CN116411017A

CN116411017A - 一种多靶点基因编辑工具及其在调节水稻抽穗期方面的应用

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Publication number: CN116411017A
Application number: CN202310531375.XA
Authority: CN
Inventors: 万建民; 周时荣; 蔡亮; 吴豪琴; 崔松; 侯海刚; 徐壮; 郝本元; 胡渊; 朱亮; 刘喜; 田云录; 陈亮明; 刘世家; 江玲
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2023-05-12
Filing date: 2023-05-12
Publication date: 2023-07-11

Abstract

本发明公开一种多靶点基因编辑工具及其在调节水稻抽穗期方面的应用。基于CRISPR‑Cas9基因编辑方法，通过改进tRNA‑sgRNA系统实现一种高效的多靶点基因编辑工具。在水稻抽穗期基因Hd1启动子上设计八个敲除靶点。稳定遗传转化发现八个靶点的编辑效率从59％到88％不等，通过转基因后代的表型和分子鉴定，筛选出34个抽穗期呈现连续分布的家系，提高了优良品种的地区适应性，扩大优良品种的种植面积。同样我们在抽穗期基因DTH8和Ghd7的启动子也获得了抽穗期连续变异的品系。本发明同时为启动子多靶点编辑微调基因表达及寻找顺式调控元件的研究奠定基础。

Description

一种多靶点基因编辑工具及其在调节水稻抽穗期方面的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及到一种多靶点基因编辑工具在调节水稻抽穗期方面的应用。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物之一，全球有超过一半的人口以水稻为主食。在我国有超过60％的人以水稻为主食，是重要的粮食作物。因此，水稻的高产稳产对我国粮食安全具有重要意义。抽穗期(即开花时间)是水稻重要的农艺性状之一，不仅决定水稻品种的地区和季节适应能力，而且影响品种对光温自然资源的利用率，进而影响产量。水稻是一种光周期敏感作物，长日照抑制抽穗，短日照促进抽穗。因此品种的推广方面受到抽穗期的严重限制。例如本申请发明人对江苏南部品种“宁粳8号”直接引种到江苏北部地区如连云港，发现在南京106天抽穗的宁粳8号抽穗延迟到118天，抽穗期延迟，因北部地区冷空气来的更早，导致不能正常的灌浆结实，通过考察农艺性状发现结实率严重降低，最终导致产量严重降低(图1)。发明人同时将主效抽穗期基因Hd1敲除后进行评估，发现敲除Hd1后极早抽穗，浪费光温资源同样导致产量的严重降低。

通过直接引种测试发现，抽穗期性状是优良品种引种的主要障碍。现已克隆的抽穗期基因大部分是主效基因，缺失功能后会极端早或极端晚抽穗，实际育种价值并不高。为了提高优良品种的地区适应性，开发能够精细调控基因表达量，从而扩大优良品种的适宜种植面积具有重要意义。

发明内容

本申请公开一种多靶点基因编辑工具及其在调节水稻抽穗期方面的应用，通过设计随机靶点对抽穗期基因的启动子进行编辑，从而精细调控基因的表达量，以期获得连续变异的遗传资源，从而扩大优良品种的适宜种植面积。因此本发明想通过编辑抽穗期基因启动子的方法以期获得抽穗期连续变异的遗传资源，从而扩大优良品种的适宜种植面积。

第一方面，本发明提供基因Hd1的启动子区域的八个敲除靶序列，八个靶序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。

第二方面，本发明还提供针对Hd1的启动子区域的八个敲除靶序列的sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示。

第三方面，本发明提供基因DTH8的启动子区域的八个敲除靶序列，八个靶序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.27所示。

第四方面，本发明还提供针对DTH8的启动子区域的八个敲除靶序列的sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.35所示。

第五方面，本发明提供基因Ghd7的启动子区域的八个敲除靶序列，八个靶序列分别如SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.43所示。

第六方面，本发明还提供针对Ghd7的启动子区域的八个敲除靶序列的sgRNA，所述sgRNA序列如SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.51所示。

第七方面，本发明还提供本发明所述的sgRNA构建的表达载体。

第八方面本发明还提供本发明所述敲除靶序列，所述sgRNA或所述表达载体在调控水稻抽穗期中的应用。

本发明所述的应用，具体为通过本发明所述的sgRNA序列或所述表达载体，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，转入到正常水稻，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系。

