CN117051006A - 一种正向调控白菜抽薹开花的基因及其应用 - Google Patents

一种正向调控白菜抽薹开花的基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种正向调控白菜抽薹开花的基因及其应用，属于植物分子生物学与植物遗传工程领域。所述基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。通过基因编辑手段，敲除白菜BrAP1基因，观察白菜抽薹开花时间的早晚。结果表明，白菜BrAP1敲除突变体植株的开花时间显著晚于野生型。本发明提供的白菜BrAP1基因在调控开花时间上的功能明确，为进一步培育、筛选或构建晚抽薹白菜品种奠定了基础，为分子育种及提高此类作物品种适应性提供理论支持。

Description

一种正向调控白菜抽薹开花的基因及其应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体涉及一种正向调控白菜抽薹开花的基因及其应用。
背景技术
白菜类作物(Brassica rapa L)广泛分布于中东亚地区和欧洲，主要包括大白菜、小白菜等多种蔬菜作物和部分油料作物。
植物在经过一段时间营养生长后开始开花，在这个过程中，顶端分生组织开始分化花而不分化成嫩叶。在十字花科模式植物拟南芥开花诱导过程中，主要有六条开花诱导途径：光周期途径(photoperiodism pathway)、赤霉素途径(gibberellin pathway)、年龄途径(aging pathway)、自主途径(autonomous pathway)、温敏途径(ambient temperaturepathway)和春化途径(venerlization pathway)。抽薹开花是植物生命周期中的关键时期，对白菜类作物而言，过早或过晚抽薹对于产量和商品品质有十分重要的影响。
现有研究中对拟南芥AP1(APETATAL1)基因分析的结果显示其属于MIKC型MADS-box转录因子家族，具有保守的MADS区和相对保守的K-box结构域，其中K-box结构域可以与DNA特异性结合，在花发育中起重要作用，并参与花形态建成。AP1还作为开花调控网络的最终整合因子与LFY(LEAFY)共同促进开花，是一个多效基因并在调控开花时间上起关键作用。
现有技术中，国内外众多科学家基于双亲构建的分离群体或自然群体，对白菜抽薹相关性状QTL进行了大量研究。目前对于白菜类作物现有研究中发现，定位到的抽薹开花基因有很多，其中大部分位于春化途径中，其中BrFLC1、BrFLC2、BrFLC3和BrFLC5基因，是春化途径中调控白菜类作物抽薹开花的重要基因。此外，近年还鉴定到BrSDG8、BrSOC1、BraVRG等与春化途径开花相关基因而在其它的途径中所鉴定到的基因相对较少，陆续发现了BraMAF1、BraMAF2、BrFT、BraELF6和BrCEN等通过其他途径调控白菜类作物抽薹开花的相关基因。由于此前白菜遗传转化技术尚未成熟，因此定位发掘的大部分基因并未能在白菜中进行转基因功能验证，仅有少数基因在近些年得到了验证其中包括BrFT1、BrFT2、BrAGL19、BrAGL24、BrLEAFY、BrSOC1、BrFLC1、BrFLC2和BrVIN3.1，但未能解析其具体调控机制。目前对白菜类作物开花基因克隆和功能验证的研究较少，目前还无法提出有效的分子调控策略。
作物育种的传统技术需要进行杂交、筛选才能达到品种纯化目的，不仅步骤繁琐，需要较长时间且效率低下，严重地拖慢了育种进程。自从2013年开始，世界上多个实验室都分别报道了利用CRISPR/Cas9技术在水稻、小麦、烟草和拟南芥中进行基因编辑成功的案例。并且CRISPR/Cas9凭借着技术成本低廉、操作简单，突变不同的靶位点时仅需重新设计sgRNA等优点备受青睐，被广泛应用于作物育种、对许多作物进行定点编辑并创新种质资源。虽然传统育种、分子标记辅助选择育种和转基因育种已在芸薹属中得到应用，但每种育种技术在白菜类作物中的应用都有其局限性。由于CRISPR/Cas9系统设计简洁、靶点选择灵活、构建过程简便和编辑效率高成为了短时间飞速发展的主流育种技术。即利用特异性导向RNA作为DNA结合结构域从而代替了蛋白质结合过程。CRISPR/Cas9技术不仅可以突变单个基因，还可以同时突变多个基因，并在主要农作物中产生稳定遗传的基因敲除突变体，是改善农作物农艺性状和加速育种进程的强大工具。在过去8年中，CRISPR/Cas9技术在芸薹属作物中的应用迅速增加。其中在油菜中研究最为广泛，许多基因已被编辑并用于改良农艺性状。而在甘蓝和白菜中研究较少。
