CN117402908A - Gl6.1基因在调控水稻粒型中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了GL6.1基因在调控水稻粒型中的应用，属水稻基因工程技术领域，具体涉及GL6.1在调控水稻粒长、粒宽、粒厚和千粒重等粒型性状中的应用。本发明首次发现GL6.1具有调控水稻粒型的用途，具体涉及GL6.1的克隆、功能验证、进化及应用。通过生物技术手段调控GL6.1的表达量可以实现调控水稻粒型。
Description
技术领域
本发明属于水稻基因工程技术领域，尤其涉及GL6.1基因在调控水稻粒型中的应用。
背景技术
水稻(Oryza Sativa L.)是主要的粮食作物之一，在我国65％以上的人口以稻米为主食，因此，水稻的产量关系到国家粮食安全和社会稳定。水稻的产量是由有效穗数、穗粒数、结实率和千粒重所决定的，千粒重是由粒型和灌浆程度决定的，而粒型又包括粒长、粒宽、粒厚以及籽粒长宽比，其中粒长、粒宽和粒厚对粒重的影响力达94.4％，因此，研究粒型相关性状的遗传规律，挖掘粒型调控的有利基因将有助于高产优质水稻新品种的培育。
水稻粒型是受多基因调控的，这些基因在12条染色体上均有分布，其中已被克隆的调控水稻粒长的主效基因有GS3、PGL1、PGL2、TGW6、GL7、GLW7、GS2、GS9等，调控粒宽的主效基因有GW2、WTG1、GS6、GW5、GS5、GW7、GW8和TGW2等，这些基因所涉及的调控途径包括泛素-蛋白酶体、G蛋白信号、植物激素调控、转录因子和表观遗传、MAPK等途径，这些途径主要通过影响颖壳细胞的增殖和扩张来调控粒型。
目前虽已克隆了许多粒型的调控基因或QTLs，确定了一些调控水稻粒型的关键信号途径，但是粒型的调控网络还远不清楚，因此，需要不断挖掘新的粒型调控基因，阐明其调控的分子机制，明确各基因的上下游关系，从而将不同的调控途径逐步的建立联系，不断完善粒型调控网路，从而为水稻高产优质分子设计育种提供更加详尽的理论参考。
发明内容
本发明提供了一个调控水稻粒型的新基因GL6.1，通过转基因的手段首次发现了GL6.1对水稻粒长、粒宽、粒厚和千粒重等粒型性状具有明显的调控作用，从而为培育高产优质水稻新品种提供一条新的途径。
为达上述目的，本发明采用如下的技术方案：
GL6.1基因在调控水稻粒型中的应用，其是通过基因敲除或基因过表达来调控水稻粒型；所述GL6.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码区序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
所述调控水稻粒型为调控水稻种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重。
所述基因敲除是以GL6.1为目的基因，采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建所述目的基因的敲除载体，转化入水稻中，对水稻进行培育。
所述敲除载体为pYLCRISPRCas9Pubi-H-GL6.1。
所述敲除载体pYLCRISPRCas9Pubi-H-GL6.1的构建包括以下步骤：
选择两个靶点并设计导向RNA；用T4连接酶将合成的导向RNA链接到载体pYLCRISPRCas9Pubi-H上，再将其转化大肠杆菌，选择菌落单克隆并提取质粒，然后测序进行验证。
所述导向RNA序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示。
所述基因过表达是以GL6.1为目的基因，采用同源重组和golden gate无缝克隆方法，构建所述目的基因的过表达载体，转化入水稻中，对水稻进行培育。
所述基因过表达载体为pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp。
所述过表达载体pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp的构建包括以下步骤：
S1.针对GL6.1基因的DNA序列设计上下游引物进行PCR扩增；
S2.扩增产物用BsaI/Eco31I酶切载体pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp，并将载体酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化，然后通过重组反应得融合GL6.1基因的重组质粒pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp。