第九方面，本发明还提供一种水稻抽穗期调控的方法，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，利用串联多靶点编辑水稻抽穗期基因的启动子，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系。

第十方面，本发明还提供一种培育不同抽穗期水稻品系的方法，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，利用串联多靶点编辑水稻抽穗期基因的启动子，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系。

本发明抽穗期调控中目标的抽穗期基因可以为现有技术中存在能够对抽穗期具有调控作用的基因，例如基因Hd1、基因DTH8或基因Ghd7。针对这些基因所编辑的靶点为启动子区，在本发明中，提供了三个基因的八个靶点位置，具体如前所述。这八个靶点可单独或组合进行编辑。

具体的编辑方法可以采用本领域常规的CRISPR-Cas9基因编辑技术，例如具体为通过本发明所述的sgRNA序列或所述表达载体，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系。

在一些实施例中，本发明所述的水稻为“宁粳8号”。

有益效果：

本发明通过开发一种多靶点基因编辑工具及其在调节水稻抽穗期方面的应用。在水稻抽穗期基因Hd1启动子上设计了八个敲除位点，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术遗传转化，共获得58株T0代转基因植株，通过PCR测序发现八个靶点的编辑效率从59％到88％不等。T1代鉴定发现58株T0代转基因家系中有19个家系出现大片段缺失(大于50bp的缺失)。由于部分家系是编辑杂合，这些家系中共鉴定出25种不同编辑方式的大片段缺失，统计发现大片段缺失效率高达43％。通过转基因后代的表型及分子鉴定，筛选不同编辑类型的水稻株系共计34个，不同株系的抽穗期呈现梯度分布(南京)。将不同抽穗期家系播种在高纬度地区(连云港)测试地区适应性，成功获得该地区最佳抽穗期家系。本发明还利用该工具编辑抽穗期基因DTH8和Ghd7，同样也获得了抽穗期连续变异的水稻品系。综上所诉，本发明可以有效提高优良品种的地区适应性，扩大了优良品种的种植面积。

附图说明：

图1为优良品种推广受到抽穗期限制。图1A“宁粳8号”及Hd1敲除系在南京的抽穗期植株；B；C；D；E分别是“宁粳8号”及Hd1敲除系及对照品种“徐稻3号”的抽穗期，结实率，种子成熟度及单株产量数据。

图2为表达载体及工作模型。图2A为表达载体骨架；图2B为串联八靶点gRNA-tRNA的工作模型。

图3为Hd1基因结构图及设计敲除靶点位置。图3A为主效抽穗期基因Hd1的基因结构；图3B为八个敲除靶点序列及在启动子上的位置。

图4为遗传转化模式图及各靶点编辑效率检测。图4A为遗传转化示意图，共获得58个转基因T₀家系；图4B为八个靶点产生编辑的效率统计。

图5为34个不同编辑方式家系所对应的抽穗期(南京)。

图6为挑选出不同抽穗期家系及对应的表达量(南京)。图6A为抽穗期梯度分布家系的田间图；图6B为对应家系的表达量检测；图6C是对应家系的抽穗期统计；图6D为缺失启动子核心区-258bp家系的表达量检测。

图7为启动子编辑家系引种评估(连云港)。图7A是评估家系的表达量检测；图7B为评估家系的田间植株表型；图7C；D；E分别是各家系的抽穗期，结实率及单株产量测定。

图8为编辑DTH8和Ghd7启动子编辑的分子和表型鉴定。图8A和图8B分别为DTH8和Ghd7启动子编辑家系田间表型图；图8C-D是DTH8启动子编辑家系的编辑方式及抽穗期数据；图8E-F是Ghd7启动子编辑家系的编辑方式及抽穗期数据。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1基因表达载体的构建

1、抽穗期基因启动子区编辑靶点选择

本发明通过改善tRNA-gRNA系统对长日照条件下开花抑制因子Hd1的启动子区域进行多靶点编辑。

根据水稻基因组数据库中的基因序列，利用CRISPR-P在线网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)设计sgRNA，选取8个序列作为靶序列(图3)，靶序列如SEQ ID NO.1～8所示，sgRNA序列如SEQ ID NO.9～16所示。

