CN104878042A - 一种提高植物抗逆性的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高植物抗逆性的方法及其应用，属于植物转基因育种技术领域。本发明所提供的方法是通过PCR扩增获得抗逆基因后，构建植物表达载体，再将植物表达载体转化到农杆菌上，再利用含有表达载体的农杆菌侵染目标植物，培育被侵染的目标植物至获得转抗逆基因的种子。本发明通过将GmAKT1基因转入拟南芥中，使转GmAKT1拟南芥表现出莲座叶少，开花早，荚数多，株高增加的特性，与野生型相比有一定程度的生理优势。同时，转入GmAKT1基因后拟南芥的ABA耐受性、抗旱及抗盐能力得到了提高。另外，GmAKT1的过表达还能够一定程度上清除逆境时植物体内的活性氧。

Description

一种提高植物抗逆性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种提高植物抗逆性的方法及其应用，属于植物转基因育种技术领域。

背景技术

大豆对干旱、盐碱等逆境胁迫十分敏感，逆境导致大豆品质和产量下降。因此，研究抗逆相关基因，明确抗逆分子机制，提高大豆抗逆性非常重要。随着分子生物技术的发展，将抗逆基因转入相关作物中，使其在目的作物中高效表达，从而提高作物对逆境环境的适应性，提高作物产量和品质已成为目前研究的重点。但是，关于大豆中AKT1类基因相关信息的研究还很少，尚没有利用AKT1类基因改善植物抗逆性的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种提高植物抗逆性的方法，采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，通过PCR扩增获得抗逆基因后，构建植物表达载体，再将植物表达载体转化到农杆菌上，再利用含有表达载体的农杆菌侵染目标植物，培育被侵染的目标植物至获得转抗逆基因的种子。

所述方法的步骤如下：

1)提取大豆子叶总RNA，反转录后获得cDNA，并以所得cDNA为模板，进行PCR扩增，获得抗逆基因；

2)将步骤1)所扩增的抗逆基因插入到质粒载体上获得植物表达载体；

3)再将步骤2)所得的植物表达载体转化到农杆菌上，获得农杆菌转化子；

4)利用步骤3)所得的农杆菌转化子侵染目标植物，获得侵染植物；

5)培育侵染植物至获得含有抗逆基因的种子。

优选地，步骤1)所述大豆，品种为东农50；所述抗逆基因，抗逆基因GmAKT1，GeneBank登陆号为KM491715.1；所述PCR扩增，所用引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3所示；扩增条件为：94℃2min；再进行38个循环，其中每个循环降0.2℃：98℃10s，58℃30s，68℃3min；68℃终延伸10min。

优选地，步骤2)所述质粒载体，是质粒载体pCXSN。

优选地，步骤3)所述将植物表达载体转化到农杆菌上，是将植物表达载体通过冻融法转化到根瘤农杆菌EHA105中。

优选地，步骤4)所述目标植物为拟南芥或大豆，侵染部位为花絮；所述侵染是将拟南芥的花絮浸入到转化液中28-32s。

所述转化液，是将农杆菌转化子在室温5000rpm下离心10min后，再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中，加入表面活性剂SilwetL-77制得。

所述方法的具体步骤如下：

1)提取东农50大豆子叶的总RNA，反转录获得cDNA后，以所得cDNA为模板，以如SEQID NO.2-SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，扩增条件为：94℃2min；再进行38个循环，其中每个循环降0.2℃：98℃10s，58℃30s，68℃3min；68℃终延伸10min，获得抗逆基因GmAKT 1扩增产物；

2)通过XcmI和Hind III的酶切作用将步骤1)所得的抗逆基因GmAKT 1扩增产物连接到质粒载体pCXSN上，获得植物表达载体pCXSN-GmAKT1；

3)通过冻融法将步骤2)所得的植物表达载体pCXSN-GmAKT1转化到根瘤农杆菌EHA105中，获得农杆菌转化子pCXSN-GmAKT1；

4)将步骤3)所得的农杆菌转化子pCXSN-GmAKT1在室温5000rpm下离心10min后，再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中，加入表面活性剂SilwetL-77制得转化液，将拟南芥的花絮浸入到转化液中30s后取出，获得侵染拟南芥；

