CN114763373A

CN114763373A - 一种调控穗粒数的基因及其应用

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Publication number: CN114763373A
Application number: CN202011613759.9A
Authority: CN
Inventors: 韩斌; 罗江虹; 刘波涛; 韩悠阳; 朱静洁; 上官颖颖
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-07-19

Abstract

本发明涉及一种调控穗粒数相关基因及其应用。本发明提供一种调控植物农艺性状的方法，所述方法包括调节植物中DUO基因的表达。

Description

一种调控穗粒数的基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及一种穗粒数调控基因及其应用。

背景技术

随着全球耕地面积的逐年减少，农作物的产量难以维持人类的发展。近些年来，虽然粮食作物的亩产在增加，但总产量难以维持增势。水稻作为全世界一半以上人口的主要粮食作物，如何提高其产量一直是科研工作中的重要课题。

我国栽培的水稻属于亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)，主要分为籼稻(Oryzasativa L.ssp.Indica)和粳稻(Oryza sativa L.ssp.Japonica)两个亚种。就其起源，可能是由普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)驯化而来。水稻基因组较小，大约为430Mb，其中粳稻日本晴(Nipponbare)全基因组序列已经被精细测定，而籼稻93-11(93-11)全基因组序列也被鸟枪法测定，为研究水稻基因功能奠定了重要的基础。随着新一代高通量测序技术的面世，为大规模测定物种基因组序列提供了可能。利用高通量测序技术对水稻各品种的基因组进行测序和重测序，鉴定种内及种间序列多态，结合农艺性状的考察和收集，进行关联分析，为水稻基因的研究开辟了新局面。

水稻产量由分蘖数、每穗粒数、结实率和千粒重四个方面构成，每穗粒数是决定水稻产量的一个重要农艺性状，阐明控制每穗粒数的遗传机制对水稻产量提高及品种改良有着重要意义。

目前已知的控制每穗粒数的基因还很少，例如，Gn1a/OsCKX2，OsCKX2编码细胞分裂素氧化酶，该基因通过调控体内细胞分裂素水平来影响每穗粒数。而DEP1和DST基因则是分别调控了OsCKX2的表达，从而影响穗粒数。OsSPL14和OsmiR156协同作用也控制水稻每穗粒数。Spikelet number基因(qTSN4)是从热带粳稻地方品种中克隆的，它是Narrow leaf1(NAL1)基因的一个等位变异，引入籼稻品种IR64会提高每穗粒数和产量。Ghd7编码一个CCT结构域的基因，该基因上调表达不仅延长抽穗期而且极大地提高每穗粒数和产量。与花序分生组织发育相关的基因TAW1突变影响每穗粒数。而与种子芒发育相关的基因Awn-1也调控每穗粒数和单株产量。控制每穗粒数的遗传机制非常复杂，每穗粒数是一个多基因调控的复杂性状，为了充分阐明每穗粒数的控制机制，需解析其调控网络的组分、克隆更多的调控每穗粒数的基因，从而可以更广泛地调控每穗粒数和提高产量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种穗粒数相关基因及其应用。

本发明第一方面提供一种物质的用途，所述物质选自下组：DUO基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，用于调控植物的农艺性状，所述农艺性状选自以下的一种或多种：植物株高、叶长度、叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述物质为DUO基因或其编码蛋白、或其促进剂，并且所述调控植物的农艺性状选自以下的一种或多种：增加植物株高、增加叶长度、增加叶宽度、增加穗长、增加枝梗数目、增加每穗粒数、增加单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述物质为DUO基因的抑制剂，并且所述调控植物的农艺性状选自以下的一种或多种：降低植物株高、降低叶长度、降低叶宽度、降低穗长、降低枝梗数目、降低每穗粒数、降低单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂是特异性干扰DUO基因转录和/或表达的抑制分子。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以DUO基因或其转录本作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SEQ ID NO:1或2作为抑制靶标。在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SEQ ID NO:2第8-26位和/或第244-263位核苷酸作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。优选地，所述抑制分子是以SEQ ID NO:2或其转录本作为沉默靶标的dsRNA或构建物。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子是以SEQ ID NO:2第8-26位和/或第244-263位核苷酸作为靶标的sgRNA。优选地，所述sgRNA如SEQ ID NO:13或14所示。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂还包含Cas酶(例如Cas9)、其编码序列、和/或表达所述Cas酶的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。

