WO2013060136A1 - 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用 - Google Patents

一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用 Download PDF

Info

Publication number
WO2013060136A1
WO2013060136A1 PCT/CN2012/075637 CN2012075637W WO2013060136A1 WO 2013060136 A1 WO2013060136 A1 WO 2013060136A1 CN 2012075637 W CN2012075637 W CN 2012075637W WO 2013060136 A1 WO2013060136 A1 WO 2013060136A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
grain
gene
rice
qgl3
seq
Prior art date
Application number
PCT/CN2012/075637
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
张红生
张晓军
蓝虹霞
王建飞
王才林
唐海娟
Original Assignee
南京农业大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 南京农业大学 filed Critical 南京农业大学
Publication of WO2013060136A1 publication Critical patent/WO2013060136A1/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/46—Gramineae or Poaceae, e.g. ryegrass, rice, wheat or maize
    • A01H6/4636—Oryza sp. [rice]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • the invention relates to the technical field of plant genetic engineering, relates to the cloning and application of a semi-dominant gene qG 3 for controlling rice grain length and grain weight, and particularly relates to a control grain length and length on the long arm of the third chromosome of rice. Gene cloning and crop improvement application of the major semi-dominant gene qG 3 of grain weight. Background
  • the yield traits of rice are quantitative traits controlled by multiple genes, which are characterized by continuous variation and are greatly affected by the environment.
  • the direct constituent factors include grain weight, number of spikelets per panicle, effective panicle number and seed setting rate.
  • plant height, tiller number, panicle type, leaf type and other traits can also indirectly affect the yield of rice population. Yield formation is the result of the interaction of these many traits under specific environmental conditions.
  • the grain weight is a quantitative trait controlled by multiple genes, its higher heritability indicates that the trait can isolate certain major gene loci.
  • the weight of the grain can be decomposed into multiple components such as grain length, grain width, grain thickness and graining density.
  • grain length was controlled by a single gene ⁇ -f; Mckenziedeng (1983) reported that grain length was controlled by 2-3 or more genes.
  • Transmembrane protein near the filament has allelic variation at three different truncated sites, from the site of Minghui 63 (cut off all functional domains, complete protein inactivation) to control long grain kernels (9.91 ⁇ 0.10 mm) , mean ⁇ SD), from the site of Jane 97 (completely functional protein) formed medium grain (8.08 ⁇ 0.07 mm), from the site of Chuan 7 (cut off the C-terminus) 1NFR and functional domain, only retained The N-terminal 0SR domain) forms short particles (6.30 ⁇ 0.09 mm) (Mao ef a/., 2010).
  • the regulation of grain length by GS3 is regulated by controlling cell division to regulate the number of cells in the longitudinal direction of the hull (Mao ei) a/., 2010). It was discovered by Ashikari et al. and Fujisawa et al. (1999). Due to the loss of function mutation W, an abnormal short grain is formed, which encodes the alpha subunit of a G protein, which is considered to be a molecular switch downstream of the receptor in the hormone regulatory pathway.
  • the 33 ⁇ 43 gene is by Kitagawa et al. (2010) It was discovered through the study of mutants. The mutant gene srs3 forms an abnormal grain by reducing the length of the cell in the longitudinal direction of the hull, which is a member of the kinesin-13 family.
  • GW2 (SDng et al., 2007) Wo B GW & q3A/5 (Wan et al., 2008; Snomura et al., 2008) are two species controlling rice grain width.
  • both of these genes are loss-of-function mutations leading to increased lateral cell segregation in the hulls, which in turn leads to an increase in the number of lateral cells to form wider kernels.
  • G1/I/2 is a RNG-type B ubiquitin ligase, but an unknown function protein.
  • Yeast double hybrid found that its interaction protein is also a polyubiquitin, whether it is two sites. The regulation of grain width by the same ubiquitin proteasome molecular pathway remains to be further studied.
  • the purpose of the present invention is to isolate and clone a complete coding segment DNA fragment of a semi-dominant allele of a major Q and its dominant function simultaneously controlling rice grain length and grain weight, and using this gene to improve rice The ability to produce and view quality. At the same time, it was cloned and proved that the two homologous genes of this gene in rice also have the regulation effect on rice grain length.
  • the protein encoded by the gene g L3 that is, the amino acid polypeptide corresponding to the translation of positions 219 to 3230 in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the dominant allele qGL3-D of the gene qG 3 has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 3.
  • the protein encoded by the dominant allele gQL3-D is the amino acid polypeptide corresponding to the translation of positions 219 to 3230 in SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 4.
  • the homologous gene qGL3-L1 of the gene gGL3 in rice has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO: 5, and the encoded protein sequence thereof is as
  • SEQ ID NO: 6 is an amino acid polypeptide corresponding to translation at positions 99 to 2774 in SEQ ID NO: 5.
  • the gene gGL3 is a homologous gene qG 3-L2 in rice, and the nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 7, and the encoded protein sequence is as
  • SEQ ID NO: 8 which is the amino acid polypeptide corresponding to translation of 78 to 3107 in SEQ ID NO: 7.
  • the use of the gene g «3L3 in crop genetic improvement is preferably used in improving crop grain length and/or grain weight.
  • the use of the gene gQL3-D in crop genetic improvement is preferably used in improving crop grain length and/or grain weight.
  • the use of the gene gQL3-/ in crop genetic improvement is preferably used in improving crop grain length and/or grain weight.
  • the use of the gene gQL3- in crop genetic improvement is preferably used in improving crop grain length and/or grain weight.
  • the two predicted expression genes in this segment were cloned and sequenced in two parents, and the cDNA sequence of one of the genes was There is no difference between the two parents.
  • the other gene has two mutations between the large parent N411 and the small parent 93-11. Specifically: the site from the large parent N411 (SK) ID NO: 3) compared to the site from the small parent 93-11 (SK) ID No.
  • the structure and coding protein product of this gene were predicted and analyzed, and it was found that the gene consisted of 21 exons and 20 introns.
  • the coding region is 3012 bp in length and encodes a polypeptide of 1003 amino acids.
  • the polypeptide encoded by the protein domain was predicted to be a serine/threonine phosphate enzyme containing two kelch repeat domains.
  • this gene is a small family of three homologous genes, which the applicants named as gGL3 (SK) ID NO:1), qGL3-L1 (SK) ID NO:5) and gQL3- ( SK) ID NO: 7).
  • the GUS expression activity analysis of the transgene promoter by linking the promoter (SK) ID NO:9 of this gene to the GUS gene also confirmed the results of Fteal-Tlme PCR, and it was also found that c?GL3 was at the root tip and stem.
  • the complete reading frame of the wild-type gene g L3 (sequence as shown in SEQ ID NO: 1) was ligated into the overexpression vector PCAMBIA-1300S, transformed into rice variety, flower transgenic T 0 generation and transgenic overexpression positive single plant. Both showed a shortened grain type with no significant effect on panicle type and plant type (Fig. 10).
  • the two predicted functional domains encoded by this gene were truncated separately.
  • the two truncated polypeptides existed in a 296 amino acid span of the intermediate junction region, and the overexpression vector was transformed into the rice variety Zhonghua 11, OX-Kelch transgene. T.
  • the phenotypic analysis of the insertion knockout mutant of one of the homologous genes qGL3-L1 revealed that the complete loss of the function of qGL3-L1 resulted in a markedly smaller seed and overexpression of the transgenic T of qOB-L1 and qGL3-L2.
  • Representative analysis revealed that the homologous genes qGL3-L1 and gQL3- overexpressing qGL3 can weakly increase the grain growth of rice, Figure 13D. This suggests that gGL3 and its homologous genes gQL3-/ and gQL3- have similar functions in regulating rice grain length.
  • the near-isogenic line 93-11 NIL-gQL3-0 analysis of the allele gQL3-0 from the large parental parent N411 was introduced by molecular marker selection.
  • the dominant allelic variation qG 3 of the gene qG 3 was found.
  • -D e.g., SK
  • the granule analysis obtained by the hybridization of the near-isogenic line 93-11 NIL-gQL3-0 and 93-11 and the two-line hybrid rice restorer line and the two-line sterile line Guangzhan 63S was found to be from The allelic variation of the large parent can also increase the grain length in the hybrid state (Fig. 14).
  • the analysis of the near-isogenic line of the cultivar of rice cultivar (the short-grain allele background of GS and the near-isogenic line of the rice cultivar Longli black carp) (Di's short-grain allele background cii) found that g L3 can mask gs3 And W to shorten the grain length ( Figure 15).
  • the wild-type granule length control gene g L3 in the background of Zhonghua 11 , whether it is up-regulated or down-regulated, will make the grain shorter and smaller.
  • the dominant allele of qG 3 qGL3-D ( SEQ ID NO: 3) occurs at the D position of the conserved motif AVLDT in the kelch domain.
  • Aspartic acid Aspartic acid (Asp, D) is converted to glutamate. (du, E), caused the protein encoded by this gene to enter the nucleus from the cytoplasm, and then played a role in making the rice grain longer, which is a function-acquired mutation.
  • qG 3-L1 and qG 3-L2 of gGL3 in rice also have the function of regulating grain length and grain weight of rice.
  • qQ3's dominant allele gQL3-0 SEQ ID NO: 3
  • W upstream genes
  • semi-dominant properties make It can be used for the improvement of restorer lines for use in hybrid rice breeding.
  • the above-mentioned genes cloned in the present invention provide new genetic resources for high-yield and high-quality breeding of rice and other cereal crops, and provide technical references for cloning related genes in other crops, and can also be rice, wheat, corn, sorghum, etc. Molecular evolution studies of cereal crops and dicotyledonous crops such as soybean and rapeseed provide evidence. DRAWINGS
  • Figure 1 Overall technical roadmap for use with the present invention.
  • Figure 2 Molecular marker genetic map constructed using N411 and 05-643 and localized QTl3.
  • Figure 3 Distribution pattern of 206 phenotypes of random 206 strains in BQF 3 constructed by N411 and 93-1 1 , and the filling pattern shows the genotype of qO locus.
  • Figure 4 Fine positioning process diagram of QQL3, A shows the number of recombinant individuals between markers in 2968 individuals; B. shows further number of recombinant individuals between cells; G high-precision linkage between phenotype and genotype Analysis; D. shows the physical distance between xj39 and xj26 as indicated by the Nipponbare genome annotation.
  • Figure 5 Partial protein alignment of the kelch domain of the qG 3 homologous gene family in plants and Arabidopsis, the arrow indicates the allelic variation of gQL3-0 in the large parent N411: D364E
  • Figure 6 Semi-quantitative expression analysis of g(3L3 and its homologous genes qGL3-L1 and qGL3-L2 and real-time quantitative Ffeal-Time PCR expression analysis.
  • Figure 7 g L3 gene promoter GUS expression activity analysis.
  • Figure 8 Subcellular localization of the wild-type and dominant alleles of the g L3 gene.
  • 93-11 -qGL3-GFP indicates the subcellular localization map of the qQL3 gene wild-type protein
  • N411 -qGL3-[ GFP indicates the subcellular localization of the dominant allele after the qQL3 gene mutation.
  • Figure 9 Structural cleavage site map of overexpressed transgenic vector pO IBIA-1304, pCAMBIA-1300S and RNA interference vector pC 303.
  • A is a structural cleavage site map of pCAMBIA-1304
  • B is a structural cleavage site map of pO IBIA-1300S
  • C is a structural cleavage site map of pC 303.
  • Figure 10 Detection of expression of overexpressed and RNAi interfering transgenic lines.
  • A is a semi-quantitative expression analysis result graph
  • B is a real-time quantitative expression analysis result statistical graph.
  • Figure 11 Agronomic phenotype and ear and grain phenotype of wild-type gene overexpression and RNAi interference transgenic lines.
  • A is wild type gene overexpression and RNAi interference transgenic line agronomic phenotype
  • B is wild type gene overexpression and RNAi interference transgenic line ear phenotype
  • C is wild type gene overexpression and RNAi interference transgenic line grain Phenotype.
  • Figure 12 The polypeptide corresponding to the construction of the overexpression transgenic vector of the truncated domain, and the corresponding phenotype of the transgenic plants.
  • A is a schematic diagram of the polypeptide corresponding to the construction of the overexpression transgenic vector of the truncated domain
  • B is the phenotype corresponding to the transgenic plant
  • OX-qGL3 represents a schematic diagram of a polypeptide corresponding to the construction of a qGL3 overexpression transgene vector
