CN116445510A

CN116445510A - OsAAP8在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用

Info

Publication number: CN116445510A
Application number: CN202310543186.4A
Authority: CN
Inventors: 孟栓; 蔺金红; 徐智军; 叶能辉; 赵静; 段美娟; 张建华
Original assignee: Hunan Agricultural University
Current assignee: Hunan Agricultural University
Priority date: 2023-05-15
Filing date: 2023-05-15
Publication date: 2023-07-18

Abstract

本发明提供了OsAAP8在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用，涉及水稻基因工程技术领域。本发明提供了OsAAP8在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建得到了水稻的osaap8突变体植株，证实了由OsAAP8基因编码的氨基酸转运蛋白OsAAP8能够负调控水稻的分蘖数、影响水稻的粒型、改变千粒重。OsAAP8基因敲除后可以使得水稻的分蘖数增加，并增加水稻的粒厚，千粒重增加；而在水稻中过表达OsAAP8基因，水稻的分蘖减少，粒厚变窄，千粒重降低。

Description

OsAAP8在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用

技术领域

本发明涉及水稻基因工程技术领域，具体涉及OsAAP8基因在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用。

背景技术

水稻的产量主要由有效穗数，每穗粒数，千粒重，结实率决定(万建民.中国水稻分子育种现状与展望[J].中国农业科技导报,2007(2):1-9.)。水稻的有效分蘖数的多少直接决定了穗数和穗粒，从而影响水稻的株型和产量(Duan E,Wang Y,Li X,et al.OsSHI1regulates plant architecture through modulating the transcriptional activityof I PA1 in rice[J].Plant Cell,2019,31(5):1026-1042)。水稻的分蘖受到多种因素的调控和影响，其受到遗传、植物激素、栽培环境等因素组成的复杂网络所调控(张米欢,胡东坡,张德春.水稻分蘖的分子机理研究进展[J].生物资源,2022,44(01):26-35.DOI:10.14188/j.ajsh.2022.01.004.)。水稻粒型影响水稻的千粒重，从而影响水稻的产量(曾博虹,孙晓棠,李玲锋,等.水稻粒重遗传研究进展[J].南方农业学报,2016,47(12):2033-2040.)。已被报道克隆粒型相关基因共计256个，其中一部分粒型基因广泛应用于育种中，如GS3、GW2、GW5等(康云海,方玉,李潜龙,杜明,张从合.水稻粒型基因研究进展及其育种应用[J/OL].杂交水稻:1-4.2022-05-25.DOI:10.16267/j.cnki.1005-3956.20210224.074.)。根据前人的研究表明，参与调控水稻粒型的分子调控网络包括泛素-蛋白酶体、植物激素调控、G蛋白信号、丝裂元活化蛋白酶、转录因子和表观遗传这几大途径(宫李辉,高振宇,马伯军,等.水稻粒形遗传的研究进展[J].植物学,2011,46(6):597-605；勾晓霞,王建军,王林友,等.调控水稻产量性状的分子机理研究进展[J].浙江农业学报,2014,26(1):254-259.)。

