CN111118035A - 参与调控水稻根系发育的pin9基因及应用 - Google Patents

Abstract

本发明从水稻中分离得到一个参与调控水稻根系发育的PIN9基因，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，CDS核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示，用于PIN9亚细胞定位观察的报告基因GFP的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示，并通过观察PIN9基因编辑功能缺失和过量表达的转基因植株根系生长情况，确定了该基因在调控水稻根系生长发育中的功能。该基因可用于对水稻根系进行精准定向分子遗传改良，并为长远的种质改造和设计储备资源。

Description

参与调控水稻根系发育的PIN9基因及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一个参与调控水稻根系发育的PIN9基因及应用。

背景技术

近年来，水稻基因组测序的完成，我国适时启动了水稻功能基因组研究，水稻分子遗传学和基因组学研究取得了重大的突破，水稻功能基因组研究已经走在世界前列。在当今以贯彻绿色发展理念，发展资源节约型、环境友好型的农业生产体系的背景下，开展提高水稻重要农艺性状的分子网络的研究，使水稻改良育种由过去的以机遇性为主发展为设计性育种，大大提高了水稻遗传改良的目的性和针对性。

根是水稻重要的营养器官，水稻的耐旱、耐涝、耐盐碱、耐瘠能力以及地上株型、育性差异都与其根系的生长状况和生长活力密切相关。通过改良根系形态和生理性状以提高品种本身对水分和肥料的利用率，将大大减少人力和物力资源的浪费，并能减少因大量化学肥料和农药流失对环境造成的污染。水稻根系遗传发育调控机制研究也取得引人注目的进展，一批调控根系发育功能基因得到发掘和克隆，如Crown rootless1(CRL1)、Adventitious rootless1(ARL1)、WOX11、CRL5、ERF3，Osgnom1/CRL4，CRL6等，但是我国具有自主知识产权的根系发育调控基因并不多。因此，研究水稻根系发育机制，发掘我国具有自主知识产权的水稻根系发育调控优良基因，对开展水稻根系进行分子遗传改良，提高我国农作物育种的国际竞争力，对我国持续、高效的绿色农业具有重要意义。

本发明通过分子生物学、细胞生物学等手段对PIN9基因在调控根发育中的功能进行了深入的研究，揭示了其在水稻根生长发育中的重要作用，以期用于对植物根系进行分子改良。

发明内容

本发明克隆了一个水稻膜定位基因PIN9，通过观察PIN9基因编辑功能缺失和过量表达的转基因植株根系生长情况，确定了该基因在调控水稻根系生长发育中的功能。该基因可用于调控植物根系生长发育，植株形态设计、抵御外来的生物与非生物胁迫等，可用于精准定向分子遗传改良育种和设计储备资源。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

本发明从水稻中分离得到一个与水稻根系发育相关的膜蛋白基因PIN9(LOC_Os01g58860)，其基因组核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，序列长度为2797bp。

所述PIN9基因的编码区(CDS)核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，序列长度为1281bp，编码427个氨基酸。

根据水稻公共数据库Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu)，以序列表SEQ ID NO:1为参考基因序列，构建了PIN9基因敲除载体CRISPR-PIN9。

选取PIN9基因起始密码子前2000个核苷酸(如序列表SEQ ID NO:3所示)融合GUS报告基因，构建了启动子融合载体DX-PIN9。

为了确定该基因在细胞的表达部位，利用PIN9编码区(序列表SEQ ID NO:2)进一步构建了PIN9蛋白N端融合GFP-PIN9亚细胞定位载体。之后将载体CRISPR-PIN9和DX-PIN9，将该转化载体转化到水稻品种“中花11”，得到该基因的基因敲除和启动子融合的转基因阳性水稻植株。表型观察统计分析后发现，该基因敲除转基因水稻植株种子根长显著减短、侧根和冠根数目显著减少(图4)。根茎交界处石蜡切片表明，PIN9基因敲除转基因水稻冠根发生减少。实时定量PCR结果指示，CRISPR-PIN9转基因植株根系中OsORC3、OsCML16、ERF3、DRO1、OsYUC7、OsPIN5a、OsABCB14等一系列根系发育相关基因表达量发生显著变化(图5)。PIN9基因表达模式分析表明，该基因在根、根茎交界处、茎节、茎秆、叶片和穗中均有表达，但在根、茎、叶片和穗中表达较高。启动子GUS融合转基因植株染色结果表明，PIN9在水稻根系伸长区、中柱、侧根等部位表达(图6)。这些指示，PIN9在水稻根系发育中发挥了重要的调控作用。通过不同的激素处理野生型水稻植株，检测该基因的表达情况，发现该基因受6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、激动素(KT)的诱导(图7)。农杆菌介导的洋葱细胞亚细胞定位观察显示，PIN9是一个细胞膜定位蛋白(图8)。

具体操作步骤如下：

(1)根据水稻公共数据库Rice Genome Annotation Project，以序列表SEQ IDNO:1为参考基因组，设计CRISPR靶点，利用华南农业大学刘耀光院士赠送基因编辑载体及说明(Ma X et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.MOLECULAR PLANT,2015,8(8):1274-1284)，构建CRISPR-PIN9。使用引物分别为：

