Leu Leu Ala Glu

660 665 670

Ala Glu Ala Ala Trp Ala Gln Arg Glu Trp Thr Ile Gln His Val Leu

675 680 685

Phe Pro Ser Met Arg Leu Phe Leu Lys Pro Pro Lys Ser Met Ala Thr

690 695 700

Asp Gly Thr Phe Val Gln Val Ala Ser Leu Glu Lys Leu Tyr Lys Ile

705 710 715 720

Phe Glu Arg Cys

<210> 2

<211> 2175

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggacgagc cttcgccgcg cggaggtggg tgcgccgggg agccgccccg catccggagg 60

ttggaggagt cggtggtgaa ccgcatcgcg gcgggggagg tgatccagcg gccgtcgtcg 120

gcggtgaagg agctcatcga gaacagcctc gacgctggcg cctccagcgt ctccgttgcg 180

gtgaaggacg gtggcctcaa gctcatccag gtctccgatg acggccatgg catcaggttt 240

gaggatttgg caatattgtg cgaaaggcat actacctcaa agttatctgc atacgaggat 300

ctgcagacca taaaatcgat ggggttcaga ggggaggctt tggctagtat gacttatgtt 360

ggccatgtta ccgtgacaac gataacagaa ggccaattgc acggctacag ggtttcttac 420

agagatggtg taatggagaa tgagcctaag ccttgcgctg cggtgaaagg aactcaagtc 480

atggttgaaa atctatttta caacatggta gcccgcaaga aaacattgca gaactccaat 540

gatgactacc ccaagatcgt agacttcatc agtcggtttg cagtccatca catcaacgtt 600

accttctctt gcagaaagca tggagccaat agagcagatg ttcatagtgc aagtacatcc 660

tcaaggttag atgctatcag gagtgtctat ggggcttctg tcgttcgtga tctcatagaa 720

ataaaggttt catatgagga tgctgcagat tcaatcttca agatggatgg ttacatctca 780

aatgcaaatt atgtggcaaa gaagattaca atgattcttt tcataaatga taggcttgta 840

gactgtactg ctttgaaaag agctattgaa tttgtgtact ctgcaacatt gcctcaagca 900

tccaaacctt tcatatacat gtccatacat cttccatcag aacacgtgga tgttaatata 960

cacccaacca agaaagaggt tagccttttg aatcaagagc gtattattga aacaataaga 1020

aatgctattg aggaaaaact gatgaattct aatacaacca ggatattcca aactcaggca 1080

ttaaacttat cagggattgc tcaagctaac ccacaaaagg ataaggtttc tgaggccagt 1140

atgggttctg gaacaaaatc tcaaaaaatt cctgtgagcc aaatggtcag aacagatcca 1200

cgcaatccat ctggaagatt gcacacctac tggcacgggc aatcttcaaa tcttgaaaag 1260

aaatttgatc ttgtatctgt aagaaatgtt gtaagatcaa ggagaaacca aaaagatgct 1320

ggtgatttgt caagccgtca tgagctcctt gtggaaatag attctagctt ccatcctggc 1380

cttttggaca ttgtcaagaa ctgcacatat gttggacttg ccgatgaagc ctttgctttg 1440

atacaacaca atacccgctt ataccttgta aatgtggtaa atattagtaa agaacttatg 1500

taccagcaag ctttgtgccg ttttgggaac ttcaatgcta ttcagctcag tgaaccagct 1560

ccacttcagg agttgctggt gatggcactg aaagacgatg aattgatgag tgatgaaaag 1620

gatgatgaga aactggagat tgcagaagta aacactgaga tactaaaaga aaatgctgag 1680

atgattaatg agtacttttc tattcacatt gatcaagatg gcaaattgac aagacttcct 1740

gttgtactgg accagtacac ccctgatatg gaccgtcttc cagaatttgt gttggcttta 1800

ggaaatgatg ttacttggga tgacgagaaa gagtgcttca gaacagtagc ttctgctgta 1860

ggaaacttct atgcacttca tcccccaatc cttccaaatc catctgggaa tggcattcat 1920

ttatacaaga aaaatagaga ttcaatggct gatgaacatg ctgagaatga tctaatatca 1980

gatgaaaatg acgttgatca agaacttctt gcggaagcag aagcagcatg ggcccaacgt 2040