水稻基因组中共有85个AAT家族成员(Wang J,WuB,Lu K,Wei Q,Qian J,Chen Y,Fang Z.(2020).The amino acid transporter AAP1mediates growth and grain yieldby regulating neutral amino acid uptake and reallocation in Oryza sativa.JExp Bot 71(16):4763-4777.)。已发表的AAT家族中，通过QTL定位到的OsAAP6参与调控籽粒的蛋白品质，(Peng B,Kong H,Li Y,Wang.L.,Zhong,M.,Sun,L.,Gao,G.,Zhang,Q.,Luo,L.,Wang,G.,Xie,W.,Chen,J.,Yao,W.,Peng,Y.,Lei,L.,Lian,X.,Xiao,J.,Xu,C.,Li,X.,and He,Y.(2014)OsAAP6 functions as an important regulator ofgrain proteincontent and nutritional quality in rice.Nat Commun,5,doi:10.1038.)。OsLHT1基因调控水稻氨基酸从根向地上部的转运以及叶片到籽粒的转运影响氮素吸收效率来调控水稻，敲除OsLHT1基因显著降低水稻的产量(Guo N,Hu JQ,Yan M,Luo L,Qu H,Tegeder M,Xu,GH.(2020)Oryza sativa Lysine-Histidine-type Transporter 1functions in rootuptake and root-to-shoot allocation of amino acids in rice.Plant J.103(1),395-411.Guo N,Gu M,Hu J,Xu,GH.(2020).Rice OsLHT1 Functions in Leaf-to-PanicleNitrogen Allocation for Grain Yield and Quality.Front Plant Sci 11:1150.)。敲除OsAAP3基因在水稻中的表达，通过增加水稻分蘖数，使得水稻的产量和氮素利用率提高(LuK,WuB,Wang J,Zhu W,Ny HP,Qian JJ,Huang WT,Fang ZM.(2018)Blocking Aminoacid transporter OsAAP3 improves grain yield by promoting outgrowth buds andincreasing tiller number in rice.Plant Biotechnol.J,Feb 26)。OsAAP4基因编码的氨基酸转运蛋白通过调节中性氨基酸的分配正向调控水稻的分蘖和产量；OsAAP5基因的表达降低能够增加水稻的分蘖和单株产量(Wang J,Wu B,Lu K,Wei Q,Qian J,ChenY,.FangZ.(2019).The Amino Acid Permease 5(OsAAP5)Regulates Tiller Number and GrainYield in Rice.Plant Physiol 180(2):1031-1045.)。OsAAP1基因通过影响分蘖芽来影响水稻的产量(Wang J,Wu B,Lu K,Wei Q,Qian J,ChenY,Fang Z.(2020).The aminoacidtransporterAAP1mediates growth and grain yield by regulating neutralamino acid uptake and reallocation in Oryza sativa.J Exp Bot 71(16):4763-4777.)。前人的研究说明，不同的氨基酸转运蛋白对水稻生长发育的发挥的功能各不相同，然而，目前为止，在水稻AAT家族中，大部分氨基酸转运蛋白成员的功能也未被研究，调控水稻粒型和粒重的氨基酸转运蛋白也未被报道，且没有同时调控水稻分蘖、粒型和粒重的相关报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供了OsAAP8基因在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用，由OsAAP8基因编码的氨基酸转运蛋白OsAAP8能够调控水稻分蘖数、粒型和千粒重。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了OsAAP8基因在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用，所述OsAAP8基因编码由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质。

优选的，所述OsAAP8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述OsAAP8基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述调控包括敲除水稻中的OsAAP8基因或在水稻中过表达OsAAP8基因。

本发明提供了一种增加水稻分蘖数、粒重并改变水稻籽粒粒型的方法，根据所述OsAAP8基因的核苷酸序列设计靶位点对水稻中该基因进行CRISPR/Cas9基因编辑，经鉴定和筛选获得osaap8突变体植株；所述osaap8突变体植株的分蘖数和粒重增加，突变体植株的籽粒粒厚增加。

优选的，所述靶位点为所述OsAAP8基因核苷酸序列的中花11背景，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种降低水稻分蘖数、水稻籽粒粒厚和粒重的方法，将所述OsAAP8基因构建到表达载体上，转化水稻，获得OsAAP8基因的过表达植株，所述过表达植株的分蘖数降低，水稻籽粒粒厚变窄，粒重降低。

优选的，所述表达载体为改造的pCambia1300骨架载体。

优选的，所述水稻为中花11。

本发明还提供了上述的方法在水稻育种中的应用。

本发明提供了OsAAP8基因在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用，OsAAP8属氨基酸转运蛋白家族成员，本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建得到了水稻的osaap8突变体植株，证实了由OsAAP8基因编码的氨基酸转运蛋白OsAAP8能够负调控水稻的分蘖数以及水稻籽粒粒厚和千粒重，OsAAP8基因敲除后可以使得正常水稻的分蘖数增加，并改变了osaap8突变体的粒型，增加了籽粒的粒厚和千粒重；而在水稻中过表达OsAAP8基因，水稻的分蘖数降低，影响水稻的粒型，表现为粒厚的降低，并表现出千粒重降低，即OsAAP8基因发挥着调控水稻的分蘖、粒型的功能，对水稻的株型和产量的遗传改良提供优质的基因资源。

