KR101785101B1 - OsDWD1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 벼 유래 유전자인 OsDWD1(Oryza sativa DDB1 binding WD40) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 OsDWD1 유전자에 대한 RNAi 염기서열을 포함하는 식물 병 저항성 재조합 벡터를 이용하여 식물 병 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제작하였으므로 다양한 작물에서 식물 병에 의한 피해를 줄일 수 있는 기반기술로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

OsDWD1 유전자 및 이의 용도{OsDWD1 gene and use thereof}
본 발명은 병원균 처리 시 발현이 변화하는 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.
벼, 옥수수, 보리 등과 같은 화본과 작물은 인류에 식량을 공급하는 중요한 식량작물이며, 이들 작물에는 바이러스에 의해 발병하는 흑조위축병(검은줄오갈병), 오갈병 및 줄무늬잎마름병과 세균에 의해 발병하는 벼 흰잎마름병과 곰팡이에 의해 일어나는 벼 도열병 등이 있어 경제적으로 막대한 피해를 주고 있다.
종래의 병 저항성 품종 육성에 대한 연구는 전통적인 교배 육종에 의존하였으며, 최근의 개발된 몇몇 저항성 품종은 수직 저항성을 이용한 저항성이므로 저항성이 쉽게 무너지는 문제점이 있었다.
이에, 최근 식물 병에 저항성을 나타내는 새로운 유전자를 탐색, 분리 및 분석하고, 그 유전자를 이용하여 형질전환된 작물을 개발하는 분자 육종 분야에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명은 분자 육종법에 의한 병 저항성을 갖는 형질전환 식물체를 이용하는 것으로써, 병에 대한 저항성으로 인한 생산량 증가뿐만 아니라, 농약 사용량 절감 등을 통한 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하다.
한국공개특허 제10-2016-0031481호 한국등록특허 제10-1350225호
본 발명의 목적은 OsDWD1(Oryza sativa DDB1 binding WD40) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 식물 병 저항성 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식물 병 저항성 재조합 벡터로 형질전환된 식물 병 저항성 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 식물 병 저항성 형질전환 식물체 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 OsDWD1(Oryza sativa DDB1 binding WD40) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 식물 병 저항성 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 있어서, 용어 "OsDWD1 유전자"는 벼(Oryza sativa)로부터 유래하며 DDB1 결합 WD40 단백질(DDB1 binding WD40)을 코딩하는 유전자를 의미하는 것이다.
상기 식물 병은 벼 흰잎마름병일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 식물에 발생하는 병이라면 모두 해당될 수 있다.
용어 "벼 흰잎마름병(Bacterial blight)"은 벼 잎에 난 상처를 통해 세균이 감염돼 주로 발생하는 병으로, 잎의 가장자리가 노랗게 변하면서 건조되고 점차 잎이 말라죽게 된다. 한번 발생하기 시작하면 급속도로 퍼져 심할 경우 논 전체가 흰빛으로 보이기도 한다. 벼 흰잎마름병은 방제가 어렵고, 환경에 따라 갑자기 발병할 수도 있기 때문에 평소에도 주의가 요구된다.
주로 배수가 나쁘고 저습지 또는 고온다습한 곳에서 발생한다.
상기 재조합 벡터는 도 4의 개열지도를 가지는 재조합 벡터일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, OsDWD1 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 유전자는 벡터에 삽입되어(도 4) RNA 간섭 기술을 이용할 수 있는 dsRNA의 제조가 가능하다.
