CN115161331B - 水稻根形态建成调控基因clrd1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种水稻根形态建成调控基因CLRD1，其基因组核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还提供水稻根形态建成调控基因CLRD1在调控水稻根系建成中的应用，所述的应用是维持水稻根形态建成调控基因CLRD1正常水平，能促使水稻根形态建成，即，维持种子根伸长生长，促进不定根原基及侧根原基分细胞分裂与分化，促使不定根发生及侧根生长，在植物根系形态建成模式探究及育种实践中具有较大的应用及指导价值。

Description

水稻根形态建成调控基因CLRD1及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，特别涉及一种正向遗传学途径筛选克隆的水稻CLRD1基因，以及利用该基因调控水稻根形态建成。
背景技术
水稻是我国乃至世界重要粮食作物之一，近年来一个重要且新兴的育种目标就是如何进一步提高对水分和养分的吸收利用效率。根是吸收水和养分至关重要的营养器官，根系形态建成直接影响水稻植株的生长及生产，研究调控水稻根形态建成的分子机制可以指导水稻根系构型改良育种，以进一步提高水稻对水和养分的吸收利用效率、保证稳产增产。
水稻具有典型的须根系，不定根及侧根是其根系的主要组成部分，它们的生长发育过程受到复杂遗传因素的严格调控。如编码ASYMMETRIC LEAVES2/LATERAL ORGANBOUNDARIES(LOB)蛋白家族成员的CROWN ROOTLESS1/ADVENTITIOUS ROOTLESS1(CRL1/ARL1)特异的参与不定根发育的调控，其发生突变导致不定根缺失，但对侧根发育影响不大(Inukai et al.,2005；Liu et al.,2005)。而当肽基脯氨酰顺反异构酶编码基因CYCLOPHILIN 2(OsCYP2)发生突变时，严重抑制了水稻侧根的发生，对不定根发育没有影响(Kang et al.,2013)。再如当TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS(TAA)同源蛋白编码基因FISH BONE(FIB)功能缺失能时内源生长素合成异常，进而导致水稻不定根数和侧根数较对照同时显著减少(Yoshikawa et al.,2014)。虽然近年来国内外对植物根系发育已经有大量相关文献报道，但是针对水稻根系形态建成的分子调控机制尚不清楚、调控通路尚不完整，亟待进一步的基因挖掘和功能解析。
研究发现植物Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachmentprotein receptors(SNARE)蛋白广泛参与到细胞分裂和生长、向重力性、激素信号、植物防御反应等生理活动中，对植物的生长发育具有重要作用(Park et al.,2018；Liu et al.,2019；Xia et al.,2019)。然而SNARE蛋白在水稻生长发育过程，特别是在水稻根系发育、根形态建成领域的研究几乎是空白。
目前现有的水稻根形态建成调控基因的研究鲜有报道，OsRAA1(rootarchitecture associated 1)被命名为根形态建成相关基因，其编码一个12千道尔顿的小G蛋白，OsRAA1过表达的转基因水稻主根生长受抑制、中期细胞数增多，而后期细胞数减少，表明OsRAA1通过抑制细胞分裂后期的发生而限制根的生长(Ge et al.,2004；Han et al.,2008)。
参考文献
Ge,L.,Chen,H.,Jiang,J.F.,Zhao,Y.,Xu,M.L.,Xu,Y.Y.,Tan,K.H.,Xu,Z.H.,andChong,K.(2004).Overexpression of OsRAA1 causes pleiotropic phenotypes intransgenic rice plants,including altered leaf,flower,and root development androot response to gravity.Plant Physiology,135:1502-1513.(OsRAA1的过表达导致转基因水稻植物的多效性表型，包括改变的叶、花和根发育以及根对重力的反应。植物生理学，135：1502-1513)。
Han,Y.,Cao,H.,Jiang,J.,Xu,Y.,Du,J.,Wang,X.,Yuan,M.,Wang,Z.,Xu,Z.,andChong,K.(2008).Rice ROOT ARCHITECTURE ASSOCIATED1 binds the proteasomesubunit RPT4 and is degraded in a D-box and proteasome-dependent manner.PlantPhysiology,148:843-855.(水稻ROOT ARCHITECTURE ASSOCIATED1与蛋白酶体亚基RPT4结合，并以D-box和蛋白酶体依赖性方式降解。植物生理学，148：843-855)。
Inukai,Y.,Sakamoto,T.,Ueguchi-Tanaka,M.,Shibata,Y.,Gomi,K.,Umemura,I.,Hasegawa,Y.,Ashikari,M.,Kitano,H.,and Matsuoka,M.(2005).Crown rootless1,which is essential for crown root formation in rice,is a target of an AUXINRESPONSE FACTOR in auxin signaling.The Plant Cell,17:1387-1396.(CRL1作为生长素响应因子下游靶基因参与生长素信号途径控制不定根形成。植物细胞，17:1387-1396)。
Kang,B.,Zhang,Z.,Wang,L.,Zheng,L.,Mao,W.,Li,M.,Wu,Y.,Wu,P.,and Mo,X.(2013).OsCYP2,a chaperone involved in degradation of auxin-responsiveproteins,plays crucial roles in rice lateral root initiation.The PlantJournal,74:86-97.(OsCYP2是一种参与植物生长素应答蛋白降解的分子伴侣，在水稻侧根的起始中起着至关重要的作用。植物期刊，67：472-484)。
Liu,H.,Wang,S.,Yu,X.,Yu,J.,He,X.,Zhang,S.,Shou,H.,and Wu,P.(2005).ARL1,aLOB-domain protein required for adventitious root formation inrice.The Plant Journal,43:47-56.(ARL1编码一个LOB结构域的蛋白，是水稻不定根形成所必需的。植物期刊，43：147-56)。
Liu,L.,Li,C.,Teo,Z.W.N.,Zhang,B.,and Yu,H.(2019).The MCTP-SNAREcomplex regulates florigen transport in arabidopsis.Plant Cell,31:2475-2490.(MCTP-SNARE复合物调节拟南芥中成花素的运输。植物细胞，31：2475-2490)。
