CN112725359B

CN112725359B - 水稻穗型调控基因sdp1及其应用

Info

Publication number: CN112725359B
Application number: CN202110237715.9A
Authority: CN
Inventors: 汪得凯; 孙宗修; 傅亚萍; 裘霖琳; 刘窍
Original assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Current assignee: Zhejiang Sci Tech University ZSTU
Priority date: 2021-03-04
Filing date: 2021-03-04
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2041-03-04
Also published as: CN112725359A

Abstract

本发明涉及植物基因工程领域，具体而言，涉及一种水稻穗型调控基因SDP1及其应用。本发明采用图位克隆结合T‑DNA标签的方法克隆得到调控水稻穗发育的基因SDP1，其具有如SEQ ID NO：1所示的DNA序列；并通过突变体表型分析及过量表达分析证明了SDP1基因在调控水稻穗型的重要作用。SDP1基因的克隆不仅丰富了水稻穗型调控的分子机理研究，在也为水稻穗型遗传改良提供了新的基因资源，为水稻分子设计育种提供了新的种质资源。在水稻中过量表达SDP1可以培育直立密穗水稻品种，为拓宽现有的直立穗型品种的遗传基础提供了新的思路和途径。

Description

水稻穗型调控基因SDP1及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体而言，涉及一种水稻穗型调控基因SDP1及其应用。

背景技术

水稻是我国乃至世界上的重要粮食作物，全世界超过一半人口以稻米为主食，水稻生产在我国的粮食安全中占有极为重要的地位，穗型直接影响水稻最终产量，是水稻育种最受关注的性状之一。水稻的穗长和着粒密度是影响产量的重要因素，因此，阐明穗发育的遗传基础和分子调控机理有助于改良水稻的穗型和产量。穗型直接影响水稻最终产量，是水稻育种最受关注的性状之一，水稻穗型主要由初级和次级枝梗的形态、数量和长度决定，对水稻穗型的研究很大程度集中于对穗分枝(panicle branching)的数量和状态的研究。综观世界范围内水稻产量不断增加的过程，从第一次“绿色革命”——矮化育种到上世纪90年代初日本、国际水稻研究所(IRRI)、中国相继开展的“新株型”育种(超级稻育种)、北方粳稻直立穗(DEP1基因)的育种应用，到近年来受广泛关注的理想株型基因-IPA1/SPL14的遗传应用，都与水稻株型和穗型的遗传改良密切相关。

随着水稻基因组测序计划的全面完成和功能基因组学的全面实施，为研究水稻穗型形成的分子机理提供了良好的基础。为实现在现有产量水平上实现单产水平的进一步突破，充分挖掘作物产量遗传潜力，对穗型形成的分子机理进行遗传解析具有重要的理论意义和应用价值。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本公开涵盖以下实施方案：

分离的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

如上所述核酸表达得到的分离的蛋白质。

重组DNA构建体，包含可操作地连接到至少一个异源调控序列的如上所述的核酸。

宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或如上所述的蛋白质，或被如上所述的重组DNA构建体所转化。

生产转基因稻的方法，包括将如上所述的重组DNA构建体引入稻属植物；

其中所述核酸在稻中的表达调节稻穗发育及穗型功能。

如上所述的方法产生的转基因稻属植物用于产生水稻繁殖材料的用途，其中繁殖材料适宜于有性繁殖、植物性繁殖或可再生的细胞的组织培养。

本发明sdp1突变体是从野生型水稻日本晴T-DNA插入突变体库中筛选到的，突变体穗轴和枝梗缩短,着粒密度变大，穗直立，命名为sdp1(short and dense panicle1)，遗传分析表明，该突变为不完全显性单基因遗传。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中sdp1突变体的表型；图A和图B分别是野生型日本晴、杂合体和纯合突变体的株型和穗型，WT为野生型日本晴，WT/sdp1为突变杂合体，sdp1/sdp1为突变纯合体。

