JP7023979B2 - タンパク質ｎｏｇ１の植物収量と一穂粒数の調節への応用 - Google Patents
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Description
本発明は、生物技術の分野に関し、具体的には、タンパク質ｎｏｇ１の植物収量と一穂粒数の調節への応用に関する。
イネは、世界で最も重要な食用作物の一つであり、１２０以上の国でイネを栽培し、栽培面積が常に１．５億ヘクタール以上に保持され、世界で５０％の人口は、イネを主食とする。人口が増加し続けているが栽培可能耕地面積が年々減少している現在、イネの単位面積当たりの収量の増加は、世界食糧安全保障のための有力な措置の一つである。半世紀余り以来のイネ育種史を振り返ると、中国ではイネの単位面積当たりの収量が、矮性育種を標識とする緑の革命と、イネの雑種強勢の利用との二回の飛躍を遂げた。しかし、ここ２０年、イネの単位面積当たりの収量は、ずっと停滞して進まない。研究者は、現在生産に利用する多くの栽培品種が同じ又は類似する遺伝源を有し、イネ栽培種の遺伝資源に対する利用が飽和する傾向があり、イネ品種間の狭い遺伝的多様性により、イネ品種の遺伝基礎と遺伝子型が近くなり、イネの収量の潜在力のさらなる向上を制限するボトルネックとなっていると考えている。
普通野生イネ（Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ Ｇｒｉｆｆ．）は、アジアの栽培イネの野生祖先種であり、人工的に馴化された栽培イネに比べて、より豊富な遺伝的多様性と遺伝子資源を有する。普通野生イネは、遺伝分化型が栽培イネよりもはるかに多く、イネ収量を高めることができる豊富な遺伝子を含む。従って、普通野生イネのゲノムから、栽培イネでは既に失われた又は弱められた優れた馴化遺伝子を見つけ出して利用し、それらをイネ育種や生産に用いることは、非常に重要な理論的意義と実践価値があり、現在のイネ育種の難題を解決するための有効な経路ともなっている。
本発明が解決しようとする技術課題は、植物収量と一穂粒数を如何に調節するかである。
前記技術課題を解決するために、本発明は、まず、ａ１）、ａ２）、ａ３）又はａ４）であってもよいタンパク質ｎｏｇ１の植物収量及び／又は一穂粒数の調節への応用を提供する。
ａ１）アミノ酸配列が配列表における配列番号２に示されるタンパク質、
ａ２）配列表における配列番号２に示されるタンパク質のＮ端及び／又はＣ端にタグを接続した融合タンパク質、
ａ３）配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加した、植物収量及び／又は一穂粒数に関するタンパク質、
ａ４）ａ１）で定義されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するタンパク質。
ａ１）アミノ酸配列が配列表における配列番号２に示されるタンパク質、
ａ２）配列表における配列番号２に示されるタンパク質のＮ端及び／又はＣ端にタグを接続した融合タンパク質、
ａ３）配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加した、植物収量及び／又は一穂粒数に関するタンパク質、
ａ４）ａ１）で定義されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するタンパク質。
そのうち、配列表における配列番号２は、３８９個のアミノ酸残基からなる。
ａ１）のタンパク質を精製しやすくするために、配列表における配列番号２に示されるタンパク質のアミノ末端又はカルボキシ末端に表１に示されるタグを接続することができる。
前記ａ３）のタンパク質において前記１つ又は複数のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加は、１０個以下のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は付加である。
前記ａ３）のタンパク質は、人工的に合成されてもよく、そのコード遺伝子を合成した後、生物発現により得られてもよい。
前記ａ３）のタンパク質のコード遺伝子は、配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基のコドンが欠失すること、及び／又は１つ又は複数の塩基対のミスセンス変異を行うこと、及び／又はその５’端及び／又は３’端に表１に示されるタグのコード配列を接続することにより得られる。
前記ａ４）で用いられる用語「同一性」とは、配列表における配列番号２に示されるタンパク質のアミノ酸配列との配列類似性を指す。「同一性」には、本発明の配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。同一性は、肉眼又はソフトウェアで評価されることができる。ソフトウェアを使用し、２つ又は複数の配列間の同一性をパーセント（％）で示すことができ、それは、関連配列間の同一性を評価するために用いられることができる。
前記タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子の植物収量及び／又は一穂粒数の調節への応用も、本発明の保護範囲に属する。
前記タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子は、以下のｂ１）、ｂ２）、ｂ３）又はｂ４）で表されるＤＮＡ分子であってもよい。
ｂ１）コード領域が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ２）ヌクレオチド配列が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ３）ｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子、
ｂ４）厳密な条件でｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子。
ｂ１）コード領域が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ２）ヌクレオチド配列が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ３）ｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子、
ｂ４）厳密な条件でｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子。
そのうち、前記核酸分子は、ＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は組換えＤＮＡであってもよく、前記核酸分子は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡ等であってもよい。
そのうち、配列表における配列番号１は、１１７０個のヌクレオチドからなり、配列表における配列番号１のヌクレオチドは、配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。