在一个或多个实施方案中，所述水稻包括籼稻、粳稻、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述水稻是日本晴。

在一个或多个实施方案中，所述枝梗数目包括一次枝梗数目和/或二次枝梗数目。

在一个或多个实施方案中，所述叶包括剑叶。

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因包括cDNA序列、基因组序列、或其组合。

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因来自禾本科植物，优选来自水稻。

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因的氨基酸序列选自下组：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个(如1-20个；优选地1-10；更优选地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％(优选地93％；更优选地95％或98％)以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％(优选地90％；更优选地95％或98％)以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个优选地1-30，更优选地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明第二方面提供一种调控植物农艺性状的方法，所述方法包括：调节植物中DUO基因的表达或活性，从而调控植物农艺性状。优选地，所述农艺性状选自以下的一种或多种：植物株高、叶长度、叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述水稻是日本晴。

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一个优选实施方案中，所述调控植物农艺性状的方法包括：上调植物中DUO基因的表达；从而增加植物株高、增加剑叶长度、增加剑叶宽度、增加穗长、增加枝梗数目、增加每穗粒数和/或增加单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中DUO基因的表达包括：将DUO基因转入植物，获得转化的植物。

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因的表达由UBI启动子驱动。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中DUO基因的表达的方法包括：

(1)提供携带含有DUO基因的核酸构建物的农杆菌，

(2)将植物的细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。

在一个或多个实施方案中，所述上调植物中DUO基因的表达的方法还包括：

(3)选择出转入了DUO基因的植物组织、器官或种子；和

(4)将步骤(3)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在另一优选实施方案中，所述调控植物农艺性状的方法包括：下调植物中DUO的表达；从而降低植物株高、降低剑叶长度、降低剑叶宽度、降低穗长、降低枝梗数目、降低每穗粒数和/或降低单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中DUO基因的表达包括：将下调DUO基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SEQ ID NO:1或2作为抑制靶标。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

在一个或多个实施方案中，所述抑制分子以SEQ ID NO:2第8-26位和/或第244-263位核苷酸作为靶标的sgRNA。

在一个或多个实施方案中，所述sgRNA如SEQ ID NO:13或14所示。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中DUO基因的表达的方法包括：

(i)提供携带可干扰基因表达的核酸构建物的农杆菌，所述核酸构建物含有或产生所述抑制剂；

(ii)将植物的细胞或组织或器官与步骤(i)中的农杆菌接触，从而使所述核酸构建物转入植物组织或器官。

在一个或多个实施方案中，所述下调植物中DUO基因的表达的方法还包括：

(iii)选择出转入了所述核酸构建物的植物组织、器官或种子；和

(iv)将步骤(iii)中的植物组织、器官或种子再生成植物。

在本发明的另一方面，提供一种DUO基因的用途，用于作为鉴定植物农艺性状的分子标记。

在一个或多个实施方案中，所述农艺性状包括：植物株高、剑叶长度、剑叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾谷类作物。

在一个或多个实施方案中，所述植物是禾本科植物。

在一个或多个实施方案中，所述水稻是日本晴。

在一个或多个实施方案中，所述叶包括剑叶。

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供一种表达DUO基因的表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、DUO基因的ORF序列、和终止子。

在一个或多个实施方案中，所述5’UTR区如SEQ ID NO:15所示。

在一个或多个实施方案中，DUO基因的ORF序列编码：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

在一个或多个实施方案中，所述DUO基因的ORF序列包含选自以下的核酸序列：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

本发明还提供核酸构建物，其包含本文所述的表达盒或其互补序列。

本发明还提供宿主细胞，其(1)包含核酸构建物，所述核酸构建物包含本文所述的表达盒或其互补序列，或(2)染色体中整合有本文所述的表达盒。

在一个或多个实施方案中，所述的宿主细胞为植物细胞，优选为禾本科植物细胞，更优选为水稻细胞。

在本发明的另一方面，提供一种靶向DUO基因的抑制剂。

在一个或多个实施方案中，所述抑制剂选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、特异性抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。所述抑制剂特异性干扰DUO基因的转录和/或表达。优选地，所述抑制剂是以SEQ IDNO:1或2作为抑制靶标的抑制剂。