图2为实施例2中SDP1基因的定位和表达分析，其中，图A为图位克隆所用的标记和定位示意图；图B为T-DNA插入位点共分离分析，A1-A3为野生型表型，B1-B7为杂合体，C1-C4为纯合突变体；M为marker，P为含T-DNA区的质粒对照。

图3为实施例3中候选基因表达分析；图A所示的定位区间中T-DNA插入位点示意图；图B为T-DNA插入位点前后各3个基因的半定量PCR表达分析，UBQ5为基因表达分析的内参基因；图C为T-DNA插入位点前后各3个基因的qPCR表达分析，UBQ5为基因表达分析的内参基因。

图4为实施例4中SDP1基因过量表达转基因植株的qPCR分析和表型，其中，图A为过量表达植株的qPCR分析；图B为野生型和过量表达SDP1基因的单株表型；图C为野生型和过量表达SDP1基因的穗型。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

名词定义

在陈述本发明的详细内容之前，应当了解被使用于本说明书中的数个用语。

“稻属”或“稻”或“水稻”是禾本科的一属(Oryza)，其优选包括O.sativa种，进一步包括籼稻O.s.indica、粳稻O.s.japonica或者热带粳稻O.s.javanica亚种。

“农学上优良的(性状)”，如本文使用的，指基因型，其具有许多可辨别性状的较佳或最佳表现，其允许生产者收获具有商业重要性的产品。包括但不限于种子产量、萌发势、营养势、抗病性、绿度、生长速率、总生物质或累积速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、谷粒收率、总植株氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植株游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植株蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮吸收、根倒伏、收获指数、茎杆倒伏、植株高度、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序大小、早期幼苗活力以及低温胁迫下的出苗情况等。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

“杂交”两种亲本植物的交配。

“核酸”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用并且是指单链或者双链的RNA和/或DNA的聚合物，其任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。-核苷酸(通常以其5′-单磷酸盐形式存在)通过如下的单字母代码指代：“A”表示腺苷酸或脱氧腺苷酸，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，并且“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，分别对应RNA或DNA；“U”表示尿苷酸；“T”表示脱氧胸苷酸；“R”表示嘌呤(A或G)；“Y”表示嘧啶(C或T)；“K”表示G或T；“H”表示A或C或T；“I”表示肌苷；并且“N”表示任一核苷酸。

“分离的”是指这样的物质，诸如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常与其相伴随或相互作用的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括如下修饰，包括但不限于：糖基化、脂质连接和硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“重组的”是指例如通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸区段来实现的两个原本分离的序列区段的人工组合。“重组的”也包括指涉已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源自经过这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖天然发生的事件(例如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，所述天然发生的事件诸如不经蓄意人为干预而发生的那些事件。

“重组DNA构建体”是指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或者源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。在一些具体的实施方式中，重组DNA构建体为质粒或病毒。在一些实施方式中，本发明所述重组DNA构建体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

本发明涉及分离的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明所请求保护的核酸片段基因还包括与核苷酸序列SEQ ID NO：1所示的核酸片段中的一个或多个高度同源，并且具有同样的调控稻属植物穗发育及穗型功能的高度同源的等价体序列。

所述高度同源的功能等价体序列包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1所示的序列的DNA杂交的DNA序列。本发明中使用的“严格条件”是公知的，包括诸如在含400mMNaCl、40mM PIPES(pH6.4)和1mM EDTA的杂交液中于60℃杂交12～16小时，然后在65℃下用含0.1％SDS、和0.1％SSC的洗涤液洗涤15～60分钟。

功能等价体序列还包括与SEQ ID NO：1所示序列有至少90％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性，且具有同样的调控稻属植物穗发育及穗型功能的基因序列，可以从任何植物中分离获得。其中，序列同一性的百分比可以通过公知的生物信息学算法来获得，包括Myers和Miller算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对法(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对法(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman相似性搜索法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这对于本领域技术人员来说是熟悉的。