因此本发明对开花基因进行克隆及功能验证工作，这将有助于深入了解白菜类作物开花时间的机制，也为白菜类作物的遗传育种和种质资源改良奠定基础。结合基因编辑技术加快白菜育种进程并培育具有优良农艺性状的品种以及在增强品种适应性、稳定性上具有良好前景和重要意义。
发明内容
针对现有技术之不足，本发明的目是提供一种正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1及其应用，构建BrAP1基因的CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法侵染野生型白菜子叶柄，对白菜中该基因进行敲除，从而对白菜BrAP1基因进行功能验证，证明BrAP1基因对白菜抽薹开花时间起到正向调控作用。本发明可以丰富白菜类作物抽薹遗传调控网络，为分子育种及提高此类作物品种适应性提供技术支持。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1，所述基因BrAP1的DNA序列为下列组的任一序列：
(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与所述SEQ ID NO.1基因序列具有至少90％以上同源性的序列，且具有相同功能的DNA序列；
(3)能够与(1)所述序列的DNA杂交的DNA序列；
(4)与(1)-(3)中任一所述序列互补的DNA序列。
第二方面，本发明提供一种上述的正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列为下列组的任一：
(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
第三方面，本发明提供了包含所述基因BrAP1的重组质粒。
第四方面，本发明提供了包含所述基因BrAP1的重组表达载体。
可选地，所述重组表达载体的载体为pHSE401。
第五方面，本发明提供了所述的基因BrAP1在正向调控白菜早抽薹开花或者选育晚抽薹开花白菜或者鉴定晚抽薹开花白菜中的应用。
第六方面，本发明提供了所述的蛋白质在正向调控白菜早抽薹开花或者选育晚抽薹开花白菜或者鉴定晚抽薹开花白菜中的应用。
可选地，正向调控白菜早抽薹开花的方法，包括(1)或(2)中任一：
(1)使白菜包含权利要求1所述的基因；
(2)使白菜表达权利要求2所述的蛋白质。
可选地，选育晚抽薹开花白菜的方法，包括(1)或(2)中任一：
(1)敲除白菜中包含的权利要求1所述的基因；
(2)敲除白菜中包含的表达权利要求2所述的蛋白质的基因。
可选地，鉴定晚抽薹开花白菜的方法，包括(1)或(2)中任一：
(1)检测白菜中是否包含权利要求1所述的基因，如果包含权利要求1所述的基因，则鉴定为晚抽薹开花白菜；
(2)检测白菜中是否包含表达权利要求2所述的蛋白质的基因，如果包含表达权利要求2所述的蛋白质的基因，则鉴定为晚抽薹开花白菜。
第七方面，本发明提供了所述的基因BrAP1在延迟白菜开花时间中的应用。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑手段对白菜抽薹开花关键基因BrAP1进行转基因功能验证，并且BrAP1敲除阳性植株的开花时间显著晚于野生型，并经过实验研究发现BrAP1基因对白菜抽薹开花呈现正向调控，BrAP1基因在筛选或培育晚抽薹开花白菜中具有重要应用价值。
附图说明
图1a为晚抽薹材料CSSL16与极早抽薹的轮回亲本RcBr的表型，图1b为AP1基因在白菜中的三个同源基因在两个开花时间差异材料中的表达情况。
图2为BrAP1基因的编码区序列的图位克隆结果。
图3为BrAP1亚细胞定位结果。
图4为CRISPR-BrAP1敲除载体构建序列比对结果。
图5为白菜BrAP1基因遗传转化过程；其中，a为播种，b为愈伤组织诱导，c为抗性筛选，d为芽诱导，e为继代培养，f为生根培养。
图6为抗性苗载体通用引物PCR检测结果；图中，M为D2000，1-18为筛选抗性苗中的18株，V为空载，阴为阴性对照，阳为阳性对照。
图7为靶点序列比对结果；其中，a为靶点1序列比对结果，b为靶点2序列比对结果。