Park,M.,Krause,C.,Karnahl,M.,Reichardt,I.,El Kasmi,F.,Mayer,U.,Stierhof,Y.D.,Hiller,U.,Strompen,G.,Bayer,M.,Kientz,M.,Sato,M.H.,Nishimura,M.T.,Dangl,J.L.,Sanderfoot,A.A.,and Jurgens,G.(2018).Concerted action ofevolutionarily ancient and novel snare complexes in flowering-plantcytokinesis.Development Cell,44:500-511.(进化上古老和新颖的SNARE复合物在开花植物细胞分裂中的协同作用。细胞发育，44：500-511)。
Shao,Y.,Zhou,H.Z.,Wu,Y.,Zhang,H.,Lin,J.,Jiang,X.,He,Q.,Zhu,J.,Li,Y.,Yu,H.,and Mao,C.(2019).OsSPL3,an sbp-domain protein,regulates crown rootdevelopment in rice.The Plant Cell,31:1257-1275.(OsSPL3编码一种sbp结构域蛋白，可调节水稻冠根发育。植物细胞，31：1257-1275)。
Wang,L.,Guo,M.,Li,Y.,Ruan,W.,Mo,X.,Wu,Z.,Sturrock,C.J.,Yu,H.,Lu,C.,Peng,J.,and Mao,C.(2018).LARGE ROOT ANGLE1,encoding OsPIN2,is involved inroot system architecture in rice.Journal of Experimental Botany,69:385-397.(编码OsPIN2的LARGE ROOT ANGLE1参与水稻的根系结构。实验植物学杂志，69：385-397)。
Xia,L.,Mar Marques-Bueno,M.,Bruce,C.G.,and Karnik,R.(2019).Unusualroles of secretory snare syp132 in plasma membrane h(+)-atpase traffic andvegetative plant growth.Plant Physiology,180:837-858.(分泌型SNARE SYP132在质膜H(+)-ATPase运输和营养植物生长中的异常作用。植物生理学，180：837-858)。
Yoshikawa,T.,Ito,M.,Sumikura,T.,Nakayama,A.,Nishimura,T.,Kitano,H.,Yamaguchi,I.,Koshiba,T.,Hibara,K.I.,and Nagato,Y.(2014).The rice FISH BONEgene encodes a tryptophan aminotransferase,which affects pleiotropic auxin-related processes.The Plant Journal,78:927-936.(水稻FISH BONE基因编码一种色氨酸氨基转移酶，它影响多效性生长素相关过程。植物期刊，78:927-936)。
Zhao,H.,Ma,T.,Wang,X.,Deng,Y.,Ma,H.,Zhang,R.,and Zhao,J.(2015).OsAUX1controls lateral root initiation in rice(Oryza sativa L.).Plant Cell&Environment,38:2208-2222.(OsAUX1控制水稻(Oryza sativa L.)的侧根起始。植物细胞与环境，38:2208-2222)。
Zhu,J.,Li,Y.,Lin,J.,Wu,Y.,Guo,H.,Shao,Y.,Wang,F.,Wang,X.,Mo,X.,Zheng,S.,Yu,H.,and Mao,C.(2019).CRD1,an Xpo1 domain protein,regulates miRNAaccumulation and crown root development in rice.The Plant Journal,100:328-342.(CRD1编码一种Xpo1结构域蛋白，可调节水稻中miRNA的积累和冠根发育。植物杂志，100：328-342)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻根形态建成调控基因CLRD1及其应用，所述基因参与调控水稻根系形态建成。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种水稻根形态建成调控基因CLRD1，该基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述，该基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还涉及所述水稻根形态建成调控基因CLRD1的编码蛋白，所述编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.3所述。
本发明的要点之一在于提供了SEQ ID NO.1所示基因组核苷酸序列和SEQ IDNO.2所示编码区核苷酸序列，并提供了SEQ ID NO.3所示氨基酸序列，在已知该核苷酸序列和氨基酸序列的前提下，该核苷酸序列和氨基酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.1所示基因组核苷酸序列及SEQ IDNO.2所示编码区核苷酸序列的变体，只要其与所述多核苷酸具有90％以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指在所述多核苷酸序列添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ NO.3所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在95％以上，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
本发明还同时提供了上述水稻根形态建成调控基因CLRD1的应用：调控水稻根系形态建成(参与调控水稻根系形态建成)。
即，本发明还提供水稻根形态建成调控基因CLRD1在调控水稻根系建成中的应用，所述的应用是维持水稻根形态建成调控基因CLRD1正常水平，能促使水稻根形态建成，即，维持种子根伸长生长，促进不定根原基及侧根原基分细胞分裂与分化，促使不定根发生及侧根生长，在植物根系形态建成模式探究及育种实践中具有较大的应用及指导价值。相反将水稻根形态建成调控基因CLRD1突变或修饰，使水稻根系建成迟滞，具体表现为水稻种子根变短，不定根原基和侧根原基发育均发生滞缓或停滞，同时不定根数及侧根数减少或变没。
本发明还提供一种所述水稻根形态建成调控基因CLRD1突变后构建的转基因水稻细胞。