启动子区多靶点编辑引物设计规则如下：

(1)合成通用引物：Universal-F:5’-ta-GGTCTCTGGCAacaaagcaccagtgg-3’

其中，通用引物序列最前面为保护碱基(ta)及BsaI识别序列(GGTCTC)，‘TGGCA’为U3启动子的3’序列，后面的15bp序列与tRNA的5’序列配对。

(2)设计最后一个gRNA的反向引物：Gene1-Last-R:5’-ta-GGTCTCAAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNtgcaccagccggg-3’

其中，‘AAAAC’为sgRNA scaffold的5’序列，中间斜体的N为最后一个spacer的反向互补序列，最后13bp序列为tRNA的3’序列。

(3)其余的引物按以下规则设计引物，除了最后一个guide-RNA不再设计外，其余每个guide-RNA设计一对。第X个靶点正向引物Gene1-gR[x]-F为：

5’-ta-GGTCTC-N-N₉N₁₀N₁₁N₁₂ N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆N₁₇N₁₈N₁₉N₂₀-gttttagagctagaa-3’

其中，序列最前面的为保护碱基及BsaI识别序列，后面接任意一碱基，然后是第9-20位的spacer序列，最后的15bp序列与sgRNA scaffold的5’序列配对。

相应的反向引物Gene1-gR[x]-R为：

5’-cg-GGTCTC-N-N₁₂N₁₁N₁₀N₉ N₈N₇N₆N₅N₄N₃N₂N₁-tgcaccagccggg-3’

其中，序列最前面的为保护碱基及BsaI识别序列，后面接任意一碱基，然后斜体的N应为spacer的反向互补序列，最后的13bp序列是tRNA的3’序列。

2、sgRNA表达盒的扩增

抽穗期基因编码区敲除sgRNA表达盒的扩增体系(10μL)为：前后引物(100μM)分别1μL，8μL ddH₂0。PCR扩增程序为：95℃5min；常温条件下退火。

抽穗期基因启动子区sgRNA表达盒的扩增方法如下：以pUC57-sgRNA-tRNA质粒为模板，sgRNA-tRNA序列如SEQ ID NO.17所示，用高保真KOD酶将sgRNA表达盒扩增。其扩增体系如下表1所示：

表1扩增体系

PCR扩增程序：94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃1min，34个扩增循环；68℃10min，4℃10min。

电泳检测后割胶回收，采用AXYGEN DNA凝胶回收试剂盒和离心法分离提纯目的片段。利用NanoDrop 2000核酸蛋白测定仪检测回收目的片段浓度。

3、sgRNA表达盒与载体重组

利用Golden Gate方法将抽穗期基因启动子区sgRNA表达盒组装到pCRISPR-zero载体。其反应体系如下：

混合均匀，短暂离心。在PCR仪上进行酶切连接30个循环:37℃5min；16℃5min；最后60℃5min。

本研究改造的pCRISPR-zero载体，通过Bsal酶切位点将八个启动子编辑靶序列导入载体中，串联完成的target-sgRNA-tRNA序列如SEQ ID NO.18所示，其示意图如图2所示。

4、大肠杆菌感受态的转化

将连接产物用热激法转化大肠杆菌感受态(DH5α)。其基本步骤如下：

(1)取10μL连接产物转入50μL大肠杆菌感受态细胞DH5α中，依次冰浴30min，42℃热激60s，置于冰上2min以终止热激反应。

(2)于超净工作台加入800μL无抗生素的LB液体培养基，放置摇床(设置程序：37℃，250rmp)中复苏1h左右。

(3)将菌液均匀涂布在含有卡那抗性的LB固体培养基中，用封口膜封好平板后倒放置于37℃培养箱过夜培养。

(4)长出菌落后，于超净工作台挑取单克隆进行PCR鉴定和测序检测。

实施例2遗传转化

1、农杆菌感受态的转化

将质粒转化农杆菌感受态(EHA105)。其基本步骤如下：

(1)取1μg质粒加入50μL农杆菌EHA105中，依次序液氮5min，37℃水浴5min，冰浴5min。

(2)加入800μL无抗生素的LB液体培养基，放置摇床(程序设置：28℃，250rmp)中复苏3h左右。

(3)将菌液均匀涂布于含有卡那和利福平抗性的LB固体培养基中，用封口膜封好平板后倒放置于28℃培养箱培养2天左右。

(4)长出菌落后，挑取单克隆进行PCR鉴定。

2、农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤诱导与继代

挑选成熟水稻种子，剥离颖壳，倒入50ml离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，倒掉，再加入30％次氯酸钠消毒20min，倒掉次氯酸钠后用无菌水冲洗5-6遍。移液枪吸去多余的水份(可用灭菌过的滤纸吸干)，将种子转移到诱导培养基上，每皿20-25颗种子。

