CN115851788A - GmOTSa基因在植物抗逆境中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开GmOTSa基因在植物抗逆境中的应用，属于植物育种的技术领域。为了提供一种可以同时抗干旱的植株。本发明一种培育抗逆植株的方法：步骤1：将GmOTSa基因与pFGC5941载体连接，获得重组载体；步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入植物中获得转基因植株，鉴定后获得阳性的转基因植株。为植物在逆性的环境下的育种奠定扎实的基础。
Description
技术领域
本发明属于植物育种的技术领域，具体涉及GmOTSa基因在植物抗逆境中的应用。
背景技术
干旱属于全球范围内的一种自然灾害，影响植物生长发育。在萌发阶段，种子会因土壤水分含量低导致出苗率下降；在作物生长发育阶段，干旱会影响作物干物质的积累，从而大幅度影响作物产量；另外，干旱胁迫还会改变作物体内营养成分比例，从而影响作物品质。自然界中，植物一般会通过改变根和叶的形态来应对干旱胁迫：植物根系的根毛及侧根数量增加以提高吸水能力；叶片表面积降低，蜡质层增加，叶片枯萎甚至凋落以减少水分的流失。除了形态上的改变，作物还会通过改变自身生理过程及分子应答机制来应对胁迫状况。植物在长期适应逆境的过程中，进化出了从胁迫信号感受和转导、转录调控、蛋白翻译后修饰到代谢调控等多层次的应对策略。如何提高植物的抗干旱能力，是育种中的一个难题。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种可以抗干旱的植株，为植物在逆性的环境下的育种奠定扎实的基础。
本发明公开一种GmOTSa基因在植物抗逆境中的应用，编码GmOTSa基因的氨基酸序列的NCBI登录号为XP_003551198.1所示。
进一步地限定，所述GmOTSa基因的序列的NCBI登录号为XM_003551150.4所示。
进一步地限定，所述逆境为抗干旱或抗ABA。
进一步地限定，所述植物为烟草或大豆。
本发明公开一种超表达GmOTSa基因的植株在植物抗逆中的应用。
本发明公开一种含有GmOTSa基因的重组载体在植物抗逆中的应用。
本发明公开一种含有GmOTSa基因的重组载体的微生物细胞在植物抗逆中的应用。
进一步地限定，所述逆境为抗干旱或抗ABA；所述植物为烟草或大豆；所述GmOTSa基因的序列的NCBI登录号为XM_003551150.4所示。
本发明公开一种培育抗逆植株的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：将GmOTSa基因与pFGC5941载体连接，获得重组载体；
步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；
步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入植物中获得转基因植株，鉴定后获得阳性的转基因植株。
进一步地限定，所述植株为烟草或大豆。
有益效果：本发明首先进行GmOTSa的序列分析和启动子顺式调控元件分析，通过qRT-PCR对GmOTSa基因表达模式进行分析，发现GmOTSa基因在转录水平响应非生物胁迫；接着通过亚细胞定位实验确定GmOTSa定位于细胞核；然后通过体外反应验证了GmOTSa的SUMO蛋白酶活性及其活性发挥的关键位点；同时利用本实验室培育的转GmOTSa基因烟草验证了GmOTSa的体内SUMO蛋白酶活性；进一步通过对GmOTSa基因过表达烟草株系干旱胁迫处理前、后的表型分析、生理指标分析及干旱响应marker基因的表达模式分析，明确了GmOTSa基因具有提高植物抗旱性的功能。
同时利用发根农杆菌介导的大豆毛状根转化系统，获得了GmOTSa过表达大豆毛状根；并利用CRISPR-Cas9方法对GmOTSa和大豆基因组中另一个同源基因GmOTSb2进行了双基因双靶点的基因编辑，获得了两个基因同时敲除的突变体毛根；通过对过表达毛根和基因编辑毛根的抗旱性分析和生理指标分析，进一步明确了GmOTSa具有提高植物抗旱性的功能。
(1)通过GmOTSa的序列分析和启动子顺式调控元件分析，发现GmOTSa蛋白具有SUMO蛋白酶的完整C48蛋白结构域及特殊的催化三联体位点，预测大豆GmOTSa属于SUMO蛋白酶；同时发现GmOTSa的启动子区域包含多种胁迫响应元件，推测GmOTSa可能在转录水平响应多种生物或非生物胁迫；接着进行GmOTSa基因的表达模式分析，发现GmOTSa基因在大豆不同的组织中均有表达，并且在转录水平响应200mM NaCl、100μM ABA和20％ PEG 6000胁迫处理。
(2)构建pCAM35S-GmOTSa-GFP基因植物表达载体，通过根癌农杆菌GV3101介导本氏烟的瞬时转化，利用激光共聚焦显微镜观察荧光，确定GmOTSa定位于细胞核，GmOTSa是SUMO蛋白酶，定位于细胞核对GmOTSa生化功能的发挥即参与底物蛋白的去SUMO化过程至关重要。
(3)对野生型与GmOTSa过表达烟草进行甘露醇处理的萌发及根表型实验，发现GmOTSa过表达烟草的萌发率及侧根数均高于野生型；进行不同浓度ABA处理下的烟草萌发实验，发现GmOTSa过表达烟草株系在萌发期对ABA的敏感性低于野生型；对30日龄烟草植株进行干旱复水实验，发现复水2周后GmOTSa过表达株系的存活率明显高于野生型；对45日龄烟草植株进行干旱处理，发现控水7天后，野生型明显黄化萎蔫，GmOTSa过表达烟草植株叶片深绿并且形态相对完整；同时测定了丙二醛(MDA)含量及叶绿素含量，并进行DAB及NBT染色。表明干旱处理后，GmOTSa基因过表达通过增加植物的侧根数、提高叶片光合能力和活性氧的清除能力并降低了胁迫下的膜脂损伤，从而增强了烟草植株的抗旱性。
(4)与干旱处理前相比，干旱处理后GmOTSa基因过表达烟草中的干旱响应基因NtNCED1、NtSOD、NtAPX、NtRD22、NtTIP、NtP5CS、NtERD10B的转录水平比野生型增加幅度更大，而NtCAT的表达水平在野生型与过表达烟草间没有显著差异。表明GmOTSa基因过表达提高了烟草干旱响应基因的表达水平从而提高了植株的抗旱性。
(5)GmOTSa过表达大豆毛状根嵌合体通过降低膜脂损伤、增强光合能力及提高过氧化物清除酶的活性减少过氧化物积累增强了对干旱胁迫的抗性。
附图说明
图1为GmOTSa基因表达模式分析，注：A：大豆GmOTSa基因的组织表达特异性分析；B-E：在大豆根中胁迫处理表达模式分析200mM NaCl(B)、20％ PEG 6000(C)、100μM ABA(D)、42℃(E)；柱形图中“*”表示显著差异(p<0.05),“**”表示极显著差异(p<0.01)；
图2为pCAM35S-GmOTSa-GFP载体构建，注：A：植物表达载体pCAM35S-GmOTSa-GFP质粒构建示意图；B：GmOTSa基因PCR扩增；C：pCAM35S-GmOTSa-GFP转化DH5α鉴定；D：pCAM35S-GmOTSa-GFP转化GV3101鉴定；M1：5000Marker M2：2000Marker-：ddH2O对照+：阳性质粒对照；1：GmOTSa目的片段；2：pCAM35S-GmOTSa-GFP转化DH5αPCR；3：pCAM35S-GmOTSa-GFP转化GV3101 PCR；
图3为GmOTSa的亚细胞定位分析，注：使用共聚焦激光扫描显微镜观察信号，分别观察到35S：GmOTSa：GFP和35S：GFP转基因烟草细胞的荧光信号。图像从左至右分别是：明场，GFP荧光图像；合并的GFP荧光图像，显示GmOTSa定位于细胞核。比例尺＝25μm；
图4为GmOTSa(C486S)点突变位点示意图；
图5为pET32a-GmOTSa，pET32a-GmOTSa(C486S)载体构建，注：A：原核表达载体pET32a-GmOTSa质粒构建示意图；B：GmOTSa基因PCR扩增；C：GmOTSa(C486S)N端C端PCR扩增；D：pET32a-GmOTSa，pET32a-GmOTSa(C486S)转化DH5α鉴定；E：pET32a-GmOTSa，pET32a-GmOTSa(C486S)转化BL21(DE3)Star鉴定；M1：2000Plus Marker M2：15000Marker；-：ddH2O对照+：阳性质粒对照；1，2：GmOTSa目的片段；3：GmOTSa(C486S)N端PCR扩增；4：GmOTSa(C486S)C端PCR扩增；5：pET32a-GmOTSa转化DH5αPCR；6：pET32a-GmOTSa(C486S)转化DH5αPCR；7：pET32a-GmOTSa转化BL21(DE3)Star PCR；8：pET32a-GmOTSa(C486S)转化BL21(DE3)Star PCR；