附图说明

图1为osaap8突变体的峰图；其中，ZH11为野生型亲本，p8-1、p8-2分别代表以ZH11为遗传背景的不同突变类型的突变体。

图2为osaap8突变体的表型和农艺性状图；其中，(A)单株籽粒饼图；(B)单株分蘖数统计数据；(C)单株粒数统计数据；(D)单株产量统计数据。

图3为osaap8突变体的千粒重和粒型统计和表型图；其中，(A)粒型表型图；(B)千粒重统计数据；(C)粒厚统计数据。

图4为OsAAP8过表达材料相对表达量数据分析图；其中，(A)根部表达量数据；(B)地上部表达量数据。

图5为OsAAP8过表达材料的产量和分蘖数据；其中，(A)单株籽粒饼图；(B)单株分蘖数统计数据；(C)单株粒数统计数据；(D)单株产量统计数据。

图6为OsAAP8过表达材料的千粒重、粒型统计数据和表型图；其中，(A)粒型表型图；(B)千粒重统计数据；(C)粒厚统计数据。

具体实施方式

本发明中，所述OsAAP8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述OsAAP8基因的编码序列如SEQ ID NO.3所示。本发明所述由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质为氨基酸转运蛋白OsAAP8；所述氨基酸转运蛋白OsAAP8负调控水稻的分蘖数、水稻籽粒的千粒重，影响水稻籽粒的粒型。本发明中，所述调控优选的包括敲除水稻中的OsAAP8基因或在水稻中过表达OsAAP8基因；敲除水稻中的OsAAP8基因后，水稻的分蘖数和粒重增加、影响水稻籽粒的粒型；在水稻中过量表达OsAAP8基因后，水稻的分蘖数、粒厚和千粒重降低。

本发明提供了一种增加水稻分蘖、粒厚和粒重的方法，根据所述OsAAP8基因的核苷酸序列设计靶位点对水稻中该基因进行CRISPR/Cas9基因编辑，经鉴定和筛选获得osaap8突变体植株；所述osaap8突变体植株的分蘖数和粒重增加，突变体植株的籽粒粒厚增加。

本发明中，所述靶位点优选为上述OsAAP8基因所述靶位点的核苷酸序列优选为以ZH11为遗传背景的突变体具体靶序列信息为：GTACTACTACCCGCCTTCGG(SEQ ID NO.4)。本发明中，所述水稻优选为中花11(ZH11)。本发明对所述CRISPR/Cas9基因编辑的具体方法并没有特殊限定，根据本领域的常规技术手段进行即可。

本发明通过对CRISPR/Cas9基因编辑获得的osaap8突变体进行鉴定和筛选，从而得到osaap8突变体植株。本发明中，所述鉴定引物优选的根据所述OsAAP8基因设计得到；

以ZH11为遗传背景的osaap8突变体的基因型鉴定引物为：所述序列为P8F和P8R。具体序列如下表1所示。

表1osaap8突变体鉴定引物序列

本发明还提供了一种降低水稻分蘖数、水稻籽粒粒厚和粒重的方法，将所述OsAAP8基因构建到表达载体上，转化水稻，获得OsAAP8基因的过表达植株，所述过表达植株的分蘖数降低，水稻籽粒粒厚变窄，粒重降低。本发明中，所述表达载体优选为改造的pCambia1300骨架载体，所述改造的方法优选为：将pUN1301载体上的Ubi启动子序列和多克隆酶点序列片段连接至pCambia1300载体即获得所述改造的pCambia1300骨架载体。本发明中，所述水稻优选为中花11。本发明中，所述纯合阳性转基因植株优选的经基因表达水平鉴定得到。

本发明中，所述OsAAP8基因优选的以水稻cDNA为模板扩增得到；所述扩增的引物见表2。

表2CDS克隆引物序列

本发明还提供了上述的方法在水稻育种中的应用。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

osaap8突变体的构建和获得：

1.委托百格基因科技(江苏)有限公司，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，以中花11水稻材料为遗传背景，具体靶序列信息为：GTACTACTACCCGCCTTCGG(SEQ ID NO.4)，