서열번호 1의 염기서열을 갖는 유전자 외에도 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는, 염기서열은 변화되지만 서열번호 1의 염기서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자이다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "발현 벡터"는 흔히 "재조합 벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "재조합 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 유비퀴틴, 액틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 CaMV 35S 프로모터를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 a-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타(BASTA) 제초제에 대한 내성 유전자가 있다. 본 발명에 따른 재조합 벡터는 바스타(BASTA)에 대한 내성을 가지는 유전자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
용어 "RNAi"는 짧은 이중가닥 RNA가 자신의 염기서열에 해당하는 표적 mRNA를 선택적으로 분해하여 표적 유전자의 전사와 단백질 합성을 중단시키는 과정이다. 이러한 RNAi 현상을 특이적으로 유도하는데 사용되는 siRNA(small interfering RNA)을 제조하기 위해서 in vitro에서 siRNA를 직접 합성한 후 transfection을 통해 세포 안으로 도입시키는 방법과 세포 내에서 siRNA를 발현할 수 있도록 제작된 shRNA(short hairpin RNA) 발현벡터를 활용하는 방법이 널리 사용되고 있다.
본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 유전자를 포함하는 OsDWD1 유전자의 발현을 제어하기 위해 RNAi 기술을 활용하였으며, OsDWD1 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다.
본 발명은 식물 병 저항성 재조합 벡터로 형질전환된 식물 병 저항성 형질전환 식물체를 제공한다.
상기 형질전환 식물체는 OsDWD1 유전자에 대한 RNAi에 의해 식물 병 저항성이 증가한 것일 수 있다.
상기 식물체는 벼, 담배, 애기장대, 수박, 참외, 오이. 호박, 토마토, 풋고추, 가지, 당근, 땅콩, 감자, 고구마, 및 기타 약용작물인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명은
(1) 제 1항의 OsDWD1(Oryza sativa DDB1 binding WD40) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
(2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
(3) 상기 형질전환 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 식물 병 저항성 형질전환 식물체 제조방법을 제공한다.
식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0301316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움이 매개된 유전자 전달을 포함한다. 상기 방법들은 이 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 OsDWD1 유전자의 일부를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체는 식물 병에 대하여 저항성을 가지므로 식물 병에 의해 피해를 입는 작물에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 OsDWD1 유전자의 염기서열(서열번호 1)이다.
도 2는 OsDWD1 유전자의 아미노산 서열(서열번호 2)이다.
도 3은 OsDWD1 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 OsDWD1에 대한 RNAi 벡터의 모식도이다.
도 5는 OsDWD1 유전자 발현 억제(KD: knock down) 형질전환체의 DWD1 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 OsDWD1 유전자 발현 억제(KD: knock down) 형질전환체의 병 검정 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 OsDWD1 유전자 발현 억제(KD: knock down) 형질전환체의 병 저항성 유도 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 통상의 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> OsDWD1 유전자 분리 및 염기서열 분석
일미벼 종자를 3일간 발아시켜, 파종 후 3주가 된 벼를 온실에 확보하였다. 또한, 벼 흰잎마름병균 KACC10859(KACC, 한국)와 KXO42를 PSA 배지에서 2일간 배양하고 10mM MgCl2에 현탁시켜 OD600에서 0.5로 조정한 뒤 벼에 이쑤시게로 접종하였다. 이후 벼 잎으로부터 총 RNA를 트리졸 시약 키트(Trizol reagent kit)(Invitrogen, 미국)를 이용하여 분리하고, 올리고 dT 프라이머(oligo dT primer)와 MMLV 역전사효소(reverse transcriptase)(Promega, 미국)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 하기 표 1의 게이트웨이 클로닝 프라이머(gateway cloning primer)-F(5’-aaaaagcaggcttgATGGCGGCGGCGGCGTTG-3’)(서열번호 3)와 게이트웨이 클로닝 프라이머-R(5’-agaaagctgggtaGCTTGAAGTGCATCCTAC-3’)(서열번호 4)를 이용한 PCR을 통해 유전자를 분리하여 840bp의 염기서열 및 아미노산 서열을 결정하고(서열번호 1 및 서열번호 2) 그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었으며, 유전자는 OsDWD1로 명명하였다.