  • OX-kelch represents a schematic diagram of a polypeptide corresponding to the construction of a kelch domain overexpression transgene vector in qGL3
  • OX-PP2AC represents a PP2AC domain overexpression in qGL3
  • Figure 13 Plant and grain phenotype of gQL3-/ insertion knockout mutants, and grain phenotype of homologous genes gQL3-/ and gQL3-overexpressing transgenic plants.
  • A is the plant phenotype of wild-type Dongjin DJ and mutant
  • ⁇ is the ear phenotype of wild-type Dongjin DJ and mutant
  • C is the grain phenotype of wild-type Dongjin DJ and mutant qgl3-l1.
  • D is the grain phenotype of gGL3 homologous genes qO 3-L1 and gQL3-overexpressing transgenic plants; Zhonghua 11 is the recipient parent.
  • g L3 is in the near isogenic line of the rice variety Reyan B (the short-grain allele background of GS and the near-isogenic line of the rice variety Longli black carp (di short allele background di) grain.
  • Figure 15 Grid phenotype map of background parent 93-11 and near isogenic line 93-11 NIL-gQL3-D.
  • A is the plant type control map of the background parent 93-11 and the near isogenic line 93-11 NIL-gQL3-0
  • B is the background comparison map of the background parent 93-11 and the near isogenic line 93-11 NIL-QQL3-D
  • C is a grain phenotype comparison map of background parent 93-11 and near isogenic line 93-11 Ml-qG 3-D.
  • Figure 16 93-11 and the near-isogenic line 93-11 NIL-gQL3-0 and their comparison with the two-line sterile line with a 63S configuration of hybrid rice tassels and kernels.
  • A is 93-11 and the near isogenic line 93-11 NIL-QQL3-D and their comparison with the two-line male sterile line 63S configuration of hybrid rice ears;
  • B is 93-11 and near isogenic line 93 -11 NIL-gQL3-0 and their comparison with hybrid rice grains with two-line sterile line and 63S configuration.
  • the PCR reaction volume is 10 microliters, of which 10X buffer is 1 microliter, buffer with 2.5mM Mgd 2 is 1 microliter, 2.5mM dNTPs
  • the genetic map of rice was constructed by using the population genotype data.
  • the software used was Mapmaker3.0, and the LOD threshold was set to 3.0, and the linkage map was obtained.
  • Rice glutinous rice germplasm ⁇ 411 (1000-kilogram weight 71.1 g) was obtained by crossing with 05-643 (1000-kilogram weight: 19.9 g) 93-11 (1000-grain weight 28.3 g). Both the grain length and the 1000-grain weight are in the middle of the parental value or the middle parent is low in value.
  • the grain length and 1000-grain weight of F 2 were plotted as a number of times, showing continuous quantitative traits, indicating that grain length and grain weight are traits controlled by multiple genes.
  • a molecular marker map was constructed using 107 SSR polymorphism markers distributed on 12 chromosomes using 182 individuals of the F 2 generation of N411/05-643, as shown in Fig. 2.
  • the first 212 plants were randomly collected, and the length and width of the seeds were examined.
  • the molecular marker data of the target region was analyzed, as shown in Fig. 3.
  • the exchange strains were screened on both sides of the remaining BQF 2 population, and the position of the QTL was confirmed by examining the phenotypic data of the exchange strain and combining the encrypted internal markers (Fig. 4).
  • the allele qG 3-D of N411 was introduced in the background of 93-11, and a strain with an interval span of about 700k from InDel marker xj39 to RM3601 was self-crossed and then determined to be granules.
  • the cloning primer qGL3-F of the LO ⁇ QsO3 ⁇ 4 ⁇ 45 ⁇ gene (SEQ ID NO: 10) , qGL3-R (SEQ ID NO: 11) and the cloning primer G12-F of the LOQ_QsO3 ⁇ 4 ⁇ 4484 gene (SEQ ID NO: 12), G12R C SEQ ID NO: 13); respectively, with the above primer pair two parents N411 and
  • the panicle cDNA template of 93-11 was amplified, and the two genes were successfully amplified from the panicle cDNA templates of two parents N411 and 93-11 (conventional PCR procedure, annealing temperature was adjusted appropriately), TA clone, the amplified sequence was ligated into pMD18-Tsimple vector (purchased from Takara), transformed into E.
  • the coding region is 3012 bp in length and encodes a polypeptide of 1003 amino acids.
  • the encoded polypeptide is a serine/threonine phospholipase containing two kelch repeats (Kelch repeat-containing serine/threonine phosphatases in rice, this subgene family contains three members).
  • the rice ⁇ profiles database analysis found that three members of the gGL3 family of rice have been expressed in a variety of tissues, especially in young, vigorously divided tissues.
  • the design tool designed a specific primer pair for qG 3, qG 3-L1, gQL3- three genes, which are: qP1-F (SEQIDNO: 22), qP1-R (SEQIDNO: 23); qP2-F (SEQIDNO: 24) ), qP2-R (SEQ ID NO: 25) ; qP3-F (SEQ ID NO: 26), qP3-R (SEQ ID NO: 27), and further analyzed the expression of three genes in various tissues by the method of Quantitative PCR.
  • the specific reagents used were: SYBRf Premix ⁇ TaqTM II (Perfect Ffeal Time), purchased from Takara, and the fluorescent PCR instrument used ABI's 7500fast. This analysis added unextracted young leaves (1_) on a semi-quantitative basis, using three replicates simultaneously on the same 96-well plate, and the internal reference gene was 18S (primer pair 18S-F (SEQ ID NO: 28) , 18S-R (SEQ ID NO: 29)) The results are shown in Figure 6B.
  • Fig. 6B the entire gene family is expressed in various tissues, and g L3 and qG 3-L are higher in expression than qC 3-L1, and have more similar expression patterns, which are followed in the ear.
  • the developmental process has a tendency to increase in expression throughout the family.
  • qGL3-L2 has maintained a high expression level in young leaves, mature leaves and sheaths, which is different from the gradual upward trend of gGL3.
  • the promoter of the gene qOL3 (SK) IDN0:9), we designed the primers qGL3Ro-F (SEQIDNO:30, restriction site Pst I) and qGL3Ro-R (SEQIDN0:31, restriction site Nco I), Using the genomic DNA of the large parental parent N411 as a template, the promoter sequence of the gene qGL3 was obtained by PCR amplification, and the PCR product was obtained by TA cloning, ligated into the pMCM8TsimpleT-simple vector (purchased from Takara), and transformed into the large intestine by heat shock method.
  • Bacillus DH5a competent cells coated with ampicillin-resistant LB plates, picked for monoclonal detection by PCR positive (using primer pairs qGL3Ro-F and qGL3Ro-R), and sent the positive monoclonal to the biological company for sequencing, the correct sequence of the strain Shake bacteria extract the plasmid with the target fragment.
  • the obtained plasmid was digested with restriction endonucleases Pst I and Nco I to the same vector plasmid pO IBIA-1304 (see Figure 9A) to construct a recombinant plasmid pO IBIA-qGL3Pro- GUS transformed this plasmid into a rice variety Zhonghua 11 by Agrobacterium-mediated transformation. Positive T.
  • Transgenic plants were subjected to GUS staining analysis (specific methods refer to molecular cloning: laboratory guidelines).
  • the GUS expression activity analysis of the transgene promoter linked to the GUS gene also confirmed the results of FfenimePCR. It can also be found that g «3L3 is in the apical, stem vascular tissue, the midrib of the leaf, the periphery of the leaf sheath, the apex growth point, immature The basal part of the hull, the mature glume, and the base of the pistil are predominantly expressed, but are no longer expressed in the mature anthers (Fig. 7). Subcellular localization of 3 ⁇ 43 ⁇ 4 case 3 qd3 wild protein and superior protein qd3-D
  • coli DH5a competent cells by heat shock method, coated with ampicillin-resistant LB plate, and picked for monoclonal positive detection by PCR ( Using the primer pair qGL33 ⁇ 4q-F/qGL33 ⁇ 4q-R), the positive monoclonal was sent to the biological company for sequencing, and the correct sequence of the strain was shaken to extract the plasmid with the target fragment.
  • the obtained plasmid was ligated with 9nal I to the same digested vector plasmid pBI121 to construct recombinant plasmids pBI121-gQL3 and pBI121-gQL3-D.
  • the ligation product was transformed into E.
  • coli Top10 competent cells and the ampicillin-resistant LB plate was coated, and the monoclonal was picked up by PCR positive detection (using primer pair qGL33 ⁇ 4q-F/R), and the directionality of the ligation was verified by enzyme digestion.
  • the positive monoclonal was sent to the biological company for sequencing, and the correctly connected cells were expanded and extracted to extract the integrated PBI121 plasmid.
  • the plasmid was transformed into epidermal cells of onion by gene gun method. After overnight incubation, cells that were successfully transformed were searched under a fluorescent microscope.
  • the unmutated protein 93-11-qGL3-GFP (SEQ ID NO: 2) is distributed throughout the cell, and there is a fluorescent signal aggregation in the cytoplasmic concentration region after the plasmolysis.
  • the mutated protein N411-qGL3-[ GFP (SEQ ID NO: 4) also spreads throughout the cell, but there is more accumulation in the nucleus, which may be directly related to the post-mutation function of the protein.
  • the vector T (see particularly Example a) coding region was amplified, is connected to the P MD18-Tsimple vector by TA cloning, by heat shock method Transformation of E. coli DH5a competent cells, coating of ampicillin-resistant LB plates, picking monoclonals by PCR positive detection (using primer pair qGL3Sfeq-F/R), sending the positive monoclonals to the biological company for sequencing, and correcting the sequence Shake bacteria extract the plasmid with the target fragment.
  • the plasmid carrying the target fragment was simultaneously digested with restriction endonucleases Kpn I and I, and the small fragment was recovered, and the pO IBIA-1300S vector plasmid which was similarly digested with ⁇ I and I was used.
  • the gGL3 wild-type overexpression plasmid pO IBIA-1300SqGL3 was transformed into Agrobacterium competent cells, coated with kanamycin-resistant LB plates, and the monoclonals were picked and tested positive by PCR (using primer pairs qGL33 ⁇ 4q-F, qGL3Sfeq-R) The positive strain was co-cultured with the callus of Zhonghua 11 and four independent transgenic lines were obtained after multiple differentiation. Will T. Seeds harvested on behalf of a single plant, using qGL33 ⁇ 4q-F across introns
  • RNAi-qGL3F2 (SEQ ID NO:36) I RNAi-qGL3R2 (SEQ ID NO:37) and RNAi-qGL3F1 (SEQ ID NO:38) / RNAi were designed for the specific region of qGL3 (1260 to 1743 bp in SEQ ID NO:1). -qGL3R1 (SEQIDNO: 39).
  • T vector inserted into qGL3 as a template and RNAi-qGL3F2 and RNAi-qGL3R2 as primers, the positive insert was amplified and inserted into the vector pC 303 by restriction enzyme sites $el and S&c I.
  • Figure 9C shows (ZHBJ WANG, CHANGBIN CH J, YUNYUAN XU. FDNGXl JANG, YE HAN, ZHIHONG XL) and KA G CHONG, Hant Molecular Biology Fifeporter 22: 409-417, December 2004).
  • T vector inserted into qGL3 as a template and RNAi-qGL3F1 and RNAi-qGL3R1 as primers
  • the reverse insert was amplified, and the reverse insert was inserted into the sequencing by the restriction sites ⁇ I and BamH I.
  • pC 303-qGL3o The correctly constructed pC 303-RNAi interference vector was transformed by Agrobacterium-mediated transformation. A total of 23 independent transgenic Ts were obtained from the rice variety Zhonghua 11 (specifically, as described above for overexpression of the transgene). Generation strain.
  • the phenotypic survey found that there was no significant change in the overall plant type of both over-expressing positive plants and FNAi-interfering plants, and only the length and weight of the seeds were significantly reduced (Fig. 11).
  • the gGL3-encoded protein has two distinct domains and domains, as shown in the figure.
  • a segment-specific primer pair OXqGL3-F SEQ ID NO: 34, restriction site Kpn I
  • OXkelch-R SEQ ID NO: 40, cleavage site 3 ⁇ 4 I
  • the overexpression vector pO IBIA-1300s was constructed to form two overexpression vectors pO IBIA-1300SOX-kelch and pO IBIA-1300SOX-PP2/3 ⁇ 4Co to transform rice variety Zhonghua 11 by Agrobacterium-mediated transformation.
  • the OX-kelch transgenic T was found by phenotypic investigation.
  • SEQ ID NO: 45 the complete CDs region corresponding to two homologous genes was amplified from the cDNA of rice cultivar 93-11, and ligated into pMD18-Tsimple vector by TA cloning to obtain recombinant plasmid T-qGL3. -L1 and T-qGL3-L2.
  • E. coli DH5a competent cells were transformed by heat shock method, ampicillin-resistant LB plates were coated, and monoclonal clones were picked for PCR positive detection (using cloning primer pairs)
  • the positive monoclonal was sent to the biological company for sequencing, the gGL3-Li sequence was SEQ ID NQ5, and the gQL3- sequence was SEQ ID NQ7; the correct sequence of the strain was shaken to extract the plasmid carrying the target fragment and stored. Then, using the primer pair with the restriction site, qGL3-L1 -K
  • the near-isogenic line 93-11 NIL-gQL3-0 was used to construct hybrid rice F r 2 with the two-line restorer line Guangzhan 63S, and the hybrid rice with common 93-11 and Guangzhan 63S was used to carry out various agronomic phenotypes.
  • a comparative analysis of yields revealed that the near-isogenic line 93-11 NIL-gQL3-D containing the g «3L3 dominant allele increased the grain length of hybrid rice F1 by 17.8% (from 9.56 mm to 11.26 mm), grain weight. Increase by 30.7% (100-grain weight increased from 2.676g to 3.493 ⁇ 4), as shown in Figure 16.
  • Grain thickness (mm) 2.18 ⁇ 0.05 2.36 ⁇ 0.04
  • Ear length (cm) 24.5 ⁇ 1.6 27.5 ⁇ 2.3
  • the gGL3 of the present invention is the name of a gene , it contains two different allelic variations,