与背景技术所述的编码小G蛋白的基因不同，本发明所公开的CLRD1编码一个植物SNARE蛋白，并公开其在水稻根形态建成的功能。现有的其它水稻根系发育调控基因，如上文所述ALR1、OsCYP2及近几年公开报道的OsSPL3、CRD1、OsAUX1、LRA1等都特异或局部性的参与根系发育过程(Liu et al.,2005；Kang et al.,2013；Shao et al.,2019；Zhu etal.,2019；Zhao et al.,2015；Wang et al.,2018)，如ALR1、OsSPL3及CRD1特异性调控不定根发生(Liu et al.,2005；Shao et al.,2019；Zhu et al.,2019)，而OsCYP2和OsAUX1对侧根发育具有重要作用(Kang et al.,2013；Zhao et al.,2015)，而LRA1对根向重力性方面具有特异性调控作用(Wang et al.,2018)。因此，本发明与以往报道的根系发育调控基因只参与维持根系建成过程中的特定模块大不相同。本发明所述的CLRD1基因在维持水稻根形态建成方面有整体性效益，即在维持种子根伸长生长，不定根原基及侧根原基分细胞分裂与分化，不定根发生和侧根生长上均具有重要调控作用。
本发明首次发现并公开植物SNARE蛋白编码基因CLRD1具有调控水稻根形态建成的功能。由于根系发育健康与否直接关系到整株的水分养分供给乃至存活、健壮的根系建成更是水稻等农作物产量形成的先决条件，因此，本发明内容在植物根系建成模式探究及分子育种实践中具有较大的指导价值和应用潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为clrd1突变体及CLRD1野生型发芽后生长36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h的植株表型照片。标尺为3厘米。
图2为clrd1突变体及CLRD1野生型表型照片及表型参数统计结果；
图2中：
A，发芽后生长5天的clrd1突变体及CLRD1野生型表型照片，标尺为3厘米；
B，A中虚框区域放大照片；
C，clrd1突变体及CLRD1野生型胚芽鞘节横向树脂切片，标尺为50微米；上图萌发后生长48h的切片，下图萌发后生长96h的切片；
D，clrd1突变体及CLRD1野生型的侧根数、不定根数、最大根长以及株高等参数的统计。样品数量为15。
图3为clrd1突变体及CLRD1野生型侧根原基和不定根原基细胞学观察图片；
图3中：
A，clrd1突变体及CLRD1野生型侧根原基不同发育阶段连续树脂切片；
B，利用扫描电子显微镜拍照观察的clrd1突变体幼苗侧根原基未突出表皮的形态和CLRD1野生型幼苗侧根原基突出表皮的形态；
C，clrd1突变体及CLRD1野生型不定根原基不同发育阶段连续树脂切片展示图片。
图4为一种水稻根形态建成调控基因CLRD1的结构和蛋白结构域示意图；
图4中：
A，一种水稻根形态建成调控基因CLRD1的基因克隆；
B，CLRD1的野生型蛋白结构域示意图；
C，CLRD1的突变型clrd1蛋白结构域示意图。
图5为CLRD1野生型、CLRD1/clrd1杂合子、及clrd1纯合突变体测序结果展示；
图6为一种水稻根形态建成调控基因CLRD1的突变体clrd1的验证；
图6中：
A，发芽后生长5天的CLRD1野生型、CLRD1/clrd1杂合子、clrd1突变体、及3个独立35S:GFP-clrd1遗传转化HJ2株系表型照片，标尺为3厘米；
B，A中虚框区域放大照片，标尺为3厘米；
C，利用dCAPS引物对CLRD1野生型、CLRD1/clrd1杂合子、clrd1突变体、及3个独立35S:GFP-clrd1遗传转化HJ2株系等材料进行背景鉴定；
D，利用Anti-GFP抗体检测GFP-clrd1蛋白；
E，利用考马斯亮蓝染色统一蛋白上样量。
图7为一种水稻根形态建成调控基因CLRD1的功能验证；
图7中：
A，发芽后生长5天的CLRD1野生型、clrd1突变体、及6个独立pCLRD1:gCLRD1遗传转化clrd1株系(C1-C6)表型照片，标尺为3厘米；
B，发芽后生长5天的CLRD1野生型、clrd1突变体、及6个独立pCLRD1:gCLRD1遗传转化clrd1株系的根长统计结果；
C，A中相应材料的不定根数量统计结果；
D，A中相应材料的测根数量统计结果；
E，利用RT-qPCR检测发芽后生长5天的CLRD1野生型、clrd1突变体、及6个独立pCLRD1:gCLRD1遗传转化clrd1株系中的CLRD1基因的表达量。
图8为用于构建35S:GFP-clrd1载体的pCAMBIA1300-35S-eGFP双元载体结构示意图。
图9为用于构建pCLRD1:gCLRD1载体的pCAMBIA1300-eGFP双元载体结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、水稻根系建成突变株系的筛选和表型分析
一、水稻水稻培养条件及营养液配方
水稻培养条件如下述所示：
白天温度：28-30℃，夜晚温度：20-22℃；光照时间：7:00-19:00；相对湿度：65％；光照密度值：250-300μmol m-2s-1；水稻营养液pH值为5.5-5.8。营养液每隔7天更换一次。冬天更换营养液水温低时要加入温水调和至温度达到室温为宜(本发明所述室温为24-26℃)，避免稻苗产生低温应激反应。
水稻营养液配方如下表1所述：
表1
二、水稻根系建成突变株系的筛选
将田间单株收获经过甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的野生型水稻(Heijing 2，HJ2，Oryza sativa Japonica Group)材料统一编号入库并备份同期收货未经过EMS诱变的野生型。筛选突变体时，按编号从库中取种子HJ2，用0.66％的稀硝酸浸没种子，室温放置16h，以破除种子休眠。再用清水冲洗三遍，除去多余的稀硝酸。之后用清水浸没种子，于37℃烘箱催芽两天左右(每12h换水一次)至种子露白。将露白种子按编号播种于漂浮在水稻培养液上的网纱浮板上(10升/槽，营养液配方参照附表1)，每槽至少播种一份野生型HJ2作为对照，培养条件如上述一所述。培养7天后，取野生型材料放置在观察器皿(黑色塑料托盘)一侧，按编号取筛选材料放入观察器皿，观察其与野生型之间根系发育的差异，并做好记录。疑似突变体材料要重点做好标记，以备重复试验，同时保留幼苗并继续培养至收获种子(单株收种)。
三、水稻根系建成突变株系表型分析
通过规模化筛选，在EMS诱导的HJ2突变体库筛选到一个新的根系建成相关材料，将其命名为clrd1(crown and lateral root defect 1)，并将该突变材料对应的野生型表型材料命名为CLRD1。由图1中可见，clrd1种子萌发后，clrd1种子根伸长受阻，生长72h～84h并未形成不定根及侧根；生长84h～120h，还未形成不定根及侧根，根系基本形态仍然未能建成，并且在随后的生长进程中种子根都较短，且一直不能或极少长出不定根及侧根，然而与此对比明显的是，CLRD1种子在萌发后，种子根迅速长出，并快速伸长生长，培养至72h～84h即可观察到不定根及侧根形态开始形成；在生长84h～120h时，能观察到已经突破表皮的3～5根不定根，并在这些根体上长出大量侧根，此时根系基本形态已经建成，并随着生长进程，根系进一步扩大(图1)。
说明：由于纯合clrd1突变体不能开花结实，因此利用CLRD1/clrd1杂合子单株收获并繁种，以备用表型统计和后续实验。满足发芽至生长7天时不定根及侧根发育齐全，种子根正常伸长生长的可定义为CLRD1野生型材料；满足发芽至生长7天时无明显侧根及不定根，同时种子根伸长缓慢的可定义为纯合clrd1突变体材料；满足发芽后至生长7天侧根较同期CLRD1野生型材料显著减少的即可定义为CLRD1/clrd1杂合子。