在一个或多个实施方案中，所述sgRNA如SEQ ID NO:13或14所示。

本发明还提供了本文所述的表达盒的用途，用于改良作物的选自下组的农艺性状：增加植物株高、增加叶长度、增加叶宽度、增加穗长、增加枝梗数目、增加每穗粒数、增加单株产量。

附图说明

图1显示DUO-CSP1和DUO-CSP2转基因植株T2代个体测序图谱。其中，方框代表的是基因编辑之后缺失的序列，三角形代表的是在DUO-CSP植株中缺失的位置。

图2是DUO转基因植株的株型比较。

图3是DUO转基因植株的剑叶比较。

图4是DUO转基因植株的穗型比较。

图5是DUO基因的时空表达模式。

图6显示转基因植株中DUO基因的表达水平比较。

具体实施方式

发明人首次揭示通过在禾谷类植物(作物)中定向调控DUO基因表达水平，可显著调节植物的农艺性状，进而达到改良禾谷类作物、增加产量等目的。所述农艺性状选自下组的一种或多种：植物株高、叶长度、叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量。

如本文所用，“禾谷类作物”可以是禾本科植物或有芒植物(作物)。优选地，所述禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦。有芒植物是指种子壳上存在针状物植物。如本文所用，术语“农作物”或“作物”没有特别的限制，包括但不限：水稻、小麦、大麦等。

如本文所用，DUO基因编码的多肽命名为“DUO”。在本发明中，术语“DUO”指具有DUO活性的SEQ ID NO:1序列的多肽。该术语还包括具有与DUO相同功能的、SEQ ID NO:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，优选地1-30个、1-20个、1-10个、1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，优选地为10个以内，更优选地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。在本领域中，性能相似的氨基酸往往指具有相似侧链的氨基酸家族，在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、乳酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。又比如，在氨基末端和/或羧基末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变多肽或蛋白的功能。对于许多常见已知非遗传性编码氨基酸的保守氨基酸取代本领域已知。其他非编码氨基酸的保守取代可基于其物理性质与遗传上编码的氨基酸的性质的比较来确定。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体。

任何与所述DUO同源性高(比如与SEQ ID NO:1所示的序列的同源性为70％或更高；优选的，同源性为80％或更高；更优选的，同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具有DUO相似或相同功能的多肽也包括在本发明内。所述“相同或相似功能”主要是指调控农作物(如水稻)的农艺性状。

本发明还包括所要求保护的多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO:1差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分了生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外蛋白的化学衍生形式如乙酸化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质合成和加工中进行糖基化修饰。这种修饰可以通过将蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是：(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

此外，任何一种DUO的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，DUO的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的DUO的全部或部分功能。通常情况下，所述生物活性片段至少保持50％的全长DUO的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长DUO的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明还涉及编码本发明DUO或其变体、类似物、衍生物的多核苷酸序列。所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。如本文所用，简并变异体在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:1的蛋白质，但与SEQ ID NO:2所示的编码区序列有差别的核酸序列。“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:1所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，尽管本发明的实例中提供的基因来源于水稻，但是来源于其它类似的植物(尤其是与水稻属于同一科或属的植物)的、与本发明的序列(优选地，序列如SEQ ID NO:1所示)具有一定同源性(如具有70％以上，如80％，85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的DUO的基因序列，也包括在本发明的范围内，只要本领域技术人员在阅读了本申请后根据本申请提供的信息可以方便地从其它植物中分离得到该序列。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的DUO核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的DNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还提供了一种包括本发明的基因的重组载体。作为一种优选的方式，重组载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达本发明目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。作为另一种优选方式，所述的重组载体包括(从5’到3’方向)：启动子，目的基因，和终止子。如果需要，所述的重组载体还可以包括选自下组的元件：3’多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被采用的。

本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有本发明所述的基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。使用本发明的基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子。

包括本发明基因、表达盒或的载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl2法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。所述多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

本文所述多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括(但并不限于)：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

用重组DNA转化宿主可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明提供了所述DUO基因的用途，用于调控植物农艺性状；或用于筛选对于调控植物农艺性状有用的物质(即：所述物质通过调节DUO基因的表达来调节植物农艺性状)。作为一种优选方式，所述DUO基因可用于增加农艺性状。

本发明还涉及DUO上调剂或抑制剂及其用途。由于DUO的上调剂或抑制剂可调节DUO的表达和/或活性等，因此，所述上调剂或抑制剂也可通过对DUO的影响来调控植物农艺性状，从而达到改良植物的目的。