Abstract

提供了一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用。本申请从水稻中分离克隆到一个同时控制水稻籽粒粒长和粒重的主效QTL基因qGL3（SEQ ID NO:1）及其优势功能的半显性等位基因qGL3-D（SEQ ID NO:3），这两个基因具有改良水稻的产量和外观品质的能力。同时克隆并证明了该基因在水稻中的两个同源基因qGL3-L1和qGL3-L2同样具有对水稻籽粒长度的调节作用。qGL3基因、及其优势等位基因qGL3-D和两个同源基因qGL3-L1和qGL3-L2均可在作物遗传改良中应用。

Description

说明书
一种控制水稻籽雌 ¾»S的半显脑因 的克隆与細
本发明涉及植物基因工程技术领域，涉及一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因 qG 3的克隆与应 用， 具体涉及到一个位于水稻第三染色体长臂上的控制籽粒粒长和粒重的主效半显性基因 qG 3的基因克隆 和作物改良应用。 背景
随着世界人口的增长， 水稻作为主要的粮食作物面临着提高产量的迫切需要。估计到 2030年， 水稻产 量需要提高 40%以上才能满足人类的需要。 同时， 随着人类生活水平的提高， 对于水稻的外观品质也提出 了越来越高的要求。 中国南部、 美洲和欧洲国家的人偏向于喜好细长粒型， 而中国北部、 日本和韩国偏向 于喜好短圆粒型 （Unnevehr ef a/., 1992)。为了满足人类的需要，水稻遗传育种学家对水稻的产量和粒型进行 了越来越深入的研究。
水稻的产量性状是由多基因控制的数量性状， 表现为连续变异， 受环境的影响较大。 在水稻错综复杂 的产量因子中， 直接构成因子包括粒重、 每穗颖花数、 有效穗数和结实率。 此外， 植株高度、 分蘖数、 穗 型、 叶型等性状也能间接影响水稻群体的产量。 产量的形成是这些众多性状在特定环境条件下共同作用的 结果。
尽管粒重是受多基因控制的数量性状， 但其较高的遗传力说明该性状可以分离出某些主效基因位点。 粒重可以分解为粒长、 粒宽、 粒厚和灌浆密度等多个组分。 早在 1980年， Takeda和 s^to就报道了水稻籽 粒长度受单基因 ίΚ-f 控制； Mckenziedeng (1983)报道认为粒长由 2-3个或者更多的基因控制。随着计算机技 术为基础的数量遗传分析方法的改进和分子标记的大量开发， 人们越来越多的借助于 στι^分析方法来研究 水稻粒重和粒形。 众多研究者采用不同的遗传群体定位到了有关粒重和粒形的 Q 位点约 315个 ( http://www.gramene.org， 截止 2011年 9月）， 几乎分布于水稻的所有 12条染色体上， 而对粒重贡献大 的 Q 集中分布在第 2、3、5、6、8等染色体。这其中有的位点很可能有大量的重复，如关于粒长的 σΠίΚ-4( 、 gl-3、 gw3.1、 Gl/l/3与克隆的 GS处于相同的染色体区间。
近十多年来， 由于水稻基因组计划的完成， 一些水稻粒重、 穗粒数、 分蘖、 株高、 株型等水稻产量相 关基因得到分离。有多个粒重相关基因被克隆， 包括第 3染色体上的控制粒长的基因 GS， S¾3和位于第 5 染色体的 Οί; 位于第 2染色体上控制粒宽的 /Ι/2和第 5染色体上的粒宽基因 qS /51 (Μ5。 GS是由范楚 川等于 2006年利用长粒水稻材料明恢 63与短粒材料川 7构建的 BQF2群体定位得到的。它是一个位于水稻 第三染色体着丝粒附近的跨膜蛋白。 GS存在三种不同截断部位的等位变异， 来自于明恢 63的位点 （截掉 所有功能域， 蛋白完全失活）控制长粒型籽粒 (9.91 ±0.10 mm, mean ± SD)， 来自于珍汕 97的位点（完整功能 的蛋白） 形成中等粒 (8.08±0.07 mm)， 来自于川 7的位点 （截掉 C端" 1NFR和 功能域， 仅保留 N端的 0SR功能域）形成短粒（6.30±0.09 mm) (Mao ef a/., 2010)。 GS3对于籽粒长度的调节是通过控制细胞分裂来 调节颖壳纵向的细胞数目来调节的 (Mao ei a/., 2010)。 是 Ashikari等和 Fujisawa等 （1999) 发现的， 此基 因的功能缺失突变 W会形成不正常的短籽粒， 它编码一个 G蛋白的 α亚基， 此类蛋白被认为是激素调控途 径处于受体下游的分子开关。 3¾3基因是由 Kitagawa等 （2010)通过突变体的研究发现的。 突变基因 srs3 通过减少颖壳纵向的细胞数目降低谷粒的长度形成不正常的谷粒， 它是一个驱动蛋白 -13家族中的一员。 GW2 (SDng et al.， 2007)禾 B GW& q3A/5 (Wan et al.， 2008; Snomura et al.， 2008) 是两个控制水稻籽粒宽度的
Q 位点，这两个基因均是功能缺失型突变导致籽粒颖壳横向细胞分离增多，进而导致横向细胞数目的增加 形成较宽的籽粒。初步研究证明 G1/I/2是一个 RNG型的 B泛素连接酶，而 是一个未知功能的蛋 白， 酵母双杂发现它的一个互作蛋白也是一种多聚泛素， 是否两个位点通过同一个泛素蛋白酶体分子途径 调节了籽粒的宽度还有待进一步研究。
另外一些控制水稻粒重或粒型的 Q 位点也到了精细定位可以通过分子标记辅助选择的程度， 例如 gw8.1 (Xie et al" 2006)， gw9.1 (Xie et al" 2008)和 Gl l 6(Guo et a/., 2009)， 但是还没有获得克隆和进一步的功 能验证。 在其他粮食作物中关于粒重或者粒型的研究也取得了一定的进展 （Gegas ef a/., 2010)。 发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆一个同时控制水稻籽粒粒长和粒重的主效 Q 及其优势功能的半显 性等位基因的完整编码区段 DNA片度， 利用这个基因改良水稻的产量和外观品质的能力。 同时克隆并证明 了此基因在水稻中的两个同源基因同样具有对水稻籽粒长度的调节作用。
一种控制水稻籽粒长度和粒重的半显性基因 gGL3， 核苷酸序列如 SEQ ID NQ 1所示。
所述的基因 g L3编码的蛋白， 即 SEQ ID NO:1中第 219〜3230位翻译所对应的氨基酸多肽， 氨基酸序 列如 SEQ ID NO:2所示。
所述的基因 qG 3的优势等位基因 qGL3-D， 核苷酸序列如 SEQ ID NO:3所示。
所述的优势等位基因 gQL3-D编码的蛋白，由 SEQ ID NO:3中第 219〜3230位翻译所对应的氨基酸多肽， 氨基酸序列如 SEQ ID NO:4所示。
所述基因 gGL3在水稻中的同源基因 qGL3-L1， 核苷酸序列如 SEQ ID NO:5所示， 其编码的蛋白序列如
SEQ ID NO:6所示， 即 SEQ ID NO:5中 99〜2774位翻译所对应的氨基酸多肽。
所述基因 gGL3在水稻中的同源基因 qG 3-L2， 核苷酸序列如 SEQ ID NO:7所示， 其编码的蛋白序列如
SEQ ID NO:8所示， 即 SEQ ID NO:7中 78〜3107位翻译所对应的氨基酸多肽
所述的基因 g«3L3在作物遗传改良中的应用， 优选在改良作物粒长和 /或粒重中的应用。
所述的基因 gQL3-D在作物遗传改良中的应用， 优选在改良作物粒长和 /或粒重中的应用。
所述的基因 gQL3-/ 在作物遗传改良中的应用， 优选在改良作物粒长和 /或粒重中的应用。
所述的基因 gQL3- 在作物遗传改良中的应用， 优选在改良作物粒长和 /或粒重中的应用。
本发明的有益效果：
( 1 )申请者于 2005年从水稻地方品种资源材料中发现一份大粒粳稻种质 N411 ,其千粒重达 71 . 0.22 克。 随后分别与小粒籼稻家系 05-643、 中粒型品种 93-11 正反杂交以及回交， 对粒重及其相关性状展开研 究。 初步的研究表明， 粒重相关性状没有细胞质效应。 通过 N411/05-643 F2群体的 Q 分析， 在 Sffi分子 标记 RM6266-RVI3350区间检测到 1个贡献率达 52.5°/ 主效粒长 QTL qGL3, 该位点同时对粒重贡献率达 31 % 此位点物理位置位于已经报道的粒长控制基因 GS的下游 8.5Mb左右， 序列分析表明 N411、 05-643、 93-11与明恢 63具有相同的 GS3突变位点。从 F2选择携有 RM6266-RVI3350大粒亲本标记型的个体与 05-643、 93-11分别回交， 进一步通过对 93-11回交产生的 BQF2群体的 Q 分析确认了这一位点对于粒长和粒重的 单因子遗传效应。 在此基础上利用籽粒长度出现单因子分离的四个回交 BQF3群体， 将 g L3定位在 Indel 标记 xj39和 xj26之间约 46.6k 的区间内 （图 4) 。
对此区段内的两个预测表达基因在两个亲本中进行克隆测序比较发现， 其中一个基因的 cDNA序列在 两亲本间没有差异。 而另外的一个基因在大粒亲本 N411和小粒亲本 93-11间存在两处突变。 具体为： 来自 于大粒亲本 N411的位点（SK) ID NO:3)与来自于小粒亲本 93-11的位点（SK) ID No.1 )相比：一处位于 cDNA 序列的 5'UTR区域的 -72位置存在一个单碱基 G的缺失； 另一处位于第 10个外显子上的编码区 +1092位置 的一个单核苷酸替换： G^A， 进而导致蛋白质一个氨基酸的替换： 364位的天冬氨酸 （Asp, D) 转变成了谷 氨酸（du, E)， D364E; 将该发生两处突变的基因命名为 gQL3-D。对两个基因在背景亲本和近等基因系间的 表达比较发现， 两个基因在亲本和近等基因系间不存在表达差异。 将存在序列差异的基因定为 g«3L3的候选 基因。 对此基因的结构和编码蛋白产物的预测和分析， 发现该基因由 21个外显子和 20个内含子构成。 编 码区长度为 3012bp， 编码 1003个氨基酸的多肽。 根据蛋白质功能域预测发现其编码的多肽是一个含有 2 个 kelch重复结构域的丝氨酸 /苏氨酸磷酸 （酯） 酶。 在水稻中， 此基因是由三个同源基因构成的小家族， 申请人将其分别命名为 gGL3 ( SK) ID NO:1 ) 、 qGL3-L1 ( SK) ID NO:5) 和 gQL3- ( SK) ID NO:7) 。 对来自 两个亲本的等位基因进一步分析发现， 其优势等位基因 gQL3-D位于蛋白 364位的天冬氨酸 （Asp, D) 转变 成了谷氨酸（du, E) ， D364 & 此突变恰好发生在结构域 kelch的保守基序 AVLDT的 D位置上（图 5) 。 对 gGL3及其另外两个同源基因 qO 3-L1和 qGL3-L2的 F¾al-Tlme PCR表达分析发现， 该家族基因在水稻的根、 茎、 叶片、 叶鞘、 穗子的不同发育时期组织中表达， 优势表达在穗发育的中后期（图 6) 。 通过将此基因的 启动子 （SK) ID NO:9) 连接 GUS基因进行的转基因启动子 GUS表达活性分析， 同样印证了 Fteal-Tlme PCR 的结果， 同时可以发现 c?GL3在根尖、 茎的维管组织、 叶片的中脉、 叶鞘的外围、 顶点生长点、 未成熟颖壳 的基部、 成熟的颖壳中， 以及雌蕊的基部优势表达， 而不再成熟的花药中表达（图 7) 。 通过对此基因编码 蛋白的在洋葱表皮中的亚细胞定位发现： 野生型的蛋白 （如 SEQ ID NO:2所示） 分布于整个细胞质中， 在细 胞核中未有优势分布， 而突变后的蛋白 （如 SEQ ID NO:4所示） 分布于细胞质中， 同时优势分布于细胞核中 (图 8)。 推断此基因编码的蛋白的亚细胞定位的改变是其发挥不同作用的关键。 将野生型基因 g L3 (序列 如 SEQ ID NO:1所示） 完整阅读框连接到过表达载体 PCAMBIA-1300S中， 转化水稻品种中花 11中， 转基因 T0代和转基因 代超表达阳性单株均表现出变短的粒型， 而对穗型和株型没有显著影响 （图 10)。 同时将 此基因编码的两个预测的功能域分别截断， 如图 12，两个截断后多肽存在中间连接区 296个氨基酸的跨叠， 构建过表达载体转化水稻品种中花 11， OX-Kelch转基因 T。代阳性过表达植株表现出变短的粒型而 OX-PP2AC 转基因 Τ。代阳性过表达植株的粒型没有发生变化 （图 12)。 这说明在对水稻籽粒长度的调节功能主要来自 于 kelch结构域，而与 PP2A3结构域关系不大。在水稻品种中花 11中对目标基因的 RNAi干涉 T。代转基因阳 性单株及其 代转基因阳性单株分析发现， 表达抑制植株的籽粒都发生了变小 （图 10) 。