SgRNA1-F:GCCGGAGGTGTACCAGGTGGTGG

SgRNA1-R:AAACCCACCACCTGGTACACCTC

SgRNA2-F:GGCACGGCGGCGGCGCTGGGGTA

SgRNA2-R:AAACTACCCCAGCGCCGCCGCCG

所述的PIN9的基因组核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

(2)利用Rice Genome Annotation Project，以序列表SEQ ID NO:3所得的1-2000核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上Hind111和SalI的酶切位点，以水稻品种“中花11”样品为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到PIN9基因启动子片段。将目标PCR片段纯化后，经过Hind111和SalI限制性内切酶酶切后，连接DX2181载体，构建DX-PIN9。

使用引物分别为：

DX-F:GAAAGCTTACGCACTTGCTAGATAGGCAGAAT

DX-R:TATGTCGACCTTTGCCCTAACTTAGCTACT

所述的膜定位基因PIN9的启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

(3)利用农杆菌介导的转基因方法(Hiei et al.,1994.Efficienttransformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequenceanalysis of the boundaries of the T-DNA.Plant J.6:271-282)将所述的载体分别导入水稻受体中花11，获得转化植株CRISPR-PIN9和DX-PIN9。

(4)PIN9亚细胞定位载体构建经过两步完成。①pU1301-PIN9的构建。以序列表SEQID NO:2所得的1-1281核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上kpnI和BamI的酶切位点，以水稻品种“中花11”样品为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到PIN9基因cDNA片段。将目标PCR片段纯化后，经过kpnI和BamI限制性内切酶酶切后，连接PU1301载体，构建pU1301-PIN9。②GFP连接pU1301-PIN9载体。利用序列表SEQ ID NO:4所得的1-717核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端均加上KpnI的酶切位点，以pm999-GFP质粒为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到GFP基因编码区序列。将目标PCR片段纯化后，经过KpnI限制性内切酶酶切后，连接到pU1301-PIN9载体，构建亚细胞定位载体GFP-PIN9。利用农杆菌介导转化方法，将GFP-PIN9转入洋葱表皮细胞，通过荧光显微镜(Axio Scope A1，ZEISS，Germany)观察PIN9在细胞中的定位(Sun W,et al.Asimple and effective method for protein subcellular localizationusingAgrobacterium-mediated transformation of onion epidermal cells.Biologia,2007,62(5):529-532.)。

使用引物分别为：

PU1301-F:ATTGGTACCATGATTACGGGTTCGGAGGTG

PU1301-R:ATTGGATCCTCACAGCCCCAACAGAATATAG

GFP-F:ATTGGTACCATGGGCAAAGGAGAAGAACT

GFP-R:ATTGGTACCTTTGTATAGTTCATCCATG

所述的PIN9基因的CDS核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

(5)GUS染色：收获DX-PIN9转基因植株T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿(13cm×13cm)上28℃培养箱(16h/8h)垂直培养6天，然后取根系和根茎交界处放入GUS染液(Gong et al.SEUSS integrates gibberellin signaling withtranscriptional inputs from the SHR-SCR-SCL3 module toregulate middle cortexformation in the arabidopsis root.Plant Physiology,2016,170(3):1675-1683)，抽真空，37℃孵育16小时，酒精脱去非特异染色，使用体式显微镜(S8AP0，Leica，德国)观察并拍照。

(6)实时定量PCR：分别取野生型和CRISPR-PIN9水稻根系及根茎交接处RNA，利用英俊公司Trizol抽提试剂盒提取RNA，经过反转录后，利用罗氏实时定量PCR仪检测相关基因表达量变化。

使用引物分别为：

qPIN9-F:TTCTTCAGGGACGTTCATAGC

qPIN9-R:CGGGCCTATCAGAAACTTGAT

qOsORC3-F:CAGTGTGAGGATCACAAAGGATAAG

qOsORC3-R:GAAAAGGTAAACACTCAACAGAGACC

qOsCML16-F:CTGACAAGGCCAAGACGGAG

qOsCML16-R:CGGCGCTGCTAATTACACAT

qERF3-F:TGCACGTCCAGCAACGCATC

qERF3-R:TGCCGCCTTGTTCGCCGTA

qDRO1-F:GCAAGAAGCAAATCGGTTTCC

qDRO1-R:GAATTCATCCTTTCGACAATCTGA

qOsYUC7-F:CACTGCTGTGTCCTACAATATCAC

qOsYUC7-R:GGAGGTGCATCTCCGTCATCTTC

qOsPIN5a-F:TGGCGGATCTTCACGAGG

qOsPIN5a-R:CCGACGACAAGCGAGTTG

qOsABCB14-F:CAGAAACCGTGACTTCCGTGG

qOsABCB14-R:TAACCCTTAGGTGCTGGGTAC

Ubiquitin1-F:AACCAGCTGAGGCCCAAGA

Ubiquitin1-R:ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：

本发明通过分析PIN9基因敲除转基因水稻种子根减短、冠根和侧根数目变少，并且影响到许多已知调控根系发育的基因，如ERF3，OsORC3，OsCML16，DRO1等基因表达，启动子融合GUS报告基因和定量PCR结果表明PIN9基因在根茎交接处(冠根发生处)、根系中柱和伸长区等部位表达，同时，受6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ET)、激动素(KT)等激素诱导表达，该基因在调控水稻种子根、冠根和侧根发育方面具有重要的功能。这表明PIN9基因参与了水稻根系发育的调控，PIN9基因可以用于对水稻根系进行精准定向分子遗传改良，并为长远的种质改造和设计储备资源。