本分野の技術者は、周知の方法、例えば、指向性進化法や点変異法を採用し、本発明の、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするヌクレオチド配列を変異させることが容易である。それらの人工的に修飾された、本発明における分離して得られた前記タンパク質ｎｏｇ１のヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有するヌクレオチドは、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするものであれば、本発明のヌクレオチド配列から誘導され、本発明の配列と同等である。
ここで用いられる用語「同一性」とは、天然核酸配列との配列類似性を指す。「同一性」には、本発明の配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質ｎｏｇ１をコードするヌクレオチド配列と７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するヌクレオチド配列が含まれる。同一性は、肉眼又はソフトウェアで評価されることができる。ソフトウェアを使用し、２つ又は複数の配列間の同一性をパーセント（％）で示すことができ、それは、関連配列間の同一性を評価するために用いられることができる。
前記応用において、前記植物収量の調節は、植物の一株収量の調節であってもよい。前記植物の一穂粒数の調節は、植物の主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数の調節であってもよい。
前記応用において、前記植物は、以下のｃ１）～ｃ７）のいずれかであってもよい。ｃ１）双子葉植物、ｃ２）単子葉植物、ｃ３）禾本科植物、ｃ４）イネ、ｃ５）インディカ米、ｃ６）イネ品種の桂朝２号、ｃ７）東郷普通野生イネ浸透系ＳＩＬ１７６。
前記技術課題を解決するために、本発明は、遺伝子組換え植物甲の育成方法一、又は遺伝子組換え植物乙の育成方法二をさらに提供する。
本発明で提供される遺伝子組換え植物甲の育成方法一は、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を受容体植物甲に導入し、遺伝子組換え植物甲を得る工程を含んでもよい。前記受容体植物甲に比べて、前記遺伝子組換え植物甲は、収量及び／又は一穂粒数が増加する。
前記方法一では、前記「タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を受容体植物甲に導入する」ことは、受容体植物甲に組換えベクター甲を導入することにより実現される。前記組換えベクター甲は、発現ベクターに前記タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を挿入して得られた組換えプラスミドであってもよい。
前記組換えベクター甲は、具体的に、組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１であってもよい。前記組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１は、具体的に、改変された植物発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００の制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ認識配列とＭｌｕＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号３に示されるＤＮＡ分子に置換したものであってもよい。
前記方法一では、前記受容体植物甲は、ｄ１）～ｄ６）のいずれかであってもよい。ｄ１）単子葉植物、ｄ２）双子葉植物、ｄ３）禾本科植物、ｄ４）イネ、ｄ５）インディカ米、ｄ６）東郷普通野生イネ浸透系ＳＩＬ１７６。
本発明で提供される遺伝子組換え植物甲の育成方法二は、受容体植物乙に前記タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質を導入し、遺伝子組換え植物乙を得る工程を含んでもよい。前記受容体植物乙に比べて、前記遺伝子組換え植物乙は、収量及び／又は一穂粒数が減少する。
前記方法二では、前記「タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質」は、特異的ＤＮＡ分子、前記特異的ＤＮＡ分子を含む発現カセット又は前記特異的ＤＮＡ分子含有組換えプラスミドであってもよい。
前記特異的ＤＮＡ分子は、配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列であるセンス断片、配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子であるアンチセンス断片、及びそれらの間に位置するスペーサー断片を含む。
前記方法二では、前記特異的ＤＮＡ分子含有組換えプラスミドは、具体的に、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１であってもよい。前記組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１は、具体的に、ベクターｐＴＣＫ３０３／ＪＬ１４６０のＢａｍＨＩ認識配列とＫｐｎＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列に置換したもの、ＳｐｅＩ認識配列とＳａｃＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子に置換したものであってもよい。
前記方法二では、前記受容体植物乙は、ｅ１）～ｅ６）のいずれかであってもよい。ｅ１）単子葉植物、ｅ２）双子葉植物、ｅ３）禾本科植物、ｅ４）イネ、ｅ５）インディカ米、ｅ６）イネ品種の桂朝２号。
前記技術課題を解決するために、本発明は、遺伝子組換え植物丙の育成方法三をさらに提供する。
本発明で提供される遺伝子組換え植物丙の育成方法三は、受容体植物丙に前記タンパク質ｎｏｇ１の発現及び／又は活性を高める物質を導入し、遺伝子組換え植物丙を得る工程を含んでもよい。前記受容体植物丙に比べて、前記遺伝子組換え植物丙は、収量及び／又は一穂粒数が増加する。
前記方法三では、前記「前記タンパク質ｎｏｇ１の発現及び／又は活性を高める物質」は、具体的に、前記組換えベクター甲であってもよい。
前記方法三では、前記受容体植物丙は、ｄ１）～ｄ６）のいずれかであってもよい。ｄ１）単子葉植物、ｄ２）双子葉植物、ｄ３）禾本科植物、ｄ４）イネ、ｄ５）インディカ米、ｄ６）東郷普通野生イネ浸透系ＳＩＬ１７６。
前記方法では、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子は、以下のｂ１）、ｂ２）、ｂ３）又はｂ４）で表されるＤＮＡ分子であってもよい。
ｂ１）コード領域が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ２）ヌクレオチド配列が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ３）ｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子、
ｂ４）厳密な条件でｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子。
ｂ１）コード領域が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ２）ヌクレオチド配列が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ３）ｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子、