在一个方面，任何可提高DUO的活性、提高其的稳定性、促进其表达、延长其有效作用时间、或促进其基因转录和翻译的物质均可用于本发明，作为DUO基因的“促进剂”，用于调控植物农艺性状。例如提高DUO基因的转录、表达或活性的表达载体。

在另一方面，任何可降低DUO的活性、降低其稳定性、抑制其表达、减少其有效作用时间、或降低其转录和翻译的物质均可用于本发明，作为DUO的下调剂、拮抗剂或抑制剂，如干扰所述DUO基因表达的干扰分子(如可形成microRNA的干扰分子)。所述抑制剂、拮抗剂或抑制剂可用于调控植物农艺性状。在得知了靶序列后，制备干扰特定基因表达的干扰分子的方法是本领域人员熟知的。

此外，为了下调DUO基因表达或活性，可在细胞中转入基因敲除载体，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等编辑该基因。适用于本发明的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9技术为本领域所周知。各技术各自通过DNA识别域与核酸内切酶的共同作用实现靶基因的敲除。在某些实施方案中，通过将SEQ ID NO:2第8-26位和/或第244-263位核苷酸作为靶标进行基于CRISPR/Cas9的基因编辑。

本发明还涉及一种调控植物农艺性状的方法，该方法包括调节所述植物中DUO基因的表达。

一方面，本发明提供了一种调控植物(如作物)农艺性状的方法，所述方法包括：使所述植物过量表达DUO基因，从而增加农艺性状。在得知了所述DUO基因的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述DUO基因的表达。比如可通过本领域人员已知的途径将携带DUO基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的DUO。

作为本发明的一种实施方式，将DUO基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将所述带有外源基因的重组载体导入到植物组织或器官中，使所述植物表达DUO基因。可通过将所述植物组织或器官再生成植物，获得过量表达DUO基因的植物。

另一方面，本发明提供了另一种调控植物(如作物)农艺性状的方法，所述方法包括：降低所述植物中DUO基因的表达(包括使DUO基因不表达或低表达)；从而降低农艺性状。

可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低DUO基因的表达或使之缺失表达，比如将携带反义DUO基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达DUO。或者，可通过本领域人员已知的途径敲除DUO基因，和/或采用基因编辑技术如ZFN、TALEN或CRISPR/Cas9等敲除或敲减DUO基因。

本发明通过正向遗传学方法鉴定了DUO基因，该基因在水稻一次枝梗、二次枝梗原基以及小穗原基中均有强烈表达，在幼叶和维管束原基中也有表达。当用UBI强启动子驱动DUO基因在日本晴中进行过量表达时，可使一次枝梗数目、二次枝梗数目、每穗粒数和单株产量均显著提升；而通过CRISPR/cas9基因编辑技术对此基因进行基因编辑，从而敲除该基因功能，则使得一次枝梗和二次枝梗数目、每穗粒数和单株产量均显著下降。因此，DUO基因是一个对每穗粒数和单株产量起正调节作用的调节子，可使水稻增产，在未来实际的育种中有其独特的应用价值。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料和方法

1.1材料

实验以日本晴(Nipponbare)为转基因起始材料，产生了一系列转基因材料，包括过表达转基因材料和基因编辑敲除的转基因材料。

1.2DUO基因过表达质粒的构建

实验中所用的过表达载体是pNCGR，该载体以pCAMBIA-1300为骨架，引入玉米来源的UBI启动子为强启动子。以日本晴cDNA为模板，PCR扩增获得DUO基因ORF片段，将其连接到pNCGR的UBI启动子之后，构建pDUO-OX质粒。扩增DUO基因ORF的引物为，F端：AGGCGCGCCatggtggggggagaggtca，R端：GGGGTACCGCgagccgcaggtccgtgca。

1.3DUO基因CRISPR/Cas9编辑质粒的构建

基因编辑系统CRISPR/Cas9系统参考发表的文章(Ma X,et al.Mol Plant.2015(8):1274-8)，载体骨架为pCAMBIA-1300(ACCESSION:AF234296)。选择双靶点敲除，靶点1序列：ggggagaggtcatgtgcga，靶点2序列：cactaccacctccccgggaa，启动子为OsU3和OsU6a，构建了pDUO-CSP质粒，具体方法参照前述文章。