所述上游引物如SEQ ID NO.6所示，下游引物如SEQ ID NO.7所示。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次发现水稻GL6.1基因具有调控水稻粒长、粒宽、粒厚和千粒重等粒型性状的作用，并且是一个新的粒型调控基因；并且发现GL6.1调控水稻粒型的途径、表达模式和亚细胞定位；此外，还发现GL6.1在不同水稻中的进化关系。
附图说明
图1为实施例1中GL6.1基因敲除载体YLCRISPRCas9Pubi-H图谱；
图2为实施例1中GL6.1敲除植株T1代种子粒型调查；
图3为实施例1中(海南)GL6.1敲除植株粒型调查；
图4为实施例1中(贵阳)GL6.1敲除植株粒型调查；
图5为实施例1中(北京)GL6.1敲除植株粒型调查；
图6为实施例2中GL6.1超表达载体pBWA(V)HS-GL6.1-Glosgfp图谱；
图7为实施例2中GL6.1过表达植株T2代种子的粒型调查；
图8为实施例2中(贵阳)GL6.1过表达植株的粒型调查；
图9为实施例2中(北京)GL6.1过表达植株的粒型调查；
图10为实施例3中GL6.1的表达模式；
图11为实施例4中GL6.1的亚细胞定位；
图12为实施例5中GL6.1在不同亚种间的进化分析；
图13为实施例6中酵母双杂交筛选回转验证图；
图14为实施例6中GL6.1与OsMFAP1双分子荧光互补；
图15为实施例6中GL6.1与OsMFAP1免疫共沉淀；
具体实施方式
为对本发明进行更好的说明，特列举实施例如下。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
SEQ ID NO.1序列如下：
GTGCAACAGAAGATCCCCATCTCAGTGCGGATCGTCGTCATCACAGTCTCCTTCCCCATCTCAGACTCAGATCGATCTAAACTCTTCACTGAACCCAGCCGCCGCCGCCGCCGCCGGCTGCCCCCCTCCGCCGCTCACCGGCGACCAGCCATGGCTCGAGCCCCTTCCTTCCTCCTCCTCCCCTTACTCCTCCTCGTCTCCTCCTCGCTCACGCCCGCCGCCACGGCGGCCGCGTTTGTCGGCCTCGACTCCTTCCTCGCGGCGGCGGCCGCCCGCGACCCCTCCGCCGGCAACGACACCTTCGGCGCCCTCCCCGCCGCGCTCCTCCGCCAGCTCTCGACCCCGTCCCCGCTCCTCCCCACCCGCCTCCTCTCCCTCTCCGCGCAGGTCCCCGTCACCGTCCGCCTCGCCGGCGCCTCCTTCCCGCCCGCCACCGGCCGCCTCCTCGAGTCCTTCGTCAACTCCGCCGTCTCCTCCTCGCGCTTCCTCTCCAGCCGCCGCCCGCACCGCCTCGCGCTCTCCCACAAGATCCACCTCGAGGTCGCCGCCTCCTCCTCCCAGCTCGCGCCCCGCGCCGCCGCCGCCGTCCGCGCGCACCTCGACTCCTCCGCGGCGCCGTTCCACGCCGCCGCGCTCTCCTCCGTCCCTTACTCCGTCGTCGACGACCTCGTCGCCGAGGACTACCGCGCGCTCGTCGACACCGGCTCCGCCCCGTCGGTGTACATCTACCTGCTCAACCTCGGCCCGCAGCCGCGGCCGTACGCCTACACCGCGGCATCGTCGCCGGCCGATGCGCATTCACCTGGCTTCTCCCGCTGCCTCGCCCCCGTCTGGGCTGGCAAGGAGCGGTACATTTGGATCGACCTGGGTGCAGGGCCGGTGGACTATGGCCCTGCGCTCTCCGGTGAAGGCGTGCTCCCCCGTGGCGAGTTCCACCCTCTCGCCGCGCTCCACGGCCGGCCGAGGTCGGAGAAGGCATTGGTTGCTGATCTTGCTTCGCTGGTGCTCAGTGCTTACAAGTCATTGCTAGTGCCTTCGCTCAGAATTCCAGTGCATTACGAGAGCTCGTTGCTGGTTCAGGTCTTTCACATCCATGGACACGAGAGGGATACGTCCGGGCTTGATTGGGGTTCGATCGAACAGTCGATTCGTGATGGGAATCTGGCATATGAAGGGCAGAGGTTGAAGTTTGATTTGAACAGGATCAGGTTCTCTGACTGCCCAATTTGCTCGTTTGCGGTTGCGCGGTCGACAACCTCGTTTACGTCCAGGTTCTTGTTTGATAATTACACGCTGATTGTGAGTGAATACTTGGACTCCAAGCGGATGAGGCAGGTGCTGTCTGACTCGTTGGAAGAGTTGCACAAGGTGGCTGGTGTTCATGATAATGATGACTATGACAAGGTTGTGCCAGTTTTTGTGTTTGATTTAGATTATGATAAGCTTCTGTTGCTAGATAGGTATCACCAGGCAGTGGCTTTTCGTGATATGGTGATTTCTGTGAGGACAAGGAGCTCACAGACGGTCAGCGACTACAGCTGTAATGGTCGACATGTGATTACAATGACTAGGAATCTTGACCGGCCGATCATCGCTTCAGTTCTGCAGAGCATGTGGGGTGTGTCACCGACACACCAGTCATGGAGCCCTGAGCACAATGCTACCGTCGTTGACTACACTTGGAGCACTGGACATACACCATTTGGCCCATTCTCAGAGACCAAATCGCTTTCTTTTGTGCAGAAAGATGCAGCCCGTAGGAATGTTCTTCTAACCACTCTGAACTACACAATCACAAGCGCTATTGATGTTTTGGAGTCAATGGCTGCGCATGGTGGAGAGAGTATACTCCTTAGAAGGAAAAGGCGTGTTGAATTCATTCAAAGATGGAATCTGCTCACTTATAAACTGGAGAAGGTGGTCTCAGCCATGTCCCGCCTCGACTACAATAAAGCGATGTACTTTCTGAGATCGTCAGATCATGATCTGTTTGCCGTCCACACTTTGGTGTATCAGGCGTCTCAGGAGTTGGAGGCTTCTCTGGTTTGCTTCAAAGATCCACCATTTCCCTGGTTGTCAGTTTCCATGTCTGGAATTTTCGTTTTTGGTTTCTTTTATGTTTACTCGAAGAGAGATAAATTGTTCAGGAGCAAAAGGAAACAGTTTTGACTGCACTTCAGTTCACGGATACTGTTTGAATGCTCATCTTGATACCATAGTCAGGATTCAGAAAAGTTGCATCCTTGCATAATACATGGAGATGTCACTGGATGCATGAAACGGGTGCATCTTGTTTTAAACAGATGAATTCACTTGTACGAGATATACTGGATTTCCTTAGGAAGCACTACTTCCACTAGTTTTGTAAGTTGCATGTGCCCAATTCACTCGGTACATACTGTTGATCTAGATTCTGGAGACATGCATATATGTTTTCTATTCTTGACTAGCTTAATTACTGTCATACTTGCTGGGTGCATAACCTATGTGGGATGCTGTGCTCAATTGATCATGTGTAATTTCGAGATGTCAATTTTTCTAAACAATGCCTTTGCAGGATATTTTAAGCTGATTCTTTAAGAACTATGATTGTGGCTTATATTCGCAAAGTTGGTTGTAAGTCAATAGGGTTTTTAGTCCAGTTCCTTTGTAGCACTCTTTGTTTTTTATCTGCTTGTTATTCTCTC
实施例1GL6.1基因敲除在培育粒型转基因水稻中的应用
1、GL6.1敲除载体YLCRISPRCas9Pubi-H-GL6.1的构建
在GL6.1的编码区选择两个靶点并设计导向RNA(gRNA)，gRNA序列为GGAGTCGAGGCCGACAAACGCGG(SEQ ID NO.4)；GATGCCGCGGTGTAGGCGTACGG(SEQ ID NO.5)；
用T4连接酶将合成的导向RNA链接到载体pYLCRISPRCas9Pubi-H上(具体见图1)，再将其转化大肠杆菌，选择菌落单克隆并提取质粒，质粒采用试剂盒进行提取(Solarbio，D1100)，然后测序进行验证。
其中，gRNA链接载体pYLCRISPRCas9Pubi-H的反应体系为：
1ul T4 DNA ligase
2ul 5X DNA ligase buffer
1ul plasmid
6ul gRNA
2、GL6.1转化水稻
取1μL质粒加入50μL EHA105农杆菌感受态细胞中，染后通过农杆菌介导法将重组质粒转入粳型水稻品种中花11的愈伤组织中，具体步骤如下，
(1)诱导。挑选无霉斑、芽口正常的米粒，用75％酒精消毒1min，灭菌水清洗3次，1min/次；15％次氯酸钠消毒20min，灭菌水清洗3次，1min/次；消毒后的米粒接种于诱导培养基，26℃光照培养20天。
(2)农杆菌侵染。挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600＝0.2的农杆菌重悬液，挑取愈伤于三角瓶中，加入农杆菌重悬液，侵染10-15min后弃菌液，将愈伤接种于共培培养基，20℃共培养48-72h。
(3)愈伤筛选。将愈伤接种于筛选培养基，26℃暗培养20-30天；将阳性愈伤接种至二次筛选培养基，愈伤挑取过程务必挑取单克隆愈伤，26℃暗培养7-10天；