附图说明

图1为CRISPR/gRNA相关载体示意图，其中图1A为pYLgRNA-OsU3/OsU6a载体；图1B为表达载体pYLCRISPR/Cas9-MH示意图。

图2为PIN9启动子融合GUS报告基因载体的示意图，其中图2A为表达载体质粒DX2181；图2B为本发明构建的DX-PIN载体图。

图3为亚细胞定位载体pU1301及GFP-PIN9的示意图，其中图3A为表达载体质粒pU1301载体示意图，图3B为本发明构建的GFP-PIN9载体图。

图4为PIN9基因敲除转基因植株根系表型分析，其中图4A为28℃条件下，1/2MS培养基中生长5天的PIN9基因敲除植株CR1-3，CR4-8和对照WT的根系生长图，标尺为1厘米；图4B为28℃条件下，1/2MS培养基中生长5天的PIN9基因敲除植株CR1-3，CR4-8和对照WT根茎交接处切片分析，箭头表示冠根或冠根原基，标尺为100微米；图4C为gRNA编辑PIN9基因结构示意图；图4D为28℃条件下，1/2MS培养基中生长5天的PIN9基因敲除植株种子根长度统计，WT代表阴性对照，CR1-3、CR4-8分别代表不同基因编辑转基因阳性植株；图4E为28℃条件下，1/2MS培养基中生长5天的PIN9基因敲除植株冠根数目统计，WT代表阴性对照，CR1-3、CR4-8分别代表不同基因编辑转基因阳性植株；

图4F为28℃条件下，1/2MS培养基中生长5天的PIN9基因敲除植株侧根数目统计，WT代表阴性对照，CR1-3、CR4-8代表不同基因编辑转基因阳性植株。

图5为荧光定量PCR检测根系发育相关基因在生长5天的PIN9基因敲除植株根系的表达情况，CR1-3、CR4-8代表不同基因编辑转基因阳性植株，Ubiqutin1基因作为内参基因，野生型植株WT表达量设为1。

图6为PIN9基因表达谱及DX-PIN9转基因启动子融合GUS表达位置分析，其中图6A为PIN9融合GUS报告基因在根茎交接处、侧根和根尖表达；图6B为PIN9在根(Root)、根茎交接处(Stem base)、茎(Stem)、茎节(Internode)、叶(Le)和幼穗(Panical)中表达量水平检测，Ubiqutin1基因作为内参基因，PIN9在根系中表达量设为1。

图7为野生型水稻植株经6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ET)、赤霉素(GA3)、激动素(KT)、脱落酸(ABA)处理后，PIN9基因在根系中表达水平检测，Ubiqutin1基因作为内参基因，经过Mock处理的PIN9基因在水稻植株根系中表达量设为1。

图8为GFP-PIN9在质壁分离的洋葱表皮细胞中的定位观察，其中图8A-C为GFP对照载体在洋葱表皮细胞；8D-F为GFP–PIN在洋葱表皮细胞定位；8A，8D为GFP荧光在洋葱表皮细胞分布图，8B，8E为明场下洋葱表皮观察图，8C，8F为GFP荧光与明场融合图，图中标尺均为50微米。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图及本发明的优选实施例进行详细描述。

实施例1：PIN9 CRISPR-Cas9基因编辑载体构建

(1)根据水稻公共数据库Rice Genome Annotation Project，以序列表SEQ IDNO:1为参考基因组，设计CRISPR靶点，利用华南农业大学刘耀光院士赠送基因编辑载体及说明(Ma X et al.A Robust CRISPR/Cas9 System for Convenient,High-EfficiencyMultiplex Genome Editing in Monocot and Dicot Plants.MOLECULAR PLANT,2015,8(8):1274-1284)，构建CRISPR-PIN9。具体方法如下：

(a)靶点接头制备：将接头引物TE溶解成100μM母液，各取1μl加入到98μl去离子水中混合稀释到1μM。约90℃、30s，移至室温冷却完成退火。接头制备使用如下引物：

U3-F:GCCGGAGGTGTACCAGGTGGTGG

U3-R:AAACCCACCACCTGGTACACCTC

U6a-F:GGCACGGCGGCGGCGCTGGGGTA

U6a-R:AAACTACCCCAGCGCCGCCGCCG

(b)边切边连法方法：在1x Bsa I-内切酶Buffer中加入ATP至终浓度0.5～1.0mM，加入约20ng pYLgRNA-OsU3/OsU6a质粒，0.5μl接头，5U BsaI，35U T4 DNA ligase，0.2μl10x NEB T4 DNA ligase buffer。37℃、5min，20℃、5min，变温仪循环反应5循环。