1.4农杆菌介导的水稻转化

以日本晴成熟胚为材料，进行愈伤组织诱导，利用农杆菌EHA101(包含pDUO-OX或pDUO-CSP质粒)侵染愈伤组织，愈伤组织经过潮霉素筛选，进一步分化成苗，得到转基因植株T0代。

1.5转基因植株的鉴定和筛选

取转基因材料叶片提取DNA，进行PCR验证和测序验证，分别鉴定DUO-OX植株中是否有正确插入的转基因序列，鉴定DUO-CSP植株中DUO基因是否被编辑及其基因型，从而筛选有单拷贝DUO-OX插入或者DUO基因被编辑的T2代纯合子。

1.6定量PCR检测和mRNA原位杂交

取转基因材料和对照材料的幼穗，提取RNA，反转录为cDNA，利用荧光定量PCR检测DUO基因的表达水平。定量PCR检测引物如下，F端：gtggctcggcacctacgact；R端：acgagcgggaagttggttct。

选取日本晴幼穗(<0.5cm)进行甲醛固定，经过系列酒精脱水、二甲苯透明、石蜡固定，然后切成8uM的切片。以日本晴幼穗cDNA为模板，转录产生DUO基因的antisense RNA探针，利用RNA探针与切片进行杂交，利用DIG抗体偶联的碱性磷酸酶进行显色反应(Luo,D.,等(1996).Nature 383:794–799)。

1.7转基因材料的重要农艺性状的考察

考察经验证的转基因植株种植T1和T2代，同时筛选单拷贝T2代的纯合子，对其进行重要农艺性状的考察，重要的农艺性状包括株高、剑叶长度和宽度、穗长、一次枝梗数目、二次枝梗数目、每穗粒数和单株产量。

实施例1，DUO转基因植株的验证和筛选

结合PCR鉴定和表型考察结果，我们筛选了2个单拷贝独立转化的DUO基因过表达转基因株系(简称DUO-OX)，DUO-OX1和DUO-OX2，其T2代纯合子用于进一步的性状考察。

对于利用CRISPR/Cas9系统编辑DUO基因的转基因株系(简称DUO-CSP)，我们通过PCR和测序鉴定，筛选出两个被编辑的独立株系，DUO-CSP1和DUO-CSP2，它们具有不同的基因型，均编辑在靶点1的位置，即ggggagaggtcatgtgcga(GG)。DUO-CSP1株系在CDS区域有5bp(ATGTG)的缺失，DUO-CSP2株系在CDS区域有2bp(TG)的缺失，两种情况均导致编码的蛋白框出现移位和DUO蛋白功能的缺失(图1)。

实施例2，DUO基因上调表达可增加每穗粒数和单株产量

对松江田间种植的DUO基因的过表达转基因株系(DUO-OX)和基因编辑敲除DUO基因的转基因株系(DUO-CSP)进行了重要农艺性状的考察，同时考察了对照日本晴植株。考察项目包括株高、剑叶长宽、分蘖数、穗部性状(穗长、一次枝梗、二次枝梗数目和每穗粒数)，同时连续两年(2018和2019年)考察了DUO-OX、DUO-CSP和日本晴的单株产量。

我们发现，与对照日本晴相比，DUO-OX植株的株高、剑叶长度和宽度、穗长、一次枝梗数目、二次枝梗数目及每穗粒数，这些性状都显著高于日本晴，而DUO-CSP则相反，所有的性状都显著低于日本晴，说明DUO基因明显促进水稻的营养和生殖生长。但是分蘖数在三者之间没有明显差异(图2-4，表1)。尤其是每穗粒数，DUO-OX1和DUO-OX2分别比日本晴增加62％和71％，而DUO-CPS1和DUO-CSP2则分别比日本晴降低24.4％和31％。就2018年单株产量而言，DUO-OX1和DUO-OX2分别比日本晴高31.8％和38.5％(表1)，而DUO-CPS1和DUO-CSP2则分别比日本晴低25.6％和19.0％。2019年单株产量，DUO-OX1和DUO-OX2分别比日本晴高27.1％和36.5％，而DUO-CPS1和DUO-CSP2则分别比日本晴低28.1％和14.1％(表1)。

上述表型在T0代、T1代和T2代，以及连续后代持续表现，说明转基因表型是可稳定遗传的，因此证明DUO基因是一个促进水稻生长的调节因子，可以正向调控水稻每穗粒数和单株产量，对于未来水稻增产具有其独特的应用价值。