同时对其中一个同源基因 qGL3-L1的插入敲除突变体的表型分析发现： qGL3-L1的功能完全缺失导致籽 粒明显变小，同时对 qOB-L1和 qGL3-L2的过表达转基因 T。代表型分析发现过表达 qGL3的同源基因 qGL3-L1 和 gQL3- 可以微弱使水稻的籽粒增长， 图 13D。这说明 gGL3及其同源基因 gQL3-/ 和 gQL3- 在调节水稻 籽粒长度上具有类似的功能。
通过分子标记选择获得的以 93-11 为背景导入来自大粒亲本 N411 的等位基因 gQL3-0的近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0分析发现： 基因 qG 3的优势等位变异 qG 3-D (如 SK) ID NO:3所示）对于水稻除了使籽粒 变长， 粒重增加之外， 对于其他的农艺表型没有统计学上的改变（如表 2; 图 13)。 同时利用此近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0与 93-11杂交和作为两系杂交稻恢复系与两系不育系广占 63S构建的杂交组合的获得 的 粒型分析发现， 来自于大粒亲本的等位变异在杂合状态下同样可以使籽粒长度增加（图 14)。 同时对水稻品 种热研背景的近等基因系（GS的短粒等位背景 和水稻品种龙里黑糯的近等基因系（Di的短粒等位背 景 cii) 分析发现， g L3可以掩盖 gs3和 W使籽粒长度缩短的效果 （图 15)。 综上结果说明： 野生型粒长控制基因 g L3 ( SEQ ID NO:1 ) 在中花 11背景下， 无论发生上调还是下调 都会使籽粒变短变小。 而 qG 3的优势等位变异基因 qGL3-D ( SEQ ID NO:3) 发生在 kelch结构域中的保守基 序 AVLDT的 D位置上的天冬氨酸 （Asp, D) 转变成了谷氨酸 （du, E) ， 引起了此基因编码的蛋白从胞质大 量的进入细胞核中， 进而发挥了使水稻籽粒变长的功能， 这是一种功能获得性的突变。 同时证明了 gGL3在 水稻中的两个同源基因 qC 3-L1和 qG 3-L2同样具有对水稻籽粒粒长和粒重的调节功能。 并且 qGL3的优势 等位基因 gQL3-0 ( SEQ ID NO:3) 作为一个控制水稻籽粒长度的遗传学下游基因， 可以很好的拯救上游基因 如 W等的负调控作用， 同时半显性特性使其可以用于恢复系的改良进而用于杂交稻育种。
( 2)本发明中克隆的上述基因为水稻等谷类作物的高产优质育种提供了新的基因资源， 也为其他作物 中克隆相关基因提供了技术借鉴， 也可以为水稻、 小麦、 玉米、 高粱等禾谷类作物以及大豆、 油菜等双子 叶作物的分子进化研究提供证据。 附图说明
图 1： 本发明使用的总体技术路线图。
图 2: 利用 N411和 05-643构建的分子标记遗传图谱及定位的 QTl3。
图 3: N411与 93-1 1构建的精细定位群体 BQF3中随机 206株籽粒表型次数分布图， 填充样式显示 qO 位 点的基因型。
图 4: QQL3的精细定位过程图， A所示 2968个个体中标记间的重组个体数目； B.所示进一步更小区间的重 组个体数目； G所示表型与基因型间的高精度连锁分析； D.所示根据日本晴基因组注释所示标记 xj39和 xj26 间的物理距离。
图 5:禾本科代表植物和拟南芥中 qG 3同源基因家族的 kelch结构域部分蛋白比对，箭头表示大粒亲本 N411 中 gQL3-0的等位变异： D364E
图 6: g(3L3及其同源基因 qGL3-L1和 qGL3-L2的半定量表达分析和实时定量 Ffeal-Time PCR表达分析。 八所示半定量表达分析， B.所示实时定量表达分析； 其中： R 根， G 茎， LB: 叶片， US 叶鞘、 PP: 2cm-3cm 的初级穗， \Ρ·· 8cm-10cm幼穗， MP: 刚要抽出的成熟穗子， 1_： 未抽出的幼叶。
图 7: g L3基因启动子 GUS表达活性分析。
图 8: g L3基因野生型和优势等位蛋白的亚细胞定位。
93-11 -qGL3-GFP表示 qQL3基因野生型蛋白的亚细胞定位图， N411 -qGL3-[ GFP表示 qQL3基因突变后的优势 等位蛋白的亚细胞定位。
图 9: 过表达转基因载体 pO IBIA-1304、 pCAMBIA-1300S和 RNA干涉载体 pC 303的结构酶切位点图。 其中， A为 pCAMBIA-1304的结构酶切位点图， B为 pO IBIA-1300S的结构酶切位点图， C为 pC 303的结构 酶切位点图。
图 10: 过表达和 RNAi干涉转基因株系的表达情况检测。
其中， A为半定量表达分析结果图， B为实时定量表达分析结果统计图。
图 11 : 野生型基因过表达和 RNAi干涉转基因株系农艺表型及穗子、 籽粒表型。
其中， A为野生型基因过表达和 RNAi干涉转基因株系农艺表型； B为野生型基因过表达和 RNAi干涉转基因 株系穗子表型； C为野生型基因过表达和 RNAi干涉转基因株系籽粒表型。
图 12: 截断功能域的过表达转基因载体构建所对应的多肽， 以及转基因植株对应的籽粒表型。
A为截断功能域的过表达转基因载体构建所对应的多肽示意图； B为转基因植株对应的籽粒表型； 其中 OX-qGL3表示 qGL3的过表达转基因载体构建所对应的多肽示意图， OX-kelch表示 qGL3中的 kelch功能域过 表达转基因载体构建所对应的多肽示意图， OX- PP2AC表示 qGL3中的 PP2AC功能域过表达转基因载体构建 所对应的多肽示意图。
图 13: gQL3-/ 插入敲除突变体的植株和籽粒表型， 以及同源基因 gQL3-/ 和 gQL3- 过表达转基因植株的 籽粒表型。
其中， A为野生型东津 DJ和突变体 的植株表型， Β为野生型东津 DJ和突变体 的穗子表型， C 为野生型东津 DJ和突变体 qgl3-l1的籽粒表型， D为 gGL3的同源基因 qO 3-L1和 gQL3- 过表达转基因植株 的籽粒表型； 中花 11为受体亲本。
图 14: g L3处于水稻品种热研 B背景下的近等基因系 （GS的短粒等位背景 和水稻品种龙里黑糯的 近等基因系 （Di的短粒等位背景 di) 籽粒。
图 15: 背景亲本 93-11和近等基因系 93-11 NIL-gQL3-D的株型、 穗子、 及籽粒表型对照图。
A为背景亲本 93-11 和近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0的株型对照图， B为背景亲本 93-11 和近等基因系 93-11 NIL-QQL3-D的穗子对照图， C为背景亲本 93-11和近等基因系 93-11 Ml-qG 3-D的籽粒表型对照图。 图 16: 93-11及近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0以及它们与两系不育系广占 63S配置的杂交稻穗子和籽粒的比 较。
其中 A为 93-11及近等基因系 93-11 NIL-QQL3-D以及它们与两系不育系广占 63S配置的杂交稻穗子的比较图； B为 93-11及近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0以及它们与两系不育系广占 63S配置的杂交稻籽粒的比较图。 具体
下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解为， 这些具体的实施例仅用于说明本发明而不用于 限制本发明的范围。 下列实施例中未标明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 等人， 分子 克隆： 实验室指南 （景 材 中所述的条件， 或按照各 公司销售产品所建议的条件。 其中用到的 分子标记 系列除特殊说明外， 都按照
( http://www.gramene.org ) 网站公布的序列合成。 景 錢例 1 水稻粒 因 q03的分离与获得
(一）
1 . 大粒种质 N411与 05-643 93-11杂交群体的构建 （具体流程参见图 1 )
(1 )利用水稻大粒种质 N411 (由南京农业大学水稻所种质库保存， 其优势等位基因可以从南农籼 5号 中获得， 品种申请受理号 20110730.0) 作为有利基因的供体材料， 与 05-643 (由水稻品种粵丰 B和龙特普 B杂交选育而成） 、 93-11杂交， 种植杂交种， 自交获得 。 将 自交获得的种子种植成单株构成 F2群体， 用于定位粒长、 粒重 Q
(2) F2群体中选择籽粒较长的单株连续回交给 05-643或 93-11，回交高代 BCF2群体用于精细定位主效粒 长、 粒重 Q
2. 主效粒长 Q 分子定位与标记开发方法
(1 )用 SDS法提取群体各株系 DNA (具体方法参见分子克隆：实验室指南 (景 ：
景 材） 。
(2) 首先用 976对 SSR引物（根据 ： http://www.gramene.org/ 网站公布的序列合成）对大粒种 质 N411和品种 05-643、 93-11亲本的 DNA多态性进行初步分析。获得亲本间有多态的标记用于构建遗传连 锁图谱。
(3) PCR反应体积为 10微升， 其中 10X buffer 1微升， 带有 2.5mM Mgd2的 buffer 1微升， 2.5mM dNTPs
0.1微升, Taq酶 (5单位 /微升） 0.1微升，模板 DNA 1微升，加水至 10微升。 SSR反应程序为 95°C预变性 5min 后， 95°C变性 30s， 50-58°C退火 30s， 72°C延伸展 30s， 循环 35次， 最后 72°C延伸 10min， 4度保存。 在 PCR扩增仪上进行 PCR扩增， 扩增产物在 8°非变性聚丙烯酰胺凝胶 （100 ml聚丙烯酰胺溶液中含 7.6克丙 烯酰胺和 0.4克甲叉双丙烯酰胺） 上进行电泳分离， 然后银染， 照相， 统计结果。 利用多态性标记通过 F2 分离群体建立连锁图， 分析谷粒的粒型和粒重 QTl3。
(4)标记开发： 在初定位目标区域内设计新的 InDel标记： 从水稻基因组数据库网站下载目标基因所在 定位区间的水稻基因组公布序列， 根据日本晴和 93-11的基因组序列比对差异， 设计 InDel标记（见表 1 ) 。
表 1.初定位目标区域内设计新的 InDel标记
InDel 上游引物 下游引物
xjll 236 TCTCGTCGTTGTCTCCCA AGCTCCCTTTCCACTCCA 25608821
213 CAGTTTGTATTCGGGTTGC TGGATGCTTACGTCGTCT 25636402
Xjl5 270 TTGAAGGAGATGGCAGATAG TGGGATAAACTAATCAGGGAT 25654884
Xj29 141 GATCGCCCAAATCTTCCT TGAGCCACCTTCCAACAC 25678443 xj31 228 GCCGACAGATCGTACATAAC CCATCGCCATTGATAGTTTA 25685136 xj32 160 CGTCGTCAGCTATTCAGC CTAGGCAATGCAACAAAA 25685556
Xjl9 194 AAGCCCAGTTACAAACCCAA CGAGTCAGTTCTACTCCCAAGA 25715427
Xj22 235 TGCTAGTGGAAAAGGAAATC AGTTATTATACCGTGGATGC 25747626 xj39 266 ATTTGTACTAACAATCGTCTCAAC GCATACTCTATAGTCTTTCCGTTA 25771253
Xjl8 211 CTTTGTGCGTGATTTATCTT ATGGGACTGGACTCTGTTCT 25793558
Xj24 277 AAATCCAACGGTGAGAACAA GGAGGTCTACGAGGAGGTAA 25806611 xj26 227 TCAAACTAACTCTAACCCTT CAGAAACTAAATACACCCT 25817844
Xj27 255 GCAAGGGGCTAAGATGTAAA GCAGATGAAAACTTGTGGAAT 25827461
Φ所示位置 IR3SP Build04
(5)根据连锁交换规律， 利用群体基因型资料构建水稻的遗传图谱， 所用软件为 Mapmaker3.0， LOD阈 值设为 3.0， 获得连锁图谱。
(6)利用 WinQTl£art2.5软件和 IciMapping软件对 F2群体各个单株的分子标记的基因型资料与其对应每 个单株的籽粒性状进行软件分析， 定位 στΐ3。
(二）结果与分析：