上述核酸能够调控稻属植物穗发育及穗型功能，具体的讲，能够使得穗明显缩短，穗型直立且着粒密度增加。

诸如穗型以及粒密度的参数通常相对于对照细胞或对照植物展示。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供度量其中已针对目的基因实现了遗传改变(诸如转化)的受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。受试植物或植物细胞可从作了如此改变的植物或细胞遗传而来，且将包含该改变。本领域的普通技术人员将易于认识到在使用如本文所述的组合物或方法评估或测量转基因植物的农学特性或表型时待利用的合适的对照或参照植物。

对照植物或植物细胞可包括例如：(a)野生型(WT)植物或细胞，即具有与用于进行遗传改变的起始材料相同的基因型的植物或细胞，该遗传改变得到主题植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对目的性状不具有已知效果的构建体，诸如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为主题植物或植物细胞的子代中的非转化分离体的植物或植物细胞；(d)遗传上与主题植物或植物细胞相同但未暴露于将诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者(e)处于其中目的基因不表达的条件下的主题植物或植物细胞本身。对照可包括多个代表一个或多个以上类别的个体；例如，“c”类的非转化分离体的集合通常称为批量无效对照。

本发明还涉及如上所述核酸表达得到的分离的蛋白质。

本发明还涉及重组DNA构建体，其包含可操作地连接到至少一个异源调控序列的如上所述的核酸。

本发明还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或如上所述的蛋白质，或被如上所述的重组DNA构建体所转化。

本发明所提供的核酸片段可被插入质粒、粘粒、酵母人工染色体、细菌人工染色体或其他适合转化进宿主细胞中的任何载体中。优选的宿主细胞是细菌细胞，尤其是用于克隆或储存多核苷酸、或用于转化植物细胞的细菌细胞，例如大肠杆菌、农杆菌、根瘤土壤杆菌和毛根土壤杆菌。

本发明还涉及生产转基因稻的方法，包括将如上所述的重组DNA构建体引入稻属植物；

其中所述核酸在稻中的表达调节稻穗发育及穗型功能。

在一些实施方式中，所述重组DNA构建体通过如上所述的宿主细胞导入引入稻。

本发明的方法还可直接将所述核酸引入植物产生转基因稻，使用植物生物技术领域技术人员已知的转化方法制备。任何方法可被用于将重组表达载体转化进植物细胞中，以产生本发明的转基因植物。转化方法可包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括脂质体介导的转化、使用基因枪导入、电穿孔、以及花粉管通道法等。

在一些实施方式中，所述重组DNA构建体通过杂交的方式引入稻。

在一些实施方式中，所述方法包括：

1).测定第一稻属植物是否具有SEQ ID NO：1所示核酸片段；

2).任选地对第一稻属植物的穗表型进行验证；

3).将所述第一稻属植物与第二稻属植物杂交以产生子代植物；

4).任选地使用步骤3)中所述的子代植物作为原材料，重复步骤1)-3)2-10次，以产生其它子代植物。

在一些实施方式中，所述第二稻属植物为农学上优良的品种。

本发明还涉及如上所述的方法产生的转基因稻属植物用于产生水稻繁殖材料的用途，其中繁殖材料适宜于有性繁殖、植物性繁殖或可再生的细胞的组织培养；

在一些实施方式中，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料选自小孢子，花粉，子房，胚珠，胚囊和卵细胞。

在一些实施方式中，适宜于植物性繁殖的所述繁殖材料选自插枝，根，茎，细胞，原生质体。

在一些实施方式中，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自叶，花粉，胚，子叶，下胚轴，分生组织细胞，根，根端，花药，花，种子和茎。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