图8为T1代基因编辑植株表型鉴定；其中，a为ap1-37-T1与野生型(WT)生长60天，b为ap1-38-T1与野生型(WT)生长45天，c为ap1-38-T1与野生型生长95天，d为ap1-38-T1与野生型生长60天叶片大小对比，e为ap1-38-T1生长95天到达显蕾期，f为ap1-38-T1生长140天。
图9为T1代基因编辑植株靶点序列比对结果；其中，a为靶点1序列比对结果，b为靶点2序列比对结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。实施例中所采用的试剂除特殊说明均为市场购买，所采用的常规操作方法除特殊说明参照参考文献方法。
实施例1
1、白菜BrAP1基因的挖掘，具体步骤如下：
45株野生型RcBr(极早抽薹的轮回亲本RcBr)和晚抽薹材料CSSL16(Qu G,Gao Y,Wang X,Fu W,Sun Y,Gao X,Wang W,Hao C,Feng H,Wang Y.Fine mapping and analysisof candidate genes for qFT7.1,a major quantitative trait locus controllingflowering time in Brassica rapa L.Theor Appl Genet.2022Jul；135(7):2233-2246.doi:10.1007/s00122-022-04108-w.Epub 2022May 9.PMID:35532733.)在相同条件下生长并在同一时间取样(图1a)，取样进行三次重复，分别选择长势相同的植株对叶片部位进行取样并均匀混合，分别用锡纸包好立即放置于液氮中速冻，用于转录组测序。转录组分析结果显示AP1基因在白菜中的三个同源基因是差异表达基因，并且在晚抽薹材料中表达量显著下调。本发明用实时荧光定量PCR对转录组数据进行验证。本发明使用RNA提取试剂进行RNA提取(天根，北京，中国)，具体操作流程见试剂盒内说明书(http://www.tiangen.com)。
根据RNA的浓度将cDNA统一浓度进行定量。本发明利用诺唯赞(诺唯赞，南京，中国)反转录试剂盒将提取好的RNA转化成cDNA，放于-30℃保存。试剂盒反应体系如下：
本发明采用qRT-PCR检测BrAP1在白菜中同源基因的表达水平。所用体系为20μL体系。本发明所用PCR Mix是诺唯赞的SYBR qPCR Master Mix，2-△△Ct法分析相对表达量，循环阈值(Ct值)表示为三个独立生物重复的平均值，每个样品使用三个独立的技术重复进行分析，使用QuantStudio 6Flex Manager软件分析数据，内参基因为Actin(Livak andSchmittgen,2001)，具体操作步骤如下：
(1)提前将各个部位的cDNA稀释10倍，引物稀释20倍；
(2)在灭菌的离心管中配制3.5个重复的混样，依次加入3.5μL cDNA，24.5μL DDW和35μL Mix；
(3)每孔各加入1μL上游引物和1μL下游引物，再加入18μL提前配置完成的混样。全部加完样品后，短暂离心10sec。所用引物如下：
(4)观察没有气泡后放入Biosystem Step One Real-Time PCR仪器(AppliedBiosystem)。反应体系如下：
本发明选择一个表达量差异最显著的基因进行研究，并命名为BrAP1基因(图1b)。
2、BrAP1基因的克隆
本发明中正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)如下：
tgcaaccttg gctgctttgc ctcatga
本发明中正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1编码的蛋白质的氨基酸序列(SEQID NO.2)如下：
MEKILERYERYSYAERQLIAPESDVNTNWSMEYNRLKAKIELLERNQRHYLGEDLQAMSPKELQNLEQQLDTALKHIRSRKNQLMYDSVNELQRKEKAIQEQNSMLSKQIKEREKVLRAQQEQWDQQNHGQNMPPPPPPQEHQIQHPYMLSHQPSPFLNMGGLYEEEDPMAMRRNDLDLSLEPVYNCNLGCFAS*
利用大白菜数据库(http://www.brassicadb.cn/)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的BrAP1序列信息，利用Premier 5.0设计其CDS全长序列扩增引物为：BrAP1(CDS)-F:GCCCTAATTCTGTGAATTGA和BrAP1(CDS)-R:CAGTAATATGAATCTTATAACAACA。以反转录后的cDNA作为模板，进行PCR扩增。扩增体系如下：
扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸5min，加入10μL矿物油，最终放入4℃保存。之后进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带，如目标条带清晰单一，即可将PCR产物直接合并纯化回收；若出现多条带，则重新制作2％琼脂糖凝胶，进行胶回收。本发明采用的是康为世纪提供的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(康为世纪，北京，中国)。
随后进行连接转化，连接：本发明利用的是Blunt Simple Cloning Kit(全式金生物，北京，中国)。PCR胶回收产物3μL，Blunt Simple Cloning Vector 1μL，按顺序加入PCR管中，室温反应5min，连接产物放于冰上或放-30℃保存。
转化：将大肠杆菌感受态Top 10(唯地，上海，中国)放在冰上解冻，在感受态细胞解冻后加入5μL连接产物，冰浴30min后42℃水浴90sec。水浴结束后立即冰浴3min。之后向离心管中加入500μL LB液体培养基，200rpm/min，37℃培养1h。避光将8μL 500mM IPTG和40μL 20mg/mL X-gal混合，涂在含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养箱中放置30min。待IPTG和X-gal被吸收后，将培养好的菌液8000rpm/min离心2min弃400μL上清液，轻弹悬浮菌体，将菌液均匀地涂在平板上，放在37℃培养箱中培养12h。之后进行蓝白斑筛选。用10μL吸头挑取平板中的单个白色菌落。将吸头打入装有1ml提前加入卡那霉素的液体LB培养基的2ml离心管中。200rpm/min，37℃培养12h。培养结束后进行菌液PCR，所用引物为BrAP1(CDS)-F:GCCCTAATTCTGTGAATTGA和BrAP1(CDS)-R:CAGTAATATGAATCTTATAACAACA。之后进行琼脂糖凝胶电泳，挑选含有目标条带(585bp)的菌液进行测序(生工，上海，中国)。BrAP1的CDS序列全长585bp，有七段编码序列，一共编码194个氨基酸序列。将BrAP1基因的CDS序列与大白菜数据库(http://www.brassicadb.cn/)(Zhang et al.,2018)(Zhang,L.；Cai,X.；Wu,J.；Liu,M.；Grob,S.；Cheng,F.；Liang,J.；Cai,C.；Liu,Z.；Liu,B.；et al.ImprovedBrassica rapa reference genome by single-molecule sequencing and chromo-someconformation capture technologies.Hortic Res,2018,5:50.https://doi.org/10.1038/s41438-018-0071-9.)内下载该基因在参考基因组中对应的序列，利用DNAMAN软件进行比对(图2)。序列比对结果显示，野生型RcBr中的BrAP1基因与数据库中参考基因组基因序列一致，并未发生基因突变。利用克隆后的BrAP1基因CDS序列全长来进行靶点选择，以及后续亚细胞定位载体和酵母载体的构建等。
3、BrAP1的亚细胞定位
亚细胞定位载体构建，对克隆得到的BrAP1基因全长编码区质粒，利用BsmBI/Esp3I进行酶切反应；然后利用BsaI/Eco31I对pCAMBIA1301载体修饰后的pBWA(V)HS-ccdb-GLosgfp载体进行酶切反应，将载体酶切产物和质粒酶切产物用纯化试剂盒纯化，用T4连接酶进行连接反应；最后将构建好的载体pBWA(V)HS-BrAP1-GLosgfp进行测序验证。
具体烟草瞬时转化操作步骤如下：
(1)在无菌的湿润基质土中(草炭：蛭石：珍珠岩体积比例为3:2:1)均匀撒播烟草种子，并放入人工气候培养箱培养，一个月后可用于烟草注射；
(2)将构建的亚细胞定位重组质粒转入农杆菌感受态GV3101，在30℃培养箱中培养48h；