gagtggacca ttcagcatgt cttgtttcca tccatgcgac ttttcctcaa gcccccgaag 2100

tcaatggcaa cagatggaac gtttgtgcag gttgcttcct tggagaaact ctacaagatt 2160

tttgaaaggt gttag 2175

<210> 3

<211> 5434

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

tgtcacaccc taactccggc gaactctccg gtgagatatg tggagactag gagagacaat 60

tcacgagaga gaaagagaga tagcttgagg aagaagaagt agttggggga gattgatttc 120

atttcctcat tgtctgcttc gatacaatga cttcctagga tatatacccc ctttccagct 180

gtacacgctg gtcccccatg tctcacttac acacacacaa ttgtttacgc tttacatttt 240

agaaggcgta tttcataaac ccgctatgct ctgtttcctc tgctcttcac ggagtcgctg 300

ccgttgccgc gtcggtcacc accgcaggtg tgacagtacc gcccccagga gaggaaggtt 360

gtccccaaac ttccgcattc acaaaccgag cccgaagcac atcatagtcc tcccaggtag 420

catactcagc aggtaaagag ccccaacgaa cgtgcacttg gacaatggca gcgttacctc 480

gtttcaccat acgacgatcc agaatctccg tgggaaccaa gtcttgcaca tccaattcca 540

acgatgtagg aaaagaagag aacactggag tatgatctgg aacgacccgc ttcaattgag 600

acacatgaaa caccgggtgg atacgacttg aagcaggtaa ctgtaattca taagccactg 660

atccaatctt gcgaagaaca gtgaaaggac caaaatactt catcgccaat ttgggacaag 720

gacgagaaac caccgagtgt tgagcataag gctgtaactt caaatacacc aagtccccca 780

cctgaaaaga acggtcggtg cgattggtat ctgcagcttg cttcatgcga tgctgagctt 840

ttgccaaatg atgatgcaac aagctggaat aaaaggctct attagcacag aattcagcag 900

cttcaggaga ctcatccata tcatttgcag aagaatccgg cgagaccggc atgagaccaa 960

cagaaggatc agaaccatat aatgctttgt gtggagaaca cttaatggca gaatggaaac 1020

tcgtgttgta ccaatactga gctaaaggaa gccatagaaa ccatttagct ggagtattag 1080

atatagcaca acgaaggtac atctctaaac attgattaac tcgttcggtt tgtccatcgg 1140

actgagggtg atatgctgaa ctcatgtgca aaggaactcc aaatctcttg aacaaacact 1200

gccaaaagtt acttgtgaac actttatctc tgtcagacac aatgacttta ggcaacccat 1260

aaagcttcac cacattgttt aacagcgctt cagccacttg gacagcagaa aaggggtgtt 1320

ttaagggaat gaaatgagca tatttagtgt acctgtcaac caccacaaag atcacatcat 1380

accctttaga cactggcaac ccttcaatga aatccataga gatttcctgc caagctccct 1440

caggaatagg taacggttgc aacagcccgg gatatttgca cagctcatgt ttagcctgtt 1500

gacatattga gcactgttgg acatactcct caacatgctg ttttaaacca ggccaagcaa 1560

acagcttctt caaccgatga tatgtgacca agctcccgga gtgccctccc atagcagagt 1620

tatgaaaggc atggataagt ttggtctgta atgctgaatt agcccccacc caaatcctac 1680

cattctgccg aatgagacca tgagccagag taaatccctg atcattagaa cctgtgatgg 1740

ccaactctgt gagtaactgt tgtgctttag gatcaactgc atacgaattc agtaactctt 1800

ggagccacaa tggatgaggt gctgacaaag caaaacaatc agtagtatga tgtactcggg 1860

acaaagcatc ggcaactgta ttatccaccc cttttttata ttgaaactga tattgtaaac 1920

caattaactt tgtcatggct ttacgctgca aatccgtttc taaagcttga tcattgagat 1980

gacacaaaga ttgatgatca gttttaataa tgaaaggacc tcttaacaaa taagacctcc 2040

acttggaaac agccatcatt attgctaaaa attctttctc atagatagac aacttgctgt 2100

tggctgatcc taaggctttg ctgtaaaacg caataggatg gccttcctga agtaaaacag 2160