水稻粳稻大粒种质 Ν411 (千粒重 71 .1克） 与 05-643 (千粒重 17.9克） 93-11 (千粒重 28.3克） 杂交 获得 。 粒长、 千粒重均处于中亲值或中亲偏低亲值。 F2的籽粒长度和千粒重做成次数分布图， 表现出 连续的数量性状特征， 说明粒长和粒重是由多基因控制的性状。 利用分布于 12条染色体的 107个 SSR多态 性标记， 利用 N411/05-643的 F2代的 182个个体， 建立了分子标记图谱， 如图 2。 利用 WinQTkart2.5软件 对粒重及其组分： 粒长、 粒宽和粒厚进行 定位， 采用符合区间作图法， 抽样 1000次迭代来确定 LOD 值。 cm^分析表明， 控制粒长的 cm^分布于第 3染色体， 其中贡献率最大的粒长 Q 位于分子标记
RM5864-RVI3199之间， 如图 2。 进一步采用逐步回交逐步定位的方法，精细定位粒长 Q 。利用 N411/05-643的 BQ F2群体，将目的 Q 定位在 RM6266-RVI3350之间。 从 N411/93-1 1的 BQF2群体中， 通过分子标记选择， 挑选目标区域较小， 并 且背景单一， 整株表型接近 93-11 的个体回交给 93-11， 在 群体中， 通过分子标记选择， 挑选含有目 的区域又背景接近 93-11的个体， 收取单株种子， 种植形成 BQF2群体约 3000株。
对 BQF2群体随机前 212株单株收种子， 考察种子的长宽厚， 同时分析群体目标区域的分子标记数据， 如图 3。 对剩余的 BQF2群体的两侧标记筛选交换株， 通过考察交换株的表型数据， 结合加密的内部标记， 确认 QTL的位置 (图 4)。
对 2968株分离个体的筛査， 获得了 91个在分子标记 SSR标记 RVI15561和 RM15630间的交换株， 加 密两标记间的分子标记， 并对分子标记稀疏的区域对照日本晴和 9311 的序列开发新的 InDel标记。 利用加 密的分子标记分析重组个体， 确定重组发生的具体位置。 结合分析籽粒长度数据， 进行高精度连锁分析， 将 g(3L3确定在 InDel标记 xj39和 xj26之间的 46.6k 之内， 与标记 xj24、 xj18共分离 （图 4)。
同时根据获得的重组个体： 在 93-11背景下导入 N411的等位基因 qG 3-D， 区间跨度从 InDel标记 xj39 到 RM3601 之间约 700k 的一个株系经过自交纯和之后， 确定为粒长基因 qG 3 的近等基因系
Figure imgf000009_0001
2、 基因的克隆
根据日本晴的基因组序列， 水稻基因组注释系统 （MSU Rce Genome Annotation (0sa1 ) Ffelease 6.1 : http://rice.plantbiology.msu.edu/ogi-bin/gbrowse/rice/ ) 在这一区间预测了 5个基因， 其中三个是转座子或者 逆转座子， 没有任何的 ΒΓ信息。 另外两个假定的基因： LCq_QsO¾44484和 LCq_QsO¾445(W具有部分 ΒΓ 信息， 但是没有全长 cDNA序列。根据预测序列，我们设计了 LO^QsO¾^45∞基因的克隆引物 qGL3-F ( SEQ ID NO:10)， qGL3-R ( SEQ ID N0:11 )和 LOQ_QsO¾^4484基因的克隆引物 G12- F ( SEQ ID NO: 12)， G12R C SEQ ID N0:13) ;分别以上述引物对两个亲本 N411和 93-11的穗部 cDNA模板进行扩增，从两个亲本 N411和 93-11 的穗部 cDNA模板中成功的分别扩增出了这两个基因（常规 PCR程序， 退火温度适当调整）， 通过 T-A克隆， 将扩增获得的序列连接到 pMD18-Tsimple载体上（购买自 Takara), 转化大肠杆菌感受态细胞 DH5a， 涂布氨 苄抗性的 LB平板， 挑取单克隆通过 PCR阳性检测 （分以别使用各自基因的克隆引物)， 将若干个单独的阳 性克隆送金斯瑞生物公司测序。 比较发现 LOC_O903g44484的 cDNA序列在两个亲本 N411和 93-11中没有 差异。而 LCq_QsO¾445(W的 cDNA序列在大粒亲本 N411和 93-11中存在两处差异： 与来自 93-11的等位基 因 （SEQ ID NO:1 ) 相比， 来自大粒亲本 N411的等位基因 （SEQ ID NO:3) 的 5'UTR区域的 -72位置存在一个 单碱基 G的缺失； 位于第 10个外显子上的编码区 +1092位置的一个单核苷酸替换， G^A， 进而导致蛋白质 一个氨基酸的替换： 364位的天冬氨酸（Asp, D)转变成了谷氨酸（du, E)， D364 & 由此我们将 93-11亲本 中的 LOC_Os03g44500定为 qGL3的候选基因， 序列为 SEQ ID N0:1； 而将其来自来自大粒亲本 N411的等位 变异命名为 gQL3- 序列为 SEQ ID N0:3。
生物信息学预测发现 g«3L3是由 21个外显子和 20个内含子构成。编码区长度为 3012bp， 编码 1003个 氨基酸的多肽。 根据蛋白质功能域预测发现其编码的多肽是一个含有 2个 kelch重复的丝氨酸 /苏氨酸磷酸 (酯）酶（kelch repeat -containing serine/threonine phosphatases在水稻中， 这一亚基因家族含有三个成员， 分别是 LOC_O903g44500; LOC_Os05g0524(m LOC_Os12g42310，我们将其分别命名为 qCL3、qGL3-L1、qCL3-L2。 在拟南芥中， 其同源基因属于一个四成员的亚家族， 分别为 ^SSL/i, AtBSL AtBSL2, AtBSL3， 它们是 BFfe 信号途径的正调节因子。 錢例 2 q03及其同龍因雜表达分析
根据 NCBI上， 水稻的 ΒΓ profiles数据库分析发现：水稻的 gGL3家族的三个成员在多种组织中都有表 达， 尤其是在分裂旺盛的幼嫩组织中。 为了更好的了解这个基因家族的表达模式， 根据基因注释和 ΒΓ数 据库拼接的 mRNA序列， 我们设计了三个基因 gQL3、 qC3-L gQL3- 各自的特异性表达引物对 qGL3¾q-F (SEQIDNO:14)， qGL3¾q-R (SEQIDNO:15); qGL3-L1¾q-F (SEQIDNO:16)， qGL3-L1Sfeq-R (SEQIDNO:17) 和 qGL3-L2¾q-F (SEQIDNO:18)， qGL3-L2Sfeq-R (SEQIDNO:19)。 利用半定量分析的方法对这个基因家族的 表达情况进行了分析。
分别提取 93-11和 93-11NIL-gGL3的根（R)、 茎 （C)、 刚抽出的叶片 （LB)、 叶鞘 （LB)、 2cm-3cm的初 级穗（PP)、 8cm-10cm幼穗（ P)、 刚要抽出的成熟穗子（MP) 的 RNA (使用天为公司的 RNA提取试剂盒）， 并反转为 cDNA， 反转试剂体系采用的是： Prime ripf FfTMaster Mix Fferfect Ffeal Time, 购自 Takara公司。 利用 Qsf¾ci作为内参（引物对 OsRacl-F (SEQIDNO:20) , OsRacl-R (SEQIDNO:2D)调模板浓度到一致。 然后利用三个基因特异的引物表达引物对： qGL3¾q-F/ qGL3¾q-R qGL3-L1Sfeq-F/ qGL3-L1Sfeq-R和 qGL3-L2Sfeq-F/ qGL3-L2Sfeq-R通过同一次 PCR反应来分析三个同源基因在各个组织中表达情况。从图中可以 看出， gGL3基因家族成员在各个组织中都有表达， 尤其是在叶片中的表达量最高。 同时可以看出背景亲本 93-11和近等基因系 93-11NIL-gGL3中各个组织的表达量没有差异 （图 6A)。 因而在后面的实时荧光定量分 析中未对近等基因系进行分析。
为了进一步的细致比较 qQL3及其同源基因 qGL3-L1、 qGL3-L2的表达情况，我们通过 qPCRprimer design tool网站（http：〃 www.quantprime.de/ main.php?page=home)提供的 qPCR引物设计工具设计了 qG 3、qG 3-L1、 gQL3- 三个基因的特异引物对，依次为： qP1-F(SEQIDNO:22)， qP1-R(SEQIDNO:23); qP2-F(SEQIDNO:24), qP2-R (SEQIDNO:25); qP3-F (SEQIDNO:26)， qP3-R (SEQIDNO:27)， 进一步通过 Quantitative PCR的方法 来分析三个基因在各个组织中的表达情况。 具体试剂采用的是: SYBRf Premix Εκ Taq™ II (Perfect Ffeal Time), 购自 Takara公司，荧光 PCR仪使用的是 ABI公司的 7500fast。本分析在半定量的基础上添加了未抽出的幼叶 ( 1_)， 采用在同一块 96孔板上同时进行三个重复， 内参基因采用的是 18S (引物对 18S-F(SEQIDNO:28) , 18S-R (SEQIDNO:29)) 结果如图 6B。
从图 6B中可以看出， 整个基因家族在各个组织中都有表达， 并且 g L3和 qG 3-L 比 qC 3-L1表达量 要高， 同时具有更加相似的表达模式， 在穗中随着发育进程整个家族都出现表达量上升的趋势， qGL3-L2在 幼嫩的叶片， 成熟的叶片和叶鞘中一直维持较高的表达量， 不同于 gGL3的逐渐上升趋势。
针对基因 qOL3的启动子 （SK)IDN0:9) ， 我们设计了引物 qGL3Ro-F (SEQIDNO:30， 酶切位点 Pst I) 和 qGL3Ro-R (SEQIDN0:31， 酶切位点 Nco I) ， 利用大粒亲本 N411的基因组 DNA作为模板， 通过 PCR扩 增获得了基因 qGL3的启动子序列， 将获得 PCR产物通过 T-A克隆， 连接到 pMCM8TsimpleT-simple载体上 (购买自 Takara) ， 通过热激法转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞， 涂布氨苄抗性 LB平板， 挑取单克隆通过 PCR阳性检测 （利用引物对 qGL3Ro-F和 qGL3Ro-R) ， 将阳性单克隆送交生物公司测序， 将序列正确的菌 株摇菌提取带有目标片段的质粒。将获得的质粒利用限制性内切酶 Pst I和 Nco I酶切连接到同样酶切的载体 质粒 pO IBIA-1304 (酶切位点结构图如图 9A)上， 构成重组质粒 pO IBIA-qGL3Pro-GUS 将此质粒通过农 杆菌介导法转化水稻品种中花 11。对阳性 T。代转基因植株进行 GUS染色分析（具体方法参照分子克隆： 实 验室指南）。 连接 GUS基因进行的转基因启动子 GUS表达活性分析， 同样印证了 FfenimePCR的结果， 同 时可以发现 g«3L3在根尖、 茎的维管组织、 叶片的中脉、 叶鞘的外围、 顶点生长点、 未成熟颖壳的基部、 成 熟的颖壳中， 以及雌蕊的基部优势表达， 而不再成熟的花药中表达 （图 7) 。 ¾¾例 3 qd3野^ 蛋白及优势^蛋白 qd3- D的亚细胞定位
利用引物对 qGL3GFP-F(SEQIDNO:32)， qGL3GFP-R(ffiQIDNO:33)分别将克隆到 T载体上的 qC 3 (见 具体实施例一） 及其等位变异基因 gQL3-0的全长编码区扩增出来， 通过 T-A克隆连接到 pMCM8TsimPle载 体上（购买自 Takara), 通过热激法转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞， 涂布氨苄抗性 LB平板， 挑取单克隆通 过 PCR阳性检测 （利用引物对 qGL3¾q-F/qGL3¾q-R) ， 将阳性单克隆送交生物公司测序， 将序列正确的菌 株摇菌提取带有目标片段的质粒。 将获得的质粒利用 9nal I酶切连接到同样酶切的载体质粒 pBI121上， 构 成重组质粒 pBI121-gQL3和 pBI121-gQL3-D。 将连接产物转化大肠杆菌 Top10感受态细胞， 涂布氨苄抗性 LB 平板， 挑取单克隆通过 PCR阳性检测 （利用引物对 qGL3¾q-F/R) ， 并通过酶切验证其连接的方向性， 将阳 性单克隆送交生物公司测序， 将正确连接的菌体扩繁提取整合后的 PBI121质粒。 将质粒通过基因枪法转化 洋葱的表皮细胞。 过夜培养后， 荧光显微镜下寻找转化成功的细胞。
从图 8中可以看出： 未发生突变的蛋白 93-11-qGL3-GFP (SEQ ID NO:2) 在整个细胞中都有分布， 在质 壁分离之后的细胞质浓缩区会有荧光信号的聚集。 而突变后的蛋白 N411-qGL3-[ GFP(SEQIDNO:4)也是布 满整个细胞的， 但是在细胞核中会有更多的积累， 这可能与蛋白的突变后功能获得直接相关的。 实施例 4 gGL3基因的水稻转基因研究