图6为pET32a-GmSUMO2-AtFLC载体构建，注：A：原核表达载体pET32a-GmSUMO2-AtFLC质粒构建示意图；B：GmSUMO2基因PCR扩增；C：AtFLC基因PCR扩增；D：AtFLC基因同源臂引物PCR扩增；E：pET32a-GmSUMO2-AtFLC转化DH5α鉴定；F：pET32a-GmSUMO2-AtFLC转化BL21Star(DE3)鉴定；M：2000Marker；-：ddH2O对照；+：阳性质粒对照；1：GmSUMO2目的片段；2：AtFLC目的片段；3：AtFLC基因同源臂引物PCR扩增片段；4：pET32a-GmSUMO2-AtFLC转化DH5αPCR；5：pET32a-GmSUMO2-AtFLC转化BL21 Star(DE3)PCR；
图7为GmOTSa，GmOTSa(C486S)和GmSUMO2-AtFLC的原核表达，注：M：蛋白Marker；1：pET32a空载体His抗体检测；2：pET32a-GmOTSa His抗体检测；3：pET32a-GmOTSa(C486S)His抗体检测；4：pET32a-GmSUMO2-AtFLC原核表达His抗体检测；
图8为GmOTSa体外酶活分析，注：M：蛋白Marker；1-9分别为不同对照组及实验组；1：GmSUMO2-AtFLC+GmOTSa；2：GmSUMO2-AtFLC+GmOTSa(C486S)(C486S)；3：GmSUMO2-AtFLC；4：GmSUMO2-AtFLC+GmOTSa+NEM；5：GmSUMO2-AtFLC+GmOTSa(C486S)+NEM；6：GmSUMO2-AtFLC+NEM；7：GmOTSa；8：GmOTSa(C486S)；9：GmSUMO2-AtFLC；
图9为转pBI121-GmOTSa基因抗性植株T1代的PCR检测，注：M：2000Marker；-：ddH2O对照；+：阳性质粒对照；WT：烟草野生型对照；15：GmOTSa过表达株系#6T1代幼苗PCR检测；16-30：GmOTSa过表达株系#8T1代幼苗PCR检测；31-45：GmOTSa过表达株系#10T1代幼苗PCR检测；46-55：GmOTSa过表达株系#11T1代幼苗PCR检测；56-69：GmOTSa过表达株系#18T1代幼苗PCR检测；
图10为转pBI121-GmOTSa基因抗性植株T2的PCR检测，注：M：2000Marker；-：ddH2O对照；+：阳性质粒对照；1：烟草野生型对照：2-7：GmOTSa过表达株系#6；9-13：GmOTSa过表达株系#8；14-18：GmOTSa过表达株系#10；11-23：GmOTSa过表达株系#11；24-28：GmOTSa过表达株系#18T2代幼苗PCR检测；
图11为转pBI121-GmOTSa基因抗性植株目的基因的RT-PCR检测，注：1，2：WT；3，4：GmOTSa过表达株系#6；5，6：GmOTSa过表达株系#8；7，8：GmOTSa过表达株系#10；9，10：GmOTSa过表达株系#11；11，12：GmOTSa过表达株系#18。GmOTSa PCR条带约200bp，L25 PCR条带约50bp；
图12为转GmOTSa基因烟草株系和对照高温处理后SUMO化分析，注：M：蛋白marker；1-4：未处理的GmOTSa基因过表达烟草#6，#10，#18和WT；5-8：热处理1h的WT和GmOTSa基因过表达烟草#18，#10，#6；
图13为GmOTSa过表达烟草植株幼苗甘露醇处理下的萌发率分析，注：不同浓度甘露醇处理不同天数过表达烟草萌发状态(A)及萌发率(B)；
图14为不同浓度甘露醇基处理GmOTSa过表达烟草植株幼苗根长及侧根数分析，注：GmOTSa基因过表达烟草幼苗在200mM，300mM甘露醇处理8天表型(A)；根长统计(B)；侧根数量(C)；
图15为GmOTSa过表达烟草干旱复水表型及存活率分析，注：A：GmOTSa过表达烟草干旱复水表型；B：GmOTSa过表达烟草干旱复水存活率。柱形图中“*”表示显著差异(p<0.05),“**”表示极显著差异(p<0.01)；
图16为GmOTSa过表达烟草植株T2代幼苗ABA处理下的萌发率分析，注：不同浓度ABA处理不同天数过表达烟草萌发状态(A)及萌发率(B)；
图17为GmOTSa过表达烟草抗旱表型及叶绿素MDA含量测定，注：A：GmOTSa过表达烟草干旱处理表型分析；B：GmOTSa过表达烟草叶绿素荧光测定；C，D：GmOTSa基因过表达烟草干旱处理MDA，叶绿素含量测定。柱形图中“*”表示显著差异(p<0.05),“**”表示极显著差异(p<0.01)；
图18为GmOTSa过表达植株干旱处理DAB及NBT染色，注：野生型及GmOTSa基因过表达烟草干旱处理前后DAB染色(A)及NBT染色(B)；
图19为干旱胁迫响应基因在GmOTSa过表达烟草中的相对表达量，注：柱形图中“*”表示显著差异(p<0.05),“**”表示极显著差异(p<0.01)；
图20为pFGC5941-GmOTSa-eGFP-3*FLAG载体构建，注：A:载体构建示意图；B:GmOTSa基因PCR扩增；C:pFGC5941-GmOTSa-eGFP-3*FLAG转化DH5α鉴定；D:pFGC5941-GmOTSa-eGFP-3*FLAG转化EHA105鉴定；M:2000Marker；-:ddH2O对照；+:阳性质粒对照；1:GmOTSa基因PCR；2:pFGC5941-GmOTSa-eGFP-3*FLAG转化DH5αPCR；3:pFGC5941-GmOTSa-eGFP-3*FLAG转化EHA105 PCR；
图21为GmOTSa/b基因编辑靶点设计，注：A：GmOTSa基因编辑靶点设计；B：GmOTSb2基因编辑靶点设计；C：GmOTS-gRNA1/2靶点特异性比对；
图22为GmOTSa/b基因编辑载体构建，注：A：载体构建示意图；B：GmOTS-gRNA1-AtU6-GmOTS-gRNA2基因PCR扩增；C：p216212ab-GmOTSa-b转化DH5α鉴定；D：p216212ab-GmOTSa-b转化EHA105鉴定；M：2000Marker；-：ddH2O对照；+：阳性质粒对照；1：GmOTS-gRNA1-AtU6-GmOTS-gRNA2基因PCR；2：p216212ab-GmOTSa、b转化DH5αPCR；3：p216212ab-GmOTSa/b转化EHA105 PCR；
图23为转GmOTSa基因大豆毛状根的eGFP检测，注：使用荧光显微镜观察信号，分别观察，K599，和35S：GmOTSa：eGFP：3xFLAG转基因毛状根的荧光信号。图像从左至右分别是：明场，eGFP荧光图像；
图24为GmOTSa过表达及敲除大豆毛状根嵌合体干旱处理表型及生理指标分析，注：A.过表达毛状根中GmOTSa的表达量检测，利用q-GmOTSa-S和q-GmOTSa-AS引物对进行qRT-PCR检测；B.GmOTSa/b基因编辑毛根测序鉴定；C.GmOTSa过表达毛根(OE)和GmOTSa/b基因编辑毛根断水干旱处理10天后的表型，以转空菌K599为对照；D.GmOTSa过表达毛根(OE)和GmOTSa/b基因编辑毛根断水干旱处理15天后的表型，以转空菌K599为对照；E.干旱处理前后DAB染色；F.干旱处理前后NBT染色；G.干旱处理前后SPAD检测；H.干旱处理前后MAD含量分析；I.干旱处理前后相对电导率分析；J.干旱处理前后SOD活性分析。
具体实施方式
大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α(Cat：K10119)购自海基生物科技有限公司；原核表达菌株BL21 Star(DE3)(Cat：EC1005)购自唯地生物有限公司，农杆菌菌株GV3101，为本实验室
基因克隆所用质粒载体pEASY-Blunt Zero(Cat：CB501-01)平端克隆载体购自TransGen Biotech公司；pET32a原核载体为商业购买。