愈伤长出后可用原胚直接做转化，原胚旁边长出的小颗粒可挑取到新的诱导培养基上进行继代培养，长到适宜的大小时同样可以进行转化。

(2)农杆菌侵染

准备AAM侵染液，加入AS(1000倍稀释)，挑取足够量的愈伤，要求愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右为宜，用移液器吸取AAM将平板上的农杆菌冲洗下来，调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。

挑选足够数量的愈伤组织(愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右为宜)，放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温放置20min,并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3d。

(3)选择培养

共培养3天后的愈伤组织要进行清洗步骤，用1ml的蓝枪头将共培养基上的愈伤播到已灭菌的三角瓶中加入无菌水冲洗两边，第三遍用含有500μl/L羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30min左右，待愈伤吹干后转移到筛选培养基上进行筛选培养，培养条件28-30℃，暗培养。筛选时长3-4周。

(4)分化再生

筛选一个月后，可见颜色鲜黄，直径1-2mm的阳性愈伤长出，此时可将阳性愈伤挑取到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗阳性愈伤，置于28-30℃温室中光照培养。一般10天左右可将愈伤冒出绿点，在经过10天左右会有幼苗分化出。

(5)生根培养

等待分化出的幼苗长到2-3cm左右，有明显根系的时候就可以将幼苗转移到生根培养基上让幼苗长大，生根培养基要倒在比较高的瓶子或管子里，生根后的苗子才有足够的空间长高，生根培养条件28-30度，无菌光照培养。

实施例3转基因植株的鉴定(南京)

1、基因型鉴定

T₀和T₁代转基因植株的鉴定：在第一个靶点上游设计引物和第八个靶点下游200bp附近设计扩增引物，提取转基因植株DNA扩增并一代测序，测试每一个靶点的编辑效率。

8P-Hd1-F:AGTCCTCCCAAAACTTACCG

8P-Hd1-R:TATGTGTCGTGTGTGTATGCGT

通过PCR测序发现八个靶点的编辑效率从59％到88％不等。T1代鉴定发现58株T0代转基因家系中有19个家系出现大片段缺失(大于50bp的缺失)。由于部分家系是编辑杂合，这些家系中共鉴定出25种不同编辑方式的大片段缺失，统计发现大片段缺失效率高达43％(图4)。

2、表型鉴定

将T₂代编辑纯合家系播种两行，每行10株调查抽穗期。抽穗期为播种到始穗的天数，以植株第一个穗子的穗尖露出叶鞘1cm为标准。分单株调查，每天固定时间调查一次。通过转基因后代的表型鉴定，筛选不同编辑类型的水稻株系共计34个，不同株系的抽穗期呈现梯度分布(图5)。

3、RT-qPCR检测的表达量

南京长日照条件下播种40天后取样。

(1)植物总RNA的提取及反转录

RNA的提取使用北京天根生化科技公司的植物总RNA提取试剂盒(DP432)。取1μg总量RNA，使用Takara反转录试剂盒(RR036A)反转成20μl cDNA母液，将母液稀释10倍成工作液-20℃保存备用。

(2)Real-time PCR分析

Real-time PCR仪器使用的是ABI 7500荧光定量检测系统(AppliedBiosystems)。试剂是宝生物公司的TB Green Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)预混液。

PCR体系(20μl)：

PCR程序：95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s；至第二步39个循环；65℃至95℃的溶解曲线。每个实验组分别设有三个生物学重复和三个技术性重复。水稻UBQ基因作为内参基因，定量引物如下：