5)平放步骤4)所得的侵染拟南芥，避光，保鲜膜包裹保持湿度，暗培养1d后，取出除去遮挡，放入培养箱中培养至获得转抗逆基GmAKT1的拟南芥种子。

所述任一方法用于农作物转基因育种。

优选地，所述任一方法用于培育抗逆性提高的农作物；更优选地，用于培育抗逆性提高的大豆。

发明人从大豆DN50中分离了一个新基因GmAKT1，虽然发明人公开了该基因的碱基序列，但是对于该基因的功能并未披露。对于基因GmAKT1尚无功能研究报道。

本发明获得的有益效果如下：

发明人对组织特异性进行分析，发现GmAKT1在大豆根部表达量高于其他组织，在受到ABA、NaCl及PEG诱导时，其表达量显著升高。原核表达实验证明获得的大豆GmAKT1基因可以编码翻译目的蛋白。将其转入拟南芥中，得到了转GmAKT1拟南芥，转GmAKT1拟南芥表现出莲座叶少，开花早，荚数多，株高增加的特性，与野生型相比有一定程度的生理优势。GmAKT1提高了拟南芥的抗旱及抗盐能力，转入突变体拟南芥时，可以将突变体拟南芥对盐、旱的超敏感恢复到正常水平。GmAKT1增加了拟南芥种子在萌发时期对ABA的敏感性，而AKT1基因缺失则导致拟南芥对ABA的不敏感。同时，GmAKT1的过表达可以在一定程度上清除逆境时植物体内的活性氧。

附图说明

图1GmAKT1的序列差异性分析。

图2GmAKT1蛋白与GmAKT2蛋白、水稻OsAKT1、拟南芥AKT1蛋白的氨基酸比对。

图3GmAKT1组织表达分析及PEG、NaCl、ABA处理的大豆GmAKT1基因的相对表达量。

图4转基因拟南芥的表型。

图5不同ABA浓度处理下种子的萌发率。

图6水分胁迫处理下种子的萌发率、根长变化及拟南芥离体叶片失水率。

图7不同NaCl浓度处理下种子的萌发率、根长及表型变化。

图8NBT染色检测转基因拟南芥中超氧阴离子的含量。

图9DAB染色检测转基因拟南芥中H₂O₂的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

实施例1GmAKT1的获得

一、GmAKT1的克隆及生物信息学分析

从Phytozome数据库中获得拟南芥AKT1的同源基因，利用同源克隆的方法从东农50中获得同源性最高的2个基因拷贝，分别位于17号染色体和5号染色体，氨基酸同源率分别为69.41％和68.00％，命名为GmAKT1，GmAKT2。本发明克隆的GmAKT1含有一个长2628bp的开放阅读框，编码875个氨基酸。

Trizol试剂提取大豆(Glycine max)(东农50，武天龙,杨庆凯,马占峰，吴宗璞，赵淑文，高凤兰，李文滨，张国栋，杨琪，孟庆喜，王金陵.东农小粒豆1号大豆新品种选育报告，[J].东北农业大学学报,1994,(25)1:104；公众可从东北农业大学获得，以下简称为野生型大豆)。叶片总RNA，反转录合成cDNA第一条链作为模板，以SEQ ID NO.3-4所示序列为引物，进行PCR反应，PCR条件为94℃2min；38循环：98℃10s，58℃30s，68℃3min；(每个循环降0.2℃)68℃终延伸10min。经测序，PCR产物为2707bp，有两个碱基与大豆数据库中比对得到的不同，序列中第171bp由T变为A，第501个bp由G变为A，从而导致第168个氨基酸由甘氨酸变为丝氨酸(图1)。该基因命名为GmAKT1。由于数据库中的GmAKT1序列来自于威廉姆斯82号大豆，而本申请中所克隆的GmAKT1于东农50中分离，品种的差异可能引起氨基酸的变异。本申请克隆的大豆GmAKT1在GenBank登陆号为KM491715.1。