(c)扩增gRNA表达盒：第一轮扩增(每个gRNA表达盒2个PCR反应，各15μl)：取1μl连接产物为模板，使用引物U-F/接头反向引物(反应1)，和接头正向引物/gRNA-R(反应2)，各0.2μM，2xBuffer for KODFX，KODFX 7.5μl，2mM dNTP 3μl。PCR反应条件如下：①95℃、10min，预变性，②95℃、10s，变性，③60℃、15s，④68℃、20s退火及延伸，⑤从②－④重复28次，循环扩增，⑥68℃、7min，保温，⑦4℃保存。引物如下：

U-F:CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG

gRNA-R:CGGAGGAAAATTCCATCCAC

第二轮扩增：取第一轮PCR反应1，2产物1μl用H₂O稀释10倍，各取1μl混合为模板。各表达盒30μl PCR。引物分别为B1’+B2；B2’+BL，最终浓度0.15μM；2xBuffer for KODFX，KODFX 7.5μl，2mM dNTP 3μl。PCR反应条件如下：①95℃、10min，预变性，②95℃、10s，变性，③58℃、15s，④68℃、20s退火及延伸，⑤从②－④重复20次，循环扩增，⑥68℃、7min，保温，⑦4℃保存。预先将位置特异引物对混合成10x工作液，每种1.5μM:B1’+B2；B2’+BL。引物如下：

B1’:TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG

B2:AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC

B2’:TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG

BL:AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC

(d)上述PCR产物取约20-70ng产物，加入约60-80ng未切割的pYLCRISPR/Cas9-MH质粒(100ng/μL)，15μl反应体系，1x Bsa I-内切酶Buffer，10U BsaI，0.5μl 10x NEBT4DNA ligase buffer和35U NEB T4 DNA ligase。37℃、2min；10℃、3min，20℃、5min，变温仪循环反应5循环，最后37℃、2min。

(2)电转化的方法(电转化仪为Eppendorf公司产品，所用电压为1800V，操作方法见该仪器说明书)，将连接产物转到大肠杆菌DH10β感受态中(购自普洛麦格生物技术有限公司，即美国Promega公司)，在含有250ppm卡那霉素(购自罗氏生物公司产品)的LA(LA配方参见J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)抗性培养基上涂皿培养；菌落的培养：将LA抗性培养基上长出的单菌落在超净工作台接种于灭菌的10ml离心管，管内预先加入3ml含250ppm卡那霉素的LB抗性培养基，然后在37℃摇床上培养16-18小时。按照J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔著，黄培堂等译，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002版报道的方法抽提质粒，相应限制性内切酶酶切并电泳检测，并挑取大小正确克隆测序验证。将测序正确的克隆电转化农杆菌，利用农杆菌介导的转基因方法(Wu et al.,2003.Development of enhancer trap linesfor functional analysis of the rice genome.Plant J.35:418–427)将上述的表达载体遗传转化载体导入水稻粳稻受体品种中花11(ZH11)，获得转基因植株CRISPR-PIN9，然后通过PCR对这些转基因植株根系鉴定。

(3)取T0代突变体植株叶片抽提总DNA，DNA抽提方法为CTAB法(Zhang等，geneticdiversity and differentiation of indica an japonica rice detected by RFLPanalysis,1992,Theor Appl Genet,83,495-499)。以叶片总DNA为模板，用基因组引物PINCRD-F和PINCRD-R检测转基因阳性植株。引物的序列如下：

PINCRD-F:ATGATTACGGGTTCGGAGGTG

PINCRD-R:CATGAGGCCCAGCAGCAGCAC

以上引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR反应总体积为20μl，具体配法是：模板100ng，10xPCR buffer 2μl，10mMdNTP1.6μl，2.5mM Mg2+1.5μl，左、右引物(PINCRD-F和和PINCRD-R)各0.4μl，r-Taq酶0.2μl,加去离子水到20μl(所用到的PCR buffer、dNTP、Mg2+、r-Taq酶等均购自宝生物工程大连有限公司)。PCR反应条件如下：①94℃、4min，②94℃、30s，③55℃、30s，④72℃、30s，⑤从②－④循环32次，⑥72℃、7min，⑦4℃保存。PCR产物在1％(质量/体积)的TBE琼脂糖凝胶上电泳检测。基因编辑阳性植株目标条带存在删除60bp，可以根据扩增的特异条带大小判断转基因植株是否为阳性植株。

收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿(13cm x 13cm)上28℃培养箱(16h/8h)垂直培养5天，根系表型如附图4A所示。

实施例2：PIN9融合GUS报告基因转基因植株表达模式分析

实施例2与实施例1基本相同，其不同之处在于，利用Rice Genome AnnotationProject，以序列表SEQ ID NO:2所得的1-2000核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上Hind111和SalI的酶切位点，以水稻品种“中花11”样品为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到PIN9基因启动子片段。将目标PCR片段纯化后，经过Hind111和SalI限制性内切酶酶切后，连接DX2181载体，构建DX-PIN9。完成农杆菌侵染后，转基因植株分化成苗后，T0代阳性转基因植株的检测，通过对转基因植株根系进行GUS染色观察确定。载体构建使用引物分别为：