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 서열(5'→3')
3 gateway cloning primer-F 정방향 5’-aaaaagcaggcttgATGGCGGCGGCGGCGTTG-3’
4 gateway cloning primer-R 역방향 5’-agaaagctgggtaGCTTGAAGTGCATCCTAC-3’
< 실시예 2> 벼 유래 OsDWD1 유전자의 발현양상 분석
실시예 1과 동일한 방법으로 일미벼에 벼 흰잎마름병균(KXO42)을 접종한 후, 시료를 0시간, 6시간, 12시간, 24시간마다 채취하였다. 트리졸 시약 키트를 이용하여 채취한 각 벼 잎으로부터 총 RNA를 분리하였다. 실시예 1과 동일한 방법으로 각각의 시료로부터 cDNA를 합성한 후, 하기 표 2의 OsDWD1 qRT-PCR(Quantitative real-time PCR) 프라이머-F(5’-CCGCCAGGTAGTTACAGGAT-3’)(서열번호 5)와 OsDWD1 qRT-PCR 프라미어-R(5’-TCACCGGACGTATAACCTGA-3’)(서열번호 6), 대조군인 액틴(actin)에 대한 Osactin qRT-PCR 프라이머-F(5’-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3’)(서열번호 7)와 Osactin qRT-PCR 프라이머-R(5’-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3’)(서열번호 8)를 사용하는 qPCR을 MyIQ(BioRad, 미국)를 이용하여 수행하였다.
그 결과, 도 3과 같이, OsDWD1은 벼 흰잎마름병원균 처리군(compatible 및 incompatible)에서 벼 흰잎마름병원균 무처리군(0시간)에 비해 발현이 억제되는 것을 확인하였다.
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 서열(5'→3')
5 OsDWD1 qRT-PCR primer-F 정방향 5’-CCGCCAGGTAGTTACAGGAT-3’
6 OsDWD1 qRT-PCR primer-R 역방향 5’-TCACCGGACGTATAACCTGA-3’
7 Osactin qRT-PCR primer-F 정방향 5’-ATCCTTGTATGCTAGCGGTCGA-3’
8 Osactin qRT-PCR primer-R 역방향 5’-ATCCAACCGGAGGATAGCATG-3’
< 실시예 3> OsDWD1 에 대한 RNAi 벡터 제작
게이트웨이(Gateway) 클로닝 방법에 따라 OsDWD1에 대한 RNAi 벡터를 제작하였다. 구체적으로, 하기 표 3의 OsDWD1 RNAi 프라이머-F(5’-AAA AAGCAGGCTCCGTCTGCATCGTCCAAGCGCAC-3’)(서열번호 9) 및 OsDWD1 RNAi 프라이머-R(5’-AGAAAGCTGGGTCTGCATAAACAGATCCTTCCTG-3’)(서열번호 10)로 denaturing 온도: 95 ℃, annealing 온도: 57 ℃, extention 온도: 72 ℃에서 30 사이클을 반복하는 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물은 하기 표 3의 attB1 프라이머-F(5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’)(서열번호 11)와 attB2 프라이머-R(5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’)(서열번호 12)을 사용하여 PCR 과정을 반복하였다. attB1과 attB2 어뎁터 프라이머가 부착된 RNAi 벡터용 OsDWD1 PCR 산물들은 BP 재조합 반응을 통해 pDNOR221벡터로 클로닝하여 엔트리클론을 만들고 다시 LR 반응에 의해 목적 벡터인 pB7GWIWG(II)에 클로닝하여 OsDWD1에 대한 RNAi 벡터인 35S::OsDWD1-RNAi (도 4)를 제작하였다.