GmAKT1的分子量为98137.58，等电点7.09，负电残基(Asp+Glu)为90，正电残基(Arg+Lys)是89。原子组成为4408个C、6911个H、1195个N、1277个0、33个S,化学式为C₄₄₀₈H₆₉₁₁N₁₁₉₅O₁₂₇₇S₃₃,原子总数是13824个(图2)。预测GmAKT1蛋白有5个跨膜区域，分别位于52-74，84-106，190-212，232-254，267-289，其中在S4跨膜区域上，发现一个P结构域，是钾离子通道Shaker家族的结构的基本特征。

二、GmAKT1的表达分析

1、大豆GmAKT1基因的组织特异性表达

用半定量法分析了GmAKT1在大豆各个组织器官的表达情况。于大豆盛花期取DN50根、茎、叶、荚、豆、花等各个组织部分，用Trizol试剂盒提取RNA，调整RNA浓度后以总RNA为模板，分别反转录各组织cDNA。以大豆管家基因actin为内参调整扩增目的基因的模板量。反应条件为：94℃5min；34循环：94℃30s，58℃30s，72℃30s72℃，终延伸10min。(图3)。

2、GmAKT1基因在PEG、ABA、Nacl下的诱导表达

用实时荧光定量的方法分析大豆中GmAKT1在ABA、NaCl、PEG处理下的表达情况。每个叶片样本进行三次重复。大豆管家基因Actin作为内参对照。引物序列为GmAKT1-RT正义：GTCGGAGCAACAACTACC，反义：CTGCACTACTACTCTTCAT；Actin正义：GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT，反义：GTTTCAAGCTCTTGCTCG TAATCA。PCR反应条件：95℃预变性，15min；40个循环反应：95℃，10s，62℃，20s，72℃，30s；计算在3个处理下大豆GmAKT1基因的相对表达量情况(图3)。

三、GmAKT1基因的原核表达分析

构建GmAKT1基因的原核表达载体pLATE31-GmAKT1，通过SDS-PAGE电泳确定克隆获得的GmAKT1可以编码预期蛋白。

实施例2转GmAKT1基因植物表达载体的构建及转GmAKT1基因拟南芥的培养

一、植物表达载体pCXSN-GmAKT1的构建

pCXSN载体为TA克隆的植物表达载体，利用XcmⅠ的单酶切获得具有T末端的pCXSN载体片段，将具有A末端的GmAKT1片段插入pCXSN植物表达载体中，Hind III鉴定连接正向连接后转化TOP10感受态，鉴定出阳性菌落后转化农杆菌，获得pCXSN-GmAKT1植物表达载体。

二、转GmAKT1拟南芥的培育

1、转GmAKT1拟南芥的获得

1)将上述获得的植物表达载体pCXSN-GmAKT1采用冻融法转化到根瘤农杆菌EHA105中，送去测序，结果已经成功获得质粒为pCXSN-GmAKT1的农杆菌。

2)采用农杆菌介导法将农杆菌pCXSN-GmAKT1侵染野生型拟南芥(Columbia生态型)(以下简称野生型拟南芥，郝林，徐昕，曹军.一种拟南芥突变体对高浓度CO₂反应的研究，[J].应用生态学报，2003，l4(12):2359～236.公众可从东北农业大学获得)，AKT1拟南芥突变体(于ABRC购买，美国)，得到3代转GmAKT1拟南芥。

3)本申请将转化哥伦比亚型拟南芥及AKT1突变体拟南芥。两种拟南芥的种子4℃，黑暗处理，春化3天。用10％的NaClO消毒拟南芥种子，于超净台中无菌操作将其播种于MS培养基上组培室培养。7天后移植到土壤与蛭石1:1混合的塑料钵内，培养箱培养。光照为16h光，8h暗，湿度为80％。