实施例1水稻sdp1突变体表型和遗传特性分析

在粳稻日本晴T-DNA插入突变体库的后代中，筛选到一种穗明显缩短，穗型直立且着粒密度增加的植株，命名为水稻sdp1突变体。植株表型和穗型如图1中的A和B所示，同一突变株系中可见两种突变体，其中一种为极端突变体，另外一种表型位于野生型和极端型之间，两类突变体单株收获，通过后代株系的表型分离确定遗传特性。调查分析了8个单株后代株系的表型，其中极端突变体自交后代，全部出现极端表型，不再分离，而中间型表型后代出现野生型：中间型：极端型＝1:2:1的分离关系，三种表型的分离比为1:1.84:0.91(符合1:2:1，Х²＝0.14，P>0.05)。以上结果表明，sdp1突变体表型属于单基因控制的不完全显性突变。

实施例2SDP1基因的基因定位和T-DNA插入位点分析

利用sdp1突变体与籼稻品种龙特甫B(公开使用的水稻品种，市售)构建的F2群体(sdp1与龙特甫B杂交得到F1，F1自交一代得到F2群体)，选择sdp1极端表型的93个纯合突变体表型进行基因定位，选用日本晴和龙特普B之间，分布于水稻12条染色体有多态性的183对SSR标记进行筛选，根据已知的SSR扩增程序进行PCR扩增，PCR产物取10ul，用4％的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色后拍照，记录实验结果，结果发现位于第2染色体的SSR标记RM240、RM166和RM266与SDP1连锁，进一步在RM240和RM266之间发展加密SSR标记，最终将其初步定位在第2号染色体上的SSR标记RM208和RM7337之间，遗传距离分别为3.5cM和2.3cM，与RM3850共分离(图2中的A)。随后通过遗传分析发现T-DNA与sdp1表型共分离，利用T-DNA中的HPT基因设计引物，对F2分离群体中的HPT基因进行PCR扩增，发现sdp1杂合体和纯合体均可以扩增出目的条带，而野生型表型不能扩增(图2中的B)，表明突变表型与T-DNA插入共分离。

扩增HPT的引物序列如下

HPTII-F:CAGAAGAAGATGTTGGCGAC

HPTII-R:ATGTCCTGCGGGTAAATAGC

利用TAIL-PCR分离了T-DNA插入位点的旁侧序列，通过NCBI网站进行BLAST比对分析，发现T-DNA插入到水稻第2染色体克隆P0474F11上61.2kb处两个基因之间，位于前述定位已经定位的SDP1所在的SSR标记RM208和RM7337的区间，表明sdp1表型可能是T-DNA插入引起。