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 서열(5'→3')
9 OsDWD1 RNAi primer-F 정방향 5’-aaaaagcaggctCCGTCTGCATCGTCCAAGCGCAC-3’
10 OsDWD1 RNAi primer-R 역방향 5’-agaaagctgggtCTGCATAAACAGATCCTTCCTG-3’
11 AttB1 primer-F 정방향 5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3’
12 AttB2 primer-R 역방향 5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3’
< 실시예 4> 아그로박테리움 공동배양법 이용 벼 형질전환
실시예 3에서 제작한 35S::OsDWD1-RNAi 벡터를 이용해 벼를 형질전환하기 위하여, MS 배지에서 벼의 캘러스를 유도하였다. 구체적으로, 벼 형질전환에 사용하는 볍씨는 껍질을 벗긴 현미를 사용하였다. 볍씨를 70% 에탄올에 1분 동안 침지한 뒤 락스를 50% 함유한 용액에서 40분간 소독하였다. 소독액을 모두 따라 버린 후 볍씨를 멸균수로 5회 세척하였다. 소독액을 세척한 뒤 여과지를 이용해 볍씨에서 물기를 제거한 후 볍씨를 2N6 배지(다량원소, 미량원소, 비타민을 함유한 혼합물 4g/L와 30g/L sucrose, 0.5g/L proline, 0.5g/L glutamine, 0.3g/L casamino acids, 0.01g/L myo-inositol, 2mg/L 2,4-D 및 4g/L phytagel)(pH5.8) ([Hiel et al., 1994] 기재된 배지 변형)안에 박아 넣어 배지와 접촉이 잘되도록 하고 씨눈은 위로 향하도록 치상하였다. 배양온도는 28℃이며 암처리하였다. 볍씨를 2N6에서 5일간 배양하며, 캘러스가 유도되면 배유를 제거하였다. 배유는 캘러스가 훼손되지 않도록 핀셋을 이용하여 조심스럽게 제거하였으며, 자엽과 뿌리 부분은 그대로 두어 캘러스가 훼손되는 것을 방지하였다.
상기 형질전환된 아그로박테리움을 AB 고체 배지에 3일 동안 배양한 후 AAM 액체 배지에 모아서 현탁액을 제조하였다. 흡광도 기계를 이용하여 현탁액의 농도를 측정하며 OD595=0.1이 되도록 만든 후 AAM 액체 배지로 10배 희석하여 OD595=0.01이 되도록 하였다. 상기 현탁액에 배유를 제거한 캘러스를 2분 동안 침지시키고 2분 동안 부드럽게 용액을 흔들어주어 아그로박테리움을 접종하였다. 접종 후 캘러스에서 현탁액만을 따라 버리고 여과지를 이용하여 신속히 여액을 제거하였다. 2N6-AS 배지(2N6 배지에 10g/L 글루코스(glucose) 및 100uM 아세토시린곤(acetosyringone)을 추가)(pH5.2) 배지 위에 미리 여과지를 깔아놓아 충분히 배지 성분이 스며들게 한 다음, 접종이 끝난 캘러스를 여과지 위에 옮겨서 공동배양하였다. 여과지는 공동배양기간 동안 아그로박테리움이 과도하게 성장하여 캘러스가 물러지는 현상을 방지하기 위한 것이다. 공동배양은 25℃에서 7일 동안 암배양 하였으며, 아그로박테리움 LBA4404 균주를 사용하였으므로 공동배양기간 동안 아그로박테리움의 과도한 성장이 이루어지지 않아 별도의 세척 작업을 하지 않았다. 배양된 캘러스를 2N6-CH 배지(2N6 배지에 cefotaxime 200mg/L 및 PPT(phosphinothricin)(BASTA) 6mg/L 첨가)로 옮겼으며, 이때 핀셋을 이용하여 자엽과 뿌리 부분을 제거하며 캘러스는 2-3조각으로 나누어 배지와 닿는 면적이 최대가 되게 옮겨 배양하였다. 배양온도는 28℃가 적당하며 암배양기에서 14일 동안 배양하여 형질전환된 캘러스를 유도하였다. 캘러스 유도 14일 후, 제초제인 PPT가 첨가된 2N6-CH 배지에서 형질전환된 캘러스가 분열하면서 성장하여 슈트와 뿌리를 유도할 수 있는 재분화 배지인 MSR 배지로 계대 배양하였다. 슈트와 뿌리가 유도된 형질전환체는 순화시켜 토양으로 옮겨 온실에서 키웠다.