caccaatacc agagtcacaa gcatcagttt caagaataaa agacttagag aagtcaggga 2220

gagctaacac tggagtggaa cacatggctg tcttcaaagc aacaaaagca ttctgaactt 2280

caggggtcca acaaaactta acattcttct gcagcaattt ggtaagaggc ttagctaaaa 2340

taccataatg atgcacaaat ttcctatagt atccagtgag tcccaaaaat cctctgagtt 2400

cagtgacatt agaaggtgta ggccatttgg ccatacattc agtcttggct ggatcagtag 2460

ccaccccatc cttagaaata atgtgtccca aatattccaa agtaggagct gcaaaagagc 2520

atttagacaa cttggcaaag agatgatggt gctgtaggac ctgaaagacc aactccaaat 2580

gacgcaagtg ctcagaccag gaagaactgt ataccaaaat gtcatccatg aatacaagga 2640

caaactttct catataagga gcaaacactg agttcatcaa atattgaaat gtggccggtg 2700

cattagtgag cccaaatggc atcaccctga attgaaaatg tccatgatgt gtcttaaaag 2760

cagttttgtg ttcgtcctcc tctttcatgc gtatctgatg atatccactc ttcaaatcca 2820

atttagagaa atactgagca cctgctaatt catccaacaa ttcatctact attggaaggg 2880

gaaatttatt cttcacagtt aaggagttta gctttcgata atccacacaa aatcgccaag 2940

tgttatcctt ctttttaacc aataaaacag gggatgcaaa aggactgcag ctctgagtaa 3000

tgagaccaga attcaacatt tcaattactt gcttctcaat ctcatctttt tgggcaggag 3060

agtacctata aggacggcag ttaactggca cagctccagg aagcaaagag atagaatgat 3120

caacaactcg atgtggtggc aattcagcag gagtttggaa aataagatga tacttctgaa 3180

tgagttgttg aatatcaggt ggcgtagcag acaattgaac agaggaggac acatcctcta 3240

caacagccaa agcccaaatg tcatttcctt gataccattt catgacctgc tcaggtgaga 3300

cagtagtaat catgttaaca gcagcatgct gaatgccttg taaagttatc cactgaccat 3360

tatgagaaaa tgatatactc ttagtttccc aatcacactg catagggctg tgctgttcca 3420

accaatccat gcccaaaacc atatcatagc cacccatagg taaaactttg atgggaaaat 3480

gaaaagtata accctgaatc caccattgaa aatctggcac ttgggacata cactgtaaaa 3540

attcaccatt agccaccctg acagaagaag ggggaagttc agtagtagat aactgcaact 3600

tctgacaaag cacctcatta acaaagctat gggaacttcc agagtctacc aatatcaaca 3660

ccacttggtt gttaatcaag gccctcaact gaatagtctt agctgagatt gagccagcaa 3720

tagcatgtaa agacagcaac atatcctctt gaggttcttc catttgtacc atagcatcta 3780

acacttcatc agatagaatc tctgtggatt cagccaactc aatagccttc aactgagcaa 3840

cttcaggttt agcacaaaca tgagcaggag aatacttctc cccacacttg aaacaaagac 3900

catgtgtttt cctatattcc tttaactgtt gagccttcca aatctcaccc atagccggct 3960

taactttgtc cccaacctta tgttgatatc catccttctt caacaccccc tttttgagtt 4020

gcaatgcact ttcaaaagcc aaagccactc gataagcctg gttaacatct tcaggtaatt 4080

gagctaaaac tgaaaaacgc aactcctctt ttaacccttt aacaaactgg gacagcaaaa 4140

aggatgtact gagcgtggga tcatacaacc tcaagtaata cactaactga gcaaatttag 4200

tgcgatattc tgacactgtc ccagtctgac tcaacaataa cagctcatcc attttaaacc 4260

tagcagtgtg tatctcaaac tcagcgaata tagcttcctg taattgatcc caagtatgcc 4320

accccacctc acgcttccat gcctgatacc aatgagctgc atcccctacc atgttcagag 4380

aagctgccga aactttgaac ccctcagtaa tttggtacag attgaaataa gtttcacagt 4440

tatccaccca caccctagca tcagttccat caaatttcgg aaaatccatc ttaggcatcc 4500