TAIL-PCR分离得到的T-DNA插入位点的旁侧序列如下：

1ATAAGTCCCG TTGCTCGTGC AACCGTTTGC ACGTGTGGCG TGCCAATCTC TTTTCGTCGT

61CGTCTCGTAA TCTGCACGAG CACACGATAC ATTCTACGTA AGTTGCGTAT AGTTTTGGTT

121AATACGGTCA AACAGCCAGT GACCAAGCAG GCATTATACT TTCTCTGCAT GCATGTGTAC

181TCTGATACTA CCTTTTTCAT GGACAAGAAC CAAGATCATA TACTCGAAGT CTGCATCATT

241CAGATAGTCA ATCGACAGTT GCATATCATA AATACTACTC TGTAGCCTCA GAAATTAAGG

301AGAAGTAAGC TAGAATGCGG TTAAGGAGAT AGGGGACAAT AACTGCTTGG AAGAAGAAAG

361AAAGAAAAGA AGATCGAAAT AAAGCAGCAA C

实施例3候选基因表达分析

为了鉴定候选基因SDP1，分别对T-DNA插入位点上下游各3个基因进行了RT-PCR半定量分析(图3A)，具体步骤如下：

(1)Trizol法提取野生型和sdp1突变体幼穗发育第III期的RNA，野生型和sdp1突变体各取3个生物学重复。

(2)用TOYOBO公司的ReverTra

qPCR RT Master Mix with gDNA Remover反转录试剂进行逆转录第一链(cDNA)合成，按照产品说明书操作。

(3)用NOVO protein公司的2*PCR Master Mix试剂进行半定量PCR检测，以水稻UBQ5为内参基因。

半定量PCR所用引物如下

ORF1-qPCR-F(5’-3’):AGATCAACCTCCAACTACTCTC

ORF1-qPCR-R(5’-3’):AAGCTCAGTAGTACACAGGC

ORF2-qPCR-F(5’-3’):GTGGTTCCAGAAGATCGTGTC

ORF2-qPCR-R(5’-3’):TTGTCGATGGACAGGAGCTC

ORF3-qPCR-F(5’-3’):CACGCCTACGACAACATGAAC

ORF3-qPCR-R(5’-3’):GTACTCGAACGCGTTGACATC

ORF4-qPCR-F(5’-3’):CCGGTGATACAAAGAGGTGC

ORF4-qPCR-R(5’-3’):ATATGCTTCGGCCACCTTG

ORF5-qPCR-F(5’-3’):AGCGGTTGTCTGGTGATATC

ORF5-qPCR-R(5’-3’):AGACAGAAAACCCCTTGACG

ORF6-qPCR-F(5’-3’):CAGCTTCTGATCCTGCAGTAG

ORF6-qPCR-R(5’-3’):ATCTCCCTTACTGATGCTGAC

UBQ5-qPCR-F(5’-3’):ACCACTTCGACCGCCACTACT

UBQ5-qPCR-R(5’-3’):ACGCCTAAGCCTGCTGGTT

半定量PCR反应程序为：

94℃/5min-(94℃/30sec-55℃/30sec-72℃/1min)×25个循环，72℃/5min,16℃保存。PCR产物取8ul，用1％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照。

对野生型和sdp1突变体中6个基因进行表达分析的结果显示，LOC_Os02g57480(ORF2)、LOC_Os02g57470(ORF3)、LOC_Os02g57500(ORF4)、LOC_Os02g57460(ORF5)和LOC_Os02g57510(ORF6)这5个基因在sdp1突变体中的表达量和野生型相比没有显著差异，LOC_Os02g57490(ORF1)基因在野生型中表达量很低，但是在sdp1突变体中其表达水平显著上调(图3中的B)。

(4)利用前述方法获得的cDNA，采用

qPCR Mix进行反应，在ABI7900HT仪器上进行扩增，依照产品说明书完成操作，10ul反应体系含1ul反转录产物。

qPCR所用反应参数为：95℃/1min-(95℃/15sec-55℃/30sec-72℃/30sec)×40个循环，反应结束后采用2^-ΔΔCT法对基因相对表达量进行比较。结果发现，T-DNA插入位点下游LOC_Os02g57490(ORF1)基因在sdp1突变体中其表达水平显著上调，而其他几个分析的基因表达量无显著差异(图3中的C)，与前述半定量结果相符。结果表明，LOC_Os02g57490可能是SDP1的候选基因。

实施例4转基因功能验证

由于sdp1为功能获得性突变，为了验证SDP1基因的功能，本发明利用pCAMBIA2300载体构建了水稻Actin1启动子驱动的SDP1过量表达载体，命名pCAMBIA2300-Act1-SDP1-OE，通过农杆菌EHA105介导法转化水稻品种日本晴，步骤如下：

(1)以SDP1基因序列(SEQ ID NO：1)为模板，设计如下引物：

SDP1-SalI-F：5′-ATGTCGACATGGCTGGTGCTACGGCTGC-3′；

SDP1-PstI-R：5′-ATCTGCAGCTGAGAGTAGTTGGAGGTTGAT-3′。

(2)利用上述引物对进行PCR扩增SDP1基因，获得的目标基因片段用Sal I和Pst I双酶切、回收，连接到用同样酶酶切后回收的线性化pCAMBIA2300-Act1-Nos载体上，形成pCAMBIA2300-SDP1-OE载体，测序验证。