4)开花后，切掉拟南芥主枝顶端的花絮，破除顶端优势以获取更多可开花侵染的侧枝。待侧枝大多结出花苞时，可准备侵染。

5)将pCXSN-GmAKT1农杆菌活化好的pCXSN-GmAKT1农杆菌室温离心10min，5000rpm，将收集到摇菌管底的菌液悬浮在1/2MS缓冲液中，加表面活性剂SilwetL-77以备侵染。

6)侵染前一天将拟南芥浇透水，让其气孔开放。将拟南芥的花絮浸入到转化液中30S左右。侵染后拟南芥平放，遮光，保鲜膜包裹保持湿度，暗培养一天后，取出遮挡，正常置入培养箱中，直至收获T0代转GmAKT1拟南芥种子。

2、转GmAKT11拟南芥的鉴定

1)潮霉素筛选浓度

哥伦比亚拟南芥的种子4℃，黑暗处理，春化3天。用10％的NaClO消毒，于超净台中无菌操作将其均匀播种于含潮霉素(Hygromycin B)的MS培养基上。潮霉素浓度为0、10、20、30、40、50mg/L.。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。7天后，根据其萌发率，黄花率，叶片伸展程度，确定潮霉素筛选过表达GmAKT1拟南芥的最佳浓度。结果为40mg/mL的潮霉素为有效筛选浓度。

2)筛选鉴定转基因拟南芥

T0代种子收获晾干春化后，于超净台中无菌播种于含有40mg/L的潮霉素抗性MS固体筛选培养上，组培室培养10天后，将抗性拟南芥幼苗移入MS培养基(不含抗生素)，恢复7天后移入土中培养箱培养。待拟南芥叶片足够大时，提取其叶片DNA进行PCR阳性植株检测，以SQ ID NO.3-4所示序列为引物，进行PCR鉴定，结果显示：得到2707bp的片段为阳性拟南芥植株，分株系收种，继续繁育。

实施例3转GmAKT1拟南芥的T4代功能分析

1、转GmAKT1拟南芥表型分析

野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子种植于MS培养基上，1周后分别移至土中，观察其生长发育过程，统计株高、莲座叶数、开花天数、荚数，计算平均值，结果如表1和图4所示。

表1 四种拟南芥的生长情况

转GmAKT1野生型拟南芥在株高上明显优于野生型、突变体和转GmAKT1突变体，其莲座叶较少，开花天数早，生长周期中结荚数较多。

2、转基因拟南芥ABA处理

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于0、0.5μmol/LABA、1μmol/LABA、2μmol/LABA的MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。5天后，观察其萌发生长情况(图5)，统计萌发率。试验重复三次，取平均值。

结果显示：在0处理培养基上，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥萌发率都为100％。

在ABA浓度为0.5μM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为38％、80％、33％、36％；

在ABA浓度为1μM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为7％、10％、8％、9％；

在ABA浓度为11μM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为5％、7％、3％、6％。

野生型、转GmAKT1野生型突变体恢复显示为相似的萌发率，其中过表达相对较低，AKT1突变体植株表现为对ABA的不敏感，萌发率远高于其他三种。因此，GmAKT1参与ABA信号途径，对ABA更敏感。

3、转基因拟南芥干旱胁迫

1)甘露醇处理下转基因拟南芥萌发率

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于含0、0.5mmol、1mmol、2mmol甘露醇的MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。5天后，观察其萌发生长情况，统计萌发率(图6)。试验重复三次，取平均值。

萌发率统计结果显示：0处理时野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥萌发率都为100％；

在甘露醇浓度为100mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为42％、37％、62％、39％；

在甘露醇浓度为300mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为12％、11％、16％、10％；