(1) q(13野翅赚达和 FN^i表达干涉研究
利用引物对 （SEQIDNO:34) (SEQIDNO:35)将克隆到 T载体上的 qGL3 (见具体实 施例一） 编码区扩增出来， 通过 T-A克隆连接到 PMD18-Tsimple载体上， 通过热激法转化大肠杆菌 DH5a感 受态细胞， 涂布氨苄抗性 LB平板， 挑取单克隆通过 PCR阳性检测 （利用引物对 qGL3Sfeq-F/R) ， 将阳性单 克隆送交生物公司测序， 将序列正确的菌株摇菌提取带有目标片段的质粒。 利用限制性内切酶 Kpn I和 I 同时酶切带有目标片段的质粒，跑胶回收小片段，与同样利用 Κρη I和 I酶切的 pO IBIA-1300S载体质粒
(通过对载体 pCAMBIA-1300改造而来 （Zhou et al., 2009)， 质粒结构图如图 9B所示） 跑胶回收的大片段 利用 T4连接酶连接。 将连接产物热激法转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞， 涂布卡那霉素抗性 LB平板， 挑取 单克隆通过 PCR阳性检测 （利用引物对 qGL3¾q-F， qGL3Sfeq-R) ， 将阳性单克隆送交生物公司测序， 将序 列正确的菌株摇菌提取带有目标片段的质粒， 即为 gC13野生型过表达质粒： PO IBIA-1300SqGL3。将 gGL3 野生型过表达质粒 pO IBIA-1300SqGL3转化农杆菌感受态细胞， 涂布卡那霉素抗性 LB平板， 挑取单克隆 后通过 PCR检测阳性（利用引物对 qGL3¾q-F， qGL3Sfeq-R) ， 将阳性菌株与中花 11的愈伤组织共培养， 通 过多次分化后获得了四株独立的转基因株系。将 T。代单株收获的种子种成株行，利用跨内含子的 qGL3¾q-F
(SEQIDNO:14)， qGL3¾q-R (SEQ ID NO:15) 引物对进行阳性验证。 各个不同的株系都有阳性单株出现。 对阳性单株 OX-1， OX-2和 OX-3进行表达分析和表型调査。
针对 qGL3的特异区域 （SEQ ID NO:1 中 1260~1743bp) 设计引物对 RNAi-qGL3F2 (SEQ ID NO:36) I RNAi-qGL3R2 (SEQIDNO:37) 禾 B RNAi-qGL3F1 (SEQIDNO:38) / RNAi-qGL3R1 (SEQIDNO:39)。 以插入 qGL3 的 T载体为模板，以 RNAi-qGL3F2和 RNAi-qGL3R2为引物，扩增得到正向插入片段,通过酶切位点 $el和 S&c I插入载体 pC 303，酶切位点结构图如图 9C所示（ZHBJ WANG, CHANGBIN CH J, YUNYUAN XU.FDNGXl JANG, YE HAN, ZHIHONG XL) and KA G CHONG,Hant Molecular Biology Ffeporter 22: 409-417, December 2004 )。 以插 入 qGL3的 T载体为模板， 以 RNAi-qGL3F1和 RNAi-qGL3R1为引物， 扩增得到反向插入片段,将该反向插入片 段通过酶切位点 Ιφη I和 BamH I插入到测序验证成功的插入正向插入片段的 pC 303载体的 Ιφη I和 BamH I 的酶切位点间， 将构建成功的载体送交 Takara生物公司测序， 验证正确性， 得到 qGL3 RNAi 干涉载体: pC 303-qGL3o 将正确构建的 pC 303-RNAi干涉载体通过农杆菌介导法转化水稻品种中花 11 (具体方法如上 述过表达转基因）， 总共获得了 23株独立的转基因 T。代株系。将长势较好的 18个株系种成株行， 利用位于 载体上的 L¾Z-F (SEQ ID NO:50) 和 303P1 (SEQ ID NQ51 ) 引物， PCR检测各株系的阳性： 确定株行的整体 是否有阳性出现之后， 选取代表性单株进行再次验证， 最终选定三个阳性株系 R-4， R-5和 R-6进行进一步 的表达情况分析。
将三个独立的阳性过表达株系中的单株 OX-1， OX-2和 OX-3, 和三个独立的 RNAi的阳性株系中的单株 R-4， R-5和 R-6以及野生型中花 11同时进行 qCL3的表达鉴定， 同时分析过表达和干涉株系中 qG 3-L1和 gQL3- 的表达情况 （所用引物与实施例 2中的表达分析引物相同）。 取各个单株刚刚展开的箭叶分析各个 基因的表达情况。
如图 10通过半定量表达分析表明（利用引物对 qGL3¾q-F/R)， 过表达株系的目标基因 g L3的表达量 发生了明显的提高， 而干涉植株发生了明显的表达降低， 而对于同源基因的表达没有发生影响。 实时定量 表达分析发现，过表达植株的表达量都发生了明显的提高。 FNAi植株中目标基因 g L3的表达量受到了明显 的抑制， 只有野生型植株中大约 10% 同时另外的两个同源基因的表达量也受到了一定程度的干涉， 但是 抑制的程度不是很明显， 大约干涉掉了 10°/cr50°/
表型调査发现： 无论是过表达阳性植株， 还是 FNAi干涉植株整体株型都没有发生明显的变化， 只有籽 粒的长度和重量发生了明显的变小， （图 11 )。
(2) 野^ 功能 达研究
针对基因 gGL3编码蛋白功能域的预测， gGL3编码的蛋白具有两个明显的结构域 和 结构 域， 如图 。 为了进一步检测两个功能域哪一个部位在水稻籽粒长度调节中发挥关键作用， 我们通过区段 特异性引物对 OXqGL3-F (SEQ ID NO:34， 酶切位点 Kpn I) 和 OXkelch-R (SEQ ID NO:40， 酶切位点 ¾l I ) ， 从带有 qGL3的 T载体上扩增出片段， 此片段编码去除 ΡΡ2Α3功能域的多肽 OX-kelch。 利用特异性引物对 OXPP2A-F (SEQ ID NO:41， 酶切位点 Kpn I) 和 OXqGL3-R (SEQ ID NO:35， 酶切位点 ¾l I ) ， 从带有 qC 3的 T载体上扩增出片段， 此片段编码去除 kelch功能域的多肽 OX-PP2AC (如图 12所示）。 分别构建到过表达载 体 pO IBIA-1300s上， 形成两个过表达载体 pO IBIA-1300SOX-kelch和 pO IBIA-1300SOX-PP2/¾Co 通过农 杆菌介导法转化水稻品种中花 11。 通过表型考察发现 OX-kelch转基因 T。代阳性过表达植株表现出变短的粒 型而 OX-PP2AC转基因 Τ。代阳性过表达植株的粒型没有发生统计学意义上的变化 （图 12)。 这说明在对水稻 籽粒长度的调节功能来自于 kelch结构域， 而与 PP2A3结构域， 以及 kelch和 PP2A=之间的约 290个氨基酸 的链接区关系不大， 如图 12。
(4) (?(13水稻中同 «因 q03- L1和 达研究和插入敲除突变体表型分析
通过生物信息学比对， 根据预测信息， 我们设计了 g03水稻中同源基因 gGL3- Li和 gGL3- 的特异性 克隆引物对 SEQ ID NO:42) (ffiQ ID NO:43禾 B SEQ ID NO:44)/
(SEQ ID NO:45， 从水稻品种 93-11的 cDNA中扩增出了两个同源基因所对应的完整 CDs区域， 通过 T-A克 隆， 连接到 pMD18-Tsimple载体上， 得到重组质粒 T-qGL3-L1和 T-qGL3-L2。 通过热激法转化大肠杆菌 DH5a 感受态细胞， 涂布氨苄抗性 LB平板， 挑取单克隆通过 PCR阳性检测 （利用克隆引物对 和
)，将阳性单克隆送交生物公司测序， gGL3- Li序列为 SEQ ID NQ5, gQL3- 序列为 SEQ ID NQ7; 将序列正确的菌株摇菌提取带有目标片段的质粒保存备用。 之后分别利用带有酶切位点的引物对 qGL3-L1 -K|DnF ( SEQ ID NO:46, 酶切位点 K^nF)和 qGL3-L1-¾IR(SK) ID NO:47， 酶切位点 ¾IR); qGL3-L2-K|DnF (SEQ ID NO:48, 酶切位点 K^nF)和 qGL3-L2-¾IR (SK) ID NO:49， 酶切位点 ¾IR)从带有目标基因的质粒中 分别扩增出两个同源基因 gGL3- Li和 q(13- L2，然后通过酶切连接到过表达载体 pO IBIA-1300S的上的 35S 启动子之后， 获得了两个同源基因的过表达载体 pO IBIA-1300SgQL3-/ 和 pO IBIA-1300SgQL3- 。 通过 农杆菌介导法转化水稻品种中花 11 (具体方法如上述过表达转基因）。 分别获得了若干的转基因阳性 Τ0代 株系。 分析阳性单株的籽粒之后发现过表达 qGL3的同源基因 qGL3-L1和 gQL3- 可以使水稻的籽粒增长很 微弱， 图 13D。
同时， 在水稻公共突变体数据库 ( http://signal.salk.edu/cgi-bin/RceGE) 査询后， 从韩国的 PP3 T-DNA 突变体库购得了 gQL3-/ 基因的插入敲除突变体 ¾/3-/ί。 通过表型观察可以发现， gQL3-/ 基因的缺失， 是 株高明显降低， 如图 13A， 穗子变短如图 13B， 籽粒明显变短小， 如图 13C所示。
称
实施例 5 gGL3基因优势等位变异对于 GS, 的功能优势研究
通过大粒种质 与水稻品种热研 和龙里黑糯构建的杂交组合， 以及多次的连续回交自交之后， 通 过分子标记分析整体标记达到背景亲本 以上， 同时分离世代 的籽粒粒长的分离出现简单的三峰分 布， 并且通过统计分析三峰个体数目符合 的单基因分离， 我们同样获得了以热研 和龙里黑糯为背 景的近等基因系： 热研 gC13和龙里黑糯 q(L3。 通过观察发现， 在热研 背景下 （GS3是完整功能 的等位基因， 能使籽粒较短， 短于 ）gGL3的优势等位变异依然可以发挥使籽粒变长的效果（如图 ）。 在龙里黑糯背景下 （D基因失去功能， 使籽粒超短， 短于热研 ） gC13的优势等位变异也依然可以发挥使 籽粒变长的效果（如图 ）。 这说明本发明的基因处于遗传通路的较下游的位置， 可以很好的镇压籽粒长度 控制通路中上游负调控位点的抑制作用。 称
称
实施例 6 gGL3的分子标记辅助选择育种试验
通过大粒亲本 N411与育种骨干亲本 93-11杂交以及以 93-11为轮回亲本的多次回交， 自交之后的回交 BQF2群体中， 根据整体植株形态选择接近 93-11同时籽粒长度较长的单株继续回交给 93-11， 在 中通 过与 g«3L3周围的分子标记分析各个单株的基因系， 挑选目标区域导入最小的单株， 同时背景标记型最接近 93-11的单株自交获得纯和小片段插入的近等基因系 93-11 NIL-gQL3-D (具体如实施例一）。 整体株型如图 15 所示。 分析近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0和轮回亲本 93-11在农艺性状上的差异发现， 通过杂交导入的 gQL3 的优势等位变异基因 gQL3-D可以使轮回亲本 93-11的籽粒长度增加 2mm以上，是水稻的粒重增加 37%以上。 而对于其他的农艺表型没有明显的影响， 特别注意的是并没有使穗粒数减少。 具体表型差异如表 2所示。 同时利用此近等基因系 93-11 NIL-gQL3-0与两系恢复系广占 63S杂交构建杂交稻 Fr2， 与普通 93-11与广占 63S构建的杂交稻 进行各个农艺表型和产量的比较分析发现： 含有 g«3L3优势等位基因的近等基因系 93-11 NIL-gQL3-D能使杂交稻 F1的粒长增加 17.8% (从 9.56mm增加到 11.26mm)， 粒重增加 30.7% (百粒重 从 2.676g增加到 3.49¾)， 如图 16。
表 ： 背景亲本 和近等基因系 qQL3的各个农艺学表型比较 （江苏南京， 正季） 称
^ 9^11 93-11 NIL-qGL3-D 千 (g) 30.08±0.13 41.22±0.14** 粒长 （mm) 10.21 ±0.14 12.22t0.23** 粒宽 (mm) 2.62±0.06 2.65±0.07
粒厚 (mm) 2.18±0.05 2.36±0.04 穗粒数 246±13 252±7 穗长 (cm) 24.5±1.6 27.5±2.3 株髙 (cm) 123±5.6 126±4.3 分纖 8±1.5 8±2.3 本发明所述的 gGL3是一个基因的名称， 它包含两个不同的等位变异，
qC 3-D, 一个是小粒较短粒的， 我们命名为 gGL3。 前