< 실시예 5> OsDWD1 유전자 발현 억제(KD: knock down) 형질전환체 선발
실시예 3에서 제작한 35S::OsDWD1-RNAi의 형질전환체에서 OsDWD1 유전자 발현이 억제된 형질전환 벼를 확인하기 위하여, 35S::OsDWD1-RNAi 형질전환체의 RNA 발현 수준을 분석하였다. 실시예 2와 동일한 방법으로 총 RNA를 분리하고 qRT-PCR을 수행하였으며, 액틴(actin)을 대조군으로 하여 OsDWD1의 발현을 분석하였다.
그 결과, 실시예 4에서 제작한 형질전환 벼 중 DWD1kd-5 및 DWD1kd-6이 대조군인 일미벼에 비해 OsDWD1의 발현이 현저히 저하된 것을 확인하여, 이들을 선별하였다(도 5).
< 실시예 6> OsDWD1 유전자 발현 억제(KD: knock down) 형질전환체의 병 검정
OsDWD1유전자는 벼 흰잎마름병균 처리시 발현이 억제되는 유전자이므로, RNAi에 의해 발현을 억제되면 병에 대해 어떤 반응을 나타내는지를 확인하기 위해 벼 흰잎마름병에 대한 검정 실험을 수행하였다.
벼 흰잎마름병균(KACC10859)을 PSA 배지에서 2일간 배양한 후, 10mM MgCl2에 현탁시켜 OD600에서 0.5로 조정하였다. 대조군인 일미벼 잎 및 실험군인 OsDWD1-RNAi 형질전환 벼 잎의 끝을 가위로 자르는 방법을 사용하여 벼 흰잎마름병균을 접종하였다. 접종한 뒤 17일 후, 병원균이 진전되는 정도를 자로 재고, 잎길이로 나누어 보정하였다.
그 결과, 도 6과 같이 형질전환 벼는 대조군인 일미벼에 비해 병의 진전이 매우 더딘 것을 확인하였다.
< 실시예 7> OsDWD1 유전자 발현 억제(KD: knock down) 형질전환체의 병 저항성 유도 여부 검정
실시예 6에서 OsDWD1-RNAi 형질전환체가 병 저항성을 나타내는 것을 확인하여, OsDWD1 유전자 발현 억제가 병 저항성 반응을 유도하는지를 조사하였다. OsDWD1-RNAi 형질전환체를 이용하여 병 저항성 유전자에 대해 RT-PCR을 수행함으로써 병 저항성 유전자의 발현 패턴에 대한 OsDWD1 억제 효과를 검정하였다. 구체적으로, 병 저항성 특이적 마커 유전자인 Betv1, PR10, PR10a, SAIP(SA induced protein), 키티나아제(chitinase)의 발현 패턴을 RT-PCR을 이용하여 측정하였다. OsDWD1-RNAi 형질전환체 및 일미벼에 벼 흰잎마름병균(KACC10859)을 처리한 후 24시간 뒤에 잎 샘플을 채취하여 실시예 2와 동일한 방법으로 전체 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. 각 병 저항성 특이적 마커 유전자의 프라이머를 이용하여 denaturing: 94 ℃, 30초, annealing: 58 ℃, 1분, extention: 72 ℃, 1분으로 30 사이클을 반복한 후 72℃에서 10분간 연장하는 조건으로 PCR을 수행하였다. PCR 수행 시 사용한 병 저항성 특이적 마커 유전자에 대한 각각의 프라이머는 하기 표 4와 같았다.
그 결과, Betv1, PR10, PR10a, SAIP, 키티나아제는 비형질전환체에서 병원균 처리 시 유도되는 것을 확인하여 병 저항성 마커 유전자임을 확인하였으며, OsDWD1-RNAi 형질전환체에서는 병원균 처리 이전부터 병 저항성 유전자들의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다. 이는 OsDWD1-RNAi 형질전환체로부터 병 저항성 반응이 유도되었음을 시사하였다.