为了具体描述表型，以发芽后生长5天苗龄的幼苗为例，CLRD1野生型的不定根和侧根发育较clrd1突变体显著增多、种子根根长clrd1突变体显著变长(图2中A，B和D)。虽然clrd1突变体没有形成肉眼可见成熟不定根，但是树脂切片显示其不定根原基可以形成，且数量较CLRD1野生型没有明显改变(图2中B和C)，但是发现clrd1不定根原基无法像CLRD1野生型中的不定根原基一样正常伸长生长，以突出表皮形成肉眼可见成熟不定根(图2中C)。
四、原基细胞分析
本发明对不同发育阶段的侧根及不定根原基进行树脂切片。取clrd1突变体和CLRD1野生型胚芽鞘节在质量浓度4％的多聚甲醛水溶液中室温固定过夜，然后用0.1M PBS洗三遍(每遍20min)，转移到体积浓度1％的锇酸水溶液中室温过夜，然后用0.1M PBS洗三遍(每遍20min)。使用体积浓度梯度变化的丙酮水溶液置换组织中的水分。使用丙酮体积浓度依次是30％丙酮(1h)→40％丙酮(1h)→50％丙酮(1h)→60％丙酮(1h)→70％丙酮(过夜)→80％丙酮(1h)→90％丙酮(1h)→95％丙酮(1h)→100％丙酮(1h)→100％丙酮(1h)→100％丙酮(1h)。然后使用不同浓度梯度的树脂置换组织中的丙酮。使用树脂丙酮的体积比例依次是2/3丙酮+1/3Spurr’s树脂(2h)→1/2丙酮+1/2Spurr’s树脂(2h)→1/3丙酮+2/3Spurr’s树脂(2h)→纯树脂渗透过夜→包埋→聚合过夜(70℃恒温箱)。将聚合的树脂块使用树脂切片机对根尖进行纵切(切片厚度为3μm)→展片到载玻片上→使用亚甲基蓝染色→水洗去余色→烤片→光学显微镜下观察拍照。通过树脂切片观察，发现相比于clrd1突变体，CLRD1野生型之所以能发育形成成熟的侧根原基，是因为原基各个生长阶段均发育良好(将侧根原基发育分为7个阶段，如图3中A所示)，而不同的是clrd1突变体则是在其侧根原基发育第5个阶段之前发生了停滞(图3中A)，用扫描电镜观察也有一致的发现，即clrd1突变体侧根原基无法像CLRD1野生型一样突出生长以突破表皮结果(图3中B)。树脂切片观察还发现CLRD1野生型的不定根原基的各个生长阶段也均发育良好(将不定根原基发育分为7个阶段，如图3中C所示)，而clrd1突变体不定根原基也在其发育第五个阶段之前发生了停滞(图3中C)。
由上述内容可知，本发明所得的CLRD1野生型较clrd1突变体具有明显优势的侧根原基及不定根原基生长发育模式，而侧根原基及不定根原基的良好发育是进一步发育成成熟侧根及不定根从而建成根系早期基本形态的关键，在水稻根系建成上具有重要作用。
实施例2、水稻根形态建成调控基因CLRD1的获得和功能鉴定
一、利用图位克隆手段获得基因CLRD1
由于clrd1纯合突变体无法开花结实，采用实施例1所得的CLRD1/clrd1杂合子与籼稻Kasalath杂交获得F1杂交种子，杂交种子自交后获得F2群体。使用该群体进行CLRD1的图位克隆，将CLRD1锁定在水稻基因组第7号染色体SSR(简单序列重复)标记RM1243和RM21025之间(图4中A)，对区间核苷酸进行扩增并经过测序发现，LOC_Os07g07000的第3604个核苷酸(基因组核苷酸，以起始密码子ATG的A为第1个推算)发生了替换突变，即由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)，导致原来编码谷氨酰胺的密码子替换为终止密码子，进而导致完整的CLRD1蛋白质产生一种截短的版本clrd1蛋白质(图4中A，B和C)。
在获得基因CLRD1具体信息后，为了描述的严谨性，上述实施例1中所描述的CLRD1野生型、CLRD1/clrd1杂合子、及clrd1纯合突变体均可通过对CLRD1基因进行扩增并通过二代测序进一步确定(图5)。
二、基因CLRD1的验证
为了确认突变体是由CLRD1突变引起，提取clrd1突变体总RNA，并从逆转录(根据Promegas逆转录试剂盒提供的方法操作)获得的cDNA(complementary DNA)扩增获得clrd1编码序列，用于构建35S:GFP-clrd1载体。
clrd1突变体总RNA提取具体步骤如下：
采用Trizol试剂法提取：
(1)打开离心机，4℃预冷；
(2)为离心管做好标记，并加入1ml Trizol试剂；
(3)取clrd1叶片，于液氮中研磨成细粉状，立即转移约100mg磨碎的组织上述到含1ml Trizol试剂的离心管中。剧烈震荡后在室温下放置5-10min；
(4)4℃，12000rpm离心10min，取800μl上清至另一个1.5ml离心管；
(5)加入200μl氯仿(200μl ml-1Trizol试剂)，充分震荡，室温放置10min至液体分层；
(6)4℃，12000rpm离心10min；取600μl上清至另一个1.5ml离心管；
(7)加入600μl异丙醇，轻轻混匀，至于-20℃，30min；
(8)4℃，12000rpm离心15min后弃上清，用70％的乙醇(DEPC水配制)轻旋清洗洗；4℃，10000rpm离心5min，弃上清，重复清洗一遍；
(9)4℃，10000rpm离心5min，弃上清，置于超净台吹干残余液体，加入50-100μl的DEPC水溶解，测定浓度；
(10)如果难以溶解，可置于65℃金属浴孵育10-20min，使RNA完全溶解。样品可以马上用于逆转录或保存于-80℃条件下备用。
35S:GFP-clrd1载体构建具体步骤如下：
以crld1的cDNA为模板，扩增clrd1的编码序列，用单片段同源重组酶(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)，将回收纯化后的扩增片段连入用BamhI/HindⅢ内切酶酶切过的pCAMBIA1300-35S-eGFP双元载体(图8)，得到35S:GFP-clrd1载体，并通过测序确定正确。
扩增引物为：
clrd1 F：GACGAGCTGTACAAGGGATCCATGAACAATCTCCTCACCGA
clrd1 R：ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCTAGATGACGGCGACGACAA
利用农杆菌(EHA105)介导转化体系，将35S:GFP-clrd1遗传转化到HJ2中，鉴定转基因阳性苗，并继续培养至收获种子，在子代中观察植株的表型，发现clrd1可将HJ2转变成CLRD1/clrd1杂合子特有的表型(图6中A和B)。
农杆菌(EHA105)介导35S:GFP-clrd1载体遗传转化的具体操作步骤如下：
将构建并测序正确的35S:GFP-clrd1载体转入农杆菌(EHA105)，用于转化野生型HJ2，具体步骤如下：
(1)挑选转化培养好的单克隆到装有20ml农杆菌培养液的50ml离心管中，28℃，250rpm摇床振荡培养过夜，至菌液OD600在1.0左右，4℃，4000rmp，离心10min，收集菌体；
(2)用含200μmol/L的乙酰丁香酮(As)的AAM感菌液30ml制成农杆菌悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.6；放入将50-80颗0.3-0.5立方厘米的HJ2愈伤组织，水平摇床上室温摇晃侵染5分钟后，取出愈伤组织，并置于无菌滤纸上沥干；
(3)将愈伤组织转移到垫有无菌滤纸的共培养基上，室温暗培养3天后，收集愈伤，并用含300mg/L羧苄青霉素钠(Carb)的无菌水清洗2遍，每次在水平摇床上摇晃30分钟。最后置于无菌滤纸上沥干2小时；
(4)将沥干的愈伤转入含300mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天；