大豆(Glycine max)品种东农50，烟草(Nicotiana tabacum)品种山西烟、本氏烟草由本实验室保存。
抗体：Anti-AtSUMO1 antibody(Cat：ab5316)抗体购自Abcam公司，His-TagAntibody(Cat：66005-1-Ig)购自Proteintech Group公司，辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗兔IgG(Cat：ZB-2301)及山羊抗小鼠IgG(Cat：ZB-2305)购自中杉金桥公司。
氨苄霉素及卡那霉素：存储液100mg/mL水溶液，工作浓为100μg/mL。利福平：储存液50mg/mL甲醇溶液，工作浓度为50μg/mL。IPTG：存储液100mM水溶液，工作浓度为0.1-1mM。PMSF(蛋白酶抑制剂)：存储液100mM溶于异丙醇，工作浓度为0.1-1mM。10％ APS(过硫酸铵)：量取0.1g APS粉末置于1.5mL管中，加入1mL去离子水。50×TAE缓冲液：2M Tris-醋酸，100mM EDTA，蒸馏水定容至1L。考染染色液：含有0.25％(m/v)考马斯亮蓝G250，50％甲醇和10％醋酸的水溶液。考染脱色液：含30％甲醇和10％醋酸的水溶液。PBS缓冲液：137mMNaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 7.4。Reaction Buffer：50mM Tris-HCl(pH 7.9)，150mM NaCl，1％ Triton X-100，2mM DTT。DAB染液：1mg/mL的二氨基联苯胺水溶液。NBT染液：0.5mg/mL的氯化四氮唑蓝水溶液。LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加水至1L，pH 7.2。(固体培养基每升加入琼脂15g)，高温高压灭菌。烟草生根培养基(1/8MS)：30g/L蔗糖+0.55375g/L MS盐，30g/L琼脂，pH 5.8。
系统进化树的构建：使用MEGA-X软件，对大豆(Glycine max，Gm)、拟南芥(At)、水稻(Oryza sativa，Os)、花生两个品种(Arachis duranensis，Ad与Arachis ipaensis，Ai)、番茄(Solanum lycopersicum)、杨树(Populus，Pt)和短柄草(Brachypodium distachyon，Bd)SUMO蛋白酶氨基酸序列进行多序列比对并进行系统发生分析；通过Neighbor-joining(NJ)法构建系统进化树，其中Bootstrap value为1000，采用泊松分布模型，对空位采用complete deletion方式，最后使用iTOL(https://itol.embl.de/)进行进化树美化。
SUMO蛋白酶结构分析：使用ClustalX对大豆、拟南芥、短柄草和水稻OTS类蛋白进行多序列比对；采用Pfam(http://pfam.xfam.org/)进行相关蛋白保守功能域预测分析；使用MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)对氨基酸序列进行Motifs分析。使用Texshade对多序列比对及功能区进行结果展示，使用TBtools对SUMO蛋白酶结构结果进行展示。
顺式作用元件分析：Phytozome数据库中截取基因CDS区上游1500bp区域作为启动子序列进行预测分析。利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线网站基因的启动子进行顺式作用元件分析，并筛选出激素、胁迫及生长发育响应元件，利用TBtools进行结果展示。
实施例1.GmOTSa基因转录水平表达模式分析
1.大豆非生物胁迫的处理方法及取材
处理方法：使用分别添加200mM NaCl、100μM ABA和20％ PEG 6000的1/4Hoagland营养液对大豆幼苗进行胁迫处理；将幼苗放置于42℃的恒温培养箱进行热胁迫处理。
取材方法：分别在处理后的0h、1h、6h、12h、24h取大豆幼苗的第二组三出复叶，收集的材料置于液氮中冷冻处理，避光迅速保存-80℃冰箱中，每组取三个生物学重复，备用。
2.大豆不同组织部位取材
挑取饱满“东农50”品种大豆种子，放在湿润纱布上催芽一天，播种于蛭石中，16h/8h，27℃/25℃，光/暗，期间浇灌1/4Hoagland溶液，保持蛭石湿润，培养至子叶刚展开，取子叶幼根材料；至第二片三出复叶刚展开，取第二片三出复叶及根尖3cm；于始花期取花；至豆荚长至1-2cm时取豆荚，在鼓粒期取豆，收集的材料置于液氮中冷冻处理，避光迅速保存-80℃冰箱中，每组取三个生物学重复，备用。
3.不同植物样品RNA提取
取大豆不同组织部位材料每份约200mg，迅速置于放好瓷珠的2mL RNase Free管中，使用样品快速研磨仪将样品磨碎，提取步骤详见Ultrapure RNA Kit超纯RNA提取试剂盒(CW0581)说明书。
4.cDNA第一链的合成
准备200μL RNase free离心管置于冰上，加入700ng模板RNA，2μL 4×gDNA wiperMix，以RNase Free Water补足至8μL，吹打混匀，于PCR仪中42℃保温2min；
向上步反应溶液中直接加入2μL 5×HiScriptⅡSelect qRT SuperMixⅡ，吹打混匀，50℃15min，85℃，2min后终止反应。
5.qRT-PCR分析GmOTSa基因表达模式
使用TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒，荧光定量PCR仪，目的基因的相对表达量变化倍数采用2-ΔΔCt的方法计算。引物序列见下表1。
表1 GmOTSa qPCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| q-GmOTSa-S | GGACGACCTCTCCGCTATTCCCGAT(SEQ ID NO.1) |
| q-GmOTSa-AS | TCAAGTCATTAGACACACCCTCAGT(SEQ ID NO.2) |
| GmTUA5-S | TGCCACCATCAAGACTAAGAGG(SEQ ID NO.3) |
| GmTUA5-AS | ACCACCAGGAACAACAGAAGG(SEQ ID NO.4) |
GmTUA5-S和GmTUA5-AS是内参基因引物，用来校正目的基因相对表达量。
具体反应体系如下：
| cDNA模板 | 1ng |
| 上游引物(10μM) | 0.4μL |
| 下游引物(10μM) | 0.4μL |
| 2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix | 10μL |
| ddH<sub>2</sub>O | Up to 20μL |
结果：为了分析GmOTSa基因(NCBI的登录号为XM_003551150.4)的表达模式，利用qRT-PCR的方法分析了GmOTSa基因在大豆不同组织部位(包括叶、根、子叶、幼根、花、荚、豆)表达模式以及大豆V2期根部200mM NaCl、20％ PEG 6000、100μM ABA和42℃处理0h、1h、6h、12h、24h基因的相对表达量。图1A所示，GmOTSa基因在大豆叶、根、子叶、幼根、花、荚、豆中，均有表达，并且在花中表达量明显高于其他组织。因为在V2期的大豆中，根中GmOTSa基因表达量略高于同时期的叶片，并且在胁迫处理时，大豆根部直接接触培养液，所以选择大豆根尖3cm作为分析胁迫处理后GmOTSa基因的表达模式的实验材料。在200mM NaCl处理下，GmOTSa基因在处理12h时表达量最高，达到未处理时的2倍左右，在24h时迅速降低(见图1B)；20％ PEG 6000处理时，1h时表达量略有上升，6h时表达量急剧上升并达到最高，约为未处理的30倍，随后表达量略有降低但仍维持上调趋势，24h时降低至未处理的20倍(见图1C)；100μM ABA处理条件下GmOTSa基因表达量差异不显著，在0-6h略有上升，在处理12-24h后下调至未处理的1/2(见图1D)；高温处理条件下，GmOTSa基因表达量在整个处理周期并无显著差异(见图1E)。基因表达模式分析表明GmOTSa在干旱处理下表达量上调显著，表明SUMO蛋白酶基因在转录水平上强烈响应干旱胁迫。