在甘露醇浓度为500mM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为3％、3％、4％、3％。

在甘露醇处理下，过表达植株的萌发率明显高于野生型、突变体、突变体恢复。说明GmAKT1可以在一定程度上提高拟南芥种子萌发期的抗旱性。

2)甘露醇处理下转基因拟南芥根长

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。7天后，分别将4种拟南芥幼苗移植到含0、0.5mmol、1mmol、2mmol甘露醇的MS方板培养基上，竖直培养，以便其根部垂直生长。7天后观察其生长情况，测量统计根长。试验重复三次，取平均值。

根长统计结果显示：在0处理培养基上，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为3.16cm、2.87cm、3.58cm、2.52cm；

在甘露醇浓度为100mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为2.19cm、2.08cm、3.40cm、2.39cm；

在甘露醇浓度为300mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为1.43cm、1.45cm、2.32cm、1.31cm；

在甘露醇浓度为500mM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为0.72cm、0.70cm、0.75cm、0.69cm。

转GmAKT1野生型拟南芥一直在根长上保持较大的优势。直到500mM的甘露醇处理下，四者根长变化才开始不明显。因此，GmAKT1参与调控拟南芥应对干旱逆境，可以一定程度上提高植物的抗旱能力。

3)拟南芥苗期耐性试验

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。7天后，将长势相似的拟南芥幼苗移植到土中置于温室，恢复一周后停止浇水。观察干旱缺水都4种拟南芥带来的影响(图7)。

对转基因拟南芥置于温室，进行不浇水干旱处理25d，当停止浇水后，突变体植株已经开始萎蔫枯干。野生型植株则生长缓慢于开花期开始萎蔫枯干，而转GmAKT1拟南芥可以勉强的维持开花结荚。转GmAKT1突变体植株则维持和野生型相似的萎蔫程度。说明GmAKT1可以在一定程度上提高拟南芥在苗期的耐旱性。

4)拟南芥离体叶片失水率

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。7天后，移植到土中使，正常浇水生长。待拟南芥7周龄时，取其长势相似，且完全伸展的莲座叶片，蒸馏水洗净，吸水纸擦干，放于培养皿上在万分之一天平上称量叶片重量，每一小时称量一次。

叶片失水率(％)＝(叶片鲜重—叶片干重)×100％/叶片鲜重

随着叶片离体时间的增多，各株系失水率增高。其中野生型、突变体、突变体恢复植株基本在5h失水率已经达到顶峰，维持不变。而转GmAKT1野生型植株则到6小时失水率还在增加，GmAKT1在一定程度上可以延缓离体叶片的失水率，说明GmAKT1在一定程度上可以增加拟南芥对于干旱的耐逆性。

4、转基因拟南芥的盐胁迫

1)氯化钠处理下转基因拟南芥萌发率

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于含0、50mmol氯化钠、100mmol氯化钠、150mmol氯化钠、200mmol氯化钠的MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。5天后，观察其萌发生长情况，统计萌发率。试验重复三次，取平均值。

萌发率统计结果显示：在0处理培养基上，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥萌发率都为100％；

在NaCl浓度为50mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为72％、65％、81％、68％；

在NaCl浓度为100mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为48％、38％、53％、42％；

在NaCl浓度为150mM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为28％、22％、32％、24％；

在NaCl浓度为200mM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的萌发率分别为4％、3％、13％、6％。

在NaCl处理下，过表达植株的萌发率明显高于野生型、突变体、突变体恢复型。随着浓度的增加，而过表达植株一直保持着远高于其他三者的萌发率。说明GmAKT1可以提高拟南芥种子萌发期的耐盐性。

2)氯化钠处理下转基因拟南芥根长

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。7天后，分别将4种拟南芥幼苗移植到含0、50mmol氯化钠、100mmol氯化钠、150mmol氯化钠、200mmol氯化钠的MS方板培养基上，竖直培养，以便其根部垂直生长。7天后观察其生长情况，测量统计根长。试验重复三次，取平均值。