서열번호 프라이머 명칭 프라이머 방향 서열(5'→3')
13 Betv1-F 정방향 5’-AGAAATATGCATGTCATAAAGTTACTCAT-3’
14 Betv1-R 역방향 5’-CAATGGTGGAAGCACAGAAG-3’
15 PR10-F 정방향 5’-GTCCAAACCTCAGAAGACGAT-3’
16 PR10-R 역방향 5’-CACCCATGACTCACATGTAA-3’
17 PR10a-F 정방향 5’-GCTACAGGCATCAGTGGTCA-3’
18 PR10a-R 역방향 5’-GACTCAAACGCCACGGAGAT-3’
19 SAIP-F 정방향 5’-TTGAGCAAGTGCCCTGCTTCTCCA-3’
20 SAIP-R 역방향 5’-CGACAACGCAAACCTCTACTTCTG-3’
21 chitinase-F 정방향 5’-CGCCCTAAGATAGAGTAACATCG-3’
22 chitinase-R 역방향 5’-CAAGAGCAACAAACAGTGGC-3’
23 actin-F 정방향 5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’
24 actin-R 역방향 5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’
<110> Republic of Korea <120> OsDWD1 gene and use thereof <130> P16R12D0759 <160> 24 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> nucleotide sequence of OsDWD1 <400> 1 atggcggcgg cggcgttggc ggggatggac gcgcgggggt gggacgaggc ggcgtacagg 60 cggggcatcc tgcgggagcg ggacctctcc tgccgcaccc tcttccgcgc cgtcttcttc 120 gaccaccacg acgacgaccc cgacgtcctc ctcgccgccg cctccagcga cggctccctc 180 gcctccttct ccctctcctc ctgcatctcc tcctcctcct cccatcccac cccacagacc 240 cacccggatg ccgcggtctc tctggttgat cccgtctgca tcgtccaagc gcacagtggc 300 ccggcctacg acgtcaggtt ctacccggat tcgcagcagc cgctgctctt cagcggcggg 360 gatgacgggc gccttcgggg atggagatgg cacgagatgc agagctgcct tgtgccgcta 420 tctctgcaag gggatcattt ggagccagta cttgatttgg tgaaccctca gcatgagggt 480 ccttggggtg ctcgctctcc aatacctgaa aacaacgcca ttgcgattaa caaacaggaa 540 ggatctgttt atgcagcggc cggggatgca tgtgcttatt gctgggatgt ggagagtggt 600 aaatgtaaaa tgaccttcaa gggacatact gactatttgc acagcattgc agtccgcgaa 660 gcgaaccgcc aggtagttac aggatcagag gatggcacag cccgtatctg ggattgcaga 720 agtggaaagt gcactcaggt tatacgtccg gtgaaaaaca agatttttga ggggtcatgg 780 gtcagttgtg ttgccattga tgcaagtgaa agctggctgg taggatgcac ttcaagctga 840 840 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> amino acid sequence of OsDWD1 <400> 2 Met Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Met Asp Ala Arg Gly Trp Asp Glu 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Leu Arg Glu Arg Asp Leu Ser Cys Arg 20 25 30 Thr Leu Phe Arg Ala Val Phe Phe Asp His His Asp Asp Asp Pro Asp 35 40 45 Val Leu Leu Ala Ala Ala Ser Ser Asp Gly Ser Leu Ala Ser Phe Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Cys Ile Ser Ser Ser Ser Ser His Pro Thr Pro Gln Thr 65 70 75 80 His Pro Asp Ala Ala Val Ser Leu Val Asp Pro Val Cys Ile Val Gln 85 90 95 Ala His Ser Gly Pro Ala Tyr Asp Val Arg Phe Tyr Pro Asp Ser Gln 100 105 110 Gln Pro Leu Leu Phe Ser Gly Gly Asp Asp Gly Arg Leu Arg Gly Trp 115 120 125 Arg Trp His Glu Met Gln Ser Cys Leu Val Pro Leu Ser Leu Gln Gly 130 135 140 Asp His Leu Glu Pro Val Leu Asp Leu Val Asn Pro Gln His Glu Gly 145 150 155 160 Pro Trp Gly Ala Arg Ser Pro Ile Pro Glu Asn Asn Ala Ile Ala Ile 165 170 175 Asn Lys Gln Glu Gly Ser Val Tyr Ala Ala Ala Gly Asp Ala Cys Ala 180 185 190 Tyr Cys Trp Asp Val Glu Ser Gly Lys Cys Lys Met Thr Phe Lys Gly 195 200 205 His Thr Asp Tyr Leu His Ser Ile Ala Val Arg Glu Ala Asn Arg Gln 210 215 220 Val Val Thr Gly Ser Glu Asp Gly Thr Ala Arg Ile Trp Asp Cys Arg 225 230 235 240 Ser Gly Lys Cys Thr Gln Val Ile Arg Pro Val Lys Asn Lys Ile Phe 245 250 255 Glu Gly Ser Trp Val Ser Cys Val Ala Ile Asp Ala Ser Glu Ser Trp 260 265 270 Leu Val Gly Cys Thr Ser Ser 275 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> gateway