实施例2.GmOTSa的亚细胞定位
1.亚细胞定位载体的构建
(1)GmOTSa线性化片段的制备
使用Vazyme高保真酶，以实验室前期构建的克隆载体pEASY-Blunt Zero-GmOTSa为模板，使用引物GmOTSa-GFP-S，GmOTSa-GFP-AS进行目的片段扩增，使用全氏金胶回收试剂盒回收GmOTSa线性化片段。引物序列见表3，反应体系如表2：
表2
| 2×Phanta Max Buffer | 25μL |
| dNTP Mix(10mM each) | 1μL |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | 1μL |
| 上游引物(10μM) | 2μL |
| 下游引物(10μM) | 2μL |
| 模板 | 1μL |
| ddH<sub>2</sub>O | Up to 50μL |
表3 pCAM35S-GmOTSa-GFP载体构建引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| GmOTSa-GFP-S | GAGCTCGGTACCCGGGGATCCATGGAGGAACAACAA |
| GmOTSa-GFP-AS | GGTGTCGACTCTAGAGGATCCCGTCACAGAATCCTG |
(2)pCAM35S-GmOTSa-GFP表达载体构建
利用BamHⅠ单酶切原核表达载体pCAM35S-GFP，酶切体系如下：
使用同源重组的方法构建pCAM35S-GmOTSa-GFP表达载体，重组体系如下：
| ExnaseII | 2μL |
| 5×CEII Buffer | 4μL |
| 插入片段扩增产物 | 50～200ng |
| 线性化克隆载体 | 50～200ng |
| ddH<sub>2</sub>O | Up to 20μL |
室温连接30 min后采取常规冻融法转化大肠杆菌感受态DH5α，提取质粒进行PCR鉴定，PCR体系及条件同(1)。
2.GFP融合表达载体对农杆菌的转化
将构建成功的pCAM35S-GmOTSa-GFP表达载体通过常规冻融法转化根癌农杆菌GV3101。使用GmOTSa-GFP-S，GmOTSa-GFP-AS进行检测，PCR体系及条件同2.2.3.1，将阳性转化子活化进行下一步实验。
3.农杆菌侵染烟草进行体内瞬时表达
将含有目的质粒的农杆菌活化至OD600＝0.5～0.8，5000rpm离心10min收集菌体，使用等体积重悬液(10mM MES，10mM MgCl2，0.2mM乙酰丁香酮)重悬，室温静止3h，注射本氏烟草叶片，3天后使用激光共聚焦显微镜观察荧光。
结果：SUMO蛋白酶的定位是靶标识别的关键决定因素，为了进行GmOTSa的亚细胞定位分析，构建植物表达载体pCAM35S-GmOTSa-GFP，构建示意图见图2A。首先利用引物GmOTSa-GFP-S和GmOTSa-GFP-AS对GmOTSa基因进行PCR扩增，在GmOTSa基因两端添加BamHⅠ酶切位点以及同源臂，获得1800bp左右的目的条带(图2B)，用限制性核酸内切酶BamHⅠ对植物表达载体pCAM35S-GFP(骨架是pCG3301，把bar基因替换成潮霉素抗性基因，加了egfp标签)进行酶切、回收，通过同源重组的方法，将GmOTSa全长基因与线性化的pCAM35S-GFP载体连接获得重组质粒pCAM35S-GmOTSa-GFP，转化大肠杆菌DH5α；以重组质粒作为模板，使用引物GmOTSa-GFP-S和GmOTSa-GFP-AS进行PCR检测，获得PCR扩增产物为2000bp的阳性转化子(图2C)；将构建正确的重组质粒pCAM35S-GmOTSa-GFP转化根癌农杆菌GV3101，使用引物GmOTSa-GFP-S和GmOTSa-GFP-AS进行PCR检测，获得含有35S启动子调控的目的基因GmOTSa融合GFP的重组质粒的农杆菌(图2D)，用于后续对本氏烟的瞬时转化实验。
将含有重组质粒以及空载体的农杆菌进行活化，注射烟草叶片，通过激光共聚焦分析，可见被pCAM35S-GmOTSa-GFP菌株侵染的烟草叶片仅可在细胞核中观察到绿色荧光，而空载体菌株侵染的烟草叶片在细胞核、细胞质、细胞膜中均可检测到荧光信号(图3)，表明GmOTSa定位在细胞核中。
实施例3.GmOTSa的体外酶活分析
1.GmOTSa及GmOTSa(C486S)的原核表达载体构建
(1)GmOTSa线性化片段的制备
使用Vazyme高保真酶进行目的片段扩增，使用引物GmOTSa-32a-S及GmOTSa-32a-AS对GmOTSa及GmOTSa(C486S)进行扩增，引物见下表4。
表4 pET32a-GmOTSa及pET32a-GmOTSa(C486S)原核表达载体构建引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| GmOTSa-32a-S | ATCGGATCCGAATTCGAGCTCATGGAGGAACAACAACAACA |
| GmOTSa-32a-AS | CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACGTCACAGAATCCTGGG |
| SER-S2 | AAGAATGAATATGACTCTGGTCTTTTTGTATTG |
| SER-S1 | TCTGGTCTTTTTGTATTG |
(2)目的基因活性位点的突变
使用引物GmOTSa-32a-S和SER-S2扩增获得插入片段GmOTSa(C486S)-N，使用引物SER-S1和GmOTSa-32a-AS扩增获得插入片段GmOTSa(C486S)-C，扩增程序如下：
(3)pET32a-GmOTS及pET32a-GmOTS(C486S)原核表达载体构建
利用SacⅠ及HindⅢ两种限制性内切酶对原核表达载体pET32a进行双酶切，酶切体系如下，采用琼脂糖凝胶试剂盒回收，具体操作步骤详见说明书。
| pET32a | 1μg |
| SacⅠ | 1μL |
| HindⅢ | 1μL |
| 10×CutSmart Buffer | 5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | Up to 50μL |
采用一步克隆试剂盒进行pET32a-GmOTSa：
使用多片段同源重组的方法构建原核表达载体pET32a-GmOTSa(C486S)，在GmOTSa基因的第486氨基酸位进行点突变，将其由C突变为S，体系如下：
| 线性化载体 | 4μL |
| 插入片段1：GmOTSa(C486S)-N | 2μL |
| 插入片段2：GmOTSa(C486S)-C | 2μL |
| 5×CE MultiS Buffer | 2μL |
| Exnase MultiS | 2μL |
| ddH<sub>2</sub>O | Up to 50μL |
连接30min后采取常规冻融法转化大肠杆菌感受态DH5α，提取质粒进行PCR鉴定，使用引物GmOTSa-32a-s及GmOTSa-32a-as，进行PCR检测，鉴定为正确的重组质粒进行测序。
结果：为了验证GmOTSa是否具有预测的SUMO蛋白酶活性，同时分析其酶活性位点，首先构建GmOTSa及预测的活性位点突变形式GmOTSa(C486S)(突变位点如图4所示)的原核表达载体pET32a-GmOTSa和pET32a-GmOTSa(C486S)，原核表达载体构建示意图见图5A。利用PCR的方法在GmOTSa基因两端添加酶切位点HindⅢ，SacⅠ及同源臂序列并回收片段(如图5B)；为了获得GmOTSa(C486S)突变形式，使用引物GmOTSa-32a-s和SER-S2扩增获得插入片段GmOTSa(C486S)-N，使用引物SER-S1和GmOTSa-32a-as扩增获得插入片段GmOTSa(C486S)-C(图5C)，在N端片段上游添加SacⅠ位点，在C端片段上游通过引物设计将第486位的半胱氨酸(C)突变为丝氨酸(S)，在C端片段下游添加HindⅢ位点。使用SacⅠ及HindⅢ对原核表达载体pET32a进行酶切，回收酶切后的载体大片段。使用单片段及多片段同源重组的方法分别构建pET32a-GmOTSa及pET32a-GmOTSa(C486S)原核表达载体，转化大肠杆菌DH5α，利用引物GmOTSa-32a-AS，GmOTSa-32a-AS PCR鉴定，转化子为具有2000bp PCR产物的阳性转化子(图5D)，将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)Star并检测，阳性转化子(图5E)即可诱导表达目的蛋白。