(3)将测序正确的pCAMBIA2300-SDP1-OE载体转化农杆菌EHA105。

水稻转基因的具体方法参照“Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.1994,6(2):271-282.”。

利用G418筛选获得抗性愈伤，将抗性愈伤组织转移到含有150mg/L的G418的预分化培养基上预分化10d左右，然后转移至分化培养基上培养1个月左右，获得转基因植株。获得的转基因植株用NPTII引物进行扩增，NPTII引物如下：

NPTII-F：TATGTCCTGATAGCGGTCCG

NPTII-R：GTGCCCTGAATGAACTCCAG

反应程序为：

94℃/5min-(94℃/30sec-55℃/30sec-72℃/1min)×30个循环，72℃/5min-16℃保存。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。检测阳性的植株移栽到田间，抽穗期观察植株表型并进行qPCR验证。

(4)转基因植株的鉴定和表型。随机选取3株pC2300-SDP1-OE过量表达载体转化植株和1株空载体转化植株幼穗期第III期的幼穗，提取RNA，反转录，并进行qPCR(实验方法同实施例3)，结果3株pC2300-SDP1-OE过量表达载体转化植株的幼穗，SDP1基因表达量比空载体转化对照植株显著增加(图4A)。至抽穗期，SDP1基因的过量表达植株，其稻穗变短，着粒密度变大，穗直立，表型与sdp1突变体类似(图4中的B、C)。

上述研究结果表明，sdp1突变体表型确实是由SDP1基因的过量表达引起的。此外，本实施例也表明，通过上调SDP1基因表达获得直立密穗水稻品种具有极强的可操作性。

利用基因定位结合T-DNA标签，确定T-DNA插入位点与表型共分离，利用TAIL-PCR分离了T-DNA插入位点的旁侧序列，Blast比对分析发现，T-DNA均插入到水稻第2染色体两个基因之间，利用RT-PCR对sdp1的T-DNA插入位点上下游各3个基因进行了表达分析，发现位于T-DNA插入位点下游的一个编码LOB家族转录因子基因(LOC_Os02g57490)的表达量明显增加，而其他5个基因的表达量变化不明显，提示该基因可能为SDP1的候选基因，由于sdp1突变表现为SDP1基因的过量表达引起，为了进一步验证基因的功能，针对SDP1的候选基因构建了水稻Act1(Actin1)启动子驱动的SDP1过量表达载体pCAMBIA2300-Act1-SDP1-OE载体，通过农杆菌(EHA105)转化野生型日本晴，转化后代分析表明，过量表达SDP1基因的植株表型与sdp1类似，验证了本发明SDP1基因是控制水稻穗型的目的基因。目前尚无SDP1基因调控穗型发育方面的研究，因此，本发明的目的基因SDP1是一个调控水稻穗型的新基因，SDP1基因在调控水稻穗型方面具有广阔的应用前景。

综上所述，本发明得出结论：SDP1基因的过量表达是产生sdp1突变表型的原因；SDP1基因对水稻穗型具有重要的负向调控作用；通过调节SDP1基因表达水平对于水稻穗型遗传改良具有极强的可操作性。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江理工大学