(5)挑选有抗性愈伤的初始愈伤转到含300mg/L羧苄青霉素钠和50mg/L潮霉素培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，14天，此时可见颗粒状的抗性愈伤组织长出；
(6)挑取同一愈伤来的抗性愈伤2-3颗置于分化培养基上，盖好分化罐盖子，25℃光照培养(16h/8h光周期，光强为2000lx)30天左右至愈伤组织会分化出小苗，当小苗长至5-10cm左右时，可直接移苗至实施例1中所述水稻培养条件下培养并鉴定；
(7)利用特异扩增潮霉素的引物扩增T0代转基因苗，鉴定转基因阳性苗，特异扩增潮霉素的引物序列如下：
Hyg F：CGAGTACTTCTACACAGCCATC
Hyg R：TAGCGAGAGCCTGACCTATT
(8)将鉴定获得的T0代转基因阳性苗继续培养，至收获种子35S:GFP-clrd1遗传转化到HJ2中的种子。
提取基因组DNA，并通过设计的特异识别clrd1突变位点的dCAPS引物对观察材料进行背景检测(图6中C)，通过购买自赛默飞的GFP抗体(Anti-GFP)对观察材料进行背景检测，并利用考马斯亮蓝染色统一蛋白上样量(图6中C和D)。
水稻基因组DNA提取具体实施步骤如下：
取100mg水稻叶片剪碎装入2ml EP管中，加入200μl提取液(水稻DNA提取液配方：100ml 1M Tris-HCl；40ml 0.5M EDTA；100ml 5M NaCl；150ml 10％SDS；610ml ddH2O)和一颗磨样珠，用磨样机(RetschMM400)打磨样品至小叶片完全破碎，于65℃烘箱中孵育30min后(期间颠倒混匀样品1-2次)，12000rpm室温离心5-10min。用移液器小心吸取上清至另一新的EP管中，加等体积4℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置l0 min，12000rpm离心5-10min后，可观察到管底有白色沉淀。此时弃上清，用4℃预冷的70％乙醇清洗DNA沉淀，8000rpm离心5min后，弃上清，再重复清洗一遍，8000rpm离心5min后，弃上清，待管中残余酒精完全挥发后，加适量去离子水溶液溶解DNA，4℃或-20℃保存备用。
根据clrd1突变方式，设计特异识别clrd1突变位点的dCAPS引物设计如下所示：
CLRD1 dCAPS-F：CTCTGCTTCAAGGTTTCAAATGCT
CLRD1 dCAPS-R：TTACAATCAAGCACCCTTCTTCCATGACT
以上结果表明LOC_Os07g07000基因参与调控水稻根形态建成，并将LOC_Os07g07000命名为CROWN and LATERAL ROOT DEFECT 1(CLRD1)。该基因编码蛋白质包含氨基端terminal调控结构域、t-SNARE结构域和跨膜结构域(图4中B)，而突变型clrd1蛋白质中N-terminal调控结构域和t-SNARE结构域都没有发生改变，但其跨膜结构中第297个氨基酸至蛋白质终止丢失(图4中C)，导致了CLRD1促进水稻根形态建成功能异常。所述LOC_Os07g07000或CLRD1基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；CLRD1编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。上述结果验证了CLRD1基因定位结果的准确性(图5及图6)，并进一步表明本发明所公开的CLRD1基因具有调控根形态建成的重要作用。
实施例3、为了更加直观体现本发明公开的水稻根形态建成调控基因CLRD1的应用价值，本发明还公开一种水稻根形态建成调控基因CLRD1的实际应用案例，即构建CLRD1基因自身启动子驱动CLRD1基因组载体pCLRD1:gCLRD1。
pCLRD1:gCLRD1载体构建具体步骤如下：
以CLRD1野生型的基因组DNA为模板(基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，分别用CLRD1自身启动子扩增引物扩增CLRD1的自身启动子序列、用CLRD1基因组扩增引物扩增CLRD1的基因组序列，并利用多片段用同源重组酶(购买自诺唯赞生物科技股份有限公司)，将回收纯化后的CLRD1自身启动子扩增片段和CLRD1基因组扩增片段一起连入用SacI/HindⅢ内切酶酶切过的pCAMBIA1300-eGFP双元载体(图9)，得到pCLRD1:gCLRD1载体，并通过测序确定正确。
CLRD1自身启动子扩增引物为：
pCLRD1 F：CATGATTACGAATTCGAGCTCGTGTTCCAGATAGCACAAGA
pCLRD1 R：GAGGAGATTGTTCATGGTACCGGCGGCGAGGTCTCGCCGGC
CLRD1基因组扩增引物为：
gCLRD1 F：CGAGACCTCGCCGCCGGTACCATGAACAATCTCCTCACCGT
gCLRD1 R：ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCAAGCACCCTTCTTCCATG
构建并测序确定pCLRD1:gCLRD1载体构建正确后，利用上述实施例中具体描述的农杆菌(EHA105)介导转化体系，将pCLRD1:gCLRD1遗传转化到clrd1突变体中。进一步利用上述实施例中具体描述的特异扩增潮霉素的引物鉴定转基因阳性苗，并继续培养至收获种子，在子代中观察植株的表型，发现导入CLRD1自身启动子驱动的CLRD1基因组后，后代阳性植株根系形态建成较clrd1突变体有着显而易见的改善趋势。以发芽后生长5天的CLRD1野生型、clrd1突变体、及6个独立pCLRD1:gCLRD1遗传转化clrd1株系(C1-C6)根系建成表型为例(图7)，其中C1、C2和C3号株系虽然根长较clrd1突变体没有明显变长，但其侧根较clrd1突变体有所增加，而最显著的改善是C1、C2和C3号株系均可以建成2-5根不定根发育，(图7中A，B，C和D)，这非常类似CLRD1/clrd1杂合子表型(图6)，有趣的是C4、C5和C6号株系的根系形态建成较C1、C2和C3号株系还有更全局性改善，具体描述为C4、C5和C6号株系的根长较clrd1突变体明显变长，侧根较clrd1突变体明显变多，同时C4、C5和C6号株系均可以建成4-6根不定根，值得注意的是C4、C5和C6号株系的侧根及不定根数较CLRD1野生型都有明显改良(图7中A，B，C和D)。
为了进一步探究发明所公开的CLRD1基因在上述pCLRD1:gCLRD1转化材料根系建成改善中的作用，采取上述实施例中具体描述的总RNA提取方法，提取发芽后生长5天的CLRD1野生型、clrd1突变体、及6个独立pCLRD1:gCLRD1遗传转化clrd1株系的总RNA，并逆转录获得的cDNA(根据Promegas逆转录试剂盒提供的方法操作)，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法进一步检测了这些材料中的CLRD1基因的表达水平。
RT-qPCR具体实施步骤如下：
利用Primer Premier 5软件设计CLRD1基因定量引物如下：
RT-qPC-CLRD1 F：TCCTGATGAAGAGACAGTTGAC
RT-qPC-CLRD1 R：CATGAATATCTGCTGCAACTCC
利用持家基因OsActin(LOC_Os03g50885)作为定量标准或内参，矫正所有样品的定量数据。
内参引物如下：
RT-qPC-OsActin F：CAACACCCCTGCTATGTACG
RT-qPC-OsActin R：CATCACCAGAGTCCAACACAA