2.底物蛋白GmSUMO2-AtFLC的原核表达载体构建
(1)拟南芥AtFLC基因(NCBI登录号为NM_121052.3)克隆
以拟南芥cDNA为模板，利用拟南芥AtFLC基因序列克隆引物AtFLC-S，AtFLC-AS引物序列见表5，使用高保真酶，通过PCR扩增获得目的基因，并连接到pEASY-Blunt ZeroCloning Kit(Cat：CB501-01)克隆载体上。
表5pET32a-GmSUMO2-AtFLC原核表达载体构建引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| AtFLC-S | AAATAGAAAGAGAAAACGCTTAGTA |
| AtFLC-AS | CTTATCAGCGGAATAATTACATA |
| 32a-GmSUMO2-S | ATCGGATCCGAATTCGAGCTCATGTCTGTATCAGGA |
| GmSUMO2-AtFLC | GTTTTTTTCTTCCCATACCTCCGGTTTGGTG |
| AtFLC-32a-AS | CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCTAATTAAGTAGTGG |
连接克隆载体37℃，反应30min体系如下：
目的基因 4μL
pEASY-T1 Simple克隆载体 1μL
(2)AtFLC片段的获得
以测序正确的pEASY-Blunt Zero-AtFLC为模板，使用GmSUMO2-AtFLC，AtFLC-32a-AS引物，使用高保真酶，通过PCR扩增获得AtFLC基因(NM_121052.3)片段，使用胶回收试剂盒进行PCR产物纯化。(3)GmSUMO2(NCBI登录号为XM_003552073.5)基因片段的获得
以实验室前期构建的克隆载体pEASY-Blunt Zero-GmSUMO2为模板，利用引物32a-GmSUMO2-S，GmSUMO2-AtFLC，使用高保真酶，通过PCR扩增获得GmSUMO2基因片段。
(2)pET32a-GmSUMO2-AtFLC原核表达载体构建
使用及多片段同源重组的方法构建原核表达载体pET32a-GmSUMO2-AtFLC。
结果：为了验证GmOTSa的体外蛋白酶活性，首先对SUMO-底物融合蛋白进行原核表达，拟南芥AtFLC是文献报道的已知SUMO蛋白酶底物，因此构建原核表达载体pET32a-GmSUMO2-AtFLC，构建示意图见图6A，以实验室保存的pEASY-Blunt Zero-GmSUMO2为模板，用引物32a-GmSUMO2-S和GmSUMO2-AtFLC进行PCR扩增获得带有同源臂的GmSUMO2基因片段(图6B)；同时提取拟南芥叶片总RNA，反转录获得cDNA模板，用引物AtFLC-S和AtFLC-AS进行PCR扩增，获得约800bp的PCR产物(图6C)，经测序获得目标基因AtFLC，使用GmSUMO2-AtFLC和AtFLC-32a-AS进行扩增在AtFLC两端加同源臂(图6D)；利用SacⅠ及HindⅢ进行双酶切获得线性化的pET32a原核表达载体，采用多片段同源重组的方法，构建pET32a-GmSUMO2-AtFLC原核表达载体；利用引物AtFLC-S和AtFLC-AS进行PCR检测，阳性转化子可鉴定出约800bp的目的条带(图6E)，经测序，确定重组转化子GmSUMO2与AtFLC基因融合表达且表达框正确。将pET32a-GmSUMO2-AtFLC转化BL21 Star(DE3)，检测获得正确重组转化子(图6F)，用于后续原核表达实验。
3.GmOTSa、GmOTSa(C486S)及GmSUMO2-AtFLC的原核表达
将上一步构建得到的原核表达载体pET32a-GmOTSa、pET32a-GmOTSa(C486S)及pET32a-GmSUMO2-AtFLC采取常规冻融法转化BL21(DE3)star感受态细胞。使用IPTG进行诱导表达。
结果：分别将成功转化pET32a-GmOTSa、pET32a-GmOTSa(C486S)及pET32a-GmSUMO2-AtFLC重组质粒的BL21 Star(DE3)菌株进行IPTG诱导表达并使用His-Tag蛋白纯化试剂盒纯化，利用His抗体对纯化后的蛋白进行Western blot检测，结果如图7泳道2和3，在80-100kDa位置可观察到诱导产生的特异性条带，这与预期融合了标签的目的蛋白条带大小相符，表明GmOTSa及GmOTSa(C486S)已成功表达；图7泳道4在58-80kDa有目的蛋白表达，与预期的融合的底物蛋白GmSUMO2-AtFLC大小相符，表明GmSUMO2-AtFLC已成功表达，可以进行下一步SUMO蛋白酶活性检测实验。
为了明确GmOTSa的体外蛋白酶活性并验证其酶活性位点，将GmOTSa、GmOTSa(C486S)与GmSUMO2-AtFLC进行体外反应，反应结束后进行Western blot分析，如图8所示；GmOTSa与GmOTSa(C486S)蛋白大小与预期相符(图8样品7，8)；图8样品9为单底物对照，在无蛋白酶抑制存在时37℃反应30min条件下，在32kDa位置出现一条蛋白条带，表明底物蛋白自身存在一定程度的水解；当加入GmOTSa蛋白与底物后，His-GmSUMO2-AtFLC的信号明显减弱，His-GmSUMO2蛋白量明显增多(图8样品1)，表明底物蛋白可以被GmOTSa迅速水解；而在相同底物中加入GmOTSa(C486S)后，在相同反应条件下底物量没有明显减少，32kDa位置的信号推测为自身水解条带(图8样品2)，表明C486S突变导致了SUMO蛋白酶活性的丧失，验证了GmOTSa具有SUMO蛋白酶活性且活性位点为第486位的半胱氨酸。同时，验证了GmOTSa的蛋白酶活性对蛋白酶抑制剂NEM的敏感性。在NEM存在时，无论加入GmOTSa(图8样品4)、GmOTSa(C486S)(图8样品5)和His-GmSUMO2-AtFLC进行反应，或者只加入His-GmSUMO2-AtFLC(开花基因)(图8样品6)经过反应后，His-SUMO蛋白水平均无明显变化，表明GmOTSa的活性可被NEM抑制。
4.GmOTSa体外酶活分析
将超声破碎获得的GmOTSa，GmOTSa(C486S)，GmSUMO2-AtFLC蛋白使用Reactionbuffer低温过夜透析后，按下表配置反应体系，反应管1、2、3、9于37℃反应30min，反应管4、5、6、7、8加样后立刻加入上样缓冲液煮沸，进行SDS-PAGE电泳后，使用His抗体进行Westernblot检测，方法如表6所示：
表6体外酶活反应体系
5.GmOTSa的体内酶活分析
提取转GmOTSa基因T2烟草代的总DNA并以此作为PCR模板进行阳性植株的检测，以pBI121-GmOTSa质粒作为阳性对照，以ddH2O为空白对照，未进行转化的植株(WT)总DNA作为阴性对照，以q-GmOTSa-S,q-GmOTSa-AS进行PCR扩增。将PCR检测均为阳性的株植株再进行RT-PCR检测，使用内参引物L-25序列见表7作为对照，以q-GmOTSa-S,q-GmOTSa-AS进行RT-PCR检测。L-25内参扩增时，调整cDNA模板加样量，使扩增出L-25内参条带亮度基本一致。
表7 L-25PCR引物序列
| 引物名称 | 引物序列 |
| L25-S | GCTTTCTTCGTCCCATCA |
| L25-AS | CCCCAAGTACCCTCGTAT |
将野生型与GmOTSa过表达烟草(带有pBI121-GmOTSa载体的农杆菌转化到烟草中获得的)幼苗进行42℃高温处理，提取烟草总蛋白并定量，利用拟南芥AtSUMO1抗体进行Western blot检测，通过对比野生型与GmOTSa过表达烟草SUMO结合物量的变化，验证GmOTSa的体内SUMO蛋白酶活性。