<120> 调控水稻穗型的基因SDP1及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 651

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

atggctggtg ctacggctgc cggcgctgcc gctgccgcgg cggggacggg agccgggtcg 60

ccgtgcggcg cgtgcaagtt cttgcggcgg cggtgcgtgc cggagtgcgt gttcgcgccc 120

tacttcagct cggagcaagg ggcggcgagg ttcgcggcga tccacaaggt gttcggcgcc 180

agcaacgcct ccaagctcct ctcccacctc cccgtcgccg accgctgcga ggccgtcgtc 240

accatcacct acgaggccca ggccaggctc cgcgaccccg tctatggctg cgtcgcccaa 300

atcttcgccc tccagcagca ggtcgcgatc ctgcaagcgc agctgatgca ggcgagggcg 360

cagctggcgt gcggcatcca gagcagctcg cactctccgg tgagctggcc ggacagcggc 420

agcatcagcg cgctactccg gcaggacatg gcgagaaggc cgcccggcgg cgccctcgac 480

gactgcttcg gcggcggcgg cgcgctgctg ccggagctca tggcggccgg cttcaaggac 540

gacgtcgccg ccgtgcagat gcagcagcat tgctccaagg cggtggacgc cggcgagctc 600

cagtatctgg cccaggcgat gatgagatca acctccaact actctcagta g 651

<210> 2

<211> 216

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2

Met Ala Gly Ala Thr Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr

1 5 10 15

Gly Ala Gly Ser Pro Cys Gly Ala Cys Lys Phe Leu Arg Arg Arg Cys

20 25 30

Val Pro Glu Cys Val Phe Ala Pro Tyr Phe Ser Ser Glu Gln Gly Ala

35 40 45

Ala Arg Phe Ala Ala Ile His Lys Val Phe Gly Ala Ser Asn Ala Ser

50 55 60

Lys Leu Leu Ser His Leu Pro Val Ala Asp Arg Cys Glu Ala Val Val

65 70 75 80

Thr Ile Thr Tyr Glu Ala Gln Ala Arg Leu Arg Asp Pro Val Tyr Gly

85 90 95

Cys Val Ala Gln Ile Phe Ala Leu Gln Gln Gln Val Ala Ile Leu Gln

100 105 110

Ala Gln Leu Met Gln Ala Arg Ala Gln Leu Ala Cys Gly Ile Gln Ser

115 120 125

Ser Ser His Ser Pro Val Ser Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ile Ser Ala

130 135 140

Leu Leu Arg Gln Asp Met Ala Arg Arg Pro Pro Gly Gly Ala Leu Asp

145 150 155 160

Asp Cys Phe Gly Gly Gly Gly Ala Leu Leu Pro Glu Leu Met Ala Ala

165 170 175

Gly Phe Lys Asp Asp Val Ala Ala Val Gln Met Gln Gln His Cys Ser

180 185 190

Lys Ala Val Asp Ala Gly Glu Leu Gln Tyr Leu Ala Gln Ala Met Met

195 200 205

Arg Ser Thr Ser Asn Tyr Ser Gln

210 215

Claims

1.生产转基因水稻的方法，包括将重组DNA构建体引入水稻；

所述重组DNA构建体包含可操作地连接到至少一个异源调控序列的核苷酸序列如SEQID NO：1所示的核酸；

其中所述核酸在水稻中的表达调节稻穗发育及穗型。

2.根据权利要求1所述的方法，所述重组DNA构建体通过宿主细胞引入水稻；

所述宿主细胞含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的核酸。

3.根据权利要求2所述的方法，所述重组DNA构建体通过基因枪介导转化法、花粉管通道法或脂质体转化法引入水稻。

4.根据权利要求2所述的方法，所述重组DNA构建体通过杂交的方式引入水稻。

5.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括：

（1）. 测定第一水稻是否具有SEQ ID NO：1所示核酸片段；

（2）.对第一水稻的穗表型进行验证；

（3）. 将所述第一水稻与第二水稻植物杂交以产生子代植物；

（4）.使用步骤（3）中所述的子代植物作为原材料，重复步骤（1）-（3）2-10次，以产生其它子代植物。

6.权利要求1～5任一项所述的方法产生的转基因水稻用于产生水稻繁殖材料的用途，其中繁殖材料适宜于有性繁殖或可再生的细胞的组织培养。

7.根据权利要求6所述的用途，适宜于有性繁殖的所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。

8.根据权利要求6所述的用途，适宜于可再生的细胞的组织培养的所述繁殖材料选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、花药、花、种子和茎。