(4)分化及生根。将阳性愈伤接种至分化培养基，25-27℃光照培养15-20天，待分化出2-5cm的芽后接种至生根培养基，30℃光照培养7-10天；
(5)阳性苗检测。采用CTAB法提取水稻基因组DNA，对目的基因进行扩增，胶回收后送测序，之后经过比对明确基因的突变方式。
3、表型鉴定
T0植株收获后，将T1代种子烘干后，利用万深SC-A1型考种仪对粒型性状进行测定，筛选纯合的敲除株系，分别在海南、贵阳和北京对野生型(WT)和敲除植株进行种植，期间对植株的形态进行拍照，在收获T2代种子烘干后对粒型性状及穗长、一次枝梗数、二次枝梗数、实粒数、瘪粒数、粒数、结实率等农艺性状进行考种，并做统计分析。
如图2，试验共获得10个独立转基因株系，其中gl6.1-2、gl6.1-6、gl6.1-8为纯合突变体，gl6.1-7突变位点未明确，其余株系均为杂合突变体(具体见图2.e)。T0代植株中，gl6.1-2、gl6.1-3、gl6.1-6、gl6.1-7、gl6.1-8、gl6.1-9、gl6.1-10的粒长显著大于野生型(具体见图2.a、b)，gl6.1-2、gl6.1-4、gl6.1-8、gl6.1-10的粒宽显著小于野生型(具体见图2.c、d),由于gl6.1-2、gl6.1-6、gl6.1-8为纯合突变体，将T1代分别种植于海南(具体见图3)、贵阳(具体见图4)、北京(具体见图5)三个地区进一步调查籽粒性状，根据图3-5和表1-3中结果可以看出，gl6.1-2、gl6.1-6、gl6.1-8的粒长显著大于野生型，粒宽、粒厚显著小于野生型，千粒重显著小于野生型。
表1(海南)敲除植株及野生型农艺性状的考察
表2(贵阳)敲除植株及野生型农艺性状的考察
表3(北京)敲除植株及野生型农艺性状的考察
实施例2GL6.1基因过表达在培育粒型转基因水稻中的应用
1、GL6.1过表达载体pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp的构建
以审定的粳型水稻品种“中花11”为材料，通过CTAB法取GL6.1的DNA，然后按照引物GL6.1-CDS(F):5’-aacacgggggactttgcaacatggctcgagccccttccttc-3’(SEQ ID NO.6)、GL6.1-CDS(R):5’-cctgaagcggccgctgtacaaaactgtttccttttgctcctgaacaatttatctctc-3’(SEQ ID NO.7)合成GL6.1的序列，载体构建主要采用同源重组和golden gate无缝克隆方法，用BsaI/Eco31I酶切载体pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp，并将载体酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化，然后通过重组反应得融合GL6.1基因的重组质粒pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp(见图6)，最后通过测序进行验证。
相关试验的流程及反应体系如下，
PCR扩增反应体系(50μL)流程如下：
DNA：4μL
5X FastPfu Buffer：10μL
dNTP：4μL
Primer F(50uM)：0.5μL
Primer R(50uM)：0.5μL
FastPfu：0.5μL
ddH2O：30.5μL
回收目的片段采用胶回收试剂盒，市场上生物公司销售的任意一款都可以。
连接T载体。通常用的T载体为pMD18-T载体，在16℃恒温状态下，连接2小时左右，反应体系如下：
体系如下：
目的片段 4μL
SolutionⅠ连接酶 5μL
18-T载体 1μL
转化大肠杆菌(TOP10)。将TOP10感受态细胞融化；将连接后的18-T载体加入到感受态细胞中，轻弹混匀并于冰上静置30分钟；然后在42℃的条件下热激90秒，而后冰浴5min；之后加入890μL无抗的2×YT培养基，37℃、150rpm条件下培养1小时；用氨苄抗性的培养基进行筛选；在超净工作台中挑取单菌落，在2×YT(A+氨苄抗性)的液体培养基中过夜培养，37℃、250rpm培养约12h。
提取质粒酶切鉴定。13000rpm离心1分钟集菌；弃去上清液后加入300μL提取液并震荡重悬菌块；加入300μL裂解液，颠倒使其混匀，常温静置5分钟；加入300μL溶液Ⅲ(4℃保存)，颠倒使其混匀，可看到絮状沉淀；加入900μL的酚仿，颠倒混匀，13000rpm离心10分钟；吸取上清液，加入800μL异丙醇，混匀后，室温静置30分钟，随后13000rpm离心10min；弃上清，加入700μL 70％乙醇进行洗涤，13000rpm离心，5分钟；弃上清，室温晾干，加入3μL用RNase处理过的ddH2O备用。
酶切鉴定并测序。双酶切体系(20μL)如下：
