CN110386967B - 与植物雄性育性相关的蛋白SiMS1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与植物雄性育性相关的蛋白SiMS1及其编码基因与应用。本发明利用谷子生产上应用的高度雄性不育系1066A，通过图位克隆的方法得到一个谷子高度雄性不育基因SiMS1，并对SiMS1基因不育机理进行了深入研究。通过研究发现：本发明的SiMS1基因具有调控谷子花药绒毡层细胞程序化死亡及花粉外壁形成的功能，该基因的缺失会导致谷子的高度雄性不育。与现有的技术相比，本发明具有如下的有益效果：由于SiMS1基因功能的缺失会特异性导致谷子的高度雄性不育；可利用敲除或抑制SiMS1的特异性表达技术获得新的谷子高度雄性不育系，在农业生产上具有十分重要的应用。

Description

与植物雄性育性相关的蛋白SiMS1及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及与植物雄性育性相关的蛋白SiMS1及其编码基因与应用。

背景技术

谷子[Setaria italica(L.)Beauv]，属禾本科，狗尾草属。作为一种重要的粮食作物，谷子在中国栽培历史已有8700年以上，至今仍是中国北方干旱及半干旱地区的主要栽培作物之一。谷子是二倍体自花授粉植物，全基因组测序已完成，基因组只有约490Mb，与同为禾本科的模式作物水稻的共线性极高。谷子还是一种C₄作物，光合效率高、耐旱且营养高效，部分早熟的谷子品种由于其全生育期短且植株矮小，便于培养箱培养，这些特征正使谷子成为研究C₄光合作用的新兴模式作物。

植物雄配子体的发育是一个极其复杂的过程，涉及到雄配子体腔室多层壁细胞的发育及腔室内花粉母细胞的减数分裂和小孢子的有丝分裂等发育过程，发育的每一个阶段产生异常都可能影响花粉的正常形成。成熟雄配子体壁细胞层分为表皮层、内皮层、中层和绒毡层。花粉的发育依赖于这四层细胞的物质代谢、营养供给及其抵御外界不利生长因子的保护作用。位于雄配子体壁细胞最内层的绒毡层细胞直接与花粉母细胞和小孢子接触，该层细胞能够合成和分泌成熟花粉形成所必须的一些营养物质和花粉外壁的组成成份。因此影响绒毡层细胞发育和花粉外壁正常形成的任何异常都会导致植物雄性不育的发生。

杂种优势是生物界的一种普遍现象，是指两个性状不同的亲本(基因型、品种)杂交产生的杂种，在生长势、生活力、繁殖力、适应性以及产量、品质等性状方面超过其双亲的现象。杂种优势利用也是提高作物产量的重要途径，雄性不育基因的克隆及雄性不育系的培育是有效利用杂种优势的前提和基础。而在谷子生产方面，杂种优势同样得到了应用，其利用方式不同于水稻的“三系法”和“两系法”，谷子杂种优势利用主要依赖于上世纪70年代发现的高度雄性不育材料(崔文生等，1979)。利用该不育材料培育的各类雄性不育系依靠5％左右的自交结实小花来繁殖，即不育系本身非100％不育，自交可繁殖自身。用其与具有抗除草剂基因的谷子品种杂交配制杂交种，形成的杂种F₁代种子经除草剂处理，即可去除假杂种。虽然该不育基因已经在谷子生产上成功得到应用，但是这个基因一直未被克隆。因此对谷子高度雄性不育基因的克隆及其功能的深入研究，将为发掘和创制新的谷子雄性不育资源提供必要的前提和基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控植物雄性的育性。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物雄性育性相关蛋白。

本发明所提供的与植物雄性育性相关蛋白的名称为SiMS1，来源于谷子[Setariaitalica(L.)Beauv]，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质SiMS1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质SiMS1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质SiMS1的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

为解决上述技术问题，本发明又提供了与SiMS1蛋白质相关的生物材料。

本发明提供的与SiMS1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码SiMS1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或序列3所示的基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码SiMS1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码SiMS1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法对本发明的编码SiMS1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的SiMS1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiMS1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，A2)所述的含有编码SiMS1的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达SiMS1的DNA，该DNA不但可包括启动SiMS1转录的启动子，还可包括终止SiMS1转录的终止子。进一步的，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子及胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

所述植物重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCG1301或其他衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区，即包含多聚腺苷酸信号和任何其他参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述多聚腺苷酸信号可引导多聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始或邻近区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是人工合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可以不加任何选择标记基因，直接以逆境筛选转化植株等。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了SiMS1蛋白质或上述相关生物材料的新用途。