ｂ４）厳密な条件でｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、前記タンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子。
そのうち、前記核酸分子は、ＤＮＡ、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又は組換えＤＮＡであってもよく、前記核酸分子は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ又はｈｎＲＮＡ等であってもよい。
そのうち、配列表における配列番号１は、１１７０個のヌクレオチドからなり、配列表における配列番号１のヌクレオチドは、配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードする。
前記技術課題を解決するために、本発明は、植物育種方法一又は植物育種方法二をさらに提供する。
本発明で提供される植物育種方法一は、植物における前記タンパク質ｎｏｇ１の含有量及び／又は活性を高めることにより、植物収量及び／又は一穂粒数を増加させる工程を含んでもよい。
前記植物育種方法一では、前記「植物における前記タンパク質ｎｏｇ１の含有量及び／又は活性を高める」ことは、マルチコピーや、プロモーター、調節因子の改変、遺伝子組換え等の本分野における周知の方法により、植物における前記タンパク質ｎｏｇ１の含有量及び／又は活性を高める効果を達成することができる。
本発明で提供される植物育種方法二は、植物における前記タンパク質ｎｏｇ１の含有量及び／又は活性を低減することにより、植物収量及び／又は一穂粒数を減少させる工程を含んでもよい。
前記植物育種方法二では、前記「植物における前記タンパク質ｎｏｇ１の含有量及び／又は活性を低減する」ことは、ＲＮＡ干渉、相同組換え、遺伝子部位特異的編集等の本分野における周知の方法により、植物における前記タンパク質ｎｏｇ１の含有量及び／又は活性を低減する目的を達成することができる。
前記方法では、前記植物は、ｆ１）～ｆ４）のいずれかであってもよい。ｆ１）単子葉植物、ｆ２）双子葉植物、ｆ３）禾本科植物、ｆ４）イネ。
前記いずれかの方法では、前記収量は、一株収量であってもよい。前記一穂粒数は、主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数であってもよい。
前記「前記タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質」も、本発明の保護範囲に属する。
前記タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制するいずれかの前記物質は、具体的に、特異的ＤＮＡ分子、前記特異的ＤＮＡ分子を含む発現カセット又は前記特異的ＤＮＡ分子含有組換えプラスミドであってもよい。
前記特異的ＤＮＡ分子は、センス断片、アンチセンス断片及びそれらの間に位置するスペーサー断片を含む。
前記センス断片は、配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列であり、前記アンチセンス断片は、配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子である。
前記特異的ＤＮＡ分子含有組換えプラスミドは、具体的に、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１であってもよい。前記組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１は、具体的に、ベクターｐＴＣＫ３０３／ＪＬ１４６０のＢａｍＨＩ認識配列とＫｐｎＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列に置換したもの、ＳｐｅＩ認識配列とＳａｃＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子に置換したものであってもよい。
実験によると、Ｇｕｉｃｈａｏ ２に前記タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質（即ち、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１）を導入し、遺伝子組換え植物乙を得、Ｇｕｉｃｈａｏ ２に比べて、遺伝子組換え植物乙は、一株収量及び／又は主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数が減少した。タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子をＳＩＬ１７６に導入し、遺伝子組換え植物甲を得、ＳＩＬ１７６に比べて、遺伝子組換え植物甲は、一株収量及び／又は主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数が増加したことが証明された。結果として、タンパク質ｎｏｇ１は、イネ収量と一穂粒数の調節に非常に重要な作用を有することが示される。
以下、具体的な実施形態により本発明をさらに詳述するが、提供される実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するためのものではない。
下記実施例における実験方法は、特に断りがない限り、常法である。
下記実施例で用いられる材料、試薬等は、特に断りがない限り、商業的に入手できる。
以下の実施例における定量試験は、いずれも実験を三回繰り返すことにし、平均値を結果とする。
ベクターｐＴＣＫ３０３／ＪＬ１４６０は、Ｗａｎｇ Ｚ， Ｃｈｅｎ ＣＧ， Ｘｕ ＹＹ， Ｊｉａｎｇ ＲＸ， Ｈａｎ Ｙ， Ｘｕ ＺＨ ａｎｄ Ｃｈｏｎｇ Ｋ． Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ， ２００４， ２２： ４０９－４１７．に記載されている。
桂朝２号は、Ｚｈａｎｇ Ｘ， Ｚｈｏｕ Ｓ Ｘ， Ｆｕ Ｙ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌｅｒａｎｔ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｄｏｎｇｘｉａｎｇ ｃｏｍｍｏｎ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ （Ｏ． ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ Ｇｒｉｆｆ．）． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， ２００６， ６２：２４７～２５９に記載されており、公衆は、中国農業大学から取得することができる。桂朝２号は、以下、単にＧｕｉｃｈａｏ ２と称する。桂朝２号は、インディカ米に属する。