并利用SYBR green I嵌合荧光法试剂盒及实时荧光定量PCR系统LightCycler480(Roche，德国)进行RT-qPCR反应。
RT-qPCR反应体系(384孔板)：
cDNA模板：0.1μl(根据模板浓度调整)；2×Master：2.5μl；定量引物：0.1μl/0.1μl；无RNase H2O：2.2μl。
RT-qPCR反应程序(384孔板)：
95℃：2min；
95℃：10s；60℃：10s；72℃：20s，45个循环；
95℃：5s；65℃：1min；40℃：30s。
采用法对RT-qPCR数据进行分析。结果发现，pCLRD1:gCLRD1转化材料的C1、C2和C3号株系中CLRD1基因的表达水平较clrd1突变体略有提升，而有趣的是C4、C5和C6号株系中CLRD1基因的表达水平较clrd1突变体明显提升，甚至超过了CLRD1野生型(图7中E)。结果显示CLRD1基因的表达水平与以上观察到的C1、C2和C3号株系对根系建成有着局部性改善，及C4、C5和C6号株系对根系建成全局性改善有着显而易见的正相关关系。
以上结果表明本发明所公开的水稻根形态建成调控基因CLRD1基因在水稻根系改良育种中有着重要指导意义和较强商业应用潜质。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 水稻根形态建成调控基因CLRD1及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6249
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
gtgttccaga tagcacaaga atataaaaac ctcgcaaatg gaaaacatca gaattcggaa 60
gtttttccca aaatcatctt atcgaatctt tagacacatg catatagcat taaatataga 120
ttaaaaaaaa actaatttgc acagttagag gtaaaatcgc gagacgaatc ttttgaatct 180
aattagtcca taattagcca taagtgctac agcaacatac atgtgctaat gacggattaa 240
ttaggcttaa aagattcgtc tcgcggtttc cagaagagtt atgaaattag ttttttcatt 300
tgtgtcaaaa accccttccg acatccggtc aaacatctga tgtgacaccc aaaaattttt 360
atttcgtgaa ccaaacagga ccaagttgtg ctacggctac atgggcaatg acttcgcttt 420
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aacttgcatg taactacagt gtaacttgca tataagtttc acgtaatttt gaatcgttaa 1500
atctattaca agatttgttt tggtgaggaa gaaaaaaaaa tcacagcaca aacatatgtg 1560
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taaactacga ttgtactgta attacatctg tcaaattttt aggagaaaat ttgtcgacaa 1740
atatatagca gaatcggtca acaagacttc tcgtactgcc atggacaccg gcccaacctg 1800
cagacagtaa caatttaaca acaaaaaccc ggtgggaccc acctgccagt ggcagatatg 1860
ccagcttaac ccccaccacc tccccttaaa aaagtatctc cacctcctac ggtacaaggg 1920
ccacgccacg cctaactctc tccctctctc tctcctcgcc gccgccgccg cctccacgtt 1980
tctctctcct cgccgcgcgc cggcgagacc tcgccgccat gaacaatctc ctcaccgtaa 2040
gtagcatcct cctccctcct gatctcctcc tctctctttt gctgctcgcg tcgagtggtc 2100
ggggacacgg gatccagtca cctgtcaccc ccagtggtgc agcgagctcg agatctgcgc 2160
gggcgggggg ttgtcatgtg cgggcttcgg gaattcgggg gaggtggtcg ccgccggtgg 2220
tgctgctagg agcagctgtg gttgattggg ttgttttttt tttttttttt gcggcggtgg 2280
aggagtggta aggaggtgga agccgggaag ggattgcttt ggcgtggcgt gggggaatcg 2340
gaatgcgtcg gtaggggcgg gaaggaatcg tctgggtttc tctgctgctc ggcgaaaaat 2400
ttgcagctgt cgggatgatc gggttagatc tgctggtttt tgctccgagg cagatgggct 2460
tgtgaattgt gattggagca aatgggcatg tggtgctact ggtttcgcca tggttgccgt 2520
ggagctcttc tgggcgtata agggttgggt gttctgtttg tctccgagct ttctgaatag 2580
cttttgatgt gaagtgatgc attgatattg tttgttgcag tcactatcga attacacttg 2640
ttgtatcaat gctattagct gttgcagttt tagtaactcg taatgttcga atttccgtgg 2700
gtttgatgtg ctgaagaact ccagaatgtt tccttttgca atctaagggt ctgtgacgtg 2760
tttatttgcg cagagcgcat ttcgttagga attttgcgca cttcataatg gcaagtaaaa 2820
tgaaataata aaaatacctt tttaggggaa gttatctgtt ctgtcgcgaa tacactggcc 2880
tgtaattaat gtgctattct tcattgggcc tcaatcttgt tatttactta tttttagctg 2940
gtgcaagtag cacagatggc ttattgtatt gttttatagt ctaaccttct tcttgtaagc 3000
agtgaggcac atttgtccgt attataacat tccagtttta caggattcgt ttgagctccc 3060
tcggggaggc tcttcaagag atggggacat tgaaatggga atgcaagctg atccttcaga 3120
caatctaaaa ggtttcttga aaaaggtgct gtttacaaag cattttggtg tgtgcatctt 3180
gcattttgca gcagtattat attacccact tactagacac ttcatattat tgacatcttg 3240