本发明提供了SiMS1蛋白质或上述相关生物材料在如下b1)-b6)中任一种中的应用：

b1)调控植物雄性育性；

b2)调控植物花药绒毡层细胞程序化死亡；

b3)调控植物花粉外壁的形成；

b4)培育雄性可育的转基因植物；

b5)培育雄性不育的转基因植物；

b6)植物育种。

上述应用中，所述调控植物雄性育性为使植物育性恢复。

上述应用中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为谷子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育雄性可育的转基因植物的方法。

本发明提供的培育雄性可育的转基因植物的方法包括提高受体植物中SiMS1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物为雄性可育；所述受体植物为雄性不育系。

上述方法中，所述提高受体植物中SiMS1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达SiMS1蛋白质；所述过表达的方法为将SiMS1蛋白质的编码基因导入受体植物；所述SiMS1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列3所示的DNA分子。

在本发明中，所述SiMS1蛋白质的编码基因通过互补载体pCUbi1390-SiMS1导入受体植物。所述互补载体pCUbi1390-SiMS1为将序列3所示的SiMS1基因全长片段插入pCUbi1390载体的KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点间，且保持pCUbi1390载体的其他序列不变得到的载体。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为谷子，所述谷子具体为谷子雄性不育系1066A。

为解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种培育雄性不育的转基因植物的方法。

本发明提供的培育雄性不育的转基因植物的方法包括降低受体植物中SiMS1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物为雄性不育。

上述方法中，所述降低受体植物中SiMS1蛋白质的表达量和/或活性为沉默或抑制受体植物基因组中SiMS1蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除SiMS1蛋白质的编码基因。

上述方法中，所述沉默或抑制受体植物基因组中SiMS1蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除SiMS1蛋白质的编码基因为突变受体植物基因组中SiMS1蛋白质的编码基因使受体植物基因组中SiMS1蛋白质的编码基因的表达量降低或使受体植物基因组中SiMS1蛋白质的编码基因发生缺失突变或发生插入突变；

所述突变的方式可为CRISPR/Cas9或TELLEN技术或T-DNA插入或EMS诱变。

上述方法中，所述SiMS1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子或序列3所示的DNA分子。

上述方法中，所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物可为谷子。

本发明利用谷子生产上应用的高度雄性不育系1066A，通过图位克隆的方法得到一个谷子高度雄性不育基因SiMS1，并对SiMS1基因不育机理进行了深入研究。通过研究发现：本发明的SiMS1基因具有调控谷子花药绒毡层细胞程序化死亡及花粉外壁形成的功能，该基因的缺失会导致谷子的高度雄性不育。与现有的技术相比，本发明具有如下的有益效果：由于SiMS1基因功能的缺失会特异性导致谷子的高度雄性不育；可利用敲除或抑制SiMS1的特异性表达技术获得新的谷子高度雄性不育系，在农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

图1为近等基因系植株35A和35B的形态学观察示意图。

图2为35A和35B花粉I₂-IK染色观察示意图。

图3为35A和35B植株不同时期花药树脂切片观察示意图。

图4为35A和35B植株花粉壁透射电镜观察示意图。

图5为SiMS1基因图位克隆过程示意图及SiMS1基因结构。

图6为35A与35B植株的SiMS1基因序列比对结果。

图7为互补植株Southern结果。

图8为互补植株花粉I₂-IK染色观察示意图。

图9为互补植株穗部表型观察示意图。

图10为互补植株穗部一级分枝观察示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的谷子品种济谷15(济0515、J0515)记载于文献“秦岭等，抗除草剂谷子新品种济谷15的产量稳定性与适应性分析”中，公众可从申请人(中国农业科学院作物科学研究所)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的谷子雄性不育系1066A记载于文献“王天宇等，夏谷核高度雄性不育系的研究与利用”中，公众可从申请人(中国农业科学院作物科学研究所)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pCUbi1390载体记载于文献“彭昊，利用TDNA插入突变和RNA干涉技术研究水稻基因功能”中，公众可从申请人(中国农业科学院作物科学研究所)处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、谷子雄性不育基因SiMS1的获得

一、谷子雄性不育株和可育株的获得及形态学观察

1、实验材料的制备

将谷子雄性不育系1066A(母本)与谷子可育品种济谷15(父本)进行杂交，得到F₁代杂种，F₁杂种套袋自交，得到由9200个单株组成的F₂分离群体。F₂分离群体中正常可育植株为6771株，雄性不育植株为2229株(单基因统计学测验X² _0.05＝2.8812＜3.84)，表明该雄性不育突变表型由一个单核基因突变造成。

选择F₂群体中的可育单株自交，自交单株获得的种子下代种成系行，在F₃的雄性不育和可育分离行中继续选择可育单株套袋自交形成F₄系行，并按照同样方法形成F₅系行，在F₅代群体田间试验的第35行(区)分离出雄性不育株和正常可育株，但雄性不育株和可育株的其他植物学和农艺性状基本一致，二者构成了近等基因系植株，分别将其命名为35A和35B。近等基因系植株35A和35B的形态学观察示意图如图1所示。将上述材料35A和35B于6月至9月种植于北京顺义中国农业科学院作物科学研究所实验基地。