DX-F:GAAAGCTTACGCACTTGCTAGATAGGCAGAAT

DX-R:TATGTCGACCTTTGCCCTAACTTAGCTACT

收获T0代阳性转基因种子之后，将其种植于1/2MS培养基的平皿(13cm×13cm)上28℃培养箱(16h/8h)垂直培养6天，取根茎交际处和根系部分放入GUS染液，抽真空，37℃孵育16小时，酒精脱去非特异染色，使用微分干涉显微镜(Ni-U，尼康，日本)观察并拍照。PIN9在根系中的表达模式如附图4A所示。

实施例3：PIN9亚细胞定位载体构建及洋葱表皮细胞观察

(1)实施例3与实施例1基本相同，其不同之处在于，①pU1301-PIN9的构建。以序列表SEQ ID NO:2所得的1-1281核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端加上kpnI和BamI的酶切位点，以水稻品种“中花11”样品为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到PIN9基因cDNA片段。将目标PCR片段纯化后，经过kpnI和BamI限制性内切酶酶切后，连接PU1301载体，构建pU1301-PIN9。②GFP连接pU1301-PIN9载体。利用序列表SEQ IDNO:4所得的1-717核苷酸序列为模板序列，设计适于构建表达载体的引物并在引物两端均加上KpnI的酶切位点，以pm999-GFP质粒为模板DNA，通过PCR的方法扩增得到GFP基因编码区序列。将目标PCR片段纯化后，经过KpnI限制性内切酶酶切后，连接到pU1301-PIN9载体，构建亚细胞定位载体GFP-PIN9。载体构建使用引物分别为：

PU1301-F:ATTGGTACCATGATTACGGGTTCGGAGGTG

PU1301-R:ATTGGATCCTCACAGCCCCAACAGAATATAG

GFP-F:ATTGGTACCATGGGCAAAGGAGAAGAACT

GFP-R:ATTGGTACCTTTGTATAGTTCATCCATG

(2)农杆菌侵染洋葱表皮细胞及显微镜观察(参考Sun W,et al.A simple andeffective method for protein subcellular localization usingAgrobacterium-mediated transformation of onion epidermal cells.Biologia,2007,62(5):529-532)：

预处理：选取洋葱第3～4层鳞片，用75％乙醇浸泡10min，无菌水冲洗3～4次，在内表皮用刀划出1cm²的方块，用镊子将方块撕下，贴近叶肉的一面朝下，平铺于1/2MS固体培养基中，28℃暗培养24h。侵染过程：(a)将构建好的克隆从平板上挑取单菌落于1ml加抗生素的液体LB培养基中，28℃，200rpm，摇16～24h。(b)1:100接菌量接种菌液于50ml加抗生素的液体LB培养基中，并向其中加入10μl 100mM AS，28℃，200rpm，摇4～6h，至OD₆₀₀＝0.6(0.5～0.7)。(c)用50ml管子收集菌体，常温，5000g，离心15min。(d)倒上清，配制混合液，现配现用：在1/2MS液体培养基中加入50μl 100mM AS使其终浓度为100μm和500μl 1M MgCL₂使其终浓度为10mM，定容至50ml，使用混合液重悬菌体，至OD₆₀₀为0.6左右。(e)混合液静置3～4小时。(f)将预处理的洋葱表皮浸入农杆菌液中20～30min，滤纸吸干表面菌液，转入1/2MS固体培养基中，25℃暗培养2天。(g)取出洋葱表皮，用干净的1/2MS液体培养基洗涤，放入30％蔗糖溶液中10min，进行质壁分离，然后压片，通过荧光显微镜(Axio Scope A1，ZEISS，Germany)观察到PIN9在细胞膜中定位(如附图8所示)。

实施例4：PIN9基因表达模式分析

利用Rice Genome Annotation Project，通过RT-PCR的方法获得全长cDNA(方法参见：J.萨姆布鲁克，EF弗里奇，T曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，北京，科学出版社，2002版)，获得PIN9编码区序列(序列表SEQ ID NO：2)。具体操作步骤如下：

(1)使用液氮取样水稻品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)生长5天的根系和根茎交界处，成熟期植株的茎节、茎秆、叶片和幼穗，用Invitrogen公司的Trizol抽提试剂盒(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)抽提RNA。

(2)RT-PCR反转录合成cDNA第一链的步骤如下：①配制混合液1：总RNA 4μg，DNaseI 2U,10xDNaseI buffer 1μl，加DEPC(焦碳酸二乙酯，RNA酶的强烈抑制剂)处理水(0.01％DEPC)到10μl，混匀后将混合液1在37℃放置20分钟以除去DNA，②20分钟后将混合液1置于65℃水浴中温浴10分钟以去除DNAse I活性，然后置于冰上5分钟，③向混合液1中加入1μl 500μg/ml的oligo(dT)，④将在冰上冷却的混合液1立即置于65℃水浴中温浴10分钟，以彻底使RNA变性，然后置于冰上5分钟，⑤配制混合液2：混合液110μl，5x firststrand buffer 4μl，0.1M DTT(巯基乙醇)2μl，10mM dNTP mixture 1.5μl，DEPC处理水0.5μl，反转录酶2μl，混匀后将混合液2置于42℃水浴锅内温浴1.5小时，⑥反应结束后将混合液2置于90℃干浴10分钟，⑦-20℃保存反应最终产物，反应中用到的试剂全部购自Invitrogen公司。