ctttgataca tcaggttgac gcaattgaaa gcctaattgc taagctgacg aatctcttgc 3300
ataagcttca ggtttattta tctcacactt ccattcattt ctttctgttt ctggtccttg 3360
tcttgttctg atgatattga ttttcgtagt accagaaata taatgttgtg tctaagtttt 3420
gatgaattca tttagcatct tgaattttca tatacacctt acttttgctt gtagactgca 3480
aatgaggaat ctaaagcggt tacaaaagca agggacatga aaggtgagta cttagtttag 3540
tatatttaac cttgtctaaa aagttcttgt acacttttga taacccactt tacctattgt 3600
tgatgcaaca attatttttc catagcaatt aaacagagga tggagaaaga tattgatgaa 3660
gtggggaaaa tcgctcgcat ggcaaagaca aaagttgatg aattggaaaa agatgtatgt 3720
cacttggccc tgctagctaa tggcattgta ttaatttgcc atatctgcgt aatattctgt 3780
ttttatttca tgtgtctgca ctctatatac aatatatata aatcatcaac agtcatatag 3840
cactgcagta agtaacaaat tgaccatgtc tatccaacgt atgcattata ttttcataag 3900
agcattctct gcaacttgta tcacaaggtt atgatttagt agtgccccta aaacaaattg 3960
taggatttgc tatacttttc actaagccat ctcacgtgct agtgtcattt gtcaatagca 4020
acattgagtt gtctctcact gttcgctgcc atgtgaaaca gaacttatca aacagacaaa 4080
agcctggatg tgggaaagga tctgcggtag atcgatcaag agaacagact actgggtaaa 4140
tttactggcg atttgttttt ttttcctggt tctgtagagt gcataaagcc atgaatagtt 4200
gttcatccac tatgcttgct aaattctaca gagcagtgaa aaagaaattg aaggagcgca 4260
tggatgattt tcaggtactg agtttcctta tctggaacac ctaacttgcc atttatgggg 4320
tgattctgct attccgtcaa cgatcattac acagttaaac tactgccata tttcattttc 4380
tcggtctgtt agacatgctt ctttgagcag cagagaaaaa acacattgtt tttccattgc 4440
tagaagctat ccaagtataa gatttattgt atagcatttc atgagtagtg ggtgtctata 4500
ctgatacctg tatctacttg aagtaaaaag gaaaaaaata cattggtgaa atatgttatg 4560
gtttgtactt tcatcagctg tctctgctgc tatgattcaa ttcttagtca ctatgaacac 4620
ctgctaggac tagtgcaatg cccctaaagt ggtgacttgt gagtaatgcc cctttaccct 4680
ctgatgtagg ttttgagaga agcaatccgg caggagtatc gtgatgtcgt tgaaagaagg 4740
gtgtttacag taactggtag tcgtcctgat gaagaggtat acaatgacag gatctctgca 4800
gttctgactt ttggttaaat ttgttttctt catgcctttg ctttacagtg aaaattttga 4860
tctgtggtct gatgatcttc gatttacact atttctcatg ttgttgcttt gtactatgta 4920
gacagttgac aatttaatag agactggaag aagtgagcaa attttccaag aagctatcca 4980
acagcaggga agaggccaag tatgttatcc aatatatgca tttctttctg tatgggataa 5040
tgcctttttg gggaccaact acatttttgc ggttctgcct gttcacagta ctaaaatctc 5100
aaccatattt gtctttccag atactggaca ctgttgcaga gatacaggaa cgtcacgatg 5160
ctgtaagaga tctagagagg aagcttctgg agttgcagca ggtgactttt ttgacataag 5220
cacttattta ctaatctgat ttaatccata tgcttgtgag ctcgagttaa tgtgcctaat 5280
tactccattc cttgtttttg ccttgtagat attcatggat atggcagttt tggttgatgc 5340
tcaaggagac atgatcaaca acatagagac acatgtaaga attgcccact cttgcaccaa 5400
gttatacatg ttcttggaag caagacaaac tgtatatcac caagaattca ccttattttc 5460
gttttctctg cttcaaggtt tcaaatgcta ccaaccacat acaacaaggc gtcagtgctc 5520
tacagaacgc gaagaagctc cagaagaact ccaggaagtg gatgtgctac gccatcatcc 5580
tcctgctcat catagtggtg atcattgtcg tcgccgtcat ccagccatgg aagaagggtg 5640
cttgattgta acttggaaaa agaagatcgt gggatatatt tttttccctg tttgtgcaat 5700
atgtgtagtt gtgtctccga ttccctccta cccctgtacg tatgcttaac aaaacaacat 5760
gatgagattg agattcgttt gcccttaggc gcaggttgat tcatcttcat accagatttc 5820
ctgtgcaatc taccacgcca ggggttatgt gtgaaacaat ggtcccatca gtctcaacaa 5880
aaattgtgaa ttcctggatc ttttacaaca ttgcagctgt gcctctgtct aacaaacaat 5940
cttgcatgct atgccgtagc tgtaatgctg ctgcatttgc agctcactca tctggtgatg 6000