2、osaap8突变体材料的突变类型鉴定步骤如下：

(1)CTAB法提取植株DNA

对获得的遗传材料，按照Yoshida营养液配方水培osaap8突变体，置于光照培养箱中14h(30℃)光照/10h(25℃)黑暗条件生长，培养2周，每个株系分别剪取少量叶片于2mL的离心管中，使用CTAB法提取DNA，具体步骤如下：

a.取适量的遗传材料叶片，稍稍剪碎放入2mL离心管里，再将1颗灭过菌的钢珠放进:离心管里，用液氮冷冻，放入研磨器中碾成粉末状，立即倒出钢珠，以免叶片粉末粘到钢珠上；

b.加入600mL的2％CTAB缓冲液，轻轻摇匀；

c.放入65℃的水浴锅中，每20min摇动混合均匀，充分溶解细胞膜并与核酸形成复合物，1h后拿出；

d.冷却后加入600mL的氯仿，充分摇晃均匀；

e.使用高速离心机，在转速为12000rmp/min下常温离心10min，取上清液400mL，将其放入新的2mL离心管内；

f.往离心管中加400mL的异丙醇，混合均匀后，在转速为12000rmp/min下常温离心10min，将上清液倒掉；

g.往离心管中加75％的乙醇1mL，轻轻地弹动离心管尖，使DNA块状物悬浮于液体；

h.在室温下静置，2min后，在转速为12000rmp/min下常温离心3min，将上清液倒掉；

i.在转速为7000rmp/min下常温离心15s后，用移液枪把剩余的液体吸去；

j.开启离心管盖使DNA自然风干，加入30mL的超纯水，以溶解DNA，置于-20℃冰箱保存。

(2)PCR检测植株的突变类型

以ZH11为背景突变体的鉴定引物为P8F和P8R对目的片段进行扩增，使用高保真酶(Vazyme货号：P511-03)配制表3所示的50μL扩增反应体系，置于PCR仪中，按表4设置反应程序(PCR仪：Eppendorfflexlidpcr)。

表3突变类型PCR扩增体系

表4突变类型PCR扩增程序

反应程序结束后，将PCR原液送湖南擎科生物技术有限公司测序，测序结果利用DSDecodeM(scau.edu.cn)网站和snapgene软件进行比对测序结果。经测序结果比对，在突变体植株中鉴定得到了两种突变类型：以ZH11为遗传背景的突变体即缺失-1bp(p8-1)缺失-2bp(p8-2)，结果如图1。

3.表型观测和数据分析

获得纯合植株后，按常规方法进行种植和表型统计。对aap8突变体及其野生型亲本ZH11分别进行分蘖数统计记录，同时使用万深SC-G自动考种分析及其千粒重软件对其单株籽粒数量、单株籽粒产量、千粒重、进行分析统计，粒厚统计使用高精度千分尺数显测厚仪，采购于旗丰品牌，并拍照记录。得到图2和图3。

图2A为中花11背景的突变体材料和野生型亲本的单株籽粒表型，可见突变体籽粒平铺圆饼的直径大于野生型；图2B结果可知，aap8突变体植株相比于野生型亲本植株的分蘖数增加；图2C结果可知，突变体植株的单株籽粒数量相比于野生型亲本植株增加；图2D结果可知，aap8突变体植株相比于野生型亲本植株的单株产量也增加。由图3A可见，aap8突变体的十个籽粒的叠加粒厚相比野生型亲本增加，图3B-C的统计数据所示，aap8突变体的千粒重(图3B)，粒厚(图3C)相比野生型亲本显著增加。

由此可知，OsAAP8基因敲除后可以使得正常水稻的分蘖数增加，也增加了水稻的单株籽粒总数和单株籽粒产量，并改变了osaap8突变体的种子粒型，增加水稻籽粒的粒厚和千粒重。

实施例2

1.OsAAP8过表达材料的构建和阳性植株鉴定

(1)OsAAP8过表达载体的构建

将构建成功的OsAAP8过表达载体质粒委托百格基因科技(江苏)有限公司进行农杆菌介导的遗传转化，使用受体材料为中花11。得到过表达植株后，提取RNA，反转cDNA，荧光定量PCR检测OsAAP8过表达植株的基因表达水平，选择2个株系进行后续实验。

具有步骤如下：

1)在RGAP数据库(http://rice.uga.edu/)中下载OsAAP8(LOC_Os01g66010)cDNA序列，设计用于扩增OsAAP8基因的引物，即OEP8F(SEQ ID NO.7)和OEP8-R(SEQ ID NO.8)；

2)以水稻cDNA为模板，PCR扩增目的条带，PCR扩增使用Vazyme的2×PhantaMaster(P511-03)，反应体系和扩增程序见表5和表6；

表5 PCR反应体系

表6 PCR扩增程序

3)将PCR扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，跑胶回收后，重组连入BamH1和KpnI双酶切的pCambia1300骨架的水稻过量表达载体回收片段，重组连接使用Vazyme的ClonExpress II One Step Cloning Kit酶于37℃反应30min，连接体系如表7；