连接双元载体。将载体和鉴定正确的目的基因通过双酶切的方法切出并回收。用Solution连接目的片段和双元载体(pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp载体)，将鉴定正确的质粒转化农杆菌。
2、GL6.1转化水稻
试验步骤(1)-(4)与实施例1的相同。
(5)阳性苗检测。采用CTAB法提取水稻基因组DNA，对目标基因或标签基因(GFP)进行PCR检测。
(6)T0代植株收获，获取T1代种子。
(7)T1代通过胚芽鞘绿色荧光鉴定进一步筛选阳性种子，然后播种进行下一步的表型观察。
3、表型鉴定
T2代种子收获烘干后，用万深SC-A1型考种仪对粒型性状进行测定，结果如图7，共获得24个独立转基因株系，如图7所示，与WT相比，过表达的24个株系整体上表现出粒增加的趋势，其中OEX9、OEX10、OEX16、OEX18、OEX20与WT的差异均达到显著或极显著水平，随后选择OEX9、OEX10、OEX16这三个独立株系分别在贵阳和北京这两个生态区进一步验证，如图8和图9所示，在贵阳和北京，GL6.1过表达可显著增加粒长，虽然粒宽和粒厚较野生型有降低的趋势，但是野生型和转基因株系之间并未都表现出显著差异，表4和表5显示，GL6.1过表达可显著减小千粒重。
表4GL6.1过表达突变体农艺性状考察(贵阳)
表5GL6.1过表达突变体农艺性状考察(北京)
实施例3GL6.1的表达模式
1、取样
以水稻中花11为材料，在其生长发育的进程中分别取幼年叶、根、茎、穗、成年叶和叶鞘并放置于液氮中，之后保存于-80℃冰箱。
2、获取cDNA
组织的总RNA采用天根生化科技有限公司的RNA Easy Fast植物组织RNA快速提取试剂盒(DP452)试剂盒进行提取，用Nanodrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)检测RNA OD值，采用Aidlab公司反转录试剂盒(TUREscript 1st Stand cDNA SYNTHESISKit)进行反转录操作，最终获得cDNA备用。
3、Real-time PCR反应
试验以Actin作为内参，GL6.1为目的基因，用ABI stepone plus荧光定量PCR检测系统(美国)对水稻不同组织器官中的表达量进行检测，Actin和GL6.1的引物如下：
如图10所示可知，GL6.1基因在粳稻的幼年叶、成年叶、根、叶鞘和茎秆中均有表达，在幼穗中的表达量最高。
实施例4GL6.1基因编码蛋白的亚细胞定位
1、GL6.1过表达载体pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp的构建
构建方法与实施例2相同。
2、制备水稻原生质体
(1)分别用75％的乙醇和20％的NaClO浸泡25min，然后置于MS培养基上培养1周；
(2)将水稻幼苗的茎切成约0.5mm的薄片并在黑暗条件下将其浸泡在0.6M甘露醇放置10min；
(3)用细胞筛过滤掉甘露醇并将组织转移进行酶解；
(4)向酶解液中加入W5溶液进行洗脱；w5溶液(200ml)的配方如下：
MES：2mL
NaCl：1.8g
CaCl2·2H2O：3.67525g
KCl：0.5mL
ddH2O：197.5mL
(5)细胞筛过滤，冲洗获得原生质体。
3、转化水稻原生质体
将pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp载体转化到水稻原生质体进行瞬时表达，利用激光共聚焦显微镜进行观察(激发光波长为488nm)，根据图11所示内容可以看出，GL6.1基因主要在细胞器和细胞膜中表达。
实施例5GL6.1的进化分析
利用3K水稻数据库(Rice SNP-Seek Database，https://snp-seek.irri.org/index.zul)，筛选出878份稻种资源(包括籼稻、AUS稻、热带粳稻和温带粳稻)，利用mega软件对878份稻种资源的GL6.1进行序列比对，再通过邻接法(Neighbor-Joining)构建树图，根据图12内容可以看出，GL6.1基因在籼稻(Group IV)、AUS稻(Group III)、热带粳稻(Group II)和温带粳稻(Group I)存在分化。
实施例6GL6.1编码蛋白与微丝相关蛋白(MFAP1)互作调控水稻粒型
1、酵母文库构建
取粳稻品种日本晴的叶片、茎秆、幼穗、叶鞘等组织，送西安淳风生物科技有限公司构建酵母文库。
2、诱饵蛋白载体构建
对目标基因GL6.1进行PCR扩增，扩增引物如下：
F:5’-GccaaaatatctgcaatggccattacggccGCCGCGTTTGTCGGCC-3’(SEQ ID NO.12)；
R:5’-ATCGAATTCCTGCAGATGGCCGAGGCGGCCCCAAACTGTTTCCTTTTGCTCCTGAACA-3’(SEQ ID NO.13)，