结果：为了确定后续实验材料为转基因阳性材料，提取T1及T2代GmOTSa基因过表达株系的总DNA，作为PCR模板进行阳性植株的检测，结果如图9，10所示。结果表明，检测的四个过表达株系中有三个过表达株系为PCR阳性。接着对PCR阳性的GmOTSa过表达株系，使用引物q-GmOTSa-S，用q-GmOTSa-AS进行RT-PCR检测，结果如图11所示，野生型植株RT-PCR结果未见阳性条带，T2代过表达株系#6、#8、#18分别各有两个单株可见明亮条带，T2代GmOTSa过表达株系#10仅有一个单株检测为阳性，检测结果表明GmOTSa基因在T2代#6、#8、#18三个转基因烟草株系中可稳定遗传并可以正常转录。
已有文献报道高温处理可以诱导多种植物中SUMO结合物急剧上升，而SUMO蛋白酶会使SUMO结合物水平受到抑制，为了验证GmOTSa是否具有体内SUMO蛋白酶活性，分别选取长势基本一致的3株过表达阳性烟草植株和野生型植株，在42℃恒温培养箱里处理60min，再选取同样大小的正常培养的野生型和过表达烟草作为对照，取从上向下第4片叶子提取蛋白并定量。使用拟南芥AtSUMO1抗体进行Western blot，结果如图12所示，在42℃高温处理后，野生型植株中SUMO高分子结合物水平明显上升(泳道4和5)与之前研究结果相符，而在42℃处理的GmOTSa过表达烟草中，SUMO结合物水平明显低于野生型植株(泳道6-8)，表明GmOTSa基因的过表达增强了转基因烟草的去SUMO化能力，验证了GmOTSa在植物体内具有SUMO蛋白酶的活性。
实施例4.GmOTSa过表达的烟草的抗旱功能
1.GmOTSa过表达烟草萌发实验
对野生型及T2代GmOTSa过表达烟草种子用75％酒精表面消毒15s，2％次氯酸钠消毒15min，用灭过菌的ddH2O冲洗5遍，接种于含200mM、300mM甘露醇，3μM、5μM ABA的不同培养基进行培养，并观察萌发率。
2.GmOTSa过表达烟草根长实验
将灭菌的野生型及T2代GmOTSa过表达烟草种子接种于萌发培养基中，7天后挑选长势一致的幼苗接于附加不同浓度甘露醇的培养基中，于8天后观察表型，并统计根长以及侧根数量。
3.GmOTSa过表达烟草干旱处理
对在土中生长30天的GmOTSa过表达烟草进行分子生物学检测，充分浇水后控水14天，观察并记录表型，接着复水14天，观察表型并统计复水后的存活率。
在土中生长45天的野生型及GmOTSa过表达烟草，充分浇水后控水一周，观察表型，取处理前后从上至下第3片叶子测定MDA及叶绿素含量，进行NBT及DAB染色。
4.GmOTSa过表达烟草生理指标测定
MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法，叶绿素含量测定采用分光光度法，具体步骤详见《植物生理学实验教程》。
NBT及DAB染色方法：取干旱处理前后相同叶位的野生型与过表达烟草完整植物叶片，置于染液中抽真空30min，染色4-6h，95％乙醇沸水浴脱色，观察染色结果。
5.GmOTSa过表达烟草干旱处理下游marker基因分析
在土中生长45天的野生型及GmOTSa过表达烟草充分浇水后控水一周，取从上至下的第二片叶子，提取RNA并反转录，利用表8的引物进行qPCR实验。
表8烟草干旱响应基因qPCR引物
| 引物名称 | 引物序列 |
| NtSOD-S | CTCCTACCGTCGCCAAAT |
| NtSOD-AS | GCCCAACCAAGAGAACCC |
| NtCAT-S | AGGTACCGCTCATTCACACC |
| NtCAT-AS | AAGCAAGCTTTTGACCCAGA |
| NtAPX-S | GCTGGAGTTGTTGCTGTTGA |
| NtAPX-AS | TGGTCAGAACCCTTGGTAGC |
| NtRD22-S | GCTGTAGTTTGCCACAAGCA |
| NtRD22-AS | AGCCTTTGTTCCATCAGCAC |
| NtNCED1-S | AAGAATGGCTCCGCAAGTTA |
| NtNCED1-AS | GCCTAGCAATTCCAGAGTGG |
| NtERD10B-S | CGGACGAATACGGCAATC |
| NtERD10B-AS | CAGCGTGAGTTCCATAGG |
| P5CS-S | TGTTATTCCAAGAGGTAGCA |
| P5CS-AS | AGTGTTTCCATCGCATTAC |
| TIP-S | CATCATCTGTTCCACCATAAG |
| TIP-AS | GCTATCTCTTCCTCTATCTTGT |
结果：甘露醇是一种常见的用于模拟干旱的渗透压调节剂，为了探讨GmOTSa过表达烟草在萌发期对干旱胁迫的响应，利用甘露醇模拟干旱观察野生型与GmOTSa过表达烟草T2代在干旱胁迫下的萌发情况。如图13中的A、B所示，1/8MS培养基生长的野生型与GmOTSa过表达烟草幼苗表型与萌发率均无明显差异；而在添加200mM和300mM甘露醇的1/8MS培养基萌发15天后，GmOTSa过表达烟草萌发状态与萌发率明显好于野生型，并且与野生型植株相比GmOTSa过表达烟草幼苗长势较好。表明在萌发期GmOTSa过表达烟草对干旱的抗性增强。
植物根系生长状态是评价植物抗旱性的形态指标，为了分析GmOTSa过表达烟草的抗旱增强与其根系发育的关系，进行了甘露醇模拟干旱条件下野生型与GmOTSa基因过表达烟草的根长及侧根数量的统计分析，结果如图14所示，不添加甘露醇时野生型与GmOTSa过表达烟草之间并无明显表型差异并且根长及侧根数统计无明显差别，在200mM甘露醇处理下，野生型与GmOTSa基因过表达烟草的根长并无明显差别，但过表达烟草侧根数较野生型植株多，且幼苗生长情况相对野生型来说长势较好，而在300mM甘露醇处理下野生型植株与GmOTSa过表达烟草根长表型及侧根数量均无明显差别，GmOTSa基因通过影响植物侧根数量以影响植物根系吸水能力，进而增加植物对干旱胁迫的抗性。
为了进一步分析GmOTSa过表达烟草的抗旱性，对30日龄的幼苗进行干旱复水实验，在充分浇水后控水14天，之后复水并在复水第14天时进行表型观察及存活率统计。结果如图15所示，干旱14天时野生型与GmOTSa过表达烟草均受到了严重的干旱胁迫，烟草叶片均萎蔫黄化严重；复水14天后，野生型植株大部分死亡，只有少部分植株出现了表型恢复，而大部分GmOTSa过表达烟草生恢复继续生长，叶片挺立、颜色深绿，且GmOTSa过表达烟草新生绿叶面积明显大于野生型烟草；进一步统计野生型和GmOTSa过表达烟草干旱复水后的存活率(图15B)，可见两个过表达株系的存活率均在80％以上，而野生型植株的存活率只有约15％。30日龄GmOTSa过表达烟草对严重干旱的抗性明显高于野生型，并且复水后存活率高于野生型，表明GmOTSa的过表达使烟草的抗旱性显著增强。
抗ABA的实验：ABA处理下的萌发实验，如图16中的A、B所示，1/8MS培养基生长的野生型与GmOTSa过表达烟草幼苗表型与萌发率均无明显差异；在含3μM或5μM ABA培养基萌发15天，GmOTSa过表达烟草萌发率高于野生型，并且幼苗生长情况优于野生型，表明GmOTSa过表达烟草在萌发期对ABA敏感性降低。
GmOTSa过表达烟草干旱处理下的生理指标分析：为了进一步分析GmOTSa过表达烟草在干旱胁迫下的生理响应，对生长45天的幼苗进行轻度的干旱处理。结果如图17A所示，处理前选取长势相似的野生型和过表达烟草，控水7天后，野生型植株叶片明显黄化萎蔫，GmOTSa基因过表达烟草的叶片受损较轻，形态完整且颜色深绿，在干旱胁迫初期表现出更强的抗旱性。MDA水平通常用作衡量膜损坏和植物抗性的指标，对野生型和过表达烟草干旱处理前后的MDA含量进行了测定。结果如图17B所示，干旱处理前，野生型与过表达烟草MDA含量无显著差异，而干旱处理后，GmOTSa基因过表达烟草MDA含量明显低于野生型，表明GmOTSa过表达烟草受到的细胞膜损伤较轻。叶绿素含量是衡量植物抗逆性的重要指标。对野生型以及GmOTSa过表达烟草行了叶绿素荧光测定，如图17C所示，干旱处理前野生型植株与GmOTSa过表达烟草的叶绿素荧光并无显著差异，干旱处理后过表达植株叶绿素荧光强度明显高于野生型。同时测定了干旱处理前后野生型与GmOTSa过表达烟草的叶绿素含量，如图17D所示，干旱处理前野生型和GmOTSa过表达烟草的叶绿素含量无显著差异，干旱处理后野生型和GmOTSa过表达烟草的叶绿素荧光均有所降低，但是GmOTSa过表达烟草的叶绿素含量显著高于野生型。以上结果表明GmOTSa过表达烟草通过降低膜脂损伤及增强光合能力增强了对干旱胁迫的抗性。