2、花粉I₂-IK染色

对35A和35B植株花粉进行I₂-IK染色。具体步骤如下：取成熟期的35A和35B植株花药置于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，再加1-2滴I₂-KI溶液，盖上盖玻片，于低倍显微镜下观察。凡被染成黑色的为含有淀粉的活力较强的花粉粒，呈黄褐色的为发育不良的败育花粉粒。

结果如图2所示。35B植株花粉能够正常着色，而35A植株花粉不能够正常着色。

3、树脂切片

对发育不同时期的35A和35B植株花药进行树脂切片观察。具体步骤如下：

(1)固定材料：将发育不同时期谷子小花固定于FAA固定液中，并抽真空使FAA渗入小花内部。

(2)脱水：材料经50％，60％，70％，80％，90％，95％，100％，100％乙醇脱水，每步30min。

(3)前渗透：等体积混合无水乙醇和Technovit 7100(Kulzer-Technik公司)试剂盒中Technovit 7100base liquid试剂，渗透材料2h。

(4)渗透：取100ml Technovit 7100 base liquid加入1g haedenerⅠ配置成Preparation solution，均匀混匀后渗透材料过夜。

(5)包埋：取15ml Preparation solution加入1ml hardenerⅡ，混匀后包埋材料。

(6)修块：用小刀将包埋的树脂块修成适合切片的梯形性状。

(7)切片：用超薄切片机切片并用水展片于载玻片上。

(8)染色：切片浸入含有0.4％甲苯胺蓝染液的染缸中，浸泡5min，取出切片用清水冲洗2min。

(9)观察及拍照：在光学显微镜下观察花药横切切片并拍照。

结果如图3所示。与35B植株花粉发育情况相比，35A植株花粉发育出现异常。35A植株花粉发育异常发生在花粉母细胞减数分裂之后，减数分裂后的单核花粉不能够发育成成熟的花粉。随着花粉发育，花药配子体壁细胞最内层的绒毡层细胞会逐步进入细胞程序化死亡进程，在绒毡层细胞程序化死亡进程中分泌花粉成熟所必须的一些营养物质和花粉外壁的组成成分。绒毡层细胞提前进入或者滞后进入程序化死亡进程都会影响花粉的发育。

另外扫描及透射电镜观察35A和35B植株花药和成熟花粉花粉壁发现：35B植株的花粉饱满，可以观察到很多内含物，同时花粉外壁十分规则；但是35A植株的花粉整体呈现出败育的形态，内含物较少，花粉外壁发育异常，特别是中间的空隙较小且十分不规则。同时35A植株的乌氏体排列也比较紊乱(图4A、B、E和F)。但是35A和35B植株的花药表面并没有明显的区别(图4C、D、G和H)。

二、SiMS1基因的定位和克隆

提取1066A×济谷15F₂群体中2229株雄性不育植株的基因组DNA，并用SSR引物进行群体扫描。通过图位克隆的方法最终将靶基因定位于CAAS61001和CAAS61018标记之间，区间大小为12.6kb，本区间只有一个开放阅读框Seita.6G075500(图5)，将其命名为SiMS1基因，SiMS1基因的开放阅读框如序列1所示，编码序列表中序列2所示的蛋白质。具体步骤如下：

1、谷子DNA的提取

采用改进的CTAB法提取谷子基因组DNA。具体步骤如下：取叶片0.1-0.2g放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入800ul 65℃预热的CTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入65℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积800ul的氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇体积比为24:1)，猛烈混匀，12000rpm离心10分钟，取上清，再次加入800ul的氯仿/异戊醇，12000rpm离心10分钟，取上清于新离心管中，加入600ul异丙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA12000rpm离心10分钟。弃上清，收集沉淀，并将沉淀用500ul 70％乙醇清洗两次，离心干燥，溶于100ul去离子水中，-20℃冰箱保存。

2、图位克隆

定位标记为本发明自行开发的SSR引物，SSR引物序列如表1所示。采用集团分离分析法筛选到与目标基因连锁的标记，之后提取2229株隐形单株DNA进一步进行精细定位。

表1、图位克隆所用SSR引物

3、目标基因测序和蛋白结构分析

从S.italica genomeproject V2.2数据库(http://www.phytozome.net)中获得定位区间的参考序列，并利用此参考序列设计测序引物，测序引物序列如表2所示。采用设计的测序引物PCR扩增35A和35B植株中的目标区段(SiMS1基因)并测序，比对35A和35B植株中此区间的差异。35A和35B植株中的SiMS1基因序列比对结果如图6所示。