根长统计结果显示：在0处理培养基上，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为3.16cm、2.87cm、3.58cm、2.52cm；

在NaCl的浓度为50mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为2.12cm、1.64cm、3.04cm、2.36；

在NaCl的浓度为100mM时，野生型、转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为1.33cm、1.09cm、2.13cm、1.11cm；

在NaCl的浓度为150mM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为1.02cm、0.82cm、1.26cm、0.96cm；

在NaCl的浓度为200mM时，转GmAKT1野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥的根长分别为0.97cm、0.92cm、1.05cm、1.01cm。

转GmAKT1野生型的根长长于野生型，且突变体的根长最短，转GmAKT1野生型拟南芥一直在根长上保持较大的优势。GmAKT1在一定程度上提高了拟南芥的耐盐性。

3)氯化钠处理下苗期耐性试验

将T4代转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子，经次氯酸钠灭菌后超净台内无菌操作播种于MS培养基上，以野生型作为对照。组培室光照条件为16h光/8h暗，温度22℃。7天后，将长势相似的拟南芥幼苗移植到土中。依次用100mmol氯化钠、200mmol氯化钠、300mmol浇灌，其间间隔3天。观察盐胁迫下4种拟南芥的生长情况。

处理20天后，结果显示：突变体植株叶片和茎都已经在盐渍的影响下完全萎蔫直至烂掉，而转GmAKT1的野生型植株却可以存活至结籽，表明，在一定程度上，GmAKT1在拟南芥的生长过程中提高了其对盐胁迫的抵抗性。

5、转基因拟南芥胁迫下DAB、NBT染色

1)染液配置

50mgDAB粉末倒入三角瓶中，加入45mL的灭菌水，用Hcl调PH值至3.0。随后加入2.5μL吐温20，2.5mL200mM的Na₂HPO₄，在调PH值至3.8。用锡纸包裹三角瓶，避光保存。

7.16g的Na₂HPO₄·12H₂O加蒸馏水定容至100mL配位为缓冲液甲，3.12g的NaH₂PO₄·2H₂O加蒸馏水定容至100mL配置为缓冲液乙。91.5mL的缓冲液甲加入8.5mL的缓冲液乙配置成10μMPH值为7.8的磷酸缓冲液。50mgNBT粉末倒入三角瓶中，加磷酸缓冲液定容至50mL，搅拌至溶解，避光保存。

2)幼苗处理

将野生型拟南芥、转GmAKT1的野生型拟南芥、AKT1突变体、转GmAKT1的AKT1突变体拟南芥种子无菌种植在MS培养基上，待长出4片叶时将长势相似的拟南芥移植200mM的NaCl培养基、10μM的ABA培养基、500mM的甘露醇处理16h。

3)染色方法：

处理后的拟南芥幼苗全部浸没在DAB染液中。真空处理15min，待全部植株完全沉入染液底部。光下染色2h。90％的酒精95℃-100℃洗脱，多次更换酒精直至叶绿素脱尽。保存在95％酒精中。

在0处理培养基上生长的野生型、突变体、转GmAKT1野生型、突变体恢复四种拟南芥DAB染色情况相似，产生过氧化氢的部位和程度差距不明显。在10μM ABA处理中，明显可以发现除过表达植株外，其余三者叶片颜色加深产生更多的过氧化氢。200mM NaCl处理中，突变体产生过氧化氢的量尤其多，转基因拟南芥的幼叶只有边缘被染色，而其他三种拟南芥的幼叶全部被染色，野生型的根部和突变体根部相比受到更多的过氧化氢伤害。500mM甘露醇处理后，突变体叶片过氧化氢产生量远远高于对照。因此，GmAKT1的过表达可以使转基因植株体内的过氧化氢得到一定程度的清除，减缓由活性氧引起的植株损伤(图8)。