为了进一步分析GmOTSa过表达烟草抗旱性增强的原因，利用二氨基联苯胺(DAB)和氯化四氮唑蓝(NBT)染色对GmOTSa过表达烟草和对照干旱胁迫后ROS的积累情况进行了检测。DAB可被H2O2氧化后产生红棕色沉淀，NBT与O2-反应形成深蓝色的化合物，因此可通过反应后样品的颜色判断植物受到氧化损伤的程度。DAB及NBT染色结果如图18中的A、B所示，干旱处理前，野生型和GmOTSa过表达烟草颜色均较浅，没有明显差异；干旱处理后野生型烟草叶片颜色相对于处理前叶片染色面积增多并且颜色加深，而GmOTSa过表达烟草叶片相对于处理前颜色变化很小，且颜色明显比野生型浅。表明处理前野生型与GmOTSa过表达烟草均没有明显的ROS积累，干旱处理后，野生型与GmOTSa过表达烟草的ROS积累均有升高，但是GmOTSa过表达烟草的ROS积累明显低于野生型。推测GmOTSa基因过表达烟草干旱处理后ROS的积累量较小，其在干旱胁迫中带来的毒害作用较小，从而表现出更强的抗旱能力。
转基因烟草干旱处理下游marker基因分析：为了分析GmOTSa在植物抵抗干旱胁迫过程中的基因调控途径，选取长势相似的45日龄的野生型和GmOTSa过表达烟草植株，充分浇水后控水7天，取从上向下第2片叶子，提取总RNA并反转录为cDNA，采用qRT-PCR方法对干旱胁迫前后的野生型和GmOTSa过表达烟草的胁迫相关基因表达水平进行了检测。
为了探讨GmOTSa基因与ROS清除基因的关系，检测了ROS清除相关基因NtSOD、NtAPX和NtCAT在干旱处理前后野生型与GmOTSa过表达烟草中的表达水平，如图19中的A、B、C所示，在正常生长条件下，野生型与GmOTSa过表达烟草的中NtAPX、NtSOD、NtCAT基因表达量均无显著差异，而在干旱处理后，与处理前相比，NtAPX、NtSOD基因表达量在野生型中无显著差异，而在GmOTSa过表达烟草中表达量都显著上调，约为野生型植株中的4倍；而干旱处理后NtCAT在野生型和GmOTSa过表达烟草中均上调且无显著差异；表明GmOTSa基因可能通过调节部分编码过氧化物清除酶基因的表达使植株中ROS的积累降低，从而增强GmOTSa过表达烟草的抗旱性。
为了探讨干旱胁迫下GmOTSa基因与干旱响应基因的调控关系，检测了脯氨酸合成过程中关键基因NtP5CS，液泡膜水通道蛋白基因NtTIP，脱水素基因NtERD10B在干旱处理前后野生型与GmOTSa过表达烟草中的表达水平。如图19中的D所示，干旱处理前，野生型中NtP5CS基因的转录水平与GmOTSa过表达烟草无显著差异；干旱处理后NtP5CS基因在野生型中表达量略有上调，约为之前的1.2倍，而GmOTSa过表达烟草中该基因表达量明显上调，约为处理前的3倍左右。如图19中的E所示，干旱处理前，野生型和GmOTSa过表达烟草NtTIP基因表达量无显著差异，干旱处理后NtTIP在野生型中表达量约为干旱处理前的8倍，而其在GmOTSa过表达烟草中该基因的表达量约为处理前的10-30倍，明显高于野生型。如图19中的F所示，干旱处理前，野生型和GmOTSa过表达烟草NtERD10B基因表达量差异不显著，干旱处理后NtERD10B在野生型中表达量约为干旱处理前的7倍，其在GmOTSa过表达烟草中的表达量约为处理前的16倍，明显高于野生型。表明GmOTSa基因过表达使部分干旱响应基因的转录水平显著上调，从而增强了烟草植株的抗旱性。
为了探讨GmOTSa基因与ABA响应基因的关系，检测了受ABA调控的脱水诱导蛋白基因NtRD22及ABA合成途径关键基因环氧类胡萝卜素双加氧酶基因NtNCED1在干旱处理前后野生型与GmOTSa过表达烟草中的表达水平。干旱处理前，野生型与GmOTSa过表达烟草NtRD22和NtNCED1基因表达水平均很低且无显著差异；干旱处理后NtRD22基因在野生型中表达量约为干旱处理前的3倍，而在GmOTSa过表达烟草中的表达量约为处理前的15倍，明显高于野生型(图19中的G)；干旱处理后NtNCDE1在野生型中表达量约为处理前的2倍，而在GmOTSa过表达烟草中的表达量高达处理前的300倍左右，明显高于野生型(图19中的H)。表明GmOTSa基因的过表达可能增强了GmOTSa过表达烟草中ABA响应基因表达量，可能通过影响内源ABA含量，进而影响ABA相关基因的表达情况，增强了GmOTSa过表达烟草的抗旱性。
实施例5.GmOTSa基因在大豆中的抗旱功能
生理指标检测：叶绿素含量，丙二醛含量，游离脯氨酸含量，SOD，POD活性等采用常规方法。
1.GmOTSa干旱胁迫下的生理功能分析
为了研究GmOTSa在干旱胁迫下的功能，首先构建了植物表达载体pFGC5941-GmOTSa-eGFP，载体构建示意图如图20所示，以实验室构建的pEasy-Blunt Zero-GmOTSa(pEasy-Blunt Zero载体插入GmOTSa基因)为模板，使用GmOTSa-pFGC5941-S：ttacaattaccatggggcgcgccATGGAGGAACAACAA，eGFP-pFGC5941-AS：GGTATCGATAAGCTTggcgcgccAGTACAGCTCGTCCAT)引物进行目的片段的扩增。通过同源重组的方式，基础载体是pFGC5941，构建pFGC5941-GmOTSa-eGFP载体(以实验室构建的pCAM35S-GmOTSa-eGFP(pCAM35S-eGFP载体插入GmOTSa基因)为模板，使用GmOTSa-pFGC5941-S，eGFP-pFGC5941-AS引物进行目的片段的扩增，通过同源重组的方式，构建pFGC5941-GmOTSa-eGFP载体，引物序列如下：GmOTSa-pFGC5941-S：ttacaattaccatggggcgcgccATGGAGGAACAACAA，eGFP-pFGC5941-AS：GGTATCGATAAGCTTggcgcgccAGTACAGCTCGTCCAT)将重组质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并通过PCR鉴定阳性菌落。从阳性菌液中提取pFGC5941-GmOTSa-eGFP质粒。
同时设计GmOTSa/b敲除载体，靶点设计如图21所示，构建GmOTSa/b基因敲除载体，载体构建示意图如图22所示(提取大豆毛状根DNA，使用J216212-F1和J216212-R1引物进行PCR，扩增获得GmOTSa基因靶点附近349bp基因片段，然后使用J216212-F3和J216212-R3引物进行PCR，扩增获得GmOTSb2基因靶点附近290bp基因片段。将上述的两个PCR获得的基因片段连入pFAST-Blunts Simple载体获得GmOTSa/b基因敲除载体，使用M13F引物测序。将测序序列与野生型大豆DNA PCR片段序列比对，检测CRISPR/Cas9基因编辑的具体位置及编辑类型)。
引物序列如下：J216212-R3：TTGTTGCCTACAAAAAGACCTCAT；J216212-F3：ATCCAGCCTTCATTGGAGCTT；J216212-R1：AATCTTGCCAACCCTCACAAC；J216212-F1：TTGCATTTGACAGGAGCGTA)。
重组质粒分别转化K599发根农杆菌感受态细胞，利用PCR鉴定阳性菌落，获得含pFGC5941-GmOTSa-eGFP，及GmOTSa/b基因敲除载体重组质粒的K599农杆菌。K599农杆菌用于穿刺法诱导大豆毛根。
利用下胚轴穿刺法，将转入K599空菌，pFGC5941-GmOTSa-eGFP和GmOTSa/b基因敲除载体的发根农杆菌K599涂抹在大豆下胚轴创口处，诱导产生大豆毛状根，并在毛状根达到5-10cm后埋入蛭石中，并剪掉初生根，转pFGC5941-GmOTSa-eGFP获得GmOTSa过表达的大豆植株，转GmOTSa/b基因敲除载体获得GmOTSa/b敲除的大豆植株。
为了进一步检测GmOTSa在大豆毛状根中是否正常表达，利用转基因植物(转pFGC5941-GmOTSa-eGFP载体)，载体中的目的基因融合的eGFP标签进行荧光显微镜检测，结果如图23，以空菌K599侵染的大豆毛状根作为阴性对照，在设置曝光时间为20ms时，阴性对照组未能观察到根自发荧光，而在空载体和GmOTSa过表达毛状根中可观察到绿色荧光。结果表明GmOTSa与eGFP融合蛋白在大豆毛状根中成功表达。