表2、定位区间测序引物

实施例2、SiMS1基因的功能分析

一、互补植株的制备

1、将序列3所示的SiMS1基因全长片段插入pCUbi1390载体的KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点间，得到互补载体pCUbi1390-SiMS1。

2、将步骤1获得的互补载体pCUbi1390-SiMS1通过热击法导入农杆菌LBA4404(Tiandz，Catalog:12-96)，得到重组菌pCUbi1390-SiMS1/LBA4404。

3、将步骤2获得的含有pCUbi1390-SiMS1的重组菌pCUbi1390-SiMS1/LBA4404转染谷子雄性不育1066A植株的幼穗愈伤组织，并经过组织培养选择转化愈伤和再生，得到T₀代转化植株。对T₀代植株进行鉴定，将鉴定为阳性的植株自交，得到T₁代植株，对T₁代植株进行鉴定，将鉴定为阳性的植株自交，得到T₂代植株。PCR鉴定的引物及阳性片段大小如表3所示。

表3、PCR鉴定的引物

引物名称	产物长度	上游引物	下游引物
				UBI	727	ACGAGTCTAACGGACACCAA	AAAGATGACCCGACAAACAA
BamHIinsert	1501	TTTTGTTCGCTTGGTTGTGA	TCAGCCAACTTTCCAGTCTTC
				SpeIinsert	1227	CGACTCTTCAATGATGCTGCTA	TATGCTTCCGGCTCGTATGT
1302mgfp	167	TGCTGAAGTCAAGTTTGAGGGAG	AGTTGGCTTTGATGCCGTTC

4、Southern鉴定

对经PCR鉴定为阳性的互补植株T₂-1和T₂-10株系进行Southern鉴定。结果如图7所示。Southern鉴定具体步骤如下：

(1)将基因组DNA定容至500μl用RNA酶处理1个小时。

(2)加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提两次。

(3)加入1/10体积冰醋酸和2/3体积的异丙醇沉淀2个小时以上。

(4)12000rpm转速下离心10分钟，并用75％的酒精洗两次。

(5)在适宜的温度下用限制性内切酶消化基因组DNA12-16个小时。

(6)DNA浓缩后用50μl ddH₂O溶解，将样品点入0.8％的琼脂糖凝胶，电压5V电泳过夜。

(7)将琼脂糖胶泡入0.25mol/L的浓盐酸中10-15分钟直到溴酚蓝变黄。

(8)用ddH₂O洗涤两次，放入碱性转移液(0.4mol/L NaOH，1mol/L NaCl)中浸泡15分钟直到溴酚蓝恢复蓝色。

(9)裁剪大小合适的尼龙膜(Hybond2N+，Amersham Pharmacia biotech)，将膜浸入ddH₂O中至浸湿10min。

(10)然后将尼龙膜放入碱性转移液中5min。

(11)用Bio-Rad真空转膜仪转膜，底层先放滤纸，再放膜，最后放置有DNA的琼脂糖胶，先调到2-3 in Hg，维持1个小时，再调到5 in Hg，维持1个小时。

(12)将膜取出并放到80℃烘箱中固定2小时，保鲜膜包裹后置4℃冰箱保存。

(13)探针的标记以及杂交过程参考DIG High Prime DNA labeling andDetection Starter KitⅡ(Roche)的厂家说明书。探针的扩增引物序列如下：CAGAAAAGAATGAAGGCTGTG和GATCTCATTTGTGATTTCCTGG。探针序列如序列4所示，大小为884bp。

(14)利用UVP公司的化学发光检测仪进行拍照。

二、互补植株的育性检测

1、对步骤一获得的T₀代阳性互补植株T₀-1、T₀-5、T₀-9和T₀-10株系的花粉进行I₂-IK染色，检测其是否恢复可育性状。具体步骤同实施例1步骤一中的2。以实施例1中制备的35A和35B植株作为对照(CK)。

结果如图8所示。T₀代阳性互补植株的花粉发育恢复，花药中含成熟花粉经I₂-IK染色均变成黑色。对T₁代阳性互补植株T₁-1、T₁-5、T₁-9、T₁-10株系的单株进行花粉育性检查，发现这些系行可育植株和不育植株的分离比均为3∶1。

2、观察步骤一获得的T₂代阳性互补植株T₂-1、T₂-5、T₂-9和T₂-10株系的穗部表型。以实施例1中制备的35A和35B植株作为对照(CK)。

结果如图9和图10所示。从图中可以看出：T₂代互补植株的育性已经得到完全恢复。

上述结果表明：谷子中SiMS1基因的缺失会导致谷子的高度雄性不育，将SiMS1基因导入SiMS1基因缺失的谷子雄性不育系1066A中可使其育性恢复。说明SiMS1基因可调控谷子的雄性育性。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>与植物雄性育性相关的蛋白SiMS1及其编码基因与应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>2052