Claims

权利要求书
1. 一种控制水稻籽粒长度和粒重的半显性基因 c?GL3， 核苷酸序列如 SB3 ID NO: 1所示。
2. 权利要求 1所述的基因 c?GL3编码的蛋白， 氨基酸序列如 SB3 ID NQ2所示。
3. 权利要求 1所述的基因 c?GL3的优势等位基因 c?GL3-D， 核苷酸序列如 SB3 ID NQ3所示。
4. 权利要求 3所述的优势等位基因编码的蛋白， 序列如 SB3 ID NQ4所示。
5. 权利要求 1所述基因 c?GL3在水稻中的同源基因 c?GL3- ， 序列如 SKHD NQ5所示， 其编 码的蛋白序列如 SB31 D NQ6所示。
6. 权利要求 1所述基因 c?GL3在水稻中的同源基因 c?GL3-C 序列如 SKHD NQ7所示， 其编 码的蛋白序列如 SB31 D NQ8所示。
7. 权利要求 1所述的基因 c?GL3在作物遗传改良中的应用， 优选在改良作物粒长和 /或粒重中 的应用。
8. 权利要求 3所述的基因 c?GL3-D在作物遗传改良中的应用， 优选在改良作物粒长和 /或粒重 中的应用。
9. 权利要求 5所述的基因 c?GL3- 在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和 /或粒重 中的应用。
10. 权利要求 6所述的基因 c?GL3- 在作物遗传改良中的应用，优选在改良作物粒长和 /或粒重 中的应用。
PCT/CN2012/075637 2011-10-24 2012-05-17 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用 WO2013060136A1 (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201110325278.2A CN102352367B (zh) 2011-10-24 2011-10-24 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用
CN201110325278.2 2011-10-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013060136A1 true WO2013060136A1 (zh) 2013-05-02