cagtatcgtc gtcgtcgacg tccagtgtct tgaaatactt gccgtccaac aggtaggttc 6060
cgatggcgag ccgcacggcc cagacgtcct tcggcttccg cgccatcacc ctgctcgacg 6120
tatgcacaat tgcacatgga tgtcagtgta attcaaattc ctgtagtaac gttcttcgtt 6180
ttgtttaaat ttctctggaa ttctcttaat gttcgctgca aattcctatt ttcaatgttt 6240
aaaaaaaca 6249
<210> 2
<211> 912
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atgaacaatc tcctcaccga ttcgtttgag ctccctcggg gaggctcttc aagagatggg 60
gacattgaaa tgggaatgca agctgatcct tcagacaatc taaaaggttt cttgaaaaag 120
gttgacgcaa ttgaaagcct aattgctaag ctgacgaatc tcttgcataa gcttcagact 180
gcaaatgagg aatctaaagc ggttacaaaa gcaagggaca tgaaagcaat taaacagagg 240
atggagaaag atattgatga agtggggaaa atcgctcgca tggcaaagac aaaagttgat 300
gaattggaaa aagataactt atcaaacaga caaaagcctg gatgtgggaa aggatctgcg 360
gtagatcgat caagagaaca gactactgga gcagtgaaaa agaaattgaa ggagcgcatg 420
gatgattttc aggttttgag agaagcaatc cggcaggagt atcgtgatgt cgttgaaaga 480
agggtgttta cagtaactgg tagtcgtcct gatgaagaga cagttgacaa tttaatagag 540
actggaagaa gtgagcaaat tttccaagaa gctatccaac agcagggaag aggccaaata 600
ctggacactg ttgcagagat acaggaacgt cacgatgctg taagagatct agagaggaag 660
cttctggagt tgcagcagat attcatggat atggcagttt tggttgatgc tcaaggagac 720
atgatcaaca acatagagac acatgtttca aatgctacca accacataca acaaggcgtc 780
agtgctctac agaacgcgaa gaagctccag aagaactcca ggaagtggat gtgctacgcc 840
atcatcctcc tgctcatcat agtggtgatc attgtcgtcg ccgtcatcca gccatggaag 900
aagggtgctt ga 912
<210> 3
<211> 303
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
Met Asn Asn Leu Leu Thr Asp Ser Phe Glu Leu Pro Arg Gly Gly Ser
1 5 10 15
Ser Arg Asp Gly Asp Ile Glu Met Gly Met Gln Ala Asp Pro Ser Asp
20 25 30
Asn Leu Lys Gly Phe Leu Lys Lys Val Asp Ala Ile Glu Ser Leu Ile
35 40 45
Ala Lys Leu Thr Asn Leu Leu His Lys Leu Gln Thr Ala Asn Glu Glu
50 55 60
Ser Lys Ala Val Thr Lys Ala Arg Asp Met Lys Ala Ile Lys Gln Arg
65 70 75 80
Met Glu Lys Asp Ile Asp Glu Val Gly Lys Ile Ala Arg Met Ala Lys
85 90 95
Thr Lys Val Asp Glu Leu Glu Lys Asp Asn Leu Ser Asn Arg Gln Lys
100 105 110
Pro Gly Cys Gly Lys Gly Ser Ala Val Asp Arg Ser Arg Glu Gln Thr
115 120 125
Thr Gly Ala Val Lys Lys Lys Leu Lys Glu Arg Met Asp Asp Phe Gln
130 135 140
Val Leu Arg Glu Ala Ile Arg Gln Glu Tyr Arg Asp Val Val Glu Arg
145 150 155 160
Arg Val Phe Thr Val Thr Gly Ser Arg Pro Asp Glu Glu Thr Val Asp
165 170 175
Asn Leu Ile Glu Thr Gly Arg Ser Glu Gln Ile Phe Gln Glu Ala Ile
180 185 190
Gln Gln Gln Gly Arg Gly Gln Ile Leu Asp Thr Val Ala Glu Ile Gln
195 200 205
Glu Arg His Asp Ala Val Arg Asp Leu Glu Arg Lys Leu Leu Glu Leu
210 215 220
Gln Gln Ile Phe Met Asp Met Ala Val Leu Val Asp Ala Gln Gly Asp
225 230 235 240
Met Ile Asn Asn Ile Glu Thr His Val Ser Asn Ala Thr Asn His Ile
245 250 255
Gln Gln Gly Val Ser Ala Leu Gln Asn Ala Lys Lys Leu Gln Lys Asn
260 265 270
Ser Arg Lys Trp Met Cys Tyr Ala Ile Ile Leu Leu Leu Ile Ile Val
275 280 285
Val Ile Ile Val Val Ala Val Ile Gln Pro Trp Lys Lys Gly Ala
290 295 300

Claims (2)

1.水稻根形态建成调控基因CLRD1的应用，其特征在于：调控水稻根系形态建成；维持水稻根形态建成调控基因CLRD1正常水平，从而促使水稻根形态建成；
基因CLRD1为如下（1）~（2）的任一：
（1）、所述基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）、所述基因的编码区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的水稻根形态建成调控基因CLRD1的应用，其特征在于：所述促使水稻根形态建成为：维持种子根伸长生长，促进不定根原基及侧根原基分细胞分裂与分化，促使不定根发生及侧根生长。
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