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgccgagcg gcggaaggcg gctgccgccg tggacgtcac cgaggagcgc gggggcgccg 60

aggtggagcc ctgctgctgg taccccagtc gcgggcgcgg gttgcggccc ggtctcgggc 120

taccggacgc cgcccgtcag cgcgggaggc tgcttcggca cgcgcgtcac gccgccgacg 180

agcgggggcg cgcgcgtgac gccgccgtcg accggggggt gctcgtcgcg gccgccgagg 240

cctccacctt ccctggactc gccctacgtg cgggccaagc aggcgcaggt aattgaaaag 300

gacccaaaca aggcagttcc attgttctgg gcagctataa acagcggtga tcggattgag 360

agtgcattga aagatatggc caatgtactg aaacaagcaa atagggctga agaagccatt 420

gaggcaataa gatcctttcg tgatcgttgt ccctatgaag ctcaggattc ccttgacaat 480

attcttcttg acctttacaa gaaatgtggt aggacagaag agcagattga gatgttgacg 540

ataaagctga gagttgttga tgaggagcta gcttctggcc ggtggaaaac aaaactgtct 600

aaatctcatg gaagagtagt gtacctttct cttagagatg aaaaagcaag gttattgggg 660

aaccttgcat gggcctatat gcagtctgaa aattacgagg aagcagaaat gctctacagg 720

caagctcttg ctatagaagc tgactacaac aaagagtgta acttagccat ctgtttgatg 780

aagactggaa agttggctga agctaaatac ctgctccaag ctatacctta caactgcgat 840

gatgaaagtc atgtcaaatc tctttcccgg gctactgaaa tgcttaggga ccttgagttg 900

caatcactcc cttctcccat aactcagatg aagtccaaag aatcgcggat tttgcttgct 960

actgatgtgg agatacttga agatccacag ccacaaactc tatcaactcc tttgagtcaa 1020

ctgaaatata aagaaccaca tatttcagtt tcagcaaatg cagagcaaca tgagaagtgc 1080

agttcatggt ttccatctcc cataactcag ttgaagcgtg aagaaccacg aattttggtt 1140

actgttgatg cagaaaagaa tgaaggctgt gcagagttcc aagatctttc tcgactcttc 1200

aatgatgctg ctacacctca ttcaatactt gaaaaacttc ggaagcggtt agttaacgag 1260

gcaccaaaaa gtagcattca tgaccagatt cagactcata ctccaactga atgcttgccc 1320

aactctgagg gaaaccataa tgctagcgag aatcctgtgc aagggggcaa gctattgacc 1380

aaaggtgtta gaaaaacgtg ggctgacatg gtggatgagg aggagcaaca attgggtgag 1440

gacaagtcat ggactgacat ggtggctaag ggtgaacatc aattgcgcaa tgacaagtta 1500

acagtgggtg tgggcactac tgagcaaact gaaagcagca aacatgcaag taagcaggag 1560

tacagaacac caccaccctc tcaaggaagc agcaccctcc acagaccagt cataggtggt 1620

caccaacaag gtttttcagc gaattcatgg agacgcagca attccaaaat ctccacggat 1680

aacaaagtga actgggatct tgtcagggct gctccaacat ggagcaagca taaggtacag 1740

gatcacagtg gtcgagtttg ccaaaggcct aacgcagctc atctcaagga gaacacttca 1800

ggcagcaaac aagcaccatg gagaagcagc gcatctcagc gtgcgctttt tcctgactgg 1860

aaatcaaagg gtgaaggata tggccatggt tatgtgccgt ttggtgataa tgagcactct 1920

cagggttcta gtcgcactga ggccactcat cgctggcata ataatgcggc aggtacagtg 1980

tcatggaggc cacagaaccg tctgcgggtc ttccaggaaa tcacaaatga gatcaaccaa 2040

aatgttgtgt aa 2052

<210>2

<211>764

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Pro Ser Gly Gly Arg Arg Leu Pro Pro Trp Thr Ser Pro Arg Ser

1 5 10 15

Ala Gly Ala Pro Arg Trp Ser Pro Ala Ala Gly Thr Pro Val Ala Gly

20 25 30

Ala Gly Cys Gly Pro Val Ser Gly Tyr Arg Thr Pro Pro Val Ser Ala

35 40 45

Gly Gly Cys Phe Gly Thr Arg Val Thr Pro Pro Thr Ser Gly Gly Ala

50 55 60

Arg Val Thr Pro Pro Ser Thr Gly Gly Cys Ser Ser Arg Pro Pro Arg

65 70 75 80

Pro Pro Pro Ser Leu Asp Ser Pro Tyr Val Arg Ala Lys Gln Ala Gln

85 90 95

Val Ile Glu Lys Asp Pro Asn Lys Ala Val Pro Leu Phe Trp Ala Ala

100 105 110

Ile Asn Ser Gly Asp Arg Ile Glu Ser Ala Leu Lys Asp Met Ala Asn

115 120 125

Val Leu Lys Gln Ala Asn Arg Ala Glu Glu Ala Ile Glu Ala Ile Arg

130 135 140

Ser Phe Arg Asp Arg Cys Pro Tyr Glu Ala Gln Asp Ser Leu Asp Asn

145 150 155 160

Ile Leu Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Cys Gly Arg Thr Glu Glu Gln Ile