中国江西東郷野生イネは、Ｔｉａｎ Ｆ， Ｌｉ Ｄ Ｊ， Ｆｕ Ｑ， Ｚｈｕ Ｚ Ｆ， Ｆｕ Ｙ Ｃ， Ｗａｎｇ Ｘ Ｋ， Ｓｕｎ Ｃ Ｑ． ２００６． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ Ｇｒｉｆｆ．） ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｒｉｃｅ （Ｏ． ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｙｉｅｌｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｉｔｓ． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １１２， ５７０－８０．に記載されており、公衆は、中国農業大学から取得することができる。
アグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５（文献における名称Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ｓｔｒａｉｎ ＥＨＡ１０５）は、ＧＬＵＴＥＬＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ ＡＣＣＵＭＵＬＡＴＩＯＮ３ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｐｏｓｔ－Ｇｏｌｇｉ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｔｒａｆｆｉｃ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｖａｃｕｏｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｒｔｉｎｇ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ． Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ． ２０１４ Ｊａｎ； ２６（１）： ４１０－２５．に記載されており、公衆は、本願における実験を繰り返すために、中国農業大学から取得することができる。
東郷普通野生イネ浸透系ＳＩＬ１７６は、Ｇｕｉｃｈａｏ ２と江西東郷野生イネを複数回ハイブリダイゼーション及び戻し交配させた後代であり、Ｔｉａｎ Ｆ， Ｌｉ Ｄ Ｊ， Ｆｕ Ｑ， Ｚｈｕ Ｚ Ｆ， Ｆｕ Ｙ Ｃ， Ｗａｎｇ Ｘ Ｋ， Ｓｕｎ Ｃ Ｑ． ２００６． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｗｉｌｄ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｒｕｆｉｐｏｇｏｎ Ｇｒｉｆｆ．） ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｒｉｃｅ （Ｏ． ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｅｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｙｉｅｌｄ－ｒｅｌａｔｅｄ ｔｒａｉｔｓ． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １１２， ５７０－８０．に記載されており、公衆は、中国農業大学から取得することができる。東郷普通野生イネ浸透系ＳＩＬ１７６は、以下、単にＳＩＬ１７６と称する。
Ｇｕｉｃｈａｏ ２のｃＤＮＡ：Ｇｕｉｃｈａｏ ２の２週齢苗を実験材料とし、ＴＲＩＺＯＬ試薬で全ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素で逆転写して得られた。Ｇｕｉｃｈａｏ ２のｃＤＮＡにおけるＤＮＡの含有量が約２００ｎｇ／μＬであった。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の製品であり、製品番号が１８０６４－０１４である。
改変された植物発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００：ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００の制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩの認識配列の５’末端に制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩの認識配列を付加し、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識配列の５’末端に制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩの認識配列を付加し、他のヌクレオチド配列をすべてそのままにして得られたベクター。
実施例１、ｎｏｇ１遺伝子の発現
中国江西東郷野生イネを供与親、Ｇｕｉｃｈａｏ ２を反復親とし、それらをハイブリダイゼーション、戻し交配させることにより、２６５系を含む浸透系群（そのうちの１つの系がＳＩＬ１７６である）を構築した。該群では野生イネのゲノムのカバー率が７９．４％となり、そのうち１５系（そのうちの１つの系がＳＩＬ１７６である）は、一株収量がＧｕｉｃｈａｏ ２よりも３５％以上減少した。Ｇｕｉｃｈａｏ ２とＳＩＬ１７６の主茎の穂の形態、主茎の一穂粒数及び一株収量を比較し統計した。実験を１回３０株、三回繰り返した。
中国江西東郷野生イネを供与親、Ｇｕｉｃｈａｏ ２を反復親とし、それらをハイブリダイゼーション、戻し交配させることにより、２６５系を含む浸透系群（そのうちの１つの系がＳＩＬ１７６である）を構築した。該群では野生イネのゲノムのカバー率が７９．４％となり、そのうち１５系（そのうちの１つの系がＳＩＬ１７６である）は、一株収量がＧｕｉｃｈａｏ ２よりも３５％以上減少した。Ｇｕｉｃｈａｏ ２とＳＩＬ１７６の主茎の穂の形態、主茎の一穂粒数及び一株収量を比較し統計した。実験を１回３０株、三回繰り返した。
実験結果を図１に示した（Ａは主茎の穂の形態で、ｂａｒ＝５ｃｍであり、Ｂは主茎の一穂粒数であり、Ｃは一株収量であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１有意差を示す）。結果として、Ｇｕｉｃｈａｏ ２に比べて、ＳＩＬ１７６は、主茎の一穂粒数と一株収量が著しく少なくなったことが示される。
ＳＩＬ１７６に対してマップベースクローニングと機能分析を行った。結果として、第１染色体長腕でイネ収量に関連するＱＴＬが発見され、ｎｏｇ１遺伝子と名付けされた。ｎｏｇ１遺伝子のオープンリーディングフレームは、配列表における配列番号１に示され、それがコードするタンパクをｎｏｇ１と名付け、そのアミノ酸配列は、配列表における配列番号２に示されるとおり、３８９個のアミノ酸残基からなる。
実施例２、Ｔ２世代ホモ接合ＲＮＡｉ干渉株系の取得と表現型同定
一、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１の構築
組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１の構築工程は以下のとおりである。
一、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１の構築
組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１の構築工程は以下のとおりである。
１、プライマーの合成