Hd1 Forward Primer：CGTTTCGCCAAGAGATCAG

Hd1 Reverse Primer：AGATAGAGCTGCAGTGGAGAAC

UBQ Forward Primer：GCTCCGTGGCGGTATCAT

UBQ Reverse Primer：CGGCAGTTGACAGCCCTAG

通过对不同抽穗期家系定量分析发现，不同转基因家系中Hd1表达量同样呈现梯度分布和抽穗期基本相符合，表明本专利所述的8个靶点可以有效实现精准的抽穗期的不同时间的延长，对获得抽穗期连续变异的遗传资源，从而扩大优良品种的适宜种植面积具有重要意义。同时结合表型和分子数据得出敲除靶点5和靶点6之间的258-bp是Hd1启动子的核心基序(序列如SEQ ID NO.19所示)，缺失该区域后Hd1几乎完全丧失功能(图6)。

实施例4启动子编辑家系引种评估

为了评估启动子编辑家系的地区适应性，筛选不含外源基因插入且抽穗期连续分布的8个家系在连云港进行了田间试验。通过调查各个家系农艺性状后发现，极早抽家系和极晚抽家系结实率均较低，这可能是由于早抽穗家系在孕穗期受到高温胁迫或晚抽穗家系在灌浆期遭遇寒潮造成的。抽穗期早的株系单株产量随抽穗期延长而增加，抽穗期为109的H20家系在单株产量和小区产量上均表现较理想。抽穗期在H20之后的家系在收获时有许多未成熟的种子，这不仅影响产量，还影响水稻的外观和食用品质。通过引种评估得到H20的产量和品质性能最好，应是最适合连云港的品种(图7)。

实施例5编辑DTH8和Ghd7启动子

与实施例1～4类似的方法，我们同样在抽穗期基因DTH8和Ghd7的启动子上分别设计了8个编辑靶点，其中基因DTH8编辑靶点选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.27；基因Ghd7编辑靶点选自SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.43，基因DTH8启动子区域的编辑靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.35所示；基因Ghd7启动子区域的编辑靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.51所示。结果如图8所示，通过T2代的分子和表型鉴定，同样获得了抽穗期连续变异的品系。

参照该实施例，对于不同地区的品种引入，可以选用相应的抽穗期家系，有效扩大优良品种的适宜种植面积。

Claims

1.一种水稻抽穗期调控的方法，其特征在于，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，利用串联多靶点编辑水稻抽穗期基因的启动子，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抽穗期基因为基因Hd1、基因DTH8或基因Ghd7。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，基因Hd1编辑靶点选自SEQ ID NO.1～SEQID NO.8任意一个或多个；基因DTH8编辑靶点选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.27任意一个或多个；基因Ghd7编辑靶点选自SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.43任意一个或多个。

4.一种培育不同抽穗期水稻品系的方法，其特征在于，基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，利用串联多靶点编辑水稻抽穗期基因的启动子，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系。

5.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述抽穗期基因为基因Hd1、基因DTH8或基因Ghd7。

6.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，基因Hd1编辑靶点选自SEQ ID NO.1～SEQID NO.8任意一个或多个；基因DTH8编辑靶点选自SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.27任意一个或多个；基因Ghd7编辑靶点选自SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.43任意一个或多个。

7.基因Hd1启动子区域的编辑靶序列，其特征在于，所述靶序列分别如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。

8.基因DTH8启动子区域的编辑靶序列，其特征在于，所述靶序列分别如SEQ ID NO.20～SEQ ID NO.27所示。

9.基因Ghd7动子区域的编辑靶序列，其特征在于，所述靶序列分别如SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.43所示。

10.针对权利要求7～9所述的编辑靶序列的sgRNA。

11.根据权利要求10所述的所述sgRNA，其特征在于，基因Hd1启动子区域的编辑靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示；基因DTH8启动子区域的编辑靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.28～SEQ ID NO.35所示；基因Ghd7启动子区域的编辑靶序列的sgRNA序列如SEQ ID NO.44～SEQ ID NO.51所示。

12.权利要求10或11所述的sgRNA构建的表达载体。

13.权利要求7～9所述的编辑靶序列、权利要求10或11所述的sgRNA、权利要求12所述的表达载体在调控水稻抽穗期中的应用；优选的，所述应用为基于CRISPR-Cas9基因编辑技术，利用串联多靶点编辑水稻抽穗期基因的启动子，遗传转化获得抽穗期呈现梯度分布的品系；优选的，所述的水稻为“宁粳8号”。