165 170 175

Glu Met Leu Thr Ile Lys Leu Arg Val Val Asp Glu Glu Leu Ala Ser

180 185 190

Gly Arg Trp Lys Thr Lys Leu Ser Lys Ser His Gly Arg Val Val Tyr

195 200 205

Leu Ser Leu Arg Asp Glu Lys Ala Arg Leu Leu Gly Asn Leu Ala Trp

210 215 220

Ala Tyr Met Gln Ser Glu Asn Tyr Glu Glu Ala Glu Met Leu Tyr Arg

225 230 235 240

Gln Ala Leu Ala Ile Glu Ala Asp Tyr Asn Lys Glu Cys Asn Leu Ala

245 250 255

Ile Cys Leu Met Lys Thr Gly Lys Leu Ala Glu Ala Lys Tyr Leu Leu

260 265 270

Gln Ala Ile Pro Tyr Asn Cys Asp Asp Glu Ser His Val Lys Ser Leu

275 280 285

Ser Arg Ala Thr Glu Met Leu Arg Asp Leu Glu Leu Gln Ser Leu Pro

290 295 300

Ser Pro Ile Thr Gln Met Lys Ser Lys Glu Ser Arg Ile Leu Leu Ala

305 310 315 320

Thr Asp Val Glu Ile Leu Glu Asp Pro Gln Pro Gln Thr Leu Ser Thr

325 330 335

Pro Leu Ser Gln Leu Lys Tyr Lys Glu Pro His Ile Ser Val Ser Ala

340 345 350

Asn Ala Glu Gln His Glu Lys Cys Ser Ser Trp Phe Pro Ser Pro Ile

355 360 365

Thr Gln Leu Lys Arg Glu Glu Pro Arg Ile Leu Val Thr Val Asp Ala

370 375 380

Glu Lys Asn Glu Gly Cys Ala Glu Phe Gln Asp Leu Ser Arg Leu Phe

385 390 395 400

Asn Asp Ala Ala Thr Pro His Ser Ile Leu Glu Lys Leu Arg Lys Arg

405 410 415

Leu Val Asn Glu Ala Pro Lys Ser Ser Ile His Asp Gln Ile Gln Thr

420 425 430

His Thr Pro Thr Glu Cys Leu Pro Asn Ser Glu Gly Asn His Asn Ala

435 440 445

Ser Glu Asn Pro Val Gln Gly Gly Lys Leu Leu Thr Lys Gly Val Arg

450 455 460

Lys Thr Trp Ala Asp Met Val Asp Glu Glu Glu Gln Gln Leu Gly Glu

465 470 475 480

Asp Lys Ser Trp Thr Asp Met Val Ala Lys Gly Glu His Gln Leu Arg

485 490 495

Asn Asp Lys Leu Thr Val Gly Val Gly Thr Thr Glu Gln Thr Glu Ser

500 505 510

Ser Lys His Ala Ser Lys Gln Glu Tyr Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln

515 520 525

Gly Ser Ser Thr Leu His Arg Pro Val Ile Gly Gly His Gln Gln Gly

530 535 540

Phe Ser Ala Asn Ser Trp Arg Arg Ser Asn Ser Lys Ile Ser Thr Asp

545 550 555 560

Asn Lys Val Asn Trp Asp Leu Val Arg Ala Ala Pro Thr Trp Ser Lys

565 570 575

His Lys Val Gln Asp His Ser Gly Arg Val Cys Gln Arg Pro Asn Ala

580 585 590

Ala His Leu Lys Glu Asn Thr Ser Gly Ser Lys Gln Ala Pro Trp Arg

595 600 605

Ser Ser Ala Ser Gln Arg Ala Leu Phe Pro Asp Trp Lys Ser Lys Gly

610 615 620

Glu Gly Tyr Gly His Gly Tyr Val Pro Phe Gly Asp Asn Glu His Ser

625 630 635 640

Gln Gly Ser Ser Arg Thr Glu Ala Thr His Arg Trp His Asn Asn Ala

645 650 655

Ala Gly Thr Val Ser Trp Arg Pro Gln Asn Arg Leu Arg Val Phe Gln

660 665 670

Glu Ile Thr Asn Glu Ile Asn Gln Asn Val Val

675 680

<210>3

<211>3384

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

atgccgagcg gcggaaggcg gctgccgccg tggacgtcac cgaggagcgc gggggcgccg 60

aggtggagcc ctgctgctgg taccccagtc gcgggcgcgg gttgcggccc ggtctcgggc 120

taccggacgc cgcccgtcag cgcgggaggc tgcttcggca cgcgcgtcac gccgccgacg 180

agcgggggcg cgcgcgtgac gccgccgtcg accggggggt gctcgtcgcg gccgccgagg 240

cctccacctt ccctggactc gccctacgtg cgggccaagc aggcgcaggt atttcatgat 300

cgccgtggct cgggtaccat tccggtcatg ttttggctca gaattggatc gttccgcgac 360

tagctatgca tggctaccag cctaccatag tcggcaatta gtgcaaatcg ttatctggac 420

tcacacatgg aagtatggaa ctgtcctctg ctactgctac cacgaaatgg tttaggcatt 480

tctcctcaac aaggttgcag tgatcagtac cttgacatgc agtcccttaa cacttcaatt 540

ctatcaagcc ttctagcttg tcagtgtcag tgaacgcatg attaccctgc aagctgtatt 600

tgtgatggca tttggtttgc tgtgtgtgca atgctcattc tctttgtttg caaactcgag 660

agtaacatat caggagataa ggatgcagta gcctttaagg aaaccttggc tgttttacgt 720

gctaaaactc ccatcgtttt aggacaccat gtagctgtaa caaaagacca ggaaattgca 780

ctgcacagat aaaattgtag attaaatgag cattagcatg aaccaaggaa gtgaaaccca 840

aattttggtc ctgctgatga tgcttcattt tacgagaaac ctgttgtacc aaaagattag 900

actgacacta ttaagtcaag atttttatgt gtactggcat cagctgtttc tttcaattgt 960

ggatgctcat ttccatgctc ttttgcttat tttgcacata acgtactaca tgttcgtcag 1020

ctcttgtaaa ggaaattgca tttgccatcc tgaatatagg aactaccata agctgaaata 1080

tgcaaggttt ttgtttcctt atgttgtttc tatccattcc aggtaattga aaaggaccca 1140

aacaaggcag ttccattgtt ctgggcagct ataaacagcg gtgatcggat tgagagtgca 1200

ttgaaagata tggccaatgt actgaaacaa gcaaataggg ctgaagaagc cattgaggca 1260

ataagatcct ttcgtgatcg ttgtccctat gaagctcagg attcccttga caatattctt 1320

cttgaccttt acaaggtatc tttgcccttt ttcaaagaaa aatgttaagt tttgtaagct 1380

aaatcttccc ccgtagcttc tatcctgagg ttaggttatg ccgatagata tggaacacat 1440

ttagaatatt gcattgtcca ttgtgaatga gtcatcttaa aataatcaac tatcacatga 1500

atttttgatg aagatgtcac caatacaatt ttctgaaacc aataattttc atgttaaacc 1560

agaaatgtgg taggacagaa gagcagattg agatgttgac gataaagctg agagttgttg 1620

atgaggagct agcttctggc cggtggaaaa caaaactgtc taaatctcat ggaagagtag 1680

tgtacctttc tcttagagat gaaaaagcaa ggtactaaaa ttctttatat tcccgtttga 1740

aatttgactt gtaaacacta agtcccttgc ttcttgtaaa ggttattggg gaaccttgca 1800

tgggcctata tgcagtctga aaattacgag gaagcagaaa tgctctacag gtacatcctg 1860

ggttcattct tcttcttttt ttagatatca tgaattttct caatggcata tcgtgaatgg 1920

acctataaac actccacaat actaagagca tgcatggcca tactcgcatg tgtgcgtgtg 1980

gtgtgctgcg tgcacctccc ttatacaaaa ggaaaaacag actaattttg gatactactg 2040

acttggaaca ggcaagctct tgctatagaa gctgactaca acaaagagtg taacttagcc 2100

atctgtttga tgaagactgg aaagttggct gaagctaaat acctgctcca agctatacct 2160

tacaactgcg atgatgaaag tcatgtcaaa tctctttccc gggctactga aatgcttagg 2220

gaccttgagt tgcaatcact cccttctccc ataactcaga tgaagtccaa agaatcgcgg 2280

attttgcttg ctactgatgt ggagatactt gaagatccac agccacaaac tctatcaact 2340

cctttgagtc aactgaaata taaagaacca catatttcag tttcagcaaa tgcagagcaa 2400