(3)将固体培养基上的菌落刮下，放置在10mL YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h；
(4)4000rpm/min离心4min，弃上清液；
(5)用10mM MgCl2悬浮液重悬菌体，使用分光光度计，测量OD600的值，继续调至0.6左右；
(6)将农杆菌菌液使用1mL注射器从下表皮注射到烟草叶片中，避光培养2天；
(7)将烟草叶片制作成玻片，在激光共聚焦显微镜(莱卡，德国)下观察并拍照保存(图3)。图3中从左到右分别是叶绿体荧光通道、叶绿体自发荧光、明场和叠加场。上面四张图片是GFP绿色荧光蛋白的空载阳性对照，下面四张图片是BrAP1的表达结果。
由结果可知，BrAP1主要在烟草的细胞核中表达，并且表达效率极强，说明BrAP1有转录因子的一般特性。
4、CRISPR-BraAP1载体构建
试验所用载体为pHSE401，来源于中国农业大学生物学院陈其军老师课题组(XingHL,Dong L,Wang ZP,Zhang HY,Han CY,Liu B,Wang XC,Chen QJ.ACRISPR/Cas9 toolkitfor multiplex genome editing in plants.BMC Plant Biol.2014Nov 29；14:327.doi:10.1186/s12870-014-0327-y.PMID:25432517；PMCID:PMC4262988.)，试验中载体构建所用大肠杆菌感受态细胞(Top10)和农杆菌感受态细胞(GV3101)均购于上海唯地生物技术有限公司。登录网站(http://www.crisprscan.org/page＝sequence)，将BrAP1基因编码区序列拷贝到相应序列框中，选择两个分数较高的靶点。采用华南农业大学刘耀光实验室开发的在线软件工具包CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/home/)，将PAM序列前20nt拷贝到相应的序列框，评估脱靶情况。在CRISPR-GE中勾选靶点，点击“Primer Design”进入载体构建所需的引物设计，可直接生成构建载体所需引物。如下：
回收纯化sgRNA-BraAP1片段并与酶切后的载体进行连接，成功获得CRISPR-BraAP1重组质粒。
先将重组质粒转化到大肠杆菌细胞Top10中，具体操作步骤与上文一致。将构建的CRISPR-BraAP1重组质粒测序结果在生工生物工程股份有限公司网站进行下载，将PHSE401载体、两个靶点序列和重组质粒测序结果使用DNAMAN软件进行序列比对(图4)。载体比对结果和两个靶点序列比对结果的一致性均为100％，则说明基因编辑载体构建成功，可将重组质粒转化农杆菌细胞进行后续白菜遗传转化。
5、BraAP1基因白菜遗传转化
将测序结果正确的菌液用质粒提取试剂盒(Takara，大连，中国)进行质粒提取，详细操作步骤见Takara官网。并将提取好的质粒放-20℃保存使用。之后将重组质粒转化到农杆菌细胞GV3101中，具体操作步骤如下：
(1)将农杆菌感受态细胞GV3101放手上或室温放至半融化后立即放在冰上；
(2)将装有50μL感受态细胞的1.5mL离心管中加入5μL质粒；
(3)冰浴5min，液氮速冻5min，立即37℃水浴5min，再冰浴5min；
(4)在超净工作台中，向离心管中加入700μL无抗LB液体培养基并封口，220rpm/min 28℃培养2-3h；
(5)培养结束后，6000rpm/min离心1min。弃500μL上清液，将管中收集到的菌体与剩余的上清液轻轻吸打混匀，全部均匀的涂布在(kana和gent抗性)LB固体培养基上，在28℃培养箱中培养2天；
(6)等菌点长到适宜大小时，向2mL离心管中加入1mL(kana和gent抗性)LB液体培养基，再用10μL白色枪头挑取平板上的单菌落，并将枪头打入有抗LB液体培养基中。220rpm/min 28℃过夜培养；
(7)进行菌液PCR，所用引物U626-IDF：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC、U629-IDR：AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带，选择有目标条带(626bp)的菌液，加入等体积比的无菌50％甘油，放-80℃保存使用。