配列表における配列番号１に示されるｎｏｇ１遺伝子の配列から、プライマー８６０－ｒｎａｉ－３２０Ｆ、８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｒ、８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｆ及び８６０－ｒｎａｉ－３１４Ｒを設計して合成した。プライマー配列は、具体的に、以下のとおりである。
８６０－ｒｎａｉ－３２０Ｆ：５’－ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩの認識部位である）、
８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｒ：５’－ＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩの認識部位である）、
８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｆ：５’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位である）、
８６０－ｒｎａｉ－３１４Ｒ：５’－ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩの認識部位である）。
配列表における配列番号１に示されるｎｏｇ１遺伝子の配列から、プライマー８６０－ｒｎａｉ－３２０Ｆ、８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｒ、８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｆ及び８６０－ｒｎａｉ－３１４Ｒを設計して合成した。プライマー配列は、具体的に、以下のとおりである。
８６０－ｒｎａｉ－３２０Ｆ：５’－ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＴＧＡＧＧＡ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩの認識部位である）、
８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｒ：５’－ＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩの認識部位である）、
８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｆ：５’－ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＣＡＡＡＧＣＣＡＧＧＴＡＣ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩの認識部位である）、
８６０－ｒｎａｉ－３１４Ｒ：５’－ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＫｐｎＩの認識部位である）。
２、Ｇｕｉｃｈａｏ ２のｃＤＮＡをテンプレートとし、８６０－ｒｎａｉ－３２０Ｆと８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｒをプライマーとし、ＰＣＲ増幅を行い、約３６０ｂｐのＤＮＡ断片Ａを得た。
３、Ｇｕｉｃｈａｏ ２のｃＤＮＡをテンプレートとし、８６０－ｒｎａｉ－６８１Ｆと８６０－ｒｎａｉ－３１４Ｒをプライマーとし、ＰＣＲ増幅を行い、約３６０ｂｐのＤＮＡ断片Ｂを得た。
４、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩとＳａｃＩでＤＮＡ断片Ａを酵素切断し、酵素切断産物１を回収した。
５、制限エンドヌクレアーゼＳｐｅＩとＳａｃＩでベクターｐＴＣＫ３０３／ＪＬ１４６０を酵素切断し、約１４．６ｋｂのベクター骨格１を回収した。
６、酵素切断産物１とベクター骨格１を接続し、中間体プラスミドを得た。
７、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＫｐｎＩでＤＮＡ断片Ｂを酵素切断し、酵素切断産物２を回収した。
８、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとＫｐｎＩで中間体プラスミドを酵素切断し、約１４．９ｋｂのベクター骨格２を回収した。
９、酵素切断産物２とベクター骨格２を接続し、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１を得た。
シーケンシング結果から、組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１の構造を説明すると、以下のようである。すなわち、ベクターｐＴＣＫ３０３／ＪＬ１４６０のＢａｍＨＩ認識配列とＫｐｎＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列に置換したもの、ＳｐｅＩ認識配列とＳａｃＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子に置換したものである。
二、組換えアグロバクテリウムの取得
組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１をアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入し、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１を得た。
組換えプラスミドｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１をアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入し、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１を得た。
三、Ｔ０世代ＲＮＡｉ干渉株の取得
Ｈｉｅｉらの方法（Ｈｉｅｉ Ｙ， Ｏｈｔａ Ｓ， Ｋｏｍａｒｉ Ｔ ＆ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １９９４， ６：２７１－２８２）を用いて、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１によりＧｕｉｃｈａｏ ２を変換し、Ｔ０世代ＲＮＡｉ干渉株を得た。
Ｈｉｅｉらの方法（Ｈｉｅｉ Ｙ， Ｏｈｔａ Ｓ， Ｋｏｍａｒｉ Ｔ ＆ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １９９４， ６：２７１－２８２）を用いて、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＲＮＡｉ－ｎｏｇ１によりＧｕｉｃｈａｏ ２を変換し、Ｔ０世代ＲＮＡｉ干渉株を得た。
四、Ｔ０世代ＲＮＡｉ干渉株のリアルタイム定量ＰＣＲ検出
３つのＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株（それぞれＲＮＡｉ－１－Ｔ０～ＲＮＡｉ－３－Ｔ０と名付けされた）をランダムに選択してリアルタイム定量ＰＣＲ検出を行った。具体的な工程は以下のとおりである。
３つのＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株（それぞれＲＮＡｉ－１－Ｔ０～ＲＮＡｉ－３－Ｔ０と名付けされた）をランダムに選択してリアルタイム定量ＰＣＲ検出を行った。具体的な工程は以下のとおりである。