表7连接反应体系

其中，PCR扩增产物和双酶切线性化载体的琼脂糖凝胶回收使用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AP-GX-250)。

4)将步骤3)重组连接后的表达载体转化大肠杆菌DH5_α，涂布于含Kan⁺抗性的筛选LB平板上，具体步骤如下：

a.将感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；

b.取10μl重组产物加入到100μl感受态细胞中，轻弹混匀，冰上静置30min；

c.42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min；

d.加入900μl LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃摇床复苏1h(转速200rpm)；

e.5000xg离心5min，留下100μl上清液，用枪头轻轻吹吸混匀菌液，吸取菌液涂于含有Kan⁺的LB固体平板上，吹干后，用封口膜封口；

f.37℃生化培养箱中倒置培养16-18h。

5)在步骤4)过夜后的培养基上挑取单克隆菌落，菌液PCR鉴定阳性克隆后，委托湖南擎科生物技术有限公司进行测序，所用引物为：

Ubi-F：CCTGCCTTCATACGCTATTT(SEQ ID NO.9)；

M13-R：CAGGAAACAGCTATGACC(SEQ ID NO.10)。

将测序正确的菌液提取质粒，得到过表达质粒载体。其中，质粒提取使用生工的SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(B518191-0100)。

6)由百格基因科技(江苏)有限公司对步骤5)所获得的过表达质粒载体遗传转化于受体材料中花11，获得过表达株系。

2.OsAAP8过表达材料基因表达水平的检测

(1)过表达植株RNA提取

提取RNA使用的试剂盒为TransZol Up Plus RNA Kit(目录号：ER501)。

具体步骤如下：

a.提前准备好1.5ml的无RNA酶污染(RNase-free)的Mirocentrifuge tube(Ep)管，并加入1ml TransZol Up和0.2ml RNA Extraction Agent，放于冰上待用；

b.将存于-80℃超低温冷冻冰箱的样品取出，将液氮倒于研钵中，充分快速地用研杵研磨至粉末状，其间可以适量地补加液氮，使样品一直保持低温状态；

c.取50-100mg粉末状样品放于加有提取液的1.5ml Ep管中，用涡旋震荡仪，室温5min，充分匀浆处理；

d.将1.5ml Ep管配平放于冷冻离心机中，10000×g 4℃离心15分钟；此时提取的样品分成三层，分别为上层RNA液体相(无色的水相)，中间层为DNA及破碎组织相，下层为粉红色有机相；

e.取上清液水相500μl-600μl转移至于新的1.5ml RNase-free Ep管中(尽量不用吸到中间层，可以少吸)，加入等体积的无水乙醇(此时可能会出现沉淀)，轻轻上下颠倒混匀；

f.将混合的溶液和沉淀转移至离心柱中，12000×g室温离心30s，弃去流出液，(若体积大于离心柱容量，可分多次转移离心)；

g.在离心柱中加入500μl CB9，12000×g室温离心30s，弃去流出液；

h.重复步骤g一次；

i.在离心柱中加入500μl WB9(使用前按照所需体积加入无水乙醇，混匀)，12000×g室温离心30s，弃去流出液；

j.重复步骤i一次；

k.将离心柱和Ep管重新放回离心机，12000×g室温，空离2min，彻底去除残留的无水乙醇；

l.将离心柱置于1.5ml RNase-free Ep管上，加入50-70μl的RNase-free ddH₂O于离心柱的正中央，室温静置1min，12000×g室温离心1min，洗脱RNA；

m.重溶：为了获得更多的RNA，可以将离心后的RNA液体吸取，加于离心柱，室温静置1min，12000×g室温离心1min，得到RNA提取液；

n.RNA鉴定：吸取2μl的RNA提取液，加7μl ddH₂O，再加1μl10×Loading Buffer于200μl Ep管中，掌上离心机瞬时离心混匀，进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像一般显示为清晰完整的3条带，即为提取的RNA的质量较好；

o.RNA保存，长期保存置于-80℃，暂时保存置于4℃；

注：以上各种型号的枪头，Ep管均需使用RNase-free。

(2)cDNA合成

cDNA合成使用的试剂盒为HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)(产品编号：R212-01)。