利用qRT-PCR对转GmOTSa基因大豆毛根进行目的基因表达水平检测，如图24A所示，GmOTSa过表达毛根中GmOTSa的表达量达到对照的10倍以上；提取GmOTSa/b基因编辑毛状根DNA，分别扩增GmOTSa基因靶点附近349bp基因片段和GmOTSb2基因靶点附近290bp基因片段，对PCR产物克隆测序，如图24A所示，两位点均得到有效编辑。以K599大豆毛状根为对照，对GmOTSa超表达(大豆转pFGC5941-GmOTSa-eGFP-3*FLAG)及GmOTSa/b编辑大豆毛状根嵌合体植株(转)进行为期10天的干旱断水处理。处理10天后，如图24C所示，GmOTSa过表达植株明显受到损伤更小，叶片颜色深绿，植株挺拔，在干旱胁迫初期表现出更强的抗旱性，K599叶片出现一定程度的黄化萎蔫，GmOTSa/b编辑株系黄化程度更严重，对干旱更敏感。干旱处理15天后，如图24D所示，K599叶片呈现萎蔫，GmOTSa过表达植株正常生长，而GmOTSa/b编辑大豆毛根嵌合体已干枯。为了探究K599对照、GmOTSa过表达及GmOTSa/b编辑材料过氧化物积累情况，对三种材料进行了DAB和NBT染色，如图24E、F所示，干旱处理后，K599对照叶片染色较GmOTSa过表达深，而GmOTSa/b编辑材料叶片染色最深，表明GmOTSa/b编辑材料积累了最多的过氧化物，受胁迫最严重。叶绿素含量是衡量植物抗逆性的重要指标。对野生型以及GmOTSa过表达毛状根嵌合体行了叶绿素含量相对值测定，如图24G所示，干旱处理前对照，GmOTSa过表达及GmOTSa/b编辑的毛状根嵌合体叶的SPAD值并无显著差异，干旱处理后过表达的毛状根嵌合体SPAD值强度明显高于K599对照植株，GmOTSa/b编辑的毛状根嵌合体SPAD值明显低于K599对照。MDA水平通常用作衡量膜损坏和植物抗性的指标，对转基因大豆毛状根嵌合体干旱处理前后的MDA含量进行了测定。结果如图24H所示，干旱处理前，K599对照与GmOTSa过表达及GmOTSa/b编辑的毛状根嵌合体MDA含量无显著差异，而干旱处理后，GmOTSa基因过表达转基因大豆毛状根嵌合体MDA含量明显低于野生型，编辑毛状根嵌合体的MDA含量高于野生型，表明GmOTSa过表达毛状根嵌合体植株受到的细胞膜损伤较轻。同样对K599对照与GmOTSa过表达及GmOTSa/b编辑的毛状根嵌合体进行了干旱前后的相对电导率进行了分析，结果如图24I所示，GmOTSa过表达毛根材料相对电导率最低，GmOTSa/b编辑的毛状根嵌合体相对电导率高于K599对照，表明GmOTSa/b编辑材料由于细胞膜损伤导致的离子渗漏最严重。另外，进行了干旱前后的SOD酶活分析，结果如图24J所示，GmOTSa过表达毛根材料SOD酶活高于K599对照，而GmOTSa/b编辑的毛状根嵌合体SOD活性最低，与图24E、F中过氧化物积累量结果相对应。以上结果表明GmOTSa过表达大豆毛状根嵌合体通过降低膜脂损伤、增强光合能力及提高过氧化物清除酶的活性减少过氧化物积累增强了对干旱胁迫的抗性。
Claims (10)
1.GmOTSa基因在植物抗逆境中的应用，其特征在于，编码GmOTSa基因的氨基酸序列的NCBI登录号为XP_003551198.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GmOTSa基因的序列的NCBI登录号为XM_003551150.4所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述逆境为抗干旱或抗ABA。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物为烟草或大豆。
5.一种超表达GmOTSa基因的植株在植物抗逆中的应用。
6.一种含有GmOTSa基因的重组载体在植物抗逆中的应用。
7.一种含有GmOTSa基因的重组载体的微生物细胞在植物抗逆中的应用。
8.权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述逆境为抗干旱或抗ABA；所述植物为烟草或大豆；所述GmOTSa基因的序列的NCBI登录号为XM_003551150.4所示。
9.一种培育抗逆植株的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：将GmOTSa基因与pFGC5941载体连接，获得重组载体；
步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；
步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入植物中获得转基因植株，鉴定后获得阳性的转基因植株。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植株为烟草或大豆。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015054375A2 (en) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | International Rice Research Institute | Drought-resistant cereal grasses and related materials and methods |
| CN104561037A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-29 | 东北农业大学 | 人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD |
| CN104878042A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-09-02 | 东北农业大学 | 一种提高植物抗逆性的方法及其应用 |
-
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015054375A2 (en) * | 2013-10-08 | 2015-04-16 | International Rice Research Institute | Drought-resistant cereal grasses and related materials and methods |
| CN104561037A (zh) * | 2014-12-23 | 2015-04-29 | 东北农业大学 | 人工改造的能提高植物耐盐性和抗旱性的基因GsDREB2-mNRD |
| CN104878042A (zh) * | 2015-06-23 | 2015-09-02 | 东北农业大学 | 一种提高植物抗逆性的方法及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JINGSONG GUO 等: "Soybean SUMO Protease Gmotsa Plays a Positive Role in Response to Drought Stress", pages 2, Retrieved from the Internet <URL:https://pag.confex.com/pag/asia2022/meetingapp.cgi/Paper/46533> * |
| JINGSONG GUO 等: "SUMO protease GmOTSa positively regulates drought tolerance in transgenic tobacco and soybean hairy roots", 《ENVIRONMENTAL AND EXPERIMENTAL BOTANY》, pages 1 - 16 * |
| 李艳君: "大豆SUMO系统在盐、高温和ABA胁迫下的表达分析与底物预测", 《万方》, pages 62 * |
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