(3)根据PIN9编码区序列(SEQ ID NO:2)，设计引物PCR扩增片段。定量PCR用到的体系为10μl，具体配法为：cDNA第一链模板2μl，2xSYBR buffer 5μl，正向引物F和反向引物R各0.2μl，加水至10μl(所用到的2xSYBR buffer购自罗氏公司)。PCR反应条件如下：①95℃、10min，②95℃、15s，③60℃、60s，④从②－④循环45次。结果使用ΔΔT法分析，如附图6B所示。PIN9表达水平检测引物为：

qPIN9-F:TTCTTCAGGGACGTTCATAGC

qPIN9-R:CGGGCCTATCAGAAACTTGAT

实施例5：根系发育调控基因在PIN9-CRISPR植株根系中的表达水平分析

实施例5与实施例4基本相同，其不同之处在于，样品取样使用液氮取样水稻生长5天的PIN9-CRISPR阳性植株根系，反转录后，使用如下引物，进行定量PCR。结果如附图5所示。引物如下：

qOsORC3-F:CAGTGTGAGGATCACAAAGGATAAG

qOsORC3-R:GAAAAGGTAAACACTCAACAGAGACC

qOsCML16-F:CTGACAAGGCCAAGACGGAG

qOsCML16-R:CGGCGCTGCTAATTACACAT

qERF3-F:TGCACGTCCAGCAACGCATC

qERF3-R:TGCCGCCTTGTTCGCCGTA

qDRO1-F:GCAAGAAGCAAATCGGTTTCC

qDRO1-R:GAATTCATCCTTTCGACAATCTGA

qOsYUC7-F:CACTGCTGTGTCCTACAATATCAC

qOsYUC7-R:GGAGGTGCATCTCCGTCATCTTC

qOsPIN5a-F:TGGCGGATCTTCACGAGG

qOsPIN5a-R:CCGACGACAAGCGAGTTG

qOsABCB14-F:CAGAAACCGTGACTTCCGTGG

qOsABCB14-R:TAACCCTTAGGTGCTGGGTAC

Ubiquitin1-F:AACCAGCTGAGGCCCAAGA

Ubiquitin1-R:ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA

实施例6：PIN9基因受激素调控情况分析

实施例6与实施例4基本相同，其不同之处在于，水稻品种“中花11”(中国农业科学院作物科学研究所)生长4天的植株，移苗至含有不同激素的1/2MS培养基上生长24小时。10μM 6-BA、10μMACC、10μM GA3、10μMKT、10μM ABA处理24小时后，根系使用液氮取样。抽提RNA，反转录后，使用qPIN9引物，进行定量PCR。结果如附图7所示。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 信阳师范学院