将含有CRISPR-BraAP1重组质粒的农杆菌转化到野生型RcBr中，将根系发达并且长势良好的抗性白菜苗进行鉴定(图5)。经过载体通用引物PCR检测，筛选到15株带有目标条带(626bp)的T0代基因编辑植株。将这15株植株经Hi-Tom测序，对BrAP1基因的两个靶点进行序列比对发现，有2株植株在靶点2处发生了不同数量的碱基替换。
6、基因编辑植株鉴定
将获得抗性苗的叶片进行取样。期间共转化约30000个外植体，获得抗性苗约500株。本试验利用CTBA法提取植物叶片组织中的总DNA，方法参照Murray and Thompson(1980)稍作修改，以抗性苗DNA溶液作为模板，用pHSE401载体的通用检测引物U626-IDF、U629-IDR进行PCR扩增反应。所用PCR反应体系为10μL体系：包括2μL DNA；1μL 10×PCRBuffer；0.8μL2.5mmol/L dNTP；0.2μL Taq DNA聚合酶和0.5μL 0.5μmol/L上下游引物，剩余用无菌超纯水补齐到10μL。扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃30sec，56℃30sec，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸5min，加入10μL矿物油，最终放入4℃保存。每管PCR产物加入2μL 10*loading buffer，做1％的琼脂糖凝胶将PCR产物和D2000各点样5μL，进行琼脂糖凝胶电泳，15min后观察条带(图6)。筛选到15株带有目标条带(626bp)的T0代基因编辑植株并进行Hi-Tom测序。
在两个靶点上下游50-100bp处设计特异性引物，序列如下：
Hi-Tom测序具体方法参照Liu and Wang(2018)(Liu Q,Wang C,Jiao X,Zhang H,Song L,Li Y,Gao C,Wang K.2019.Hi-TOM:a platform for high-throughput trackingof mutations induced by CRISPR/Cas systems.Sci China Life Sci,62(1):1-7.)。将PCR产物胶回收纯化后，由安诺优达基因科技(北京)有限公司进行测序。对BrAP1基因的两个靶点进行序列比对发现，在Target1中没有植株发生碱基突变(图7a)，而在Target 2中有2株植株发生了不同数量的碱基替换，将这2株命名为A-37和A-38(图7b)。在Target 2中，A-37在20bp靶点序列上存在4bp碱基替换，分别是由C到G、由A到T、由C到A和由A到T；A-38有15bp的碱基替换，分别是由CCTATA到GAGATC、由GC到AT、由TCAG到CGTA和由ATC到TCA。经计算转化效率约为0.05％，并将两株成功编辑的T0代基因编辑植株进行自交繁殖，继续观察T1代植株的表型和BrAP1基因突变类型。
将T0代转基因植株A-37和A-38自交后所得到的T1代BrAP1敲除株系命名为A-37-T1(ap1-37-T1)和A-38-T1(ap1-38-T1)。其中T0代基因编辑植株A-37自交后得到7株T1代，A-38自交后得到30株T1代。对T1代基因编辑植株以及45株野生型RcBr进行抽薹开花表型鉴定，开花相关指标分为抽薹5cm天数(DE5)、抽薹10cm天数(DE10)和开花时间(FT)。T1代敲除植株在抽薹5cm天数、抽薹10cm天数和开花时间上均显著晚于野生型RcBr。野生型植株从播种到抽薹5cm天数是29天左右，而A-37-T1和A-38-T1分别需要76天和123天左右；野生型植株从播种到抽薹10cm天数是35天左右，而A-37-T1和A-38-T1抽薹10cm天数分别是80天和127天左右；野生型播种54天左右就可开花进行生殖生长，而A-37-T1播种85天后才能开花，A-38-T1播种130天后才能开花，表型鉴定结果见表1和图8。
表1
表1为T1代基因编辑植株开花性状统计，数据展示为平均值±标准误差，显著水平*P<0.05，**P<0.01。对T1代基因编辑植株以及45株野生型RcBr进行抽薹开花表型鉴定，开花相关指标分为抽薹5cm天数(DE5)、抽薹10cm天数(DE10)和开花时间(FT)。T1代敲除植株在抽薹5cm天数、抽薹10cm天数和开花时间上均显著晚于野生型RcBr。野生型植株从播种到抽薹5cm天数是29天左右，而ap1-37-T1和ap1-38-T1分别需要76天和123天左右；野生型植株从播种到抽薹10cm天数是35天左右，而ap1-37-T1和ap1-38-T1抽薹10cm天数分别是80天和127天左右；野生型播种54天左右就可开花进行生殖生长，而ap1-37-T1播种85天后才能开花，ap1-38-T1播种130天后才能开花。