cloning primer-F <400> 3 aaaaagcagg cttgatggcg gcggcggcgt tg 32 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> gateway cloning primer-R <400> 4 agaaagctgg gtagcttgaa gtgcatccta c 31 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> OsDWD1 qRT-PCR primer-F <400> 5 ccgccaggta gttacaggat 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> OsDWD1 qRT-PCR primer-R <400> 6 tcaccggacg tataacctga 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Osactin qRT-PCR primer-F <400> 7 atccttgtat gctagcggtc ga 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Osactin qRT-PCR primer-R <400> 8 atccaaccgg aggatagcat g 21 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> OsDWD1 RNAi primer-F <400> 9 aaaaagcagg ctccgtctgc atcgtccaag cgcac 35 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> OsDWD1 RNAi primer-R <400> 10 agaaagctgg gtctgcataa acagatcctt cctg 34 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> AttB1 primer-F <400> 11 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> AttB2 primer-R <400> 12 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Betv1-F <400> 13 agaaatatgc atgtcataaa gttactcat 29 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Betv1-R <400> 14 caatggtgga agcacagaag 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> PR10-F <400> 15 gtccaaacct cagaagacga t 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> PR10-R <400> 16 cacccatgac tcacatgtaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> PR10a-F <400> 17 gctacaggca tcagtggtca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> PR10a-R <400> 18 gactcaaacg ccacggagat 20 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> SAIP-F <400> 19 ttgagcaagt gccctgcttc tcca 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> SAIP-R <400> 20 cgacaacgca aacctctact tctg 24 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> chitinase-F <400> 21 cgccctaaga tagagtaaca tcg 23 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> chitinase-R <400> 22 caagagcaac aaacagtggc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> actin-F <400> 23 tccatcttgg catctctcag 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> actin-R <400> 24 gtacccgcat caggcatctg 20

Claims (6)

  1. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는 OsDWD1(Oryza sativa DDB1 binding WD40) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 식물 병 저항성 재조합 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 식물 병은 벼 흰잎마름병인 식물 병 저항성 재조합 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 4의 개열지도를 가지는 재조합 벡터인 식물 병 저항성 재조합 벡터.
  4. 제 1항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물 병 저항성 형질전환 식물체.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 OsDWD1 유전자에 대한 RNAi에 의해 식물 병 저항성이 증가한 것을 특징으로 하는 식물 병 저항성 형질전환 식물체.
  6. (1) 제 1항의 OsDWD1(Oryza sativa DDB1 binding WD40) 유전자에 대한 RNAi(ribonucleic acid interference) 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제조하는 단계;
    (2) 상기 벡터를 아그로박테리움을 이용하여 식물체에 형질전환하는 단계; 및
    (3) 상기 형질전환 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 식물 병 저항성 형질전환 식물체 제조방법.



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KR102194867B1 (ko) 2019-06-19 2020-12-23 대한민국 병 방어 억제 유전자 OsWRKY55, 벼 흰잎마름병균 이펙터 결합 프로모터 및 이의 용도

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