<120> 参与调控水稻根系发育的PIN9基因及应用

<141> 2020-02-24

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2797

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

aaactctcac actacaacaa ccacaacaca ctactactag tgagactagt aagcgtcatc 60

acgagatcca ggtttaatag atcgtttaat ctaccaccgt tgatttagaa aggggttgag 120

gggagggtag tagtagctaa gttagggcaa agatgattac gggttcggag gtgtaccagg 180

tggtggaggc gatggcgccg ctgtacacgg cggcggcgct ggggtacggg tcggtgcggt 240

ggctgaaggc gttctccaac gagcagtgcg ccgggatcaa ccacttcgtg gcgctctacg 300

ccgtgccggt gctcatcttc gacatggtgt ccaccaacaa cgtgtacaag atgaacggcc 360

gcctcatcgc cgccgacacg ctgcagaagg ccgtgctgct gctgggcctc atggcgtggg 420

cgctctggga gcggtcgcgc gcgcgcggcg ccggggccaa ggccaaggcg gcggtgtcgt 480

cgccgctgca gtgggtcatc acctgcttct ccgtcgcgtc gctgcccaac accatcatca 540

tgggcgtccc gctcctcaac ggcatgtacg ggcccgtgtc caaggacctc atgaagcaga 600

tcgtcgtcat gcagttctgc atctggtaca acgtcatcat cttcctctac gagtacatgg 660

cggcgcgtag atcggcctcg gcgccgccgc cggcgtcgtc ggagggcagc gccaagatca 720

gcccttcgtc gccggtgaaa gctgctgcgg cggcggcgga cacaaacggc aatgctgtcg 780

cggccgaccg gccgcaagaa gtggcggtga acatcgaaat cacggagatg gcggcgtcca 840

cggcacgaga cggcgtgtcc ggcgagacga cggcggccgc caaggaggtg agctctggtg 900

aagttgctcc ggtggaagag gaggaggcgt ctgcgccagc gccgtcgatg aagcacgtca 960

tctggatggc ggtgaagaag ctgctacaga ttccgaatac ctatgcaagc ttccttggcc 1020

tcatctggtc tctaatcgca ttcaagtacg tctttttcat ccatgtctcg tactactacc 1080

aactacactt agcaacatct ctcacgtgta cgtactgtac cgtactatct ctgtccggaa 1140

ttgttctatt ttagttctcc cctgcagtca caaaaaaaaa aattgaaatc cctcttttta 1200

atggacatgc acttgtgtgt tttgcaggtg tggattctcg atgccaaaaa tcgtcgagga 1260

ctctctgttc accattcgta ccaccgctgt aggcctaagc atgttttctt caggttagta 1320

cgacgacatg acgtattgac atctccgttt acatttggaa ctgttggact tcaaccgtgg 1380

gcctgcttcc tccaaagagg agattattac ctcgtcatct gctaatgtaa ttaagcgtga 1440

tttttttttg cgtttctgca gggacgttca tagcgcggca gtcgcggttc gtgccgtgcg 1500

gatacaagat agcgtcgttc tccatggtca tcaagtttct gataggcccg gttgtgatgc 1560

tgttcgcctc gctcgtcatc ggcatgcacg gcacacttct gcacatcgct gttgtgcagg 1620

tgagatcaca cgagcagttt acacatcacc gacttatcaa aaaagtttac acatcacctt 1680

gtgcacattt ctgcccatta aaattaagtg gacagaaatt atacacatga attccaaatt 1740

cgacatgaaa aaaaaaacat aacgcaaata tgcttcaaag tgaggacgcc tacgcgaaaa 1800

agggttattt tttcttgacg gattgtccta gccgccattt cagttgcaga taacggaaaa 1860

tggcatagtg aaagatgatt gttcacgctt gtagaagtga ggagacgtac gtccaagaag 1920

gaaaagttag ttgcaaagct gtacttcctc cattttaaaa tatagcagac ggagggagta 1980

gtattcatgt agagtagtac tttctagttt gatgtgatca attaatacga gtagtaacac 2040

aatttcagaa atctagccaa cttattttgg ttggagtaca ggagtatttc ggcaccctcg 2100

tttgatgtga tcaattaata cgagtagtaa cacaatttaa gaaatctagc caacttattt 2160

tggttggagt acaggagtat ttctctgacc acaatttttc acatgcatgc aggcggctct 2220

ccccctggca gtgacatcat ttgtgtacgc tgaagagtac aaggtccacg cagacatcat 2280

gagcacaggg tttgtttctt aaccaaatac tgttaaggtt cagaagtatt tcaattctct 2340

tctgattaat gcaagtgccc atctgactga tcattttgga tttctttttg tgccttgcag 2400

ggttattctt gggatattta tatcacttcc tgtgacaatt gtttactata ttctgttggg 2460

gctgtgagcc tgtgattgag acatctaaat ttagtcgaag gctaattaaa gttgcatgtg 2520

tgctgatgtg catatatgta ggaagacaga atacaaacag taaaaatact gaaggatgac 2580

aacaaggtga attgatttcc ctccggagcc tgaagattgg ggttctggcg agagatacag 2640

tgagatgtga ctgtaatgtt tggtaataat aagatgtcac aaaaacgcgg catatatgct 2700

gaaacttttg caatgtacag caagtataca atgaacaggg cttattacag cccaccagtt 2760

gattcttcga aatttaaaac gtaagcaaac tgagtac 2797

<210> 2

<211> 1281

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atgattacgg gttcggaggt gtaccaggtg gtggaggcga tggcgccgct gtacacggcg 60