表1：田间DUO转基因植株与日本晴对照的各种重要农艺性状的比较

***表示具有极其显著的差异

实施例3，DUO基因表达模式及转基因植株中DUO表达水平的验证

我们利用mRNA原位杂交技术确定DUO基因在水稻花序发育、枝梗发育和小穗发育时期的表达模式，结果显示DUO基因在花序原基、一次枝梗原基、二次枝梗原基和穗粒原基均有比较强的表达，在幼叶原基和微管束原基中也有强表达(图5)，这种表达模式与转基因表型非常一致，再次说明DUO基因是一个生长发育的正向调节基因，其上调表达可以增加每穗粒数，从而增加单株产量。

我们利用荧光定量PCR技术，鉴定了日本晴对照、DUO-OX1、DUO-OX2、DUO-CSP1和DUO-CPS2转基因株系幼穗(<0.5cM)中，DUO基因的表达情况，与预期一致的是，DUO基因的表达水平在DUO-OX转基因株系中被大幅度提高，而在日本晴对照和DUO-CSP株系中则表达水平较低(图6)。DUO基因的表达水平与其表型相呼应，说明DUO基因表达水平与产量有显著的正相关。

本文所涉序列

DUO蛋白	SEQ ID NO:1
		DUO基因编码序列	SEQ ID NO:2
DUO-OXF1	SEQ ID NO:3
		DUO-OXR1	SEQ ID NO:4
DUO-cspF1	SEQ ID NO:5
		DUO-cspR1	SEQ ID NO:6
DUO-cspF2	SEQ ID NO:7
		DUO-cspR2	SEQ ID NO:8
DUO-insitu-F1	SEQ ID NO:9
		DUO-insitu-R1	SEQ ID NO:10
DUO-ORF-qF1	SEQ ID NO:11
		DUO-ORF-qR1	SEQ ID NO:12
sgRNA1	SEQ ID NO:13
		sgRNA2	SEQ ID NO:14

序列表

<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心

<120> 一种调控穗粒数的基因及其应用

<130> 20A635

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 190

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Val Gly Gly Glu Val Met Cys Glu Ala Ala Ala Pro Arg Tyr Arg

1 5 10 15

Gly Val Arg Lys Arg Pro Trp Gly Arg Phe Ala Ala Glu Ile Arg Asp

20 25 30

Pro Ala Lys Arg Ala Arg Val Trp Leu Gly Thr Tyr Asp Ser Ala Glu

35 40 45

Ala Ala Ala Arg Ala Tyr Asp Val Ala Ala Arg Asn Leu Arg Gly Pro

50 55 60

Leu Ala Arg Thr Asn Phe Pro Leu Val Ser Ser Leu Pro Leu Pro Ser

65 70 75 80

Pro His Tyr His Leu Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Val

85 90 95

Ala Gly Pro Ala Cys Ser Ala Ser Ser Thr Val Glu Ser Ser Ser Gly

100 105 110

Pro Arg Gly Pro Arg Pro Ala Ala Thr Ala Ala Ala Val Pro Arg Arg

115 120 125

Arg Val Pro Arg Pro Ala Pro Pro Ala Pro Asp Ala Gly Cys His Ser

130 135 140

Asp Cys Ala Ser Ser Ala Ser Val Val Asp Asp Ala Asp Asp Ala Ser

145 150 155 160

Thr Val Arg Ser Arg Val Ala Ala Phe Asp Leu Asn Leu Pro Pro Pro

165 170 175

Leu Asp Arg Asp His Val Asp Leu Cys Thr Asp Leu Arg Leu

180 185 190

<210> 2

<211> 573

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atggtggggg gagaggtcat gtgcgaggcg gcggcgccga ggtacagggg ggtgaggaag 60

cggccgtggg ggaggttcgc ggcggagatc cgggacccgg cgaagcgggc gcgcgtgtgg 120

ctcggcacct acgactccgc cgaggccgcg gcgcgggcct acgacgtcgc cgcgcggaac 180

ctccgcggcc cgctcgccag aaccaacttc ccgctcgtct cctccctccc gctcccgtcg 240

ccccactacc acctccccgg gaaggcggcg gcggcggcgc cgccggtggc cggccccgcg 300

tgcagcgcga gctccaccgt cgagtcctcg agcgggcctc gcgggcccag accggcggcc 360

acggcggcgg cggtgccccg gaggcgggtc ccgcggcccg cgccaccggc gcccgacgcc 420

ggctgccaca gcgactgcgc ctcgtcggcc tccgtcgtgg acgacgccga cgacgcctcc 480

accgttcggt cccgcgtggc ggcgttcgac ctcaacctcc cgccgccgct ggaccgggac 540

cacgtcgacc tgtgcacgga cctgcggctc tga 573

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aggcgcgcca tggtgggggg agaggtca 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ggggtaccgc gagccgcagg tccgtgca 28