具体步骤如下：

a.RNA模板变性：在200μl的RNase-free Ep管中配置以下混合液(表8)，掌上离心机低速瞬时离心混匀，65℃加热5min，迅速至于冰上骤冷，并在冰上静置2min；

表8反应体系

b.基因组DNA去除：第一步反应管中直接加入4μl的4×gDNA wiperMix，见表9；掌上离心机低速瞬时离心混匀，42℃加热2min；

表9反应体系

c.配置第一条链cDNA合成反应液，见表10；掌上离心机低速瞬时离心混匀，PCR仪中设置反应程序，见表11；逆转录产物cDNA可以直接用于PCR扩增模板，或者在-20℃冰箱保存。

表10反应体系

表11逆转录反应程序

(3)RT-qPCR表达量分析

将反转的cDNA用灭菌ddH₂O稀释5倍，以水稻OsActin1为内参基因，OsAAP8基因引物见表12，RT-qPCR试剂盒使用qPCR SYBR Green MasterMix(High Rox Plus)(产品编号：11203ES08)。

表12引物序列

具体步骤如下：

a.将试剂盒中试剂取出，在冰上融化，按照表13在冰上配置反应体系，定量实验需要三个技术重复。

表13反应体系

b.按照表14设置扩增程序，熔解曲线为仪器默认。

表14扩增程序(三步法)

注意：荧光信号采集(★)：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置。

(4)分析实时荧光定量PCR数据，GraphPad Prism 8进行数据分析和作图，获得过表达株系OEP8-1和OEP8-2中OsAAP8的表达量，结果如图4，OEP8-1和OEP8-2两个株系中OsAAP8的表达量远远高于野生型ZH11中的表达量。

3.表型观测和统计分析

常规种植方法培育野生型ZH11，以ZH11为背景的OsAAP8过表达(OEP8-1、OEP8-2)。收获期对ZH11和OsAAP8过表达(OEP8-1、OEP8-2)分别进行分蘖数统计记录，同时使用万深SC-G自动考种分析及其千粒重软件对其单株籽粒数量、单株籽粒产量、千粒重等进行分析统计，粒厚统计使用高精度千分尺数显测厚仪，采购于旗丰品牌，并拍照记录。得到图5和图6。

图5A为中花11背景的OsAAP8过量表达材料和野生型亲本的单株籽粒表型，可见两个过量表达株系籽粒平铺圆饼的直径均小于野生型；图5B结果可知，OsAAP8过量表达植株相比于野生型亲本植株的分蘖数减少；图5C和5D结果可知，OEP8-1株系的单株籽粒数量和单株产量相比于野生型有减少趋势，OEP8-2株系的单株籽粒数量和单株产量相比于野生型显著降低。由图6A可见，OsAAP8过量表达株系的十个籽粒的叠加粒厚相比野生型亲本减小，图6B-C的统计数据所示，OsAAP8过量表达株系的千粒重(图6B)，粒厚(图6C)相比野生型亲本显著降低。

由此可知，OsAAP8基因负调控水稻的分蘖，过量表达OsAAP8降低水稻籽粒的厚度，导致千粒重减小。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.OsAAP8基因在调控水稻分蘖、粒型和粒重中的应用，其特征在于，所述OsAAP8基因编码由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsAAP8基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述OsAAP8基因的编码序列如SEQ IDNO.3所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述调控包括敲除水稻中的OsAAP8基因或在水稻中过表达OsAAP8基因。

5.一种增加水稻分蘖数、粒重并改变水稻籽粒粒型的方法，其特征在于，根据所述OsAAP8基因的核苷酸序列设计靶位点对水稻中该基因进行CRISPR/Cas9基因编辑，经鉴定和筛选获得osaap8突变体植株；所述osaap8突变体植株的分蘖数和粒重增加，突变体植株的籽粒粒型改变，表现为粒厚增加。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述靶位点为所述OsAAP8基因核苷酸序列的中花11背景，所述靶位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

7.一种降低水稻分蘖数、水稻籽粒粒厚和粒重的方法，其特征在于，将所述OsAAP8基因构建到表达载体上，转化水稻，获得OsAAP8基因的过表达植株，所述过表达植株的分蘖数降低，水稻籽粒粒厚变窄，粒重降低。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体为改造的pCambia1300骨架载体。

9.根据权利要求5或权利要求7所述的方法，其特征在于，所述水稻为中花11。

10.权利要求5-9任意一项所述的方法在水稻育种中的应用。