gcggcgctgg ggtacgggtc ggtgcggtgg ctgaaggcgt tctccaacga gcagtgcgcc 120

gggatcaacc acttcgtggc gctctacgcc gtgccggtgc tcatcttcga catggtgtcc 180

accaacaacg tgtacaagat gaacggccgc ctcatcgccg ccgacacgct gcagaaggcc 240

gtgctgctgc tgggcctcat ggcgtgggcg ctctgggagc ggtcgcgcgc gcgcggcgcc 300

ggggccaagg ccaaggcggc ggtgtcgtcg ccgctgcagt gggtcatcac ctgcttctcc 360

gtcgcgtcgc tgcccaacac catcatcatg ggcgtcccgc tcctcaacgg catgtacggg 420

cccgtgtcca aggacctcat gaagcagatc gtcgtcatgc agttctgcat ctggtacaac 480

gtcatcatct tcctctacga gtacatggcg gcgcgtagat cggcctcggc gccgccgccg 540

gcgtcgtcgg agggcagcgc caagatcagc ccttcgtcgc cggtgaaagc tgctgcggcg 600

gcggcggaca caaacggcaa tgctgtcgcg gccgaccggc cgcaagaagt ggcggtgaac 660

atcgaaatca cggagatggc ggcgtccacg gcacgagacg gcgtgtccgg cgagacgacg 720

gcggccgcca aggaggtgag ctctggtgaa gttgctccgg tggaagagga ggaggcgtct 780

gcgccagcgc cgtcgatgaa gcacgtcatc tggatggcgg tgaagaagct gctacagatt 840

ccgaatacct atgcaagctt ccttggcctc atctggtctc taatcgcatt caagtgtgga 900

ttctcgatgc caaaaatcgt cgaggactct ctgttcacca ttcgtaccac cgctgtaggc 960

ctaagcatgt tttcttcagg gacgttcata gcgcggcagt cgcggttcgc gccgtgcgga 1020

tacaagatag cgtcgttctc catggtcatc aagtttctga taggcccggt tgtgatgctg 1080

ttcgcctcgc tcgtcatcgg catgcacggc acacttctgc acatcgctgt tgtgcaggcg 1140

gctctccccc tggcagtgac atcatttgtg tacgctgaag agtacaaggt ccacgcagac 1200

atcatgagca caggggttat tcttgggata tttatatcac ttcctgtgac aattgtttac 1260

tatattctgt tggggctgtg a 1281

<210> 3

<211> 2000

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 3

acgcacttgc tagataggca gaatcaataa atcatatgct gcaatgagta gtggcaactg 60

cgaaattcgc acaacctcta gatggtcaga acacacaaaa aaaatggagt attcaagtct 120

ttgcgctgct agcttggtgt gcttttttga agtgcagacc tagcgactag cagcaagtga 180

cgccccaacg cattttcacc actagcagca agcgacgcag cagccaggaa gcagtagaat 240

actcctgtag tgacttttta cagtctcgtt ggacaaaaaa gggagagaaa acagaattga 300

cccaattgag cgaaacgtca tactagcttc ttccagctct tactgggatt aattctggtc 360

gtgacagaaa aactttagtt cagaattaat ttttggtcta acatggcaca gcgagttgca 420

tgcacgcgtg cattgcgacc ttttgaggtc gcacatttgg tgcggttata gtaaaggact 480

cctcctcgtc aaacttggcc gctagctacg gaagcgtaca cgttcacgta cgttcatcgt 540

cgtaacactg tactactaca ttcatatagc taaatcgtcc tgcaaaatta caaccaaaac 600

tgagcaaagc ccatgggaaa atcgctggct agtttttaga tgtgttccca tgcatttcca 660

ttccatgtga ttttcgcgaa gaccatgcga ttcaccactc aacgacggac gacaacacgc 720

gcgtgcatgt ggctacggat caaacgtatg attcatcgga ccatgagctg aaaatacgaa 780

agcaaatact cttacgtaaa agcctaagga cgaacagatt gtcctcctat gacttttttt 840

ccaccacctg gcacttgcta ctgatgatcg atcgatgcac ggtgcacgca tttgtgccta 900

accttccgga caaggattta ggtgaccttc cggacaagga ttttttacac ctaagtactg 960

tggtatccat caattatatg tgactcaaat agttatagaa aaaaattaaa aaaatttagt 1020

agcatcgatt gtgatgatat aagtctatac ataaccatgt atgactaaat ttgatttaca 1080

actagagaaa caaaaataat aaaatcagac agtgaatagt acccatacag cgtagataaa 1140

atttgttgtt tttgtttctt catatgttgt tgatcgaatt tagacttgca tgtttgtata 1200

gtgtcttata ttatcataat ctatcttatc aaattttata aaatttttat ataacttttt 1260

aaattgcatg catacaccta ggtgatgcca tggcacttag gggtagaaaa tacttttgcc 1320

ataataacat gcacgcgcgc ggagcaaaat gcatcgcatt gattatctgt atgcaaaaaa 1380

agggaatcca gccagtgaaa aaattaatct gtagagctgt acgacgtata gctcatcatg 1440

tgtacataca gcagtacagc tagctagcac agcgagagct agccgcgcct gcgctagtgt 1500

ctccagcacc aagacaactc gcgcttttgt tgcgcttgca gatcccaagt ggcgtcagtg 1560

cgtcaccacc attaacgtac gagaaaaact acgattccat ctctgcgtaa tgcgttacat 1620

acatagaaag ggccggccag cttatgcctt tccagtttct ctcctccctg ggacgaaaaa 1680

cctgtctttt tccatgatcc aaaaccatgg acaagaaaaa ccaccggatc gacctggctt 1740

acgaacgaac gctgtgccaa tgtccgcgtc aactcgtaat ctagtactac tagcttgtcc 1800

aagactcgag ccactatata aacacgtcca gttccaagcc aaaaacccaa actctcacac 1860

tacaacaacc acaacacact actactagtg agactagtaa gcgtcatcac gagatccagg 1920

tttaatagat cgtttaatct accaccgttg atttagaaag gggttgaggg gagggtagta 1980

gtagctaagt tagggcaaag 2000

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 4

atgggcaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt 180

gtcactactt tcacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240

cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggagaggac catctctttc 300

aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga caccctcgtc 360

aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420

ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagcta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

Claims (8)

1.一个参与调控水稻根系发育的PIN9基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因，其特征在于，所述基因的编码区CDS核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因，其特征在于，所述基因的启动子核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因，其特征在于，用于PIN9亚细胞定位观察的报告基因GFP的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。

5.权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因的基因工程应用。

6.含有权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因的生物材料，所述生物材料为载体、转基因细胞系、工程菌、宿主细胞。

7.权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因或权利要求6所述的生物材料在遗传育种中的应用。

8.权利要求1所述的参与调控水稻根系发育的PIN9基因或权利要求6所述的生物材料在调控水稻根系发育中的应用。

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