然后与pBT-SUC进行体外链接，融合后的载体转化后挑取单克隆菌落进行测序(测序引物序列如下：pBT3-SUC-F：5’-TGGCATGCATGTGCTCTG-3’(SEQ ID NO.14)；pBT3-SUC-R：5’-GTAAGGTGGACTCCTTCT-3’(SEQ ID NO.15))
3、酵母文库筛选及互作蛋白验证
诱饵基因存在自激活，在80mM 3-AT的条件下，诱饵基因本底自激活受到有效抑制。采用DUAL systems BioTech公司开发的DUAL membrane系统筛选跨膜互作蛋白，如图13所示，通过回转验证共筛选到40个互作蛋白。由图14和图15所示内容可知，通过双分子荧光互补试验和免疫共沉淀技术的验证，我们得到了一个与诱饵蛋白互作的膜蛋白MFAP1，其编码基因OsMFAP1位于6号染色体，编码一种位于细胞壁附近的微丝相关蛋白。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.GL6.1基因在调控水稻粒型中的应用，其特征在于，其是通过基因敲除或基因过表达来调控水稻粒型；所述GL6.1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码区序列如SEQ IDNO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控水稻粒型为调控水稻种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因敲除是以GL6.1为目的基因，采用CRISPR/Cas9基因编辑系统，构建所述目的基因的敲除载体，转化入水稻中，对水稻进行培育。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述敲除载体为
pYLCRISPRCas9Pubi-H-GL6.1。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述敲除载体pYLCRISPRCas9Pubi-H-GL6.1的构建包括以下步骤：
选择两个靶点并设计导向RNA；用T4连接酶将合成的导向RNA链接到载体pYLCRISPRCas9Pubi-H上，再将其转化大肠杆菌，选择菌落单克隆并提取质粒，然后测序进行验证。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述导向RNA序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示。
7.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因过表达是以GL6.1为目的基因，采用同源重组和golden gate无缝克隆方法，构建所述目的基因的过表达载体，转化入水稻中，对水稻进行培育。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基因过表达载体为pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述过表达载体pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp的构建包括以下步骤：
S1.针对GL6.1基因的DNA序列设计上下游引物进行PCR扩增；
S2.扩增产物用BsaI/Eco31I酶切载体pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp，并将载体酶切产物用PCR纯化试剂盒纯化，然后通过重组反应得融合GL6.1基因的重组质粒pBWA(V)HS-GL6.1-GLosgfp。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述上游引物如SEQ ID NO.6所示，下游引物如SEQ ID NO.7所示。
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-
2023
- 2023-10-19 CN CN202311357539.8A patent/CN117402908B/zh active Active
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| CN118006628A (zh) * | 2024-02-04 | 2024-05-10 | 贵州省水稻研究所 | 一种调控水稻穗长和粒长的新基因及其应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117402908B (zh) | 2024-06-21 |
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