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gccgggggag aggtcatgtg cga 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aaactcgcac atgacctctc ccc 23

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggcacactac cacctccccg ggaa 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

aaacttcccg gggaggtggt agtg 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

agaaccaact tcccgctcgt 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aatcgtcttc tccggttgct t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gtggctcggc acctacgact 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

acgagcggga agttggttct 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ggggagaggt catgtgcga 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cactaccacc tccccgggaa 20

<210> 15

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agccaaatcc gccgcgtctc agctcaaccc agcagcgcag cagctcaagc cttctcgcgt 60

tgcagcgccg cgccgaggag gtgtttgttg atttgtggag 100

Claims

1.物质在调控植物的农艺性状中的用途，所述物质选自下组：DUO基因或其编码蛋白、或其促进剂或抑制剂，所述农艺性状选自以下的一种或多种：植物株高、叶长度、叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量，

优选地，所述植物是禾谷类作物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述DUO基因编码的氨基酸序列选自：

(a)具有SEQ ID NO:1所示序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；或

(c)与(a)的多肽序列有90％以上同源性且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；

和/或，

所述DUO基因的核酸序列选自：

(1)编码如SEQ ID NO:1所示多肽的多核苷酸；

(2)如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或与其具有80％以上同源性的多核苷酸；

(3)在SEQ ID NO:2所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个核苷酸的多核苷酸；

(4)与(1)-(3)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，

所述促进剂选自下组：小分子化合物、核酸分子或其组合；

所述抑制剂是特异性干扰DUO基因转录或表达的抑制分子，优选地，所述抑制分子以DUO基因或其转录本作为抑制靶标，更优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

4.一种调控植物农艺性状的方法，所述方法包括：调节植物中DUO基因的表达或活性，从而调控植物农艺性状，所述农艺性状选自以下的一种或多种：植物株高、叶长度、叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量，

优选地，所述调控植物农艺性状的方法包括：上调植物中DUO基因的表达；从而增加植物株高、增加剑叶长度、增加剑叶宽度、增加穗长、增加枝梗数目、增加每穗粒数和/或增加单株产量；更优选地，所述上调植物中DUO基因的表达包括：将DUO基因转入植物，获得转化的植物，

优选地，所述调控植物农艺性状的方法包括：下调植物中DUO的表达；从而降低植物株高、降低剑叶长度、降低剑叶宽度、降低穗长、降低枝梗数目、降低每穗粒数和/或降低单株产量；更优选地，所述下调植物中DUO基因的表达包括：将下调DUO基因转录、蛋白表达或蛋白活性的抑制剂转入植物中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述抑制剂是特异性干扰DUO基因转录或表达的抑制分子，

优选地，所述抑制分子以DUO基因或其转录本作为抑制靶标，

更优选地，所述抑制分子选自下组：(1)小分子化合物、反义核酸、microRNA、siRNA、RNAi、dsRNA、sgRNA、抗体或其组合，和(2)能表达或形成(1)的核酸构建物。

6.一种DUO基因的用途，用于作为鉴定植物农艺性状的分子标记，

优选地，所述农艺性状包括：植物株高、剑叶长度、剑叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量。

7.一种表达DUO基因的表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件：5’UTR区、DUO基因的ORF序列、和终止子。

8.一种核酸构建物，其包含权利要求7所述的表达盒或其互补序列，

优选地，所述核酸构建物是表达载体或重组载体。

9.权利要求7所述的表达盒的用途，用于调节作物的选自下组的农艺性状：植物株高、叶长度、叶宽度、穗长、枝梗数目、每穗粒数、单株产量。

10.靶向DUO基因的sgRNA或能产生所述sgRNA的核酸构建物，

优选地，所述sgRNA以SEQ ID NO:2第8-26位和/或第244-263位核苷酸作为靶标。