１、それぞれ３つのＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株の２週齢苗を実験材料とし、ＴＲＩＺＯＬ試薬で全ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素で逆転写し、各Ｔ０世代擬似サイレンシング株のｃＤＮＡを得た。３つのＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株のｃＤＮＡにおけるＤＮＡの含有量が約２００ｎｇ／μＬであった。
２、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術によりそれぞれ３つのＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を検出した（ＵＢＩ遺伝子を内在性コントロール遺伝子とした）。
ｎｏｇ１遺伝子を検出したプライマーは、フォワードプライマー１：５’－ＴＣＣＧＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣ－３’とバックワードプライマー１：５’－ＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＴＴ－３’であった。ＵＢＩ遺伝子を検出したプライマーは、フォワードプライマー２：５’－ＣＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧ－３’とバックワードプライマー２：５’－ＧＧＣＧＡＧＴＧＡＣＧＣＴＣＴＡＧＴＴＣ－３’であった。
前記方法に従い、Ｔ０世代ＲＮＡｉ干渉株をＧｕｉｃｈａｏ ２に置換した以外、他の工程はいずれも変化せずに、Ｇｕｉｃｈａｏ ２におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を得た。
Ｇｕｉｃｈａｏ ２におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を１とし、他のイネ株におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を統計した。結果として、Ｇｕｉｃｈａｏ ２に比べて、３つのＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量がいずれも著しく低下したことが示される。
前記結果から、ＲＮＡｉ－１－Ｔ０、ＲＮＡｉ－２－Ｔ０及びＲＮＡｉ－３－Ｔ０がいずれもＴ０世代ＲＮＡｉ干渉株であることが示される。
五、Ｔ２世代ホモ接合ＲＮＡｉ干渉株系の取得及びリアルタイム定量ＰＣＲ検出
ＲＮＡｉ－１－Ｔ０～ＲＮＡｉ－３－Ｔ０を２世代連続して自家交配させ、Ｔ２世代ホモ接合ＲＮＡｉ干渉株系を得、それぞれＲＮＡｉ－１～ＲＮＡｉ－３と名付けした。
ＲＮＡｉ－１－Ｔ０～ＲＮＡｉ－３－Ｔ０を２世代連続して自家交配させ、Ｔ２世代ホモ接合ＲＮＡｉ干渉株系を得、それぞれＲＮＡｉ－１～ＲＮＡｉ－３と名付けした。
工程四の方法に従い、ＲＮＡｉ－１～ＲＮＡｉ－３及びＧｕｉｃｈａｏ ２に対してそれぞれリアルタイム定量ＰＣＲ検出を行った。
一部の検出結果を図２Ｂに示した（＊＊は、Ｐ＜０．０１有意差を示す）。結果として、Ｇｕｉｃｈａｏ ２に比べて、ＲＮＡｉ－１～ＲＮＡｉ－３におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量がいずれも著しく低下したことが示される。
六、Ｔ２世代ホモ接合ＲＮＡｉ干渉株系の表現型同定
被験イネ（Ｇｕｉｃｈａｏ ２、ＲＮＡｉ－１、ＲＮＡｉ－２又はＲＮＡｉ－３）の種をそれぞれ栄養土壌とバーミキュライトが入った鉢に栽培し（栄養土壌とバーミキュライトの体積比１：１）、２５℃で光照射して交互に育成し、成長過程において被験イネの主茎の穂の形態、主茎の一穂粒数、平均一穂粒数及び一株収量を比較し統計した。実験を１回３０株、三回繰り返した。
被験イネ（Ｇｕｉｃｈａｏ ２、ＲＮＡｉ－１、ＲＮＡｉ－２又はＲＮＡｉ－３）の種をそれぞれ栄養土壌とバーミキュライトが入った鉢に栽培し（栄養土壌とバーミキュライトの体積比１：１）、２５℃で光照射して交互に育成し、成長過程において被験イネの主茎の穂の形態、主茎の一穂粒数、平均一穂粒数及び一株収量を比較し統計した。実験を１回３０株、三回繰り返した。
一部の実験結果を図２Ａ、Ｃ及びＤに示した（Ａは主茎の穂の形態で、ｂａｒ＝５ｃｍであり、Ｃは主茎の一穂粒数であり、Ｄは一株収量であり、＊＊はＰ＜０．０１有意差を示す）。結果として、Ｇｕｉｃｈａｏ ２に比べて、ＲＮＡｉ－１、ＲＮＡｉ－２及びＲＮＡｉ－３は、主茎の一穂粒数、平均一穂粒数及び一株収量がいずれも著しく低下したことが示される。
実施例３、Ｔ２世代ホモ接合相補株系の取得と表現型同定
一、組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１の構築
組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１の構築工程は以下のとおりである。
一、組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１の構築
組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１の構築工程は以下のとおりである。
１、Ｇｕｉｃｈａｏ ２の２週齢苗を実験材料とし、ゲノムＤＮＡを抽出してテンプレートとし、８６０ＨＢＦ：５’－ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＣＡＴＡＣＴＧＡ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩの認識部位である）と８６０ＨＢＲ：５’－ＣＣＧＡＣＧＣＧＴＣＡＴＧＣＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＡＴ－３’（下線は、制限エンドヌクレアーゼＭｌｕＩの認識部位である）をプライマーとし、ＰＣＲ増幅を行い、約７ｋｂのＰＣＲ増幅産物を得た。
２、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩとＭｌｕＩでＰＣＲ増幅産物を酵素切断し、酵素切断産物を回収した。
３、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩとＭｌｕＩで改変された植物発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００を酵素切断し、約９ｋｂのベクター骨格を回収した。
４、酵素切断産物とベクター骨格を接続し、組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１を得た。
シーケンシング結果から、組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１の構造を説明すると、以下のようである。すなわち、改変された植物発現ベクターｐＣＡＭＢＩＡ１３００の制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ認識配列とＭｌｕＩ認識配列との間のＤＮＡ小断片を、ヌクレオチド配列が配列表の配列番号３で表されるＤＮＡ分子に置換した。
二、組換えアグロバクテリウムの取得