aatttcttct accccccgac tcagcaaact ctcgaacagt aggtgaactt gggcgtgagg 4560

gttcagatac cttaggagag aattgaggtg ccctggaagt ggatgctcct ggcggattgt 4620

ccaagagcgg cggttcagaa gttggtgatg ctgagggaga tgcctgattc actgcagcct 4680

tcatcgcttt cgccatcacc acctgctcca tctgcacttg ccctagtgaa gtcatcgata 4740

ggtccacctt gacttgcatc ttctcgagtt gattcccctg ctgcgccagc ttgtggtcga 4800

tggtgtctaa tcgcgagctc atcgtgctga ctccctccac cttcgtcacc aacgcctgga 4860

tcagctctac gattcgccct tccatcgcct ccatcgccgc cacaacttgc cgaacctgca 4920

ctccttgctt agccggcgcc gtggcgtctc ctcctccaag ccgatcgaac caaacacgag 4980

atttacagtg gttcaaccca aagggaacct ctaactcggc cacaggattt accgatcaac 5040

cgagagaatt tgagggacgt gcacacggaa gccaaccgag ctctgatacc aagttgtcac 5100

accctaactc cggcgaactc tccggtgaga tatgtggaga ctaggagaga caattcacga 5160

gagagaaaga gagatagctt gaggaagaag aagtagttgg gggagattga tttcatttcc 5220

tcattgtctg cttcgataca atgacttcct aggatatata ccccctttcc agctgtacac 5280

gctggtcccc catgtctcac ttacacacac acaattgttt acgctttaca ttttagaagg 5340

cgtatttcat aaacccgcta tgctctgttt cctctgctct tcacggagtc gctgccgttg 5400

ccgcgtcggt caccaccgca ggtgtgacag cata 5434

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

actcctccaa cctccggatg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ttatcgttgt cacggtaaca 20

<210> 6

<211> 113

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 6

acattttgca gtctcctctc ctcctccgct cgagcgagtg agtcccgacc acgtcgctgc 60

cctcgcctca ccgccggcca accgccgtga cgagagatcg agcagggcgg ggc 113

Claims

1.物质在调控植物的结实率和/或产量中的用途，所述物质选自下组：PSSR1基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，

优选地，所述植物是水稻。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述PSSR1基因编码的氨基酸序列选自：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

和/或，

所述PSSR1基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述促进剂选自下组：(1)小分子化合物、核酸分子或其组合，和/或(2)针对PSSR1基因中插入序列的敲除、编辑或转座载体；优选地，所述插入序列位于PSSR1编码序列的第271位处，

所述抑制剂是特异性干扰PSSR1基因转录或表达的抑制分子，优选地，所述抑制分子以PSSR1基因或其转录本作为抑制靶标，更优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

4.一种调控植物结实率和/或产量的方法，所述方法包括：调节植物中PSSR1基因的表达或活性，从而调控植物结实率和/或产量，

优选地，所述调控植物结实率和/或产量的方法包括：上调植物中PSSR1基因的表达；从而增加结实率和/或产量；更优选地，所述上调禾谷类作物中PSSR1基因的表达包括：将(1)PSSR1基因，和/或(2)针对PSSR1基因中插入序列的敲除、编辑或转座载体转入植物，获得转化的植物，

优选地，所述调控植物结实率和/或产量的方法包括：下调植物中PSSR1的表达；从而降低结实率和/或产量；更优选地，所述下调禾谷类作物中PSSR1基因的表达包括：将下调PSSR1基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是特异性干扰PSSR1基因转录或表达的抑制分子，

优选地，所述抑制分子以PSSR1基因或其转录本作为抑制靶标，

更优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

6.一种PSSR1基因的用途，用于作为鉴定植物结实率的分子标记。

7.一种表达PSSR1基因的表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、PSSR1基因的ORF序列、和终止子。

8.一种核酸构建物，其包含权利要求7所述的表达盒或其互补序列，

优选地，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。

9.权利要求7所述的表达盒的用途，用于调节作物的结实率和/或产量。

10.靶向PSSR1基因的sgRNA或能产生所述sgRNA的核酸构建物，

优选地，所述sgRNA是以SEQ ID NO:2作为靶标的sgRNA。