Family

ID=45576005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2012/075637 WO2013060136A1 (zh) 2011-10-24 2012-05-17 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN102352367B (zh)
WO (1) WO2013060136A1 (zh)

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735536A (zh) * 2019-03-15 2019-05-10 扬州大学 一种控制水稻粒宽和粒厚的新基因位点qGW2-1及其分子标记方法
CN111808924A (zh) * 2020-07-15 2020-10-23 中国水稻研究所 一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法
CN112501147A (zh) * 2020-12-21 2021-03-16 广西壮族自治区农业科学院 一种普通野生稻粒型相关编码基因及其应用
CN113068607A (zh) * 2021-03-29 2021-07-06 中国水稻研究所 一种大粒型高产常规粳稻的选育方法
CN113801885A (zh) * 2021-08-18 2021-12-17 中国水稻研究所 水稻大粒基因lg1及其应用
CN113817755A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国水稻研究所 水稻长粒基因log1及其应用
CN115094068A (zh) * 2022-05-10 2022-09-23 淮阴师范学院 OsbHLH189基因在改良水稻粒型中的应用
CN117402908A (zh) * 2023-10-19 2024-01-16 贵州省水稻研究所 Gl6.1基因在调控水稻粒型中的应用
CN114752601B (zh) * 2020-12-29 2024-01-26 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 调控水稻柱头外露的基因及其应用
CN117568319A (zh) * 2023-11-20 2024-02-20 江西省超级水稻研究发展中心(江西省农科院海南水稻育种中心) 水稻OsPOP8基因及其在改良水稻粒型与粒重中的应用

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102352367B (zh) * 2011-10-24 2014-01-08 南京农业大学 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用
CN103882145B (zh) * 2014-04-15 2016-03-02 江苏省农业科学院 一种鉴定水稻粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法
CN105602967B (zh) * 2014-11-24 2019-10-08 复旦大学 水稻qGL3.2基因在用于改良水稻粒型及千粒重性状中的应用
CN104694626B (zh) * 2015-01-22 2017-08-11 中国水稻研究所 一种利用分子标记辅助选育中短粒型水稻的方法
CN105820974A (zh) * 2016-03-30 2016-08-03 原巍俊 一种生防放线菌的发酵方法及应用
CN108103230B (zh) * 2018-01-24 2021-03-23 中国水稻研究所 检测水稻粒形QTLqGL35.1上细长粒等位基因的特异性PCR分子标记
CN108179221A (zh) * 2018-02-28 2018-06-19 中国水稻研究所 检测水稻千粒重QTL qTGW10.2a上高千粒重等位基因的特异性分子标记
CN110982933B (zh) * 2020-03-02 2020-06-30 鲁东大学 与小麦粒长主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用
CN115216488A (zh) * 2021-04-21 2022-10-21 中国种子集团有限公司 创制水稻大长粒型新种质或大长粒型矮杆新种质的方法及其应用
CN113151575B (zh) * 2021-06-04 2022-04-29 中国水稻研究所 一种水稻粒形主效QTL的InDel分子标记GW6a-InDel及其检测引物和应用
CN114164291B (zh) * 2021-11-10 2024-01-23 华南农业大学 水稻粒长基因gl10等位基因的应用
CN116103265A (zh) * 2023-01-10 2023-05-12 中国科学院西北生态环境资源研究院 一种表皮毛减少的沙蓬的磷酸酶突变蛋白及其应用
CN116121442A (zh) * 2023-02-07 2023-05-16 宝清北方水稻研究中心 一种水稻粒型QTL的InDel分子标记SG2-InDel、试剂、试剂盒及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009080743A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (ko nue)
CN101880671A (zh) * 2010-05-27 2010-11-10 华中农业大学 一种控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因gs5的克隆与应用
CN102154471A (zh) * 2011-01-17 2011-08-17 南京农业大学 水稻籽粒长度主效qtl位点的分子标记方法
CN102352367A (zh) * 2011-10-24 2012-02-15 南京农业大学 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005185101A (ja) * 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009080743A2 (en) * 2007-12-21 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (ko nue)
CN101880671A (zh) * 2010-05-27 2010-11-10 华中农业大学 一种控制水稻谷粒粒宽和粒重的主效基因gs5的克隆与应用
CN102154471A (zh) * 2011-01-17 2011-08-17 南京农业大学 水稻籽粒长度主效qtl位点的分子标记方法
CN102352367A (zh) * 2011-10-24 2012-02-15 南京农业大学 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK 17 December 2008 (2008-12-17), YU, J. ET AL.: "hypothetical protein Osl_12812[Oryza sativa Japonica Group]", accession no. EC75832.1 *
DATABASE GENBANK 4 August 2009 (2009-08-04), PUZIO,P. ET AL.: "unnamed protein product [Oryza sativa]", accession no. BA12827.1 *
DATABASE GENBANK 4 August 2009 (2009-08-04), PUZIO,P. ET AL.: "unnamed protein product [Oryza sativa]", accession no. BA12828.1 *
DATABASE GENBANK 5 May 2011 (2011-05-05), BUELL,C.R. ET AL.: "kelch repeat-containing serine/threonine phosphoesterase protein, putative, expressed[Oryza sativa Japonica Group", accession no. BF97885.1 *
TANG, Y. B. ET AL.: "QTLs analysis of rice grain shape by using advanced backcross Populations", CHINESE DOCTORAL DISSERTATIONS & MASTER'S THESES FULL-TEXT DATABASE (MASTER) AGRICULTURE SCIENCE AND TECHNOLOGY, 15 July 2007 (2007-07-15) *
XU, J. L. ET AL.: "Genetic dissection of grain weight and its related traits in rice (Oryza sativa L.)", CHINESE J RICE SCI, vol. 16, no. 1, 6 October 2002 (2002-10-06) *
YAO, G. X. ET AL.: "Mapping QTLs for grain weight and shape using four sister near isogenic Lines in rice (Oryza sativa L.)", ACTA AGRONOMICA SINICA, vol. 36, no. 8, 2010, pages 1310 - 1317 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109735536A (zh) * 2019-03-15 2019-05-10 扬州大学 一种控制水稻粒宽和粒厚的新基因位点qGW2-1及其分子标记方法
CN111808924A (zh) * 2020-07-15 2020-10-23 中国水稻研究所 一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法
CN112501147B (zh) * 2020-12-21 2023-08-18 广西壮族自治区农业科学院 一种普通野生稻粒型相关编码基因及其应用
CN112501147A (zh) * 2020-12-21 2021-03-16 广西壮族自治区农业科学院 一种普通野生稻粒型相关编码基因及其应用
CN114752601B (zh) * 2020-12-29 2024-01-26 中国科学院分子植物科学卓越创新中心 调控水稻柱头外露的基因及其应用
CN113068607A (zh) * 2021-03-29 2021-07-06 中国水稻研究所 一种大粒型高产常规粳稻的选育方法
CN113801885B (zh) * 2021-08-18 2023-03-31 中国水稻研究所 水稻大粒基因lg1及其应用
CN113801885A (zh) * 2021-08-18 2021-12-17 中国水稻研究所 水稻大粒基因lg1及其应用
CN113817755B (zh) * 2021-09-18 2023-03-31 中国水稻研究所 水稻长粒基因log1及其应用
CN113817755A (zh) * 2021-09-18 2021-12-21 中国水稻研究所 水稻长粒基因log1及其应用
CN115094068A (zh) * 2022-05-10 2022-09-23 淮阴师范学院 OsbHLH189基因在改良水稻粒型中的应用
CN117402908A (zh) * 2023-10-19 2024-01-16 贵州省水稻研究所 Gl6.1基因在调控水稻粒型中的应用
CN117568319A (zh) * 2023-11-20 2024-02-20 江西省超级水稻研究发展中心(江西省农科院海南水稻育种中心) 水稻OsPOP8基因及其在改良水稻粒型与粒重中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN102352367B (zh) 2014-01-08
CN102352367A (zh) 2012-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013060136A1 (zh) 一种控制水稻籽粒粒长和粒重的半显性基因qGL3的克隆与应用
CN111511920A (zh) 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的抗性基因
US20220186238A1 (en) Diplospory gene
ES2883229T3 (es) Gen para la inducción de partenogénesis, un componente de la reproducción apomíctica
JP2012514467A (ja) ２ｎ配偶子またはアポマイオシス性配偶子を産生する植物
CN101379080B (zh) 用于产生胚中具有母体基因组的全二倍体组的种子的核酸和方法
CN111153974A (zh) 玉米抗病基因和分子标记及其应用
CN109735512B (zh) 玉米基因ZmACO2在提高玉米产量中的应用
EP3169785B1 (en) Methods of increasing crop yield under abiotic stress
CA3138988A1 (en) Gene for parthenogenesis
JP2016523510A (ja) 変異型ｄａ１対立遺伝子を含んでなるアブラナ属植物
CN101747420B (zh) 一种水稻显性矮秆相关蛋白及其编码基因与应用
Yuan et al. The detection of a de novo allele of the Glu-1Dx gene in wheat–rye hybrid offspring
Ye et al. Fine mapping and candidate gene analysis of Brtri1, a gene controlling trichome development in Chinese cabbage (Brassica rapa L. ssp pekinensis)
CN113151295A (zh) 水稻温敏雄性不育基因OsFMS1及其应用
JP7023979B2 (ja) タンパク質ｎｏｇ１の植物収量と一穂粒数の調節への応用
CN107858360B (zh) 玉米籽粒大小基因ZmUrb2、其表达产物、其克隆引物、其表达载体及应用
Kinney et al. Molecular evolution of the maize sex-determining gene TASSELSEED2 in Bouteloua (Poaceae)
CN108315336B (zh) 一种控制水稻小穗发育基因pis1的应用
CN113817754B (zh) 水稻短粒基因shg1及其应用
CN113754746B (zh) 水稻雄性育性调控基因、其应用以及利用CRISPR-Cas9调控水稻育性的方法
EP4079751A1 (en) Identification of a new gene involved in sex determination in cucurbitaceae
US20230309480A1 (en) Methods of increasing outcrossing rates in gramineae
KR20230010678A (ko) 표적화된 돌연변이유발에 의해 돌연변이체 식물을 수득하는 방법
WO2024079157A1 (en) Virus and insect resistance and markers in barley

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12843748

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12843748

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1