0处理培养基上生长的野生型、突变体、转GmAKT1野生型、突变体恢复四种拟南芥NBT染色情况相似，只有很少量的超氧阴离子产生。在10μM ABA处理中，过表达植株和突变体产生较少的超氧阴离子，而野生型与突变体恢复叶片产生较多超氧阴离子。200mM NaCl处理中，过表达植株产生的超氧阴离子最少，突变体恢复植株集中在老叶上，野生型植株集中在叶片边缘，而突变体植株在集中在叶片，根部也有少许超氧阴离子产生。500mM甘露醇处理后，过表达拟南芥仅在叶片边缘产生超氧阴离子，野生型的根部也受到超氧阴离子的伤害。因此，GmAKT1的过表达可以使转基因植株体内的超氧阴离子得到一定程度的清除，减缓由活性氧引起的植株损伤(图9)。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，通过PCR扩增获得抗逆基因后，构建植物表达载体，再将植物表达载体转化到农杆菌上，再利用含有表达载体的农杆菌侵染目标植物，培育被侵染的目标植物至获得转抗逆基因的种子。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)提取大豆子叶总RNA，反转录后获得cDNA，并以所得cDNA为模板，进行PCR扩增，获得抗逆基因；

2)将步骤1)所扩增的抗逆基因插入到质粒载体上获得植物表达载体；

3)再将步骤2)所得的植物表达载体转化到农杆菌上，获得农杆菌转化子；

4)利用步骤3)所得的农杆菌转化子侵染目标植物，获得侵染植物；

5)培育侵染植物至获得含有抗逆基因的种子。

3.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述大豆，品种为东农50；所述抗逆基因，抗逆基因GmAKT1，GeneBank登陆号为KM491715.1。

4.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤1)所述PCR扩增，所用引物的核苷酸序列如SEQID NO.2-SEQ ID NO.3所示；扩增条件为：94℃2min；再进行38个循环，其中每个循环降0.2℃：98℃10s，58℃30s，68℃3min；68℃终延伸10min。

5.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤2)所述质粒载体，是质粒载体pCXSN。

6.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤3)所述将植物表达载体转化到农杆菌上，是将植物表达载体通过冻融法转化到根瘤农杆菌EHA105中。

7.权利要求2所述方法，其特征在于，步骤4)所述目标植物为拟南芥或大豆，侵染部位为花絮；所述侵染是将拟南芥的花絮浸入到转化液中28-32s。

8.权利要求7所述方法，其特征在于，所述转化液，是将农杆菌转化子在室温5000rpm下离心10min后，再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中，加入表面活性剂SilwetL-77制得。

9.权利要求2所述方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)提取东农50大豆子叶的总RNA，反转录获得cDNA后，以所得cDNA为模板，以如SEQID NO.2-SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，扩增条件为：94℃2min；再进行38个循环，其中每个循环降0.2℃：98℃10s，58℃30s，68℃3min；68℃终延伸10min，获得抗逆基因GmAKT 1扩增产物；

2)通过XcmI和Hind III的酶切作用将步骤1)所得的抗逆基因GmAKT 1扩增产物连接到质粒载体pCXSN上，获得植物表达载体pCXSN-GmAKT1；

3)通过冻融法将步骤2)所得的植物表达载体pCXSN-GmAKT1转化到根瘤农杆菌EHA105中，获得农杆菌转化子pCXSN-GmAKT1；

4)将步骤3)所得的农杆菌转化子pCXSN-GmAKT1在室温5000rpm下离心10min后，再将沉淀菌液悬浮在1/2MS缓冲液中，加入表面活性剂SilwetL-77制得转化液，将拟南芥的花絮浸入到转化液中30s后取出，获得侵染拟南芥；

5)平放步骤4)所得的侵染拟南芥，避光，保鲜膜包裹保持湿度，暗培养1d后，取出除去遮挡，放入培养箱中培养至获得转抗逆基GmAKT1的拟南芥种子。

10.权利要求1-9所述任一方法，其特征在于，用于农作物转基因育种。