組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１をアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入し、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１を得た。
組換えプラスミドｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１をアグロバクテリウムツメファシエンスＥＨＡ１０５に導入し、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１を得た。
三、Ｔ０世代相補株の取得
Ｈｉｅｉらの方法（Ｈｉｅｉ Ｙ， Ｏｈｔａ Ｓ， Ｋｏｍａｒｉ Ｔ ＆ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １９９４， ６：２７１－２８２）を用いて、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１によりＳＩＬ１７６を変換し、Ｔ０世代相補株を得た。
Ｈｉｅｉらの方法（Ｈｉｅｉ Ｙ， Ｏｈｔａ Ｓ， Ｋｏｍａｒｉ Ｔ ＆ Ｋｕｍａｓｈｉｒｏ Ｔ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｅ （Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．） ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｕｎｄａｒｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ－ＤＮＡ． Ｐｌａｎｔ Ｊ． １９９４， ６：２７１－２８２）を用いて、組換えアグロバクテリウムＥＨＡ１０５／ｐＣＡＭＢＩＡ１３００－ＮＯＧ１によりＳＩＬ１７６を変換し、Ｔ０世代相補株を得た。
四、Ｔ０世代相補株のリアルタイム定量ＰＣＲ検出
３つのＴ０世代相補株（それぞれＣＴＰ－１－Ｔ０～ＣＴＰ－３－Ｔ０と名付けされた）をランダムに選択してリアルタイム定量ＰＣＲ検出を行った。具体的な工程は以下のとおりである。
３つのＴ０世代相補株（それぞれＣＴＰ－１－Ｔ０～ＣＴＰ－３－Ｔ０と名付けされた）をランダムに選択してリアルタイム定量ＰＣＲ検出を行った。具体的な工程は以下のとおりである。
１、それぞれ３つのＴ０世代相補株の２週齢苗を実験材料とし、ＴＲＩＺＯＬ試薬で全ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素で逆転写し、各Ｔ０世代相補株のｃＤＮＡを得た。３つのＴ０世代相補株のｃＤＮＡにおけるＤＮＡの含有量が約２００ｎｇ／μＬであった。
２、ＲＴ－ｑＰＣＲ技術によりそれぞれ３つのＴ０世代相補株におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を検出した（ＵＢＩ遺伝子を内在性コントロール遺伝子とした）。
ｎｏｇ１遺伝子を検出したプライマーは、フォワードプライマー１：５’－ＴＣＣＧＡＣＴＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＡＣ－３’とバックワードプライマー１：５’－ＧＧＴＡＧＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＴＴ－３’であった。ＵＢＩ遺伝子を検出したプライマーは、フォワードプライマー２：５’－ＣＴＧＴＣＡＡＣＴＧＣＣＧＣＡＡＧＡＡＧ－３’とバックワードプライマー２：５’－ＧＧＣＧＡＧＴＧＡＣＧＣＴＣＴＡＧＴＴＣ－３’であった。
前記方法に従い、Ｔ０世代相補株をＳＩＬ１７６に置換した以外、他の工程はいずれも変化せずに、ＳＩＬ１７６におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を得た。
ＳＩＬ１７６におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を１とし、他のイネ株におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量を統計した。結果として、ＳＩＬ１７６に比べて、３つのＴ０世代相補株におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量がいずれも著しく増加したことが示される。
前記結果から、ＣＴＰ－１－Ｔ０、ＣＴＰ－２－Ｔ０及びＣＴＰ－３－Ｔ０がいずれもＴ０世代相補遺伝子組換えイネであることが示される。
五、Ｔ２世代ホモ接合相補株系の取得及びリアルタイム定量ＰＣＲ検出
ＣＴＰ－１－Ｔ０～ＣＴＰ－３－Ｔ０を２世代連続して自家交配させ、Ｔ２世代ホモ接合相補株系を得、それぞれＣＴＰ－１～ＣＴＰ－３と名付けした。
ＣＴＰ－１－Ｔ０～ＣＴＰ－３－Ｔ０を２世代連続して自家交配させ、Ｔ２世代ホモ接合相補株系を得、それぞれＣＴＰ－１～ＣＴＰ－３と名付けした。
工程四の方法に従い、ＣＴＰ－１～ＣＴＰ－３及びＳＩＬ１７６に対してそれぞれリアルタイム定量ＰＣＲ検出を行った。
一部の検出結果を図３Ｂに示した（＊＊はＰ＜０．０１有意差を示す）。結果として、ＳＩＬ１７６に比べて、ＣＴＰ－１～ＣＴＰ－３におけるｎｏｇ１遺伝子の相対発現量がいずれも著しく増加したことが示される。
六、Ｔ２世代ホモ接合相補株系の表現型同定
被験イネ（ＳＩＬ１７６、ＣＴＰ－１、ＣＴＰ－２又はＣＴＰ－３）の種をそれぞれ栄養土壌とバーミキュライトが入った鉢に栽培し（栄養土壌とバーミキュライトの体積比１：１）、２５℃で光照射して交互に育成し、成長過程において被験イネの主茎の穂の形態、主茎の一穂粒数、平均一穂粒数及び一株収量を比較し統計した。実験を１回３０株、三回繰り返した。
被験イネ（ＳＩＬ１７６、ＣＴＰ－１、ＣＴＰ－２又はＣＴＰ－３）の種をそれぞれ栄養土壌とバーミキュライトが入った鉢に栽培し（栄養土壌とバーミキュライトの体積比１：１）、２５℃で光照射して交互に育成し、成長過程において被験イネの主茎の穂の形態、主茎の一穂粒数、平均一穂粒数及び一株収量を比較し統計した。実験を１回３０株、三回繰り返した。
一部の実験結果を図３Ａ、Ｃ及びＤに示した（Ａは主茎の穂の形態で、ｂａｒ＝５ｃｍであり、Ｃは主茎の一穂粒数であり、Ｄは一株収量であり、＊＊はＰ＜０．０１有意差を示す）。結果として、ＳＩＬ１７６に比べて、ＣＴＰ－１、ＣＴＰ－２及びＣＴＰ－３は、主茎の一穂粒数、平均一穂粒数及び一株収量がいずれも著しく増加したことが示される。
出発イネ（例えば、Ｇｕｉｃｈａｏ ２）に前記タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質を導入し、一株収量及び／又は主茎の一穂粒数が減少した遺伝子組換えイネを得た。タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を出発イネ（例えば、ＳＩＬ１７６）に導入し、一株収量及び／又は主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数が増加した遺伝子組換えイネを得た。従って、タンパク質ｎｏｇ１は、イネ収量と一穂粒数を調節することができ、重要な応用価値がある。
Claims (16)
- ａ１）、ａ２）、ａ３）又はａ４）であるタンパク質ｎｏｇ１の植物収量及び／又は一穂粒数の調節への使用であって、前記植物がイネである使用。
ａ１）アミノ酸配列が配列表における配列番号２に示されるタンパク質、
ａ２）配列表における配列番号２に示されるタンパク質のＮ端及び／又はＣ端にタグを接続した融合タンパク質、