图8a是生长60天时表型结果，ap1-37-T1抽薹十厘米左右并未开花，而此时野生型已经开花。ap1-37-T1除了与野生型相比表现出极晚抽薹开花的表型外，其余性状均与野生型一致。图8b、8c、8d是ap1-38-T1和野生型植株生长45天、60天和95天的表型对比，可以看出BrAP1功能缺失后基因编辑植株不仅在抽薹开花时间上显著晚于野生型，并且在营养生长阶段与野生型相比表型差异较大。野生型并无莲座期，而基因编辑植株莲座期叶片约30片左右，并且叶面积明显大于野生型，叶面积是野生型叶面积的三倍左右，植株高度明显矮于野生型，与结球白菜表型相近。这可能是因为基因编辑植株进行营养生长时间远长于野生型导致的。图8e是ap1-38-T1在生长120天后显蕾期的表型，生长点处不再分化叶芽而开始进行花芽分化，花蕾在生长点处以聚合的形式生长，仍未抽薹。图8f为ap1-38-T1播种后生长140天的表型鉴定情况，此时已经进入生殖生长阶段，不断分化出侧枝并在侧枝生长点处陆续分化花芽进而开花。而ap1-38-T1抽薹开花后的表型于野生型植株生殖生长阶段的表型一致。
将播种的所有T1代基因编辑植株两个靶点的Hi-Tom测序结果和野生型序列进行比对，在靶点1处与野生型序列比对一致性为100％，未发现有碱基突变(图9a)。但有7株A-37-T1和4株A-38-T1在靶点2处有不同数量的碱基替换(图9b)。7株A-37-T1的碱基突变类型相同，均有三个碱基的替换，分别是由C到T、由A到G、由T到C。4株A-38-T1碱基替换的数量不同，其中38-1有两个碱基的替换，由C到T和由T到C。38-2和38-4的碱基突变类型相同，都是有一个碱基的替换，由A到G。38-3有一个碱基的替换，由T到C。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1，其特征在于，所述基因BrAP1的DNA序列为下列组的任一序列：
(1)具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与所述SEQ ID NO.1基因序列具有至少90％以上同源性的序列，且具有相同功能的DNA序列；
(3)能够与(1)所述序列的DNA杂交的DNA序列；
(4)与(1)-(3)中任一所述序列互补的DNA序列。
2.一种权利要求1所述的正向调控白菜抽薹开花的基因BrAP1编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列为下列组的任一：
(1)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。
3.包含权利要求1所述基因BrAP1的重组质粒。
4.包含权利要求1所述基因BrAP1的重组表达载体。
5.权利要求1所述的基因BrAP1在正向调控白菜早抽薹开花或者选育晚抽薹开花白菜或者鉴定晚抽薹开花白菜中的应用。
6.权利要求2所述的蛋白质在正向调控白菜早抽薹开花或者选育晚抽薹开花白菜或者鉴定晚抽薹开花白菜中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，正向调控白菜早抽薹开花的方法，包括(1)或(2)中任一：
(1)使白菜包含权利要求1所述的基因；
(2)使白菜表达权利要求2所述的蛋白质。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，选育晚抽薹开花白菜的方法，包括(1)或(2)中任一：
(1)敲除白菜中包含的权利要求1所述的基因；
(2)敲除白菜中包含的表达权利要求2所述的蛋白质的基因。
9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，鉴定晚抽薹开花白菜的方法，包括(1)或(2)中任一：
(1)检测白菜中是否包含权利要求1所述的基因，如果包含权利要求1所述的基因，则鉴定为晚抽薹开花白菜；
(2)检测白菜中是否包含表达权利要求2所述的蛋白质的基因，如果包含表达权利要求2所述的蛋白质的基因，则鉴定为晚抽薹开花白菜。
10.权利要求1所述的基因BrAP1在延迟白菜开花时间中的应用。
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