catgagaagt gcagttcatg gtttccatct cccataactc agttgaagcg tgaagaacca 2460

cgaattttgg ttactgttga tgcagaaaag aatgaaggct gtgcagagtt ccaagatctt 2520

tctcgactct tcaatgatgc tgctacacct cattcaatac ttgaaaaact tcggaagcgg 2580

ttagttaacg aggcaccaaa aagtagcatt catgaccaga ttcagactca tactccaact 2640

gaatgcttgc ccaactctga gggaaaccat aatgctagcg agaatcctgt gcaagggggc 2700

aagctattga ccaaaggtgt tagaaaaacg tgggctgaca tggtggatga ggaggagcaa 2760

caattgggtg aggacaagtc atggactgac atggtggcta agggtgaaca tcaattgcgc 2820

aatgacaagt taacagtggg tgtgggcact actgagcaaa ctgaaagcag caaacatgca 2880

agtaagcagg agtacagaac accaccaccc tctcaaggaa gcagcaccct ccacagacca 2940

gtcataggtg gtcaccaaca aggtttttca gcgaattcat ggagacgcag caattccaaa 3000

atctccacgg ataacaaagt gaactgggat cttgtcaggg ctgctccaac atggagcaag 3060

cataaggtac aggatcacag tggtcgagtt tgccaaaggc ctaacgcagc tcatctcaag 3120

gagaacactt caggcagcaa acaagcacca tggagaagca gcgcatctca gcgtgcgctt 3180

tttcctgact ggaaatcaaa gggtgaagga tatggccatg gttatgtgcc gtttggtgat 3240

aatgagcact ctcagggttc tagtcgcact gaggccactc atcgctggca taataatgcg 3300

gcaggtacag tgtcatggag gccacagaac cgtctgcggg tcttccagga aatcacaaat 3360

gagatcaacc aaaatgttgt gtaa 3384

<210>4

<211>884

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

cagaaaagaa tgaaggctgt gcagagttcc aagatctttc tcgactcttc aatgatgctg 60

ctacacctca ttcaatactt gaaaaacttc ggaagcggtt agttaacgag gcaccaaaaa 120

gtagcattca tgaccagatt cagactcata ctccaactga atgcttgccc aactctgagg 180

gaaaccataa tgctagcgag aatcctgtgc aagggggcaa gctattgacc aaaggtgtta 240

gaaaaacgtg ggctgacatg gtggatgagg aggagcaaca attgggtgag gacaagtcat 300

ggactgacat ggtggctaag ggtgaacatc aattgcgcaa tgacaagtta acagtgggtg 360

tgggcactac tgagcaaact gaaagcagca aacatgcaag taagcaggag tacagaacac 420

caccaccctc tcaaggaagc agcaccctcc acagaccagt cataggtggt caccaacaag 480

gtttttcagc gaattcatgg agacgcagca attccaaaat ctccacggat aacaaagtga 540

actgggatct tgtcagggct gctccaacat ggagcaagca taaggtacag gatcacagtg 600

gtcgagtttg ccaaaggcct aacgcagctc atctcaagga gaacacttca ggcagcaaac 660

aagcaccatg gagaagcagc gcatctcagc gtgcgctttt tcctgactgg aaatcaaagg 720

gtgaaggata tggccatggt tatgtgccgt ttggtgataa tgagcactct cagggttcta 780

gtcgcactga ggccactcat cgctggcata ataatgcggc aggtacagtg tcatggaggc 840

cacagaaccg tctgcgggtc ttccaggaaa tcacaaatga gatc 884

Claims (9)

1.与蛋白质相关的生物材料在如下b1）-b5）中任一种中的应用：

b1）调控植物雄性育性；

b2）调控植物花药绒毡层细胞程序化死亡；

b3）调控植物花粉外壁的形成；

b4）培育雄性可育的转基因植物；

b5）培育雄性不育的转基因植物；

所述蛋白质是如下a）或b）所示的蛋白质：

a）氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b）在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

所述与蛋白质相关的生物材料为下述A1）至A8）中的任一种：

A1）编码所述蛋白质的核酸分子；

A2）含有A1）所述核酸分子的表达盒；

A3）含有A1）所述核酸分子的重组载体；

A4）含有A2）所述表达盒的重组载体；

A5）含有A1）所述核酸分子的重组微生物；

A6）含有A2）所述表达盒的重组微生物；

A7）含有A3）所述重组载体的重组微生物；

A8）含有A4）所述重组载体的重组微生物；

所述植物为谷子。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：A1）所述核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：

1）其编码序列是序列1所示的cDNA分子或序列3所示的基因组DNA分子；

2）与1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

3.一种培育雄性可育的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物为雄性可育；所述受体植物为雄性不育系；所述植物为谷子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量的方法为在受体植物中过表达权利要求1中所述蛋白质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1中所述蛋白质的编码基因导入受体植物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列3所示的DNA分子。

7.一种培育雄性不育的转基因植物的方法，包括降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物为雄性不育；所述植物为谷子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述降低受体植物中权利要求1中所述蛋白质的表达量为沉默或抑制受体植物基因组中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达和/或活性或敲除权利要求1中所述蛋白质的编码基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1或序列3所示的DNA分子。

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