ａ３）配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加した、植物収量及び／又は一穂粒数に関するタンパク質、
ａ４）ａ１）で定義されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質。 - 請求項１に記載のタンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子の植物収量及び／又は一穂粒数の調節への使用であって、前記植物がイネである使用。
- 前記核酸分子が以下のｂ１）、ｂ２）、又はｂ３）で表されるＤＮＡ分子であり、前記植物がイネであることを特徴とする請求項２に記載の使用。
ｂ１）コード領域が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ２）ヌクレオチド配列が配列表における配列番号１に示されるＤＮＡ分子、
ｂ３）ｂ１）又はｂ２）で定義されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、請求項１に記載のタンパク質ｎｏｇ１をコードするＤＮＡ分子。 - 前記植物収量の調節が植物の一株収量の調節であることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
- 前記植物の一穂粒数の調節が植物の主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数の調節であることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の使用。
- 前記植物が、インディカ米であることを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の使用。
- 遺伝子組換え植物甲の育成方法、又は遺伝子組換え植物乙の育成方法を含む植物収量及び／又は一穂粒数を調節するための方法であって、
前記遺伝子組換え植物甲の育成方法は、タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を受容体植物甲に導入し、遺伝子組換え植物甲を得る工程であって、前記受容体植物甲に比べて、前記遺伝子組換え植物甲は、収量及び／又は一穂粒数が増加する工程を含み、
前記遺伝子組換え植物乙の育成方法は、受容体植物乙にタンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質を導入し、遺伝子組換え植物乙を得る工程であって、前記受容体植物乙に比べて、前記遺伝子組換え植物乙は、収量及び／又は一穂粒数が減少する工程を含み、
前記植物がイネであり、
前記タンパク質ｎｏｇ１が下記のａ１）、ａ２）、ａ３）又はａ４）である方法。
ａ１）アミノ酸配列が配列表における配列番号２に示されるタンパク質、
ａ２）配列表における配列番号２に示されるタンパク質のＮ端及び／又はＣ端にタグを接続した融合タンパク質、
ａ３）配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加した、植物収量及び／又は一穂粒数に関するタンパク質、
ａ４）ａ１）で定義されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質。 - 前記遺伝子組換え植物甲の育成方法において、前記「タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を受容体植物甲に導入する」ことは、受容体植物甲に組換えベクター甲を導入することにより実現され、前記組換えベクター甲は、発現ベクターに前記タンパク質ｎｏｇ１をコードする核酸分子を挿入して得られた組換えプラスミドであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
- 前記遺伝子組換え植物乙の育成方法において、前記「タンパク質ｎｏｇ１の発現を抑制する物質」は、特異的ＤＮＡ分子、前記特異的ＤＮＡ分子を含む発現カセット又は前記特異的ＤＮＡ分子含有組換えプラスミドであり、
前記特異的ＤＮＡ分子は、
配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列であるセンス断片、
配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子であるアンチセンス断片、及び
それらの間に位置するスペーサー断片を含むことを特徴とする請求項７に記載の方法。 - 植物収量及び／又は一穂粒数を調節するための方法であって、
前記方法は、受容体植物丙にタンパク質ｎｏｇ１の発現を高める物質を導入し、遺伝子組換え植物丙を得る工程であって、前記受容体植物丙に比べて、前記遺伝子組換え植物丙は、収量及び／又は一穂粒数が増加する工程を含む、遺伝子組換え植物丙の育成方法を含み、
前記植物がイネであり、
前記タンパク質ｎｏｇ１が下記のａ１）、ａ２）、ａ３）又はａ４）である方法。
ａ１）アミノ酸配列が配列表における配列番号２に示されるタンパク質、
ａ２）配列表における配列番号２に示されるタンパク質のＮ端及び／又はＣ端にタグを接続した融合タンパク質、
ａ３）配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加した、植物収量及び／又は一穂粒数に関するタンパク質、
ａ４）ａ１）で定義されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質。 - 植物収量及び／又は一穂粒数を調節するための方法であって、植物育種方法一、又は植物育種方法二を含み、
前記植物育種方法一は、植物におけるタンパク質ｎｏｇ１の含有量を高めることにより、植物収量及び／又は一穂粒数を増加させる工程を含み、
前記植物育種方法二は、植物におけるタンパク質ｎｏｇ１の含有量を低減することにより、植物収量及び／又は一穂粒数を減少させる工程を含み、
前記植物がイネであり、
前記タンパク質ｎｏｇ１が下記のａ１）、ａ２）、ａ３）又はａ４）である方法。
ａ１）アミノ酸配列が配列表における配列番号２に示されるタンパク質、
ａ２）配列表における配列番号２に示されるタンパク質のＮ端及び／又はＣ端にタグを接続した融合タンパク質、
ａ３）配列表における配列番号２に示されるアミノ酸配列に対して１つ又は複数のアミノ酸残基が置換及び／又は欠失及び／又は付加した、植物収量及び／又は一穂粒数に関するタンパク質、
ａ４）ａ１）で定義されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するタンパク質。 - 前記収量が一株収量であることを特徴とする請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記一穂粒数が主茎の一穂粒数及び／又は平均一穂粒数であることを特徴とする請求項７～１１のいずれか一項に記載の方法。
- 配列表の配列番号１の５’末端から第１５５位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子の逆相補的配列であるセンス断片、
配列表の配列番号１の５’末端から第１６１位～第５２２位で表されるＤＮＡ分子であるアンチセンス断片、及び
それらの間に位置するスペーサー断片を含むＤＮＡ分子。 - 請求項１４に記載のＤＮＡ分子を含む発現カセット。
- 請求項１４に記載のＤＮＡ分